Summary
Dieses Protokoll beschreibt mit kultivierten Aorta-Gonade-Wachstum für Expressionsanalysen, Koloniebildenden Einheiten in die Kultur und die Milz und die langfristige Wiederherstellung um zu bestimmen, die Auswirkungen der regulatorischen Faktoren und Signalwege auf hämatopoetischen Stammzellen Zellentwicklung. Dies wurde als ein wirksames System zur Untersuchung von hämatopoetischen Stammzellen-Biologie und Funktion nachgewiesen.
Abstract
Die Einschränkung bei der Verwendung von Mäuseembryonen für Blutbildung Studien ist die zusätzliche Unannehmlichkeiten bei Operationen, weitgehend aufgrund der intrauterinen Entwicklung des Embryos. Obwohl genetische Daten von Knockout (KO)-Mäusen überzeugend sind, ist es nicht realistisch, KO Mäuse für alle Gene zu erzeugen, wie gebraucht. Darüber hinaus durchführen in Vivo Rettung Experimente zur Konsolidierung der Daten erhalten von KO-Mäusen ist nicht bequem. Um diese Einschränkungen zu überwinden, entwickelte sich die Aorta-Gonade-Wachstum (AGM) Explant Kultur als ein geeignetes System, hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Entwicklung zu studieren. Vor allem für Rettung Experimente es lässt sich die beeinträchtigte Blutbildung in KO-Mäusen zu erholen. Durch das Hinzufügen der entsprechenden Chemikalien in das Medium, die beeinträchtigt Signalisierung kann reaktiviert werden oder Up-regulierten Bahnen gehemmt werden können. Mit dem Einsatz dieser Methode viele Experimente können durchgeführt werden, um die kritischen Regulatoren der HSC Entwicklung identifizieren, einschließlich HSC im Zusammenhang mit gen-Expression auf mRNA und Protein Ebenen, Kolonie Bildung Fähigkeit und Rekonstitution Kapazität. Diese Serie von Experimenten wäre hilfreich bei der Festlegung der zugrunde liegenden Mechanismen für HSC-Entwicklung bei Säugetieren.
Introduction
Hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) sind gewebespezifischen adulten Stammzellen, der besitzen multilineage Potenzial einschließlich erythroiden, myeloische, und lymphatischen Zellen, sowie die Fähigkeit, selbst zu erneuern. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die frühesten HSCs aus einer spezialisierten Endothelzellen Bevölkerung entstand, bekannt als Hemogenic Endothel (HE), durch die endotheliale hämatopoetischen Übergang (EHT) an der ventralen Wand des dorsalen Aorta1,2 ,3,4. Sobald die Aorta-Gonade-Wachstum (AGM) Region von embryonalen (E) 10,5 bis E12.5 in der Maus-Embryo gebildet, HSCs Wandern in der fetalen Leber für die Erweiterung und schließlich besiedeln das Knochenmark zu adulten Hämatopoese im gesamten Leben eines Individuums zu pflegen 5 , 6. obwohl dies seit vielen Jahren erforscht wird, die zugrunde liegenden Mechanismen der HSC-Entstehung und Entwicklung bleiben unvollständig verstanden.
Im Gegensatz zu in-vitro- Befruchtung und Entwicklung des Zebrafisch-Embryonen macht intrauterinen Entwicklung von Mäuseembryonen das Studium der definitiven Hämatopoese in der Embryogenese viel unbequemer. Obwohl genetische Experimente mit Knockout (KO)-Mäusen allgemein verwendet sind, schränkt das Fehlen von bestimmten KO-Mäusen auch ihre Verwendung im Bereich hämatopoetischen Forschung. Darüber hinaus werden in Vivo Rettung Versuche nicht leicht in KO-Mäusen durchgeführt. Seit 1996 wurde die AGM Explant Kultur für hämatopoetische Studien von den Pionieren im Bereich7entwickelt. Mit Hilfe dieses Kultur-Systems identifizierten ventralen Gewebe der AGM-Region HSC Aktivität zu fördern, während dorsalen Gewebe eine entgegengesetzte Wirkung8,9ausüben. Die AGM Explant Kultursystem wurde auch angewendet, um festzustellen, die Rolle von Serotonin, Mpl, SCF, BMP und Igel Signalisierung in HSC Entwicklung10,11,12,13, 14. wichtiger ist, es ist auch eine beliebte Methode, hämatopoetischen Mängel in der mutierten Embryonen13,15zu retten.
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Protocol
alle Verfahren, die unter anderem tierische Themen von der ethischen Review Committee im Institut für Zoologie, chinesische Akademie der Wissenschaften, Peking, China genehmigt worden.
1. Material Vorbereitung
- Sterilisation der 0,65 µm Filter mit UV Strahlen produziert unter dem ultravioletten Strahl der Lampe auf die sauberen Werkbank für 4 h und die Filter nach 2 h-Kennzeichen umdrehen.
Hinweis: Wenn Sie mit UV-Licht arbeiten, entsprechende Verschleißschutz. - Edelstahl-Netze mit dem Autoklav Sterilisator bei 121 ° C für 30 Minuten sterilisieren.
Hinweis: Eine bestimmte Höhe Edelstahlgeflecht ist notwendig, um die Filter an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit zu unterstützen und dadurch realisiert werden, mit dem Draht auf das Stahlgitter ( Abb. 1 A). - Verdünnen Fluoxetin, eine Endkonzentration von 10 µM in langfristige M5300 Kultur Medium und Mischung gleichmäßig.
Hinweis: Für eine sechs-Well-Platte ist 2 mL M5300 langfristige Kulturmedium für jedes gut geeignet. Hydrocortison bei 10 -6 M kann selektiv in das Medium verdünnt werden. - Das Medium ergänzt mit Fluoxetin bei 10 µM in sechs-Well Platten oder Gerichte zu übertragen und setzen die sterilisierten Edelstahl-Gitter in das Medium.
- Waschen die 0,65 µm-Filter mit kochendem Wasser zwei Mal für 3 Minuten jedes Mal in der Kulturschale Glas Zelle für die Sterilisation. Nach jeder Wäsche, setzen die Filter in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) für 2 Minuten und Platz Nässe auf der Edelstahl-Filter stehen an der Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle, Maschen wie in Abbildung 1 A [schematisch dargestellt in der Mitte].
Hinweis: Kochendes Wasser kann erzeugt werden mit dem Autoklav Sterilisator, die Asepsis zu erreichen und Ausrüstung aus Autoklav Sterilisator rechtzeitig getroffen werden, um eine Abnahme der Temperatur zu vermeiden.
2. AGM Explant Kultur
- trennen Sie vorsichtig die AGM-Regionen aus den Embryonen im E10.5 oder E11 mit der Pinzette.
- Streifen die Gebärmutter von schwangeren Mäusen mit der sezierenden Schere und die Embryonen aus der Gebärmutter zu trennen.
- Der Dottersack, der Nabelschnur und Eingeweide aus dem Körper des Embryos abwischen.
- Entfernen Sie vorsichtig die dorsale Nerv Gewebe und die umliegenden Muskelgewebe.
- Cut off das Gewebe mit der Zange auf dem Gelände des vorderen und hinteren Gliedmaßen und die AGM-Region aus dem Embryo Körper zu trennen. Figuren 1 B-C zeigen die schematische Darstellung und Morphologie der seziert AGM.
- Explant sezierten Hauptversammlungen separat auf die Filter im Air-Liquid-Schnittstelle ( Abb. 1 A) und 5 % CO 2 bei 37 ° C für ca. 2-3 Tage.
Hinweis: Nicht legen Sie seziert AGM auf den Draht von der Stahlgitter und sicherstellen Sie, dass die Filter an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit während der Kultur sind. Neben der Jahreshauptversammlung, Dottersack und fetalen Leber können auch gezüchtet werden mit diesem System 7.
3. Expressionsanalysen
- mRNA-Ebene
- sammeln die kultivierten Hauptversammlungen in 1 mL PBS und Zentrifugieren bei 4 ° C, 310 X g für 6 min.
- Nach dem Entfernen des Überstands, Gesamt-RNS wird extrahiert aus den gesammelten Hauptversammlungen mit einer monophasischen Lösung aus Phenol, nach Angaben des Herstellers ' Anweisungen s.
- Gesamt-RNS (2 µg) ist dann umgekehrt transkribiert, mit M-MLV Reverse Transkriptase cDNA als Vorlage zu erhalten. Die quantitative Echtzeit-PCR-Assays erfolgen mit SYBR Green und Gapdh dient als interne Kontrolle.
- Protein-Ebene
- der kultivierten AGM zu sammeln, wie oben beschrieben in Schritt 3.1.1.
- Bereiten das Protein von der kultivierten GV mit der Zelle Lysis Puffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl und 0,5 % NP-40) mit Protease-Inhibitor und Einsatz für das westliche Beflecken um die Protein-Ebene erkennen, wie zuvor beschrieben 13.
4. Koloniebildenden Einheiten in der Kultur (KBE-C) Assay
- nach Kultivierung für 2-3 Tage, sammeln die AGM-Regionen in 1 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und Zentrifuge bei 4 ° C, 310 X g für 6 Minuten und mit 200 µL Kollagenase (0,1 % mit PBS-Puffer) bei 37 distanzieren ° C
Hinweis: Der Zeitaufwand für die Kollagenase, einzelne Zellsuspensionen zu generieren ist etwa 20 Minuten. Schütteln das Röhrchen mit AGM können alle 5 Minuten die Verdauung beschleunigen. 200 µL 0.1 % Kollagenase dient jedes AGM und 200 µL 10 % Serum wird verwendet, um die Reaktion zu stoppen. - Kultur einzelne Zellsuspensionen in M3434 Medium in ultra-niedrigen Anlage 24-Well Platten.
Hinweis: Zur Vermeidung von Kontaminationen kann Penicillin-Streptomycin-Lösung gezielt in das Medium hinzugefügt werden. Weil das M3434 Medium zähflüssig ist, eine 1,0 cc Spritze ohne Nadel wird verwendet, um die Zellen und Medium mix. - Nach 7 - 10 Tagen Kultivierung bei 37 ° C in 5 % CO 2, die Zahl für jede Art von Kolonien einschließlich Burst bilden Einheit--erythroiden (BFU-E), KBE-Granulo-Monocyte (CFU-GM) und KBE-Granulozyten, Erythrozyten, Makrophagen, Megakaryocyte (KBE-GEMM) Zeichnen auf die Morphologie und erzielte mit einem inversen Mikroskop ( Abbildung 2 C).
5. In Vivo Transplantation-Assay
- Koloniebildenden Einheiten-Milz (KBE-S) Assay
- nach 2 - 3 Tage der modellabhängigen Kultivierung, sammeln die Hauptversammlungen und bereiten Sie einzelne Zellsuspensionen durch Inkubation mit 200 µL Kollagenase (0,1 % mit PBS-Puffer) für 20 min.
- Führen Sie tödliche Bestrahlung (9 Gy Röntgenstrahlung) von 8 bis 10 - Wochen alten männlichen C57BL/6 Mäusen 4-5h vor der Zelle Injektion.
- Eine einschränkende beschränkt seine Tätigkeit die bestrahlte Maus gesteckt.
- Wischen Sie die Rute mit einem Wattestäbchen in 75 % Alkohol durchdrungen, um Vasodilatation der Vene zu fördern.
- Injizieren 0,5 Embryo entspricht (Ee) oder 1 Ee einzelne Zellsuspensionen von AGM intravenös in die Rute Vene des bestrahlten Maus mit einer 1,0 cc Spritze.
Hinweis: Zellen sind mit PBS suspendiert und 0,5 mL PBS pro Empfänger ist eine angemessene Lautstärke. Eine Nadel von 25 Gauge oder 26 Gauge Größe wird für die Injektion mit einer 1,0 cc Spritze verwendet. Keine Luft kann in die Spritze eingeführt werden. Drücken Sie die Injektionsstelle mit einem antiseptischen Tupfer um Blutungen zu stoppen. - Elf Tage nach Transplantation, sammeln und reparieren die Milz der Empfänger Mäuse in Bouin ' s Lösung (15 mL 1,22 % Pikrinsäure gesättigte wässrige Lösung, 2 mL 40 % Methanol und 1 mL Essigsäure) für 1-2 Tage und waschen mit 80 % Alkohol für weitere 1-2 Tage. Zählen Sie Makroskopisch sichtbaren Kolonien in der Milz und bestimmen Sie die Anzahl der Kolonien pro Ee.
Hinweis: Bouin ' s Fixiermittel, geeignete Verschleißschutz.
- Langfristige Transplantation Assay
- nach 2-3 Tagen explant Kultivierung, die Hauptversammlungen zu sammeln und bereiten Sie einzelne Zellsuspensionen durch Inkubation mit 200 µL Kollagenase (0,1 % mit PBS-Puffer) für 20 min.
- Tödliche Bestrahlung (9 Gy Röntgenstrahlung) von 8 bis 10 - Wochen alten männlichen C57BL/6 Mäusen 4-5 Std. vor der Zelle Injektion durchführen.
- Eine einschränkende beschränkt seine Tätigkeit die bestrahlte Maus gesteckt.
- Wischen Sie die Rute mit einem Wattestäbchen in 75 % Alkohol durchdrungen, um Vasodilatation der Vene zu fördern. < lich > injizieren entspricht 0,5 Embryo (Ee) oder 1 Ee single Zellsuspensionen von AGM intravenös in die Rute Vene einer bestrahlten Maus mit einer 1,0 cc Spritze. Hauptversammlung werden bei einer Dosis von 1 Ee pro Empfänger mit 2 × 10 5 Knochenmarkzellen (CD45.1 Hintergrund) injiziert.
Hinweis: Es kann keine Luft in die Spritze eingeführt werden. Drücken Sie die Injektionsstelle mit einem antiseptischen Tupfer um Blutungen zu stoppen. - Vier Monate nach Transplantation, das Knochenmark des Empfängers zu sammeln und verwenden Sie es für die Rekonstitution Assay durch FACS. Nur die Empfänger mit ≥ 10 % Spender abgeleitet Chimerism gelten als erfolgreiche Rekonstitution aufweisen.
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Representative Results
Eine kürzlich erschienenen Publikation berichtet, endothelial Zelle abgeleitet Serotonin das Überleben der HSCs fördert durch die Hemmung des Pro-apoptotische Weges in der AGM-13. Um die Förderung Wirkung von Serotonin auf HSC Entwicklung bestätigen, war Fluoxetin enthalten. Als eine selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (SSRI) nachweislich die Fluoxetin hemmen Serotonin-Re-Absorption in peripheren Geweben16,17,18. Mit der Hauptversammlung explant Kultursystem, die Wirkung von Fluoxetin auf HSC-Entwicklung wurde nach dem oben dargestellten Verfahren untersucht. Die Expressionsanalysen zeigten erhöhte Expression von Runx1, bzw. als zentrale gen für HSC Entwicklung19, Fluoxetin behandelt Hauptversammlungen mRNA und Protein Ebene definiert ist (Abbildung 2A und 2 b). Fluoxetin kann auch erheblich die Kolonie Bildung Fähigkeit der HSCs an der Hauptversammlung, einschließlich der BFU-E, CFU-GM und KBE-GEMM (Abbildung 2C und Abbildung 2D). Darüber hinaus zeigten in Vivo Transplantation Ergebnisse, dass HSCs an der Hauptversammlung mit Fluoxetin behandelt können die Zahl der Milz Kolonien im bestrahlten Erwachsenen Empfänger (Abb. 2E).
Abbildung 1 . Schematische Darstellung des AGM Struktur und Explant culture System.
(A) das Flussdiagramm für die Verwendung von AGM Explant Kultur Systemto untersuchen die Wirkung von Chemikalien auf HSCs Entwicklung. Hauptversammlungen sind kurz, seziert von Embryonen und kultiviert auf Filter an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit mit Chemikalien in M5300 langfristige Kulturmedium verdünnt. 2 - 3 Tage später, die kultivierten Hauptversammlungen gesammelt und verwendet, um den Ausdruck von hämatopoetischen Verwandten Genen, Kolonie Bildung Fähigkeit und Wiederbesiedlung Kapazität zu untersuchen. AGM, Aorta-Gonade-Wachstum; KBE-C, Koloniebildenden Einheiten in der Kultur; KBE-S, Koloniebildenden Einheiten-Milz. ()B) die Struktur der Hauptversammlung wird in diesem Diagramm gezeigt. A, dorsalen Aorta; Mich, Mesenchym; G, Gonade; M, Wachstum. ()C) der Morphologie der AGM. Die AGM ist getrennt von der caudale Hälfte des embryonalen Körpers mit den umliegenden mesenchymalen Zellen am E10.5. Skalieren von Balken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Anwendung der Hauptversammlung explant Kultursystem, die Wirkung von Fluoxetin auf HSC-Entwicklung zu erkennen. (A) die mRNA-Ebene der Runx1 in den Hauptversammlungen bei 10 µM mit Fluoxetin behandelt wurde durch quantitative Real-Time PCR festgestellt. Der Student t -Test: **, P < 0,01. Die Ergebnisse, die SEM (B) Western Blot-Analyse bestätigt, dass die erhöhte Expression von Runx1 auf Proteinebene in den Hauptversammlungen mit Fluoxetin behandelt als Mittelwert ±. (C) die repräsentative Bilder zeigen die Morphologie des BFU-E, CFU-GM und KBE-GEMM. Maßstabsleisten = 100 µm. (D) KBE-C-Test zeigte, dass Fluoxetin Behandlung kann die Anzahl der jeweiligen Kolonie zu erhöhen. Entspricht einem Embryo (Ee) diente. Der Student t -Test: *, P < 0,05; **, P < 0.01.The Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM (E) KBE-S Assay mit Hauptversammlungen mit Fluoxetin zeigte, dass Fluoxetin kann die Zahl der Kolonien in der Milz der bestrahlten Erwachsenen Empfänger behandelt. Skalieren von Balken = 1,5 mm. 1 Ee verwendet wurde. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Es ist bekannt, dass Reife HSCs im Knochenmark können das Blutsystem der bestrahlten Empfänger neu zu besiedeln. Im Gegensatz zu diesen funktionalen HSCs sind die aufstrebenden HSCs an der Hauptversammlung von Mäuseembryonen unreif. Direkte Transplantation Ergebnisse zeigten, dass Typ ich (VE-CAD-+ CD45– CD41+) und Typ II (VE-CAD-+ CD45+) Pre-HSCs besitzen keine Rekonstitution Fähigkeit20. Unter Ausnutzung der AGM Explant Kultursystem, das im Entstehen begriffene HSCs in der AGM-Region kann der Empfänger in die Transplantation Assay4,20wiederherzustellen. Darüber hinaus sind aufgrund der intrauterinen Entwicklung des Mausembryos, in Vivo Experimente, die beeinträchtigte Blutbildung in KO-Mäusen zu retten ungünstig zu führen. Die AGM Explant Kultur ist ein alternatives System, ist gut geeignet für Rettung Experimente, indem einfach die Chemikalien (Wachstumsfaktoren und Zytokine) in die mittlere13,-15. Neben der Hauptversammlung können den Dottersack und der fetalen Leber auch mit diesem System7kultiviert werden.
Zu Beginn des Experiments ist die strenge Sterilisation von Filter und Edelstahl Gitter sehr wichtig zur Vermeidung von Kontaminationen. Noch wichtiger ist, ist der entscheidende Schritt in der Kultur zu seziert AGM kultiviert auf den Filter an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit. Zuviel Medium wird dazu führen, dass der GV in der Flüssigkeit kultiviert werden und es kann zerfallen, während zu wenig Mittel der AGM trocken machen wird. Während der Kultivierung unbedingt die richtige Feuchtigkeit des Inkubators Zelle auch die Verdunstung des Mediums zu verhindern.
Weitere Verbesserung dieser explant Kultursystem um die Entwicklung von HSZ in Vivo, zusammen mit neuen Zuführungen in organoide Kultur Techniken21wirklich zu imitieren, wird erheblich erweitern die Anwendung in der Hämatopoese Studien aus HSC Selbsterneuerung, Multi-Linie Differenzierung und HSC-Nische Interaktion Krankheit Modellierung und Drug Discovery.
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Disclosures
Die Autoren haben keine finanziellen widerstreitenden Interessen.
Acknowledgments
Wir danken Suwei Gao für Hilfe bei der Vorbereitung der Figur. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China (81530004, 31425016) und das Ministerium für Wissenschaft und Technology of China (2016YFA0100500). J.l. die Experimente durchgeführt und das Manuskript verfasst; F.l. bearbeitet das Manuskript. Beide Autoren gelesen und genehmigt das endgültige Manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| durapore 0.65 µm filters | Millipore | R5BA63787 | AGM explant culture |
| M5300 long-term culture medium | Stem Cell Technologies | 5300 | AGM explant culture |
| Trizol | Tiangen | 5829 | RNA extration |
| M-MLV reverse transcriptase | Promega | 90694 | reverse transcription |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | quantatitive real-time PCR |
| protease inhibitor | Roche | 55622 | Protein extration |
| collagenase | Sigma | C2674 | digestion of AGM tissues |
| MethoCult GF M3434 medium | Stem Cell Technologies | 3434 | CFU-C assay |
| ultra-low attachment 24-well plates | Costar | 3473 | CFU-C assay |
| C57BL/6 CD45.2 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | CFU-S assay | |
| C57BL/6 CD45.1 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Long-term transplantation | |
| phosphate buffered saline | Life Technologines | 8115284 | AGM Collection |
| Penicillin-Streptomycin solution | HyClone | SV30010 | AGM explant culture |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Long-term transplantation |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Long-term transplantation |
| UV lamp | Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | power: 30W |
| stainless steel mesh | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | aperture diameter: 2.5 mm |
| hydrocortisone | Sigma | H0396 | selectively diluted into M5300 medium |
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