Summary
本协议描述了丘脑和大脑皮层脊髓 cocultures 中丘脑-皮质轴突分支和突触形成同时成像的方法。单个丘脑-皮质轴突及其突触前终端的可视化细胞电穿孔技术与 DsRed 和 GFP 标记突触素。
Abstract
轴突分支和突触形成是建立精确神经回路的关键过程。在发育过程中, 感觉丘脑-皮质 (TC) 轴突形成分支和突触在特定层的大脑皮层。尽管轴突分支与突触形成之间存在明显的空间相关性, 但它们之间的因果关系却不甚明了。为了解决这个问题, 我们最近开发了一种方法, 同时成像的分支和突触形成的个别 TC 轴突在脊髓 cocultures。
本协议描述了一种由脊髓共培养和电穿孔组合组成的方法。丘脑和大脑皮层的脊髓 cocultures 促进基因操纵和轴突过程的观察, 保留特征结构如层流结构。用电穿孔技术将两种不同的质粒编码 DsRed 和 EGFP 标记的突触素 (SYP EGFP) 与小数目的丘脑神经元共转染。这种方法使我们能够同时可视化 TC 神经元和它们的突触前点的单个轴突形态。该方法还能够长期观察, 揭示轴突分支与突触形成之间的因果关系。
Introduction
哺乳动物大脑中的丘脑-皮质 (TC) 投射是研究轴突导引和靶向机制的合适系统。在发育过程中, 感觉 TC 轴突生长在皮质板块, 并形成分支和突触在大脑皮层的主要感官区域 IV.1,2中优先。即使在基础连接建立后, 轴突和突触端子也会根据环境变化而重建3,4。然而, 如何动态改变 TC 轴突形态是很不清楚的。其中一个主要原因是缺乏足够的技术来观察单个细胞水平的结构变化。虽然最近的显微学, 如双光子显微学的发展, 允许直接观察活体皮层神经元在体内, 但仍有技术上的限制, 捕获的总体 TC 轨道5,6. 因此,体外方法对 TC 轴突进行实时成像, 将为轴突分支和突触形成的结构分析提供有力的工具。
我们的小组首次建立了具有渗透性膜的静态切片培养方法7。使用这种方法, 鼠皮质切片被共培养的感觉丘脑块, 和叶片特定的 TC 连接概括在这个脊髓 cocultures 7, 8.稀疏标记与荧光蛋白进一步允许我们观察 TC 轴突生长和分支形成9,10,11。最近, 我们开发了一种新的方法, 同时成像分支和突触形成的个别 TC 轴突在脊髓 cocultures12。为了同时可视化 TC 轴突和突触前的地点, DsRed 和 EGFP 标记突触素 (SYP EGFP) 通过电穿孔脊髓共培养与小数目的丘脑神经元联合转染。目前的方法有利于 TC 轴突的形态学分析和长期观察, 可用于显示轴突分支与突触形成之间的因果关系。
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Protocol
所有实验都是根据大阪大学动物福利委员会和日本神经科学学会制定的指导方针进行的。
1. 丘脑和大脑皮层的脊髓 cocultures
注: 有关详细过程, 请参阅原始出版物7,8,13。所有程序都应在无菌条件下进行。大 (SD) 大鼠用于神经元培养。
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试剂制剂
注意:以下试剂的容量是为一只老鼠脑子。- 准备10x 修改后的 N2 补充13: 胰岛素 (50 微克/毫升), 黄体酮 (200 nm), 松 (200 纳米), 亚硒酸钠 (300 nm), 转铁蛋白 (1 毫克/毫升), 腐胺 (1 毫米), 葡萄糖 (60 毫克/毫升)
- 准备含有血清的培养基(10 毫升): 85% DMEM/F12, 10% 10x 改良 N2 补充, 5% 胎牛血清 (血清)
- 准备无血清培养基(20 毫升): 90% DMEM/F12, 10% 10x 改性 N2 补充剂
- 准备鼠尾胶原蛋白溶液(0.5 毫升)。总之, 在无菌条件下, 从大鼠尾部取嫩纤维, 在醋酸溶液中孵化过夜。离心后, 收集上清 (几毫克/毫升) 和存储在冰箱13。
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培养皿的制作
- 将膜插入到35毫米培养皿中。
- 添加 40-50 ul 的鼠尾胶原蛋白溶液的膜, 并传播胶原溶液围绕中心。
- 空气在干净的长凳上完全干燥。
- 将含血清培养基的 1.5-2 毫升放入盘中, 使膜与培养基一起浸泡。
- 将培养基放在孵化器 (37 摄氏度, 湿润95% 空气, 5% CO2) 电镀前。
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皮质切片的制备
- 用70% 乙醇消毒所有手术器械10分钟或更长时间。
- 从产后一天 (P) 2 大鼠在冰冷麻醉下快速解剖整个大脑 (浸泡在冰芯片中几分钟)。
- 将大脑放入100毫米培养皿中, 其中含有100毫升的冷汉克斯平衡盐溶液。
- 用显微外科剪刀从大脑中取出 pia, 从视觉和体感皮层切开皮质切片 (300-400 微米厚度) (详情请参阅图 1)。
注意:在双目显微镜下, 皮质切片厚度大致由网格尺度估计。
注意:另外, 皮质切片可以在无菌条件下 vibratome。 - 用一次性塑料吸管将一些皮质切片转移到膜上。
- 用火抛光的巴斯德吸管调整位于培养基中心附近的切片位置 (有关详细信息, 请参阅8、13) 并从插入中删除多余介质。
注意:调整介质的水平稍低于切片表面, 使切片能够得到足够的气体和介质供应。这对细胞活力至关重要。 - 在湿润95% 空气和 5% CO2的环境中, 将含有血清的培养基中的切片保持在37摄氏度, 而仅在丘脑块被取走并放置在其旁边的某一天进行培养。
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丘脑块的制备
- 用70% 乙醇消毒所有手术器械10分钟或更长时间。
- 麻醉一只怀孕的老鼠 (胚胎日 15), 腹腔注射戊巴比妥 (50 毫克/千克) 含有麻醉剂。
- 解剖每个胚胎从子宫角, 并将胚胎放入一个100毫米培养皿中含有100毫升的冷汉克斯平衡盐溶液。
- 在双目显微镜下, 从每个胚胎中取出大脑, 并切除主要包含 ventrobasal 复合体和侧膝状核的丘脑块 (大约0.5 毫米 x 3)7使用显微外科剪刀 (见图 1)。
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文化与维护脊髓 cocultures
- 使用巴斯德吸管, 将丘脑块放置在被放置在膜过滤器的皮质切片的心室表面旁。
- 在湿润95% 空气和 5% CO2的环境中, 保持37摄氏度的含血清培养基中的 cocultures。
- 在培养两天后, 用无血清培养基交换一半培养基。此后, 每 2-3 天交换媒介。
注意:媒介的水平应该在媒介交换以后检查, 因为它是重要的对细胞生存。
2. 电穿孔
所有程序都应在无菌条件下进行。
注意:在准备丘脑块后的某一天进行电穿孔, 以防止块体脱离。
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粒
- 使质粒的混合物如下: pCAGGS-DsRed 2 微克/ul;pCAG-SYP-EGFP 3.5 微克/ul。
注意:用无内毒素 Maxiprep 试剂盒纯化两种质粒, 并在汉克斯平衡盐溶液中溶解。
- 使质粒的混合物如下: pCAGGS-DsRed 2 微克/ul;pCAG-SYP-EGFP 3.5 微克/ul。
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电穿孔设备安装
诸如刺激器和隔离器之类的电子仪器应该连接起来, 如图 2所示。- 将刺激器连接到两相隔离器。
- 将电极 (铜线直径0.2 毫米) 连接到隔离器的负端。
- 将电极 (银线1毫米直径) 串联到100Ω电阻器, 并将该隔振的正极端子连接起来。
- 将放大器连接到示波器, 通过测量放大器的电压来监测电流是否通过电阻。
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玻璃吸管的制备
注: 两种玻璃吸管用于质粒溶液的喷射和电脉冲的应用。- 用电极拉拔器将吸管从玻璃毛细血管中制成。
- 打破喷射吸管的尖端 (尖端直径应该是 20-50 微米)。
- 用砂纸研磨和抛光电极吸管的尖端, 然后进行火抛光 (内径应为 50-200 微米)。
注意:电极尖端应该是平坦和平滑的, 因为它直接接触组织。
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电穿孔程序
- 将弹射和电极吸管连接到机械手。
- 将银线 (0.2 毫米直径) 插入电极吸管。
- 用塑料管将弹射吸管连接到1毫升的注射器上。
- 采用注射器吸入法, 将5质粒溶液的 ul 引入到弹射吸管中。
- 将共培养在电穿孔阶段, 并将1毫米直径电极插入培养基中。
- 将弹射吸管放在丘脑外植体上。
- 在提示触及丘脑块的表面后, 手动推注射器。
注意:大约0.5 质粒溶液的 ul 通常使用每一个丘脑块。 - 将电极吸管放在丘脑块上, 在弹射吸管缩回后立即放置。
- 提供电脉冲 (50-400 μA, 3 到5列车200平方脉冲1毫秒的持续时间在200赫兹)。监控示波器上列车的振幅和数量。
注意:电流的振幅取决于电极吸管的内径13。 - 收回电极吸管, 并返回到孵化器的盘子。
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显微观察
- 将培养皿放在直立共焦显微镜的微观阶段, 配备两组 EGFP (励磁、488 nm、发射、515 nm) 和 DsRed (励磁、514 nm、发射、565 nm)。
- 采用20X 长工作距离物镜, 以 1-7 µm 级尺寸拍摄 10-25 光学剖面图。选择单独区分标记的轴突, 表达 DsRed 和 SYP-EGFP。
注意:观测到的面积约为 0.7 x 0.7 毫米 (对应于 1024 x 1024 像素, 即0.68 微米/像素)。 - 每24小时捕获图像以进行每日成像。在室温下10分钟内完成, 并将培养物返回到孵化器。对于短间隔的时间推移成像, 保持文化在一个文化室, 维持环境的湿润95% 空气和 5% CO2在37摄氏度。
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Representative Results
本文的实验目的是揭示 TC 轴突分支与突触形成之间的关系。为了同时可视化突触前的轴突轨迹和位置, 脊髓 cocultures 中的单个或几个丘脑细胞被转染为 SYP EGFP 和 DsRed 使用电穿孔的两种质粒。在文化的第二周中, DsRed (图 3) 清楚地标记了单独区分的 TC 轴突。只有显示 DsRed 和 SYP-EGFP 的轴突被选择观察。标记 TC 轴突侵入皮层切片和形成分支主要在上层, 表明丘脑轴突在脊髓 cocultures 形成分支与层流特异性类似, 发现在体内7, 8,10,14,15,16,17。同时, 可以沿 puncta 标记的 TC 轴突 (图 3DsRed) 观察 SYP-EGFP (SYP-EGFP D-3F) 的点状聚合。由于这些 SYP-EGFP puncta 主要 colocalized 阳性 VGLUT2 信号, 这是丘脑细胞的突触前标记, 而 PSD95, 这是一个一般的突触后标记, 它很可能是 SYP EGFP puncta 主要代表突触前TC 轴突上的站点12。
TC 轴突的时间推移成像进一步表明, 丘脑神经元的轴突分支和突触形成是连续的, 动态的, 加上和消除 (图 4)12。此外, 大多数分支被发现从 SYP-EGFP puncta 出现, 表明突触前站点触发分支形成 (有关详细信息, 请参见12)。
图 1.丘脑和大脑皮层脊髓 cocultures 的制备方法.(A) 新生鼠脑的顶部视图。第一个切口平行于中线 (1)。然后, 从初级视觉和体感皮层 (2) 中切割出 300-500 微米厚的冠状节。最后, 做一个旁切割获得皮质切片 (3)。(B) 丘脑和大脑皮层脊髓共培养的图示。从出生日起2大鼠和丘脑块的皮质切片从胚胎日15共培养在膜过滤器上。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.电穿孔电气仪器示意图。刺激器、隔离器和电极吸管串联在一起。为了提供带负电荷的 DNA, 电极吸管连接到隔离器的负端。电穿孔的电流可以用示波器监控。丘脑。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3.丘脑-皮质轴突在一个共培养后2周的文化。(A-F)共表达 SYP-EGFP 与 DsRed 在丘脑-皮质 (TC) 轴突。DsRed 加 SYP EGFP 质粒在1天体外(DIV) 中采用电穿孔方法引入培养的丘脑细胞。(A) 12 DIV 后丘脑和皮质切片的脊髓共培养. (B ) 一个 DsRed 标记的丘脑细胞将轴突延伸到皮质切片, 并在上层形成分支。(C) (A)中盒装区域的放大图像。(-d)在(C)的盒装区域中显示 DsRed 标记的 TC 轴突的(d)和 SYP-EGFP puncta (E) 。在单个 TC 轴突上观察到 SYP-EGFP 的离散积累。丘脑。缩放条: (B) 1 毫米、 (C) 100 µm 和(F) 20 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 4.在脊髓共培养中表达 SYP-EGFP 和 DsRed 的丘脑-皮质轴突的时间推移成像。采用电穿孔法将 DsRed 加 SYP EGFP 质粒引入 1 DIV 培养的丘脑细胞。这个轴突被映像每日超过4天 (11 div 到 14 div)。刻度条:50 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
目前的协议也是一个强大的工具来研究发展方面的增长轴突以外的 TC 投影11。例如, 皮质切片培养和电穿孔技术的结合使皮层神经元的单个轴突形态学可视化, 长期观察9,18。
利用目前的协议, 在轴突分支和突触形成中, 有趣基因的作用也可以通过荧光蛋白的共表达和兴趣基因来分析。通常, 当质粒溶液的摩尔比率调整为 1:218、19时, 90% 以上的荧光蛋白表达细胞与第二种质粒共转染。然而, 随着共转染效果和表达水平在载体上的变化, 最佳比值可能不同。
虽然目前的协议对于时间推移实验是有效的, 但也存在一些技术问题。对于每日成像, 共培养被放置在一个微观的阶段每天。虽然轴突发育似乎没有受到严重影响的每日成像10, 每一个观察应该完成10分钟内, 以尽量减少蒸发的文化溶液和 pH 变化的培养基。或者, 最好在微观阶段12保持温度、湿度和 pH 值。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们还感谢加布里埃尔的手进行批判性阅读。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Hanks’ balanced salt solution (HBSS) | Nissui | 5905 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30396-03 | Hyclone |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
| Sodium selenite | Wako Pure Chemical Industries |
192-10843 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries |
16806-25 | |
| 35 mm petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Millicell-CM insert | Millipore | PICMORG50 | |
| 100 mm petri dishes | BIO-BIK | I-90-20 | petri dish sterrile |
| HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K210006 | |
| Disposable sterile plastic pipettes | 202-IS | transfer pipets sterile | |
| Glass capillary: OD 1.2 mm | Narishige | G-1.2 | inner diameter, 1.2 mm |
| Silver wire: 0.2 and 1 mm | Nilaco | AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm) | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| Stimulator | A.M.P.I | Master 8 | |
| Biphasic isolator | BAK ELECTRONICS | BSI-2 | |
| Amplifier | A-M Systems | Model 1800 | |
| Oscilloscope | Hitachi | VC-6723 | |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Micromanipulator | Narishige | MO-10 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ40 | |
| Universal stand | Olympus | SZ-STU2 | |
| Light illumination system | Olympus | LG-PS2, LG-DI, HLL301 | |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Digital eclipse C1 laser | |
| x20 objective | Nikon | ELWD 20x/0.45 | |
| Culture chamber | Tokai Hit | UK A16-U | |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Japan SLC and Nihon-Dobutsu | ||
| Microsurgery scissors | Natsume | MB-54-1 |
References
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