Summary
Questo protocollo descrive un metodo per l'acquisizione simultanea delle thalamocortical assone ramificazione e sinapsi formazione in organotipiche cocultures del talamo e corteccia cerebrale. Thalamocortical singoli assoni e loro terminali presinaptici sono visualizzati mediante una tecnica di elettroporazione di singola cellula con DsRed e lo synaptophysin GFP-etichettato.
Abstract
Formazione di ramificazione e sinapsi dell'assone sono processi cruciali per stabilire precisi circuiti neuronali. Durante lo sviluppo, gli assoni sensoriali thalamocortical (TC) formano rami e sinapsi in livelli specifici della corteccia cerebrale. Nonostante l'evidente correlazione spaziale tra formazione di ramificazione e sinapsi dell'assone, la relazione causale tra di loro è capita male. Per risolvere questo problema, abbiamo recentemente sviluppato un metodo per l'acquisizione simultanea delle formazione ramificazione e sinapsi dei singoli assoni di TC in cocultures organotipiche.
Questo protocollo descrive un metodo che consiste di una combinazione di un coculture organotipiche e l'elettroporazione. Organotipiche cocultures del talamo e corteccia cerebrale facilitare la manipolazione del gene e l'osservazione dei processi di axonal, preservando le strutture caratteristiche come configurazione laminare. Due plasmidi distinti codifica DsRed e lo synaptophysin EGFP-etichetta (SYP-EGFP) sono state co-trasfettate in un piccolo numero di neuroni talamici da una tecnica di elettroporazione. Questo metodo ci ha permesso di visualizzare singole axonal morfologie dei neuroni di TC e loro siti presinaptici simultaneamente. Il metodo attivato anche l'osservazione a lungo termine che ha rivelato il rapporto causale fra formazione di ramificazione e sinapsi dell'assone.
Introduction
La proiezione di thalamocortical (TC) nel cervello dei mammiferi è un sistema adatto per studiare assone di orientamento e di meccanismi di targeting. Durante lo sviluppo, assoni sensoriali TC crescono nella placca corticale e rami di forma e sinapsi preferenzialmente in strato IV delle aree sensoriali primarie in corteccia cerebrale1,2. Anche dopo l'istituzione di collegamenti fondamentali, pergolati assonale e terminali sinaptici sono state rimodernate a seconda dei cambiamenti ambientali3,4. Tuttavia, come la morfologia dell'assone TC dinamicamente è alterata è capita male. Uno dei motivi principali è la mancanza di un'adeguata tecnica di osservare i cambiamenti strutturali a livello di singola cellula. Anche se recenti sviluppi nella microscopia, come il microscopio a due fotoni, hanno permesso l'osservazione diretta dei neuroni corticali vivente in vivo, non ci sono limitazioni ancora tecniche per catturare il generale TC traiettorie5, 6. Pertanto, metodi in vitro per l'imaging dal vivo degli assoni TC sarebbero forniscono potenti strumenti per le analisi strutturali della formazione di ramificazione e sinapsi dell'assone.
Il nostro gruppo per la prima volta stabilito un metodo di coltura slice statico con membrana permeabile7. Utilizzando questo metodo, una fetta di corticali del ratto è stato cocultured con un blocco sensoriale talamico e connessioni TC della lamina specifiche erano ricapitolate in questo organotipiche cocultures7,8. Etichettatura di tipo sparse con una proteina fluorescente ulteriormente ci ha permesso di osservare la crescita assonale TC e ramo formazione9,10,11. Recentemente, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per la rappresentazione simultanea di ramificazione e formazione di sinapsi di singoli assoni di TC nell'organotipiche cocultures12. Per visualizzare contemporaneamente TC assoni e siti presinaptici, DsRed e lo synaptophysin EGFP-etichetta (SYP-EGFP) erano co-trasfettate in un piccolo numero di neuroni talamici mediante elettroporazione del coculture organotipiche. Il metodo corrente facilita l'analisi morfologica degli assoni di TC e permette per l'osservazione a lungo termine, che può essere utilizzato per mostrare la relazione causale tra formazione di ramificazione e sinapsi dell'assone.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo le linee guida stabilite dalle commissioni sul benessere degli animali dell'Università di Osaka e il Giappone Neuroscience Society.
1. organotipiche cocultures del talamo e corteccia cerebrale
Nota: Per la procedura dettagliata, vedere l'originale pubblicazioni7,8,13. Tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili. Ratti Sprague-Dawley (deviazione standard) sono utilizzati per colture neuronali.
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Preparazione dei reagenti
Nota: Volumi dei seguenti reagenti sono per il cervello di un ratto.- Preparare 10 x modificate N2 supplemento 13: insulina (50 μg/mL), progesterone (200 nM), idrocortisone (200 nM), selenito di sodio (300 nM), transferrina (1 mg/mL), putrescina (1 mM), glucosio (60 mg/mL)
- Terreno di coltura contenente siero preparare (10 mL): 85% DMEM/F12, supplemento del 10% x 10 per volta N2, 5% siero bovino fetale (FBS)
- Mezzo di coltura privo di siero preparare (20 mL): 90% DMEM/F12, supplemento del 10% x 10 per volta N2
- Preparare soluzione collagene coda di ratto (0,5 mL). In breve, prendere fibre tender da una coda di topo in condizioni sterili e incubare in soluzione di acido acetico durante la notte. Dopo la centrifugazione, raccogliere il surnatante (pochi mg/mL) e conservare in un frigorifero13.
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Preparazione di piatti di cultura
- Collocare un inserto di membrana in una capsula di Petri da 35 mm.
- Aggiungere 40-50 μL di soluzione di collagene di ratto coda alla membrana e diffondere la soluzione di collagene intorno al centro.
- La membrana completamente in un banco pulito asciugare all'aria.
- Mettere 1,5-2 mL di terreno di coltura contenente siero nel piatto, in modo che la membrana è impregnata con il mezzo.
- Posizionare la piastra di coltura in un incubatore (37 ° C, aria umidificata 95% e 5% CO2) prima di placcatura.
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Preparazione di fette corticali
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con etanolo al 70% per 10 minuti o più.
- Sezionare l'intero cervello rapidamente da un giorno postnatale (P) 2 ratto sotto anestesia ghiacciata (immerso in cubetti di ghiaccio per pochi minuti).
- Posto il cervello in un 100mm di Petri contenente 100 mL di freddo Hanks soluzione salina equilibrata.
- Rimuovere la materia di pia dal cervello con una pinzetta e tagliare fette corticali (300-400 μm di spessore) dalla corteccia visiva e somatosensoriale con microsurgical forbici (per dettagli, vedere la Figura 1).
Nota: Lo spessore delle fette corticali è circa dalla scala di griglie sotto un microscopio binoculare.
Nota: In alternativa, fette corticali possono essere fatta con una vibratome in condizioni sterili. - Trasferire alcune fette corticali sul modulo di membrana con una pipetta di plastica monouso.
- Regolare le posizioni delle fette vicino al centro dell'inserto cultura con una pipetta di Pasteur lucidati a fuoco (per dettagli, Vedi8,13) e rimuovere l'eccesso del prodotto dall'inserto.
Nota: Regolare il livello del mezzo leggermente sotto la superficie delle fette di modo che le fette possano ricevere un approvvigionamento sufficiente di gas sia medio. Questo è fondamentale per la vitalità cellulare. - Mantenere le fette nel terreno di coltura contenente siero a 37 ° C in un ambiente di umidificata 95% aria e 5% CO2e cultura da solo per un giorno prima di un blocco thalamic è preso e messo accanto ad essa.
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Preparazione di blocchi thalamic
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con etanolo al 70% per 10 minuti o più.
- Anestetizzare un ratto incinto (giorno 15) tramite l'iniezione intraperitoneale di pentobarbital (50 mg/kg) contenenti anestetico.
- Sezionare ogni embrione da corni uterini e inserire gli embrioni in un 100mm di Petri contenente 100 mL di soluzione salina bilanciata di freddo Hanks'.
- Sotto un microscopio binoculare, rimuovere il cervello da ogni embrione e tagliare i blocchi thalamic che contengono prevalentemente il nucleo genicolato laterale e complesso (circa 0,5 mm x 3) ventrobasale7 utilizzando forbici microsurgical (Vedi Figura 1).
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Cultura e mantenere organotipiche cocultures
- Utilizzando una pipetta Pasteur, posizionare il blocco thalamic accanto la superficie ventricolare della fetta corticale che è stato messo sulla membrana filtrante.
- Mantenere i cocultures nel terreno di coltura contenente siero a 37 ° C in un ambiente di aria umidificata 95% e 5% CO2.
- Cambio di metà del mezzo con il mezzo di coltura privo di siero dopo due giorni di cultura. Da allora in poi, scambiare il mezzo ogni 2-3 giorni.
Nota: Il livello del mezzo dovrebbe essere controllato dopo il cambio medio, quanto è importante per la sopravvivenza delle cellule.
2. elettroporazione
Tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili.
Nota: Eseguire l'elettroporazione un giorno dopo la preparazione dei blocchi thalamic per evitare il distacco dei blocchi.
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Plasmidi
- Fare una miscela di plasmidi come segue: pCAGGS-DsRed 2 μg/μL; pCAG-SYP-EGFP 3.5 μg/μL.
Nota: Purificare entrambi plasmidi utilizzando un kit di Maxiprep privo di endotossina e sciogliere in soluzione salina bilanciata di Hanks'.
- Fare una miscela di plasmidi come segue: pCAGGS-DsRed 2 μg/μL; pCAG-SYP-EGFP 3.5 μg/μL.
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Installazione di apparecchiature di elettroporazione
Gli strumenti elettrici come uno stimolatore e un isolatore devono essere collegati come mostrato nella Figura 2.- Collegare lo stimolatore del sezionatore bifase.
- Collegare un elettrodo (un diametro di 0,2 mm di filo d'argento) al terminale negativo dell'isolatore.
- Collegare un elettrodo (un diametro di 1 mm di filo d'argento) in serie ad un resistore da 100 Ω e il terminale positivo dell'isolatore.
- Collegare l'amplificatore all'oscilloscopio per monitorare se correnti elettriche vengono passate attraverso il resistore misurando la tensione con l'amplificatore.
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Preparazione delle pipette in vetro
Nota: Due tipi di pipette in vetro vengono utilizzati per espulsione della soluzione plasmide e l'applicazione di impulsi elettrici.- Rendere le pipette da capillari di vetro con un estrattore di elettrodo.
- Rompere la punta per la pipetta di espulsione (il diametro della punta dovrebbe essere 20-50 μm).
- Levigare e lucidare la punta della pipetta elettrodo con carta vetrata seguita da fuoco-lucidatura (diametro interno dovrebbe essere 50-200 μm).
Nota: La punta dell'elettrodo deve essere piana e liscia, come tocca direttamente il tessuto.
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Procedura di elettroporazione
- Collegare le pipette di espulsione e l'elettrodo per i manipolatori.
- Inserire un filo d'argento (0,2 mm di diametro) nella pipetta elettrodo.
- Allegare la pipetta di espulsione per una siringa da 1 mL con un tubo di plastica.
- Prendere > 5 μL di soluzione di plasmide nella pipetta espulsione di aspirazione di siringa.
- Mettere il coculture sul palco di elettroporazione e inserire l'elettrodo di diametro 1 mm nel terreno di coltura.
- Luogo della pipetta di espulsione il explant thalamic.
- Spingere manualmente la siringa dopo la punta tocca la superficie del blocco thalamic.
Nota: Circa 0,5 μL del plasmide soluzione è usato solitamente per un blocco thalamic. - Inserire la pipetta elettrodo sul blocco thalamic subito dopo retrazione della pipetta espulsione.
- Fornire impulsi elettrici (50-400 μA, treni di 3-5 di 200 impulsi quadrati di durata di 1 ms a 200 Hz). Monitorare l'ampiezza e il numero dei treni sull'oscilloscopio.
Nota: L'ampiezza delle correnti elettriche dipende dal diametro interno di un elettrodo pipetta13. - Ritrarre la pipetta di elettrodo e riporre la piastra nell'incubatore.
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Osservazione al microscopio
- Mettere la piastra di coltura su un palco al microscopio di un microscopio confocale verticale dotato di due set di filtri per EGFP (eccitazione, 488 nm; emissione, 515 nm) e DsRed (eccitazione, 514 nm; emissione, 565 nm).
- Prendere le immagini di 10-25 sezioni ottiche dimensioni µm-passo 1-7 con un 20 X lungo-lavoro distanza lente dell'obiettivo. Selezionare singolarmente distinguibili con etichettati assoni che esprimono sia DsRed e SYP-EGFP.
Nota: L'area osservata è di circa 0,7 x 0,7 mm (corrispondente a 1024 x 1024 pixel, cioè, 0.68 μm/pixel). - Catturare immagini ogni 24 h per l'imaging quotidiana. Completare entro 10 min a temperatura ambiente e restituire le culture nell'incubatore. Imaging di decadenza breve intervallo di tempo, per mantenere la cultura in un alloggiamento della coltura, che mantiene che l'ambiente di umidificata 95% aria e 5% CO2 a 37 ° C.
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Representative Results
L'esperimento qui descritto mira a rivelare la relazione tra formazione di ramificazione e sinapsi dell'assone TC. Per visualizzare contemporaneamente axonal traiettorie e posizioni dei siti presinaptici, singoli o poche cellule thalamic in cocultures organotipiche transfected con due plasmidi codifica SYP-EGFP e DsRed usando l'elettroporazione. Durante la seconda settimana di cultura, gli assoni TC individualmente distinguibili erano chiaramente etichettati da DsRed (Figura 3). Solo gli assoni che hanno esibito DsRed e SYP-EGFP sono stati selezionati per l'osservazione. Con etichetta TC assoni invase la fetta corticale e formata rami principalmente negli strati superiori, che indica che thalamic assoni nell'organotipiche cocultures rami forma con specificità laminare che assomiglia che trovano in vivo7, 8,10,14,15,16,17. Allo stesso tempo, potrebbero essere osservate punctate aggregazioni di SYP-EGFP (SYP-EGFP puncta) lungo gli assoni DsRed-identificati TC (Figura 3D-3F). Poiché questi puncta SYP-EGFP erano perlopiù colocalized con segnali immunopositive per VGLUT2, che è un indicatore presinaptico delle cellule thalamic, e per PSD95, che è un marker postsinaptici generale, è probabile che SYP-EGFP puncta rappresentano principalmente presinaptici siti su TC assoni12.
Time-lapse imaging degli assoni di TC più ulteriormente ha mostrato quella ramificazione dell'assone e formazione di sinapsi dei neuroni talamici erano continuo e dinamico con aggiunta e l'eliminazione (Figura 4)12. Inoltre, la maggior parte delle filiali sono stati trovati ad per emergere da SYP-EGFP puncta, indicando che siti presinaptici innescano la formazione di ramo (per dettagli, Vedi12).
Figura 1 . La procedura per la preparazione di un cocultures organotipiche del talamo e corteccia cerebrale. (A) vista dall'alto di un cervello neonatale del ratto. Il primo taglio è fatto in parallelo alla linea mediana (1). Quindi, 300 - 500-μm di spessore sezioni coronali sono tagliati dalla corteccia visiva e somatosensoriale primaria (2). Infine, fare un parasagittal tagliare per ottenere fette corticali (3). (B), una rappresentazione schematica di un coculture organotipiche del talamo e corteccia cerebrale. Fette corticali da ratto postnatale giorno 2 e thalamic isolati dal 15 giorno embrionale sono cocultured sulla membrana filtrante. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Un diagramma schematico di strumenti elettrici per elettroporazione. Lo stimolatore, l'isolatore e la pipetta di elettrodo sono collegati in serie. Per trasportare DNA caricato negativamente, la pipetta di elettrodo è collegata al terminale negativo dell'isolatore. Le correnti elettriche per elettroporazione possono essere monitorate con l'oscilloscopio. TH: talamo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Thalamocortical assoni in un coculture dopo 2 settimane nella cultura. (A–F) Coexpression di SYP-EGFP con DsRed in un assone thalamocortical (TC). DsRed plus SYP-EGFP plasmidi sono stati introdotti nelle cellule coltivate thalamic al 1 giorno in vitro (DIV) usando l'elettroporazione. (A) un organotipiche coculture delle fette thalamic e corticale dopo 12 DIV. (B) A DsRed-labeled thalamic cella si estende un assone nella corticale slice e forma rami negli strati superiori. (C) un'immagine ingrandita della regione boxed in (A). (D-F) mostrano il TC DsRed-labeled assone (D) e SYP-EGFP puncta (E) nella regione "in box" di (C). Lungo un singolo assone di TC è stato osservato accumulo discreto di SYP-EGFP. TH: talamo. Scala bar: (B) 1 mm, (C) 100 µm e (F) 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Time-lapse imaging di un assone thalamocortical esprimendo SYP-EGFP e DsRed in un coculture organotipiche. DsRed plus plasmidi SYP-EGFP sono stati introdotti nelle cellule coltivate thalamic alle 1 DIV usando l'elettroporazione. Questo assone era imaged ogni giorno per 4 giorni (11 DIV DIV 14). Barra della scala: 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo attuale è anche un potente strumento per studiare aspetti inerenti allo sviluppo della crescita assoni diversi da quelli dei TC proiezione11. Per esempio, una combinazione di cultura corticale fetta e la tecnica di elettroporazione consente di visualizzare singola axonal morfologia dei neuroni corticali e a lungo termine osservazione9,18.
Utilizzando il protocollo attuale, i ruoli dei geni interessanti nella formazione di ramificazione e sinapsi dell'assone possono essere analizzati anche da co-espressione di proteine fluorescenti e i geni di interesse. In genere, oltre il 90% delle cellule che esprimono proteine fluorescenti sono co-trasfettate con un plasmide secondo quando il rapporto molare delle soluzioni plasmide è regolato a 1:218,19. Tuttavia, il rapporto ottimale può essere diverso efficacia co-transfezione e livello di espressione sono molteplici tra vettori.
Sebbene il protocollo attuale è efficiente per esperimenti di time-lapse, ci sono alcuni problemi tecnici. Per formazione immagine quotidiana, un coculture è stato disposto su una fase microscopica ogni giorno. Anche se sviluppo axonal non sembrano risentirne seriamente di imaging giornaliero10, ogni osservazione deve essere completata entro 10 min per minimizzare evaporazione della soluzione di cultura e variazioni di pH nel terreno di coltura. In alternativa, sarebbe meglio mantenere la temperatura, umidità e pH delle culture il microscopico fase12.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo anche Gabriel Hand per lettura critica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Hanks’ balanced salt solution (HBSS) | Nissui | 5905 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30396-03 | Hyclone |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
| Sodium selenite | Wako Pure Chemical Industries |
192-10843 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries |
16806-25 | |
| 35 mm petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Millicell-CM insert | Millipore | PICMORG50 | |
| 100 mm petri dishes | BIO-BIK | I-90-20 | petri dish sterrile |
| HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K210006 | |
| Disposable sterile plastic pipettes | 202-IS | transfer pipets sterile | |
| Glass capillary: OD 1.2 mm | Narishige | G-1.2 | inner diameter, 1.2 mm |
| Silver wire: 0.2 and 1 mm | Nilaco | AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm) | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| Stimulator | A.M.P.I | Master 8 | |
| Biphasic isolator | BAK ELECTRONICS | BSI-2 | |
| Amplifier | A-M Systems | Model 1800 | |
| Oscilloscope | Hitachi | VC-6723 | |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Micromanipulator | Narishige | MO-10 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ40 | |
| Universal stand | Olympus | SZ-STU2 | |
| Light illumination system | Olympus | LG-PS2, LG-DI, HLL301 | |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Digital eclipse C1 laser | |
| x20 objective | Nikon | ELWD 20x/0.45 | |
| Culture chamber | Tokai Hit | UK A16-U | |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Japan SLC and Nihon-Dobutsu | ||
| Microsurgery scissors | Natsume | MB-54-1 |
References
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