Summary
Denne protokollen beskriver bruker kulturperler Aorta-Gonad-Mesonephros for uttrykket analyser, colony-forming enhetene i kultur og milt og langsiktig rekonstituering for å fastslå effekten av regulatoriske forhold og signalnettverk trasé på blodkreft stilk cellen utvikling. Dette har blitt vist som et effektivt system for å studere blodkreft stem cell biology og funksjon.
Abstract
Begrensning av benytter musen embryo for hematopoiesis studier er ekstra problemer i operasjoner som er intrauterine utvikling av embryoet. Selv om genetiske data fra knockout (KO) mus er overbevisende, er det ikke realistisk å generere KO mus for alle gener etter behov. I tillegg utfører i vivo redning eksperimenter å konsolidere dataene innhentet fra KO mus er ikke praktisk. For å overvinne disse begrensningene, ble Aorta-Gonad-Mesonephros (GF) explant kultur utviklet som et passende system å studere blodkreft stem cell (HSC) utvikling. Spesielt for redning eksperimenter, kan den brukes til å gjenopprette den svekket hematopoiesis i KO mus. Legger til de aktuelle kjemikaliene til medium, svekket signalene kan reaktiveres eller opp-regulert trasé kan bli hemmet. Med bruk av denne metoden, mange eksperimenter kan utføres for å identifisere kritiske regulatorer HSC utvikling, inkludert HSC relaterte genuttrykk på mRNA og protein, koloni formasjon evne og rekonstituering kapasitet. Dette rekke eksperimenter vil være nyttig i å definere de underliggende mekanismene som er avgjørende for HSC utvikling i pattedyr.
Introduction
Blodkreft stamceller (HSCs) er vev-spesifikke voksen stilk celler som har multilineage potensial inkludert erythroid, myelogen, og lymfoide celler, samt muligheten til å selv-fornye. Nyere studier har vist at de tidligste HSCs oppsto fra en spesialisert endothelial befolkning, kjent som hemogenic endotelet (han), gjennom den endothelial blodkreft overgang (EHT) på ventral veggen dorsalis1,2 ,3,4. Når dannet i aorta-gonad-mesonephros (GF) regionen fra embryonale (E) 10.5 til E12.5 i musen embryo, vil HSCs overføre til fosterets leveren for ekspansjon og endelig kolonisere benmargen for å opprettholde voksen hematopoiesis gjennom en persons liv 5 , 6. selv om dette har vært studert i mange år, de underliggende mekanismene HSC fremveksten og utviklingen fortsatt ufullstendig forstått.
I motsetning til i vitro fertilisering og utvikling av sebrafisk embryo gjør intrauterine utvikling av musen embryo studiet av definitive hematopoiesis under embryogenesis mye mer upraktisk. Selv om genetiske eksperimenter med knockout (KO) mus benyttes ofte, begrenser mangel på visse KO mus også bruken i feltet blodkreft forskning. I tillegg utføres i vivo redning eksperimenter enkelt ikke i KO mus. Siden 1996, har AGM explant kulturen blitt utviklet for blodkreft studier av pionerene i feltet7. Med hjelp av denne kultur-systemet, har ventral vev av generalforsamlingen regionen blitt identifisert for å fremme HSC aktivitet, mens dorsal vev utøve en motsatt effekt8,9. Generalforsamlingen explant kultur-systemet er også brukt for å avgjøre rollene til Serotonin, Mpl, SCF, BMP og pinnsvin signalering i HSC utvikling10,11,12,13, 14. viktigst, det er også en populær metode som brukes til å redde blodkreft defekter i mutant embryo13,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle prosedyrer inkludert dyr fag er godkjent av etiske gjennomgangen komiteen i Institutt for zoologi, kinesiske Academy of Sciences, Beijing, Kina.
1. materialet forberedelse
- Sterilize til 0,65 µm filtre med ultrafiolette stråler produsert under ultrafiolett rokke lampe på ren benken 4 h og snu filtrene etter 2t merket.
Merk: Når du arbeider med UV lys, bruk passende sjerm. - Sterilisere rustfritt stål maskene med autoklav sterilisatoren ved 121 ° C i 30 minutter.
Merk: En viss høyde av rustfritt stål mesh er nødvendig for å støtte filtrene på luft-flytende grensesnittet og dette kan realiseres med wire på stålnett ( figur 1 A). - Fortynne Fluoxetine til en siste konsentrasjon av 10 µM i M5300 langsiktige kultur medium og blandingen jevnt.
Merk: For en seks-vel plate, 2 mL M5300 langsiktige kultur medium er passende for hver brønn. Hydrocortisone på 10 -6 M kan fortynnes selektivt til medium. - Overføre mediet supplert med Fluoxetine på 10 µM i seks brønnslisser plater eller retter og setter steriliserte rustfritt stål maskene til medium.
- Vask 0,65 µm filtrene med kokende vann to ganger i 3 minutter hver gang i glass celle kultur parabolen for sterilisering. Etter hver vask, sette filtrene i fosfat bufret saltvann (PBS) for 2 minutter og sted våte filtre på rustfritt stål maskene stående i luften-flytende grensesnittet som vist i figur 1 A [skjematisk i center].
Merk: Kokende vann kan genereres med autoklav sterilisatoren å oppnå asepsis og utstyr skal tas ut av autoklav sterilisere i tide å unngå en nedgang i temperaturen.
2. Generalforsamlingen Explant kultur
- forsiktig skiller regionene generalforsamlingen fra embryoer på E10.5 eller E11 med tang.
- Stripen uteruses fra gravid mus med dissecting saksen og skille embryoene fra uteruses.
- Tørke av eggeplomme sac, navlestreng, og innvollene fra selve embryo.
- Nøye fjerne dorsal nerve vev og omkringliggende muskel vev.
- Kuttet av vev med tang på stedet av fremre og bakben lemmer og skille regionen generalforsamlingen fra selve embryo. tall 1 ABC viser skjematisk fremstilling og morfologi av dissekert AGM.
- Explant de dissekert generalforsamlinger separat på filtrene på luft-flytende grensesnitt ( figur 1 A) og kultur i 5% CO 2 på 37 ° C i 2-3 dager.
Merk: Ikke plasser dissekert generalforsamlingen på tråden av stål mesh og kontrollere filtrene er i luften-flytende grensesnittet under kultur. Foruten generalforsamlingen, eggeplomme sac og fosterets leveren kan også kultivert med denne system 7.
3. Uttrykket analyser
- mRNA nivå
- samle helstøpt generalforsamlinger i 1 mL PBS og sentrifuge ved 4 ° C, 310 x g i 6 min.
- Etter fjerner nedbryting, totalt RNA er Hentet fra de innsamlede generalforsamlinger med en monophasic løsning av fenol, ifølge produsenten ' s instruksjoner.
- Total RNA (2 µg) er så omvendt transkribert bruke M-MLV revers transkriptase for å oppnå cDNA som mal. De kvantitative sanntid PCR analyser utføres med SYBR grønne og Gapdh brukes som internkontroll.
- Protein nivå
- samle helstøpt generalforsamlingen som beskrevet ovenfor i trinn 3.1.1.
- Forberede protein fra kulturperler generalforsamlingen med lyseringsbuffer celle (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl og 0,5% NP-40) som inneholder protease hemmer og bruk for vestlige blotting å oppdage hvilket protein som tidligere beskrevet 13.
4. Colony-Forming enheter i analysen kultur (CFU-C)
- etter dyrking i 2-3 dager, samle regionene generalforsamlingen i 1 mL fosfat bufret saltvann (PBS) og sentrifuger ved 4 ° C, 310 x g i 6 minutter og dissociate med 200 µL collagenase (0,1% i PBS) på 37 ° C.
Merk: Tiden som krevs for collagenase generere enkelt celle-suspensjoner er ca 20 min. Risting røret som inneholder generalforsamlingen kan hver 5 minutter akselerere fordøyelsen prosessen. 200 µL 0,1% collagenase brukes for hver generalforsamlingen og 200 µL 10% serum brukes til å stoppe reaksjonen. - Kultur enkelt celle-suspensjoner i M3434 medium i svært lav vedlegg 24-vel plater.
Merk: For å unngå forurensning, Penicillin-Streptomycin løsning kan selektivt legges til medium. M3434 medium er tyktflytende, 1.0 cc sprøyter uten en nål brukes til å blande celler og middels. - Etter 7 - 10 dager dyrking på 37 ° C i 5% CO 2, antall for hver type kolonier inkludert Burst danner unit – erythroid (BFU-E), CFU-granulo-monocytt (CFU-GM) og CFU-granulocytt, røde blodlegemer, macrophage, megakaryocyte (CFU-GEMM) er unikt basert på morfologi og scoret med en invertert mikroskopet ( figur 2 C).
5. I Vivo Transplantasjon analysen
- Colony-forming enheter-milt (CFU-S) analysen
- etter 2 - 3 dager explant dyrking, samle generalforsamlinger og forberede enkelt celle-suspensjon av rugende med 200 µL collagenase (0,1% i PBS) for 20 min.
- Utføre dødelige bestråling (9 Gy av røntgenbilder) 8 - til 10 - uke gamle mannlige C57BL/6 mus 4-5 h før celle injeksjon.
- Inn et restrainer begrense sin virksomhet bestrålt musen.
- Tørke halen med en bomullspinne gjennomsyret 75% alkohol for å fremme vasodilatation i venen.
- Sette inn 0,5 embryo tilsvarende (ee) eller 1 ee enkelt celle-suspensjoner av generalforsamlingen intravenøst i halen åre bestrålt musen med en 1,0 cc syringe.
Merk: Celler er suspendert med PBS 0,5 mL PBS per mottaker er et egnet volum. En nål 25 gauge eller 26 måle størrelse brukes for injeksjon med en 1,0 cc syringe. Ingen luft kan bli introdusert i sprøyten. Trykk injeksjonsstedet med en antiseptisk swab å opphøre blø. - Elleve dager innlegg transplantasjon, samle og fikse spleens av mottakeren mus i Bouin ' s løsning (15 mL 1,22% pikrinsyre mettet vandig løsning, 2 mL 40% metanol og 1 mL eddiksyre) for 1-2 dager og vask med 80% alkohol for en annen 1-2 dager. Telle de synlige koloniene i milten macroscopically og bestemme antall kolonier per ee.
Merk: Bouin ' s bindemiddel, passende slitasjebeskyttelse.
- Langsiktige transplantasjon analysen
- etter 2-3 dager explant dyrking, samle generalforsamlinger og forberede enkelt celle-suspensjon av rugende med 200 µL collagenase (0,1% i PBS) i 20 min.
- Utføre dødelige bestråling (9 Gy av X-ray) 8 - til 10 - uke gamle mannlige C57BL/6 mus 4-5 timer før celle injeksjon.
- Inn et restrainer begrense sin virksomhet bestrålt musen.
- Tørke halen med en bomullspinne gjennomsyret 75% alkohol for å fremme vasodilatation i venen. < lJeg > injisere 0,5 embryoet tilsvarende (ee) eller 1 ee enkelt celle-suspensjoner av generalforsamlingen intravenøst i halen venen en bestrålt mus med en 1,0 cc syringe. Generalforsamlingen er injisert med ett dose av 1 ee per mottaker med 2 × 10 5 benmarg celler (CD45.1 bakgrunn).
Merk: Ingen luft kan bli introdusert i sprøyten. Trykk injeksjonsstedet med en antiseptisk swab å opphøre blø. - Fire måneder etter transplantasjon, samle benmargen av mottakeren, og bruke den for rekonstituering analysen av FACS. Bare mottakerne med ≥ 10% donor-avledet chimerism anses å stille vellykket rekonstituering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En fersk publikasjon rapportert endothelial celle-avledet serotonin fremmer overlevelse av HSCs begrenser pro-apoptotisk veien i generalforsamlingen13. For å bekrefte fremme effekten av serotonin på HSC utvikling, ble Fluoxetine. Som en selektive serotonin re-opptak inhibitor (SSRI), har Fluoxetine vist seg for å hemme serotonin re absorpsjon i perifere vev16,17,18. Bruke generalforsamlingen explant kultur-systemet, effekten av Fluoxetine på HSC utvikling ble undersøkt ved å følge fremgangsmåten presentert ovenfor. Uttrykket analysene viste økt uttrykk for Runx1, som er definert som en avgjørende genet for HSC utvikling19i Fluoxetine-behandlet generalforsamlinger på mRNA og protein, henholdsvis (figur 2A og 2B). Fluoxetine kan også betydelig øke kolonien formasjon evne til HSCs i generalforsamlingen, inkludert BFU-E, CFU-GM og CFU-GEMM (figur 2C og figur 2D). I tillegg viste i vivo transplantasjon resultatene at HSCs i generalforsamlingen behandlet med Fluoxetine kan øke antall milt koloniene i bestrålt voksen mottakere (figur 2E).
Figur 1 . Skjematisk fremstilling av generalforsamlingen struktur og explant kultur systemet.
(A) flytskjema for bruk av generalforsamlingen explant kultur systemto undersøke virkningen av kjemikalier på HSCs utvikling. Kort, generalforsamlinger dissekert fra embryo og kultivert på filtre på luft-flytende grensesnittet med kjemikalier fortynnet i M5300 langsiktige kultur medium. 2 - 3 dager senere, er kultivert generalforsamlinger samles og brukes til å undersøke uttrykk for blodkreft beslektede gener, koloni formasjon evne og repopulation kapasitet. Generalforsamlingen, aorta-gonad-mesonephros; CFU-C, colony-forming enheter i kultur; CFU-S, colony-forming enheter-milten. (B) strukturen i generalforsamlingen vises i diagrammet. En dorsalis; Meg, mesenchyme; G, gonad; M, mesonephros. (C) morfologi av generalforsamlingen. Generalforsamlingen er separert fra caudal halvparten av embryonale kroppen med omkringliggende mesenchymal cellene på E10.5. Skalere barer = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Anvendelse av generalforsamlingen explant kultur-systemet å oppdage effekten av Fluoxetine på HSC utvikling. (A) mRNA nivået av Runx1 i generalforsamlinger behandlet med Fluoxetine på 10 µM ble oppdaget av kvantitative sanntid PCR. Student t -test: **, P < 0,01. Resultatene presenteres som gjennomsnittlig ± SEM. (B) Western blotting analyse ytterligere bekreftet økt uttrykk for Runx1 på protein nivå i generalforsamlinger behandlet med Fluoxetine. (C) representant bildene viser morfologi av BFU-E, CFU-GM og CFU-GEMM. Skala barer = 100 µm. (D) CFU-C analysen viste at Fluoxetine behandling kan øke antall hver type koloni. En embryoet tilsvarende (ee) ble brukt. Student t -test: *, P < 0,05; **, P < 0.01.The resultatene presenteres som mener ± SEM. (E) CFU-S analysen med generalforsamlinger behandlet med Fluoxetine viste at Fluoxetine kan øke antall koloniene i milten bestrålt voksen mottakere. Skalere barer = 1,5 mm. 1 ee ble brukt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er velkjent at eldre HSCs i beinmargen kan gjenbefolke av blodet bestrålt mottakere. I motsetning til disse funksjonelle HSCs er de nye HSCs i generalforsamlingen av musen embryo umodne. Direkte transplantasjon resultatene viste den typen jeg (VE-cad+ CD45- CD41+) og type II (VE-cad+ CD45+) pre-HSCs har ingen rekonstituering evne til20. Dra nytte av generalforsamlingen explant kultur system, de begynnende HSCs i regionen generalforsamlingen kan gjeninnføre mottakerne i transplantasjon analysen4,20. Videre intrauterine utbygging av musen fosteret er i vivo eksperimenter for å redde den svekket hematopoiesis i KO mus upraktisk å utføre. Generalforsamlingen explant kulturen er en alternativ system, som er godt egnet for redning eksperimenter, ved å legge kjemikalier (vekstfaktorer og cytokiner) til middels13,15. I tillegg til generalforsamlingen, kan eggeplomme sac og fosterets leveren også bli kultivert med denne system7.
I begynnelsen av dette eksperimentet er den strenge sterilisering av filtre og rustfritt stål nett ganske viktig å unngå forurensning. Enda viktigere, er det kritiske trinnet i kulturen å gjøre dissekert generalforsamlingen kultivert på filtre på luft-flytende grensesnittet. Mye middels vil føre generalforsamlingen skal kulturperler i væsken og det kan være forfalt, mens for lite medium vil gjøre generalforsamlingen tørr. Under dyrking, opprettholde riktig fuktighet av cellen inkubator er også viktig å unngå fordampning av mediet.
Ytterligere forbedring av dette explant kultur-systemet å virkelig etterligne utviklingen av HSCs i vivo, sammen med siste fremskritt i organoid kultur teknikker21, vil utvide sin søknad i hematopoiesis studier, fra HSC selvtillit fornyelse, flere avstamning differensiering og HSC-nisje samhandling til sykdom modellering og drug discovery.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen motstridende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Suwei Gao for hjelp i figur forberedelse. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation av Kina (81530004, 31425016) og departementet for vitenskap og teknologi i Kina (2016YFA0100500). JL utført eksperimenter og utarbeidet manuskriptet; F.L. endret manuskriptet. Begge forfatterne lest og godkjent siste manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| durapore 0.65 µm filters | Millipore | R5BA63787 | AGM explant culture |
| M5300 long-term culture medium | Stem Cell Technologies | 5300 | AGM explant culture |
| Trizol | Tiangen | 5829 | RNA extration |
| M-MLV reverse transcriptase | Promega | 90694 | reverse transcription |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | quantatitive real-time PCR |
| protease inhibitor | Roche | 55622 | Protein extration |
| collagenase | Sigma | C2674 | digestion of AGM tissues |
| MethoCult GF M3434 medium | Stem Cell Technologies | 3434 | CFU-C assay |
| ultra-low attachment 24-well plates | Costar | 3473 | CFU-C assay |
| C57BL/6 CD45.2 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | CFU-S assay | |
| C57BL/6 CD45.1 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Long-term transplantation | |
| phosphate buffered saline | Life Technologines | 8115284 | AGM Collection |
| Penicillin-Streptomycin solution | HyClone | SV30010 | AGM explant culture |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Long-term transplantation |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Long-term transplantation |
| UV lamp | Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | power: 30W |
| stainless steel mesh | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | aperture diameter: 2.5 mm |
| hydrocortisone | Sigma | H0396 | selectively diluted into M5300 medium |
References
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Boisset, J. C., Robin, C. Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta. Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).
- Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129, 4891-4899 (2002).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86, 897-906 (1996).
- Peeters, M., et al. Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development. Development. 136, 2613-2621 (2009).
- Taoudi, S., Medvinsky, A. Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta. PNAS. 104, 9399-9403 (2007).
- Crisan, M., et al. BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo. Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).
- Durand, C., et al. Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells. PNAS. 104, 20838-20843 (2007).
- Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis. Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).
- Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. 5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival. J Exp Med. 214, 529-545 (2017).
- Souilhol, C., et al. Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells. Nature communications. 7, 10784 (2016).
- Fitch, S. R., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).
- Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes. Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).
- Ortiz, J., Artigas, F. Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine. Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).
- Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine. Life sciences. 15, 471-479 (1974).
- Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter. Nature. 457, 887-891 (2009).
- Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).
- Muthuswamy, S. K. Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead. Development. 144, 963-967 (2017).
