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Developmental Biology

विकास Hematopoiesis में महाधमनी-gonad-mesonephros Explant कल्चरल सिस्टम का आवेदन

Published: November 3, 2017 doi: 10.3791/56557
Automatic Translation
1,2, 1,2
1State Key Laboratory of Membrane Biology, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, 2University of Chinese Academy of Sciences

Summary

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करता है cultureed महाधमनी-Gonad-Mesonephros अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए, संस्कृति और प्लीहा में कॉलोनी बनाने इकाइयों, और दीर्घकालिक पुनर्गठन विनियामक कारकों और टेम स्टेम पर संकेत रास्ते के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए सेल विकास । यह टेम स्टेम सेल जीवविज्ञान और समारोह के अध्ययन के लिए एक प्रभावी प्रणाली के रूप में प्रदर्शित किया गया है ।

Abstract

hematopoiesis अध्ययन के लिए माउस भ्रूण का उपयोग करने की सीमा आपरेशन में जोड़ा असुविधा है, जो काफी हद तक भ्रूण के अंतर्गर्भाशयी विकास के कारण है । हालांकि नॉकआउट (KO) चूहों से आनुवंशिक डेटा कायल कर रहे हैं, यह सभी जीन के लिए चूहों को जरूरत के रूप में पैदा करने के लिए यथार्थवादी नहीं है । इसके अलावा, से चूहों से प्राप्त डेटा को मजबूत करने के लिए vivo बचाव प्रयोगों में प्रदर्शन सुविधाजनक नहीं है. इन सीमाओं को दूर करने के लिए महाधमनी-Gonad-Mesonephros (एजीएम) explant कल्चर को टेम स्टेम सेल (HSC) विकास का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त प्रणाली के रूप में विकसित किया गया । विशेष रूप से बचाव प्रयोगों के लिए, यह KO चूहों में बिगड़ा hematopoiesis को ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । मध्यम में उपयुक्त रसायनों को जोड़ने के द्वारा, बिगड़ा संकेत सक्रिय किया जा सकता है या अप-विनियमित रास्ते बाधित किया जा सकता है. इस विधि के उपयोग के साथ, कई प्रयोगों HSC विकास के महत्वपूर्ण नियामकों की पहचान करने के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है, mRNA और प्रोटीन के स्तर पर HSC संबंधित जीन अभिव्यक्ति, कॉलोनी गठन की क्षमता, और पुनर्गठन क्षमता सहित. प्रयोगों की यह श्रृंखला स्तनधारियों में HSC विकास के लिए आवश्यक अंतर्निहित तंत्र को परिभाषित करने में सहायक होगी ।

Introduction

टेम स्टेम सेल (HSCs) ऊतक विशिष्ट वयस्क स्टेम सेल कि erythroid, माइलॉयड, और लसीकावत् कोशिकाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से स्वयं को नवीनीकृत करने की क्षमता सहित multilineage क्षमता के अधिकारी हैं । हाल के अध्ययनों से पता चला है कि जल्द से HSCs एक विशेष endothelial जनसंख्या से उठी, hemogenic endothelium के रूप में जाना (वह), endothelial के माध्यम से टेम संक्रमण (EHT) पृष्ठीय ventral के महाधमनी दीवार पर1,2 ,3,4. एक बार महाधमनी में गठित-gonad-mesonephros (एजीएम) भ्रूण से क्षेत्र (ई) १०.५ e 12.5 माउस भ्रूण में, HSCs विस्तार के लिए भ्रूण जिगर में विस्थापित और अंत में अस्थि मज्जा उपनिवेश एक व्यक्ति के जीवन भर में वयस्क hematopoiesis बनाए रखने के लिए होगा 5 , 6. हालांकि यह कई वर्षों के लिए अध्ययन किया गया है, HSC उद्भव और विकास के अंतर्निहित तंत्र को पूरी तरह से समझ में रहते हैं ।

इन विट्रो निषेचन और zebrafish भ्रूण के विकास के विपरीत, माउस भ्रूण के अंतर्गर्भाशयी विकास embryogenesis के दौरान निश्चित hematopoiesis का अध्ययन बहुत अधिक असुविधाजनक बनाता है । हालांकि आनुवंशिक नॉकआउट (KO) चूहों का उपयोग प्रयोग आमतौर पर उपयोग किया जाता है, कुछ को चूहों की कमी भी टेम अनुसंधान क्षेत्र में उनके उपयोग की सीमा । इसके अलावा, vivo में बचाव प्रयोगों आसानी से KO चूहों में प्रदर्शन नहीं कर रहे हैं । १९९६ के बाद से, एजीएम explant संस्कृति क्षेत्र में अग्रणी द्वारा टेम अध्ययन के लिए विकसित किया गया है7। इस संस्कृति प्रणाली की मदद से, एजीएम क्षेत्र के ventral ऊतकों HSC गतिविधि को बढ़ावा देने के लिए पहचान की गई है, जबकि पृष्ठीय ऊतकों एक विपरीत प्रभाव डालती है8,9. एजीएम explant कल्चरल सिस्टम में सेरोटोनिन, Mpl, एससीएफ, बीएमपी, और हेज सिग्नलिंग के रोल्स का निर्धारण करने के लिए भी आवेदन किया गया है HSC development10,11,12,13, 14. महत्वपूर्ण बात, यह भी एक लोकप्रिय के उत्परिवर्ती भ्रूण13,15में टेम दोषों से बचाव के लिए इस्तेमाल किया विधि है ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > पशु विषय सहित सभी प्रक्रियाओं को इंस्टीट्यूट ऑफ जूलॉजी, चाइनीज एकेडमी ऑफ साइंसेज, बीजिंग, चीन में नैतिक समीक्षा समिति ने अनुमोदित कर दिया है ।

< p class = "jove_title" > 1. सामग्री वडा

  1. बंध्याकरण ०.६५ & #181; 4 एच के लिए स्वच्छ पीठ पर पराबैंगनी किरण लैंप के तहत उत्पादित पराबैंगनी किरणों के साथ एम फिल्टर और 2 एच निशान के बाद फिल्टर पर बारी.
    नोट: जब यूवी प्रकाश के साथ काम कर, उचित संरक्षण पहनते हैं ।
  2. 30 मिनट के लिए १२१ & #176; C पर आटोक्लेव नसबंदी के साथ स्टेनलेस स्टील के जाल निष्फल.
    नोट: स्टेनलेस स्टील के जाल की एक निश्चित ऊंचाई के लिए हवा में फिल्टर का समर्थन तरल अंतरफलक की जरूरत है और यह इस्पात मेष पर तार के साथ महसूस किया जा सकता है (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा १ A ).
  3. पतला Fluoxetine को अंतिम एकाग्रता के लिए 10 & #181; मी में M5300 दीर्घकालिक संस्कृति मध्यम और समान रूप से मिश्रण ।
    नोट: एक छह अच्छी तरह से थाली के लिए, 2 मिलीलीटर M5300 दीर्घकालिक संस्कृति मध्यम एक अच्छी तरह के लिए उपयुक्त है । Hydrocortisone पर 10 -6 एम चुनिंदा माध्यम में पतला किया जा सकता है ।
  4. स्थानांतरण मध्यम पूरक Fluoxetine के साथ 10 & #181; मीटर में छह अच्छी तरह से प्लेटें या पकवान और मध्यम में निष्फल स्टेनलेस स्टील जाल डाल दिया ।
  5. वाश को ०.६५ & #181; मी फिल्टर उबलते पानी के साथ 3 मिनट के लिए दो बार ग्लास सेल संस्कृति में नसबंदी के लिए डिश । प्रत्येक धोने के बाद, 2 मिनट के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) में फिल्टर डाल दिया और हवा में दिखाया के रूप में तरल अंतरफलक पर स्टेनलेस स्टील के जाल पर गीला फिल्टर जगह < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा १ एक [योजनाबद्ध केंद्र में].
    नोट: उबलते पानी आटोक्लेव नसबंदी के साथ उत्पन्न किया जा सकता asepsis को प्राप्त करने के लिए और उपकरण एक समय पर फैशन में आटोक्लेव नसबंदी से बाहर ले जाना चाहिए तापमान में कमी से बचने के लिए.
< p class = "jove_title" > 2. एजीएम Explant कल्चर

  1. ध्यान से ई 10.5 या E11 के साथ संदंश में भ्रूण से एजीएम क्षेत्रों अलग ।
    1. गर्भवती चूहों से गर्भाशय को विदारक कैंची से पट्टी बांधकर भ्रूण को गर्भाशयों से अलग कर जाते हैं ।
    2. बंद जर्दी थैली, गर्भनाल, और भ्रूण शरीर से आंत पोंछ ।
    3. ध्यान से पृष्ठीय तंत्रिका ऊतकों और आसपास के मांसपेशियों के ऊतकों को हटा दें ।
    4. पूर्वकाल और हिंद अंगों की साइट पर संदंश के साथ ऊतकों को काट और भ्रूण शरीर से एजीएम क्षेत्र अलग । < सबल वर्ग = "xfig" > आंकड़ें 1 बी सी विदारक आमसभा के योजनाबद्ध निरूपण एवं आकृति विज्ञान दिखाएँ.
  2. Explant हवा में फिल्टर पर अलग से विदारक AGMs तरल इंटरफेस (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा १ A ) तथा कल्चर इन ५% कं २ at ३७ & #176; C फॉर 2-3 days.
    नोट: स्टील मेष के तार पर विच्छेदित एजीएम जगह नहीं है और सुनिश्चित करें कि फिल्टर हवा में संस्कृति के दौरान तरल इंटरफेस कर रहे हैं । एजीएम के अलावा, जर्दी थैली और भ्रूण जिगर भी इस प्रणाली के साथ संस्कृति हो सकता है < सुप वर्ग = "xref" > ७ .
< p class = "jove_title" > 3. अभिव्यक्ति िरा

  1. mRNA level
    1. 1 एमएल पंजाब में कल्चरल AGMs लीजिए और 4 & #176; C, 6 मिनट के लिए ३१० x g.
    2. supernatant को हटाने के बाद, कुल आरएनए phenol के एक monophasic समाधान के साथ एकत्र AGMs से निकाला जाता है, निर्माता के अनुसार & #39; s निर्देश.
    3. कुल आरएनए (2 & #181; g) तो टेम्पलेट के रूप में सीडीएनए प्राप्त करने के लिए एम-MLV रिवर्स transcriptase का उपयोग कर लिखित रिवर्स है. मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर परख SYBR ग्रीन के साथ प्रदर्शन कर रहे है और Gapdh आंतरिक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है ।
  2. प्रोटीन तर
    1. स्टेप 3.1.1 में ऊपर बताए गए कल्चरल एजीएम को लीजिए.
    2. सेल lysis बफर (10 mM Tris-एचसीएल के साथ कल्चरल एजीएम से प्रोटीन तैयार करते हैं, 10 मिमी NaCl, और ०.५% NP-४०) को चिढ़ाने के लिए और पश्चिमी सोख्ता के लिए उपयोग के रूप में पहले से वर्णित के रूप में प्रोटीन स्तर का पता लगाने के लिए प्रयोग करें < सुप वर्ग = "xref" > १३ .
< p class = "jove_title" > 4. कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों में संस्कृति (CFU-सी) परख

  1. के बाद संवर्धन के लिए 2-3 दिन, एजीएम क्षेत्रों को 1 मिलीलीटर फॉस्फेट में लीजिए खारा (पंजाब) और 4 & #176 पर केंद्रापसारक; सी, ३१० एक्स जी के लिए 6 मिनट और २०० के साथ अलग & #181; एल collagenase (पंजाब में ०.१%) में ३७ & #176; ग.
    नोट: collagenase के लिए आवश्यक समय एकल सेल उत्पंन करने के लिए-निलंबन के बारे में 20 मिनट है । हर 5 मिनट में एजीएम युक्त ट्यूब पाचन प्रक्रिया में तेजी लाने के कर सकते हैं । २०० & #181; l ०.१% collagenase प्रत्येक एजीएम और २०० & #181 के लिए प्रयोग किया जाता है; एल 10% सीरम प्रतिक्रिया को रोकने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  2. कल्चर सिंगल सेल-M3434 मीडियम में सस्पेंशन्स अल्ट्रा कम अटैचमेंट में 24-वेल प्लेट्स.
    नोट: दूषण से बचने के लिए, पेनिसिलिन-Streptomycin समाधान चुनिंदा माध्यम में जोड़ा जा सकता है । क्योंकि M3434 मध्यम चिपचिपा है, एक सुई के बिना एक १.० सीसी सिरिंज कोशिकाओं और मध्यम मिश्रण करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  3. के बाद 7-10 दिन संवर्धन पर ३७ & #176; C 5% कं 2 , फट बनाने इकाई सहित कालोनियों के प्रत्येक प्रकार के लिए संख्या--erythroid (BFU-E), CFU-granulo-monocyte (CFU-GM) और CFU-granulocyte, एरिथ्रोसाइट, macrophage, megakaryocyte (CFU-GEMM) आकृति विज्ञान के आधार पर प्रतिष्ठित हैं और एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ बनाए गए हैं (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा २ C ).
< p class = "jove_title" > 5. में Vivo ट्रांसप्लांटेशन परख

  1. कॉलोनी बनाने इकाइयों-तिल्ली (CFU-एस) परख
    1. explant संवर्धन के 2-3 दिनों के बाद, AGMs इकट्ठा और २०० & #181 के साथ मशीन द्वारा एकल सेल-सस्पेंशन तैयार करते हैं; एल collagenase (पंजाब में ०.१%) के लिए 20 min.
    2. सेल इंजेक्शन से पहले घातक विकिरण (एक्स-रे के 9 Gy) 8-करने के लिए 10 सप्ताह पुराने पुरुष C57BL/6 चूहों 4-5 ज प्रदर्शन ।
    3. अपनी गतिविधि को प्रतिबंधित करने के लिए एक निरोधक में विकिरणित माउस डाल दिया.
    4. एक कपास ७५% शराब में डूबी को नस के vasodilatation को बढ़ावा देने के झाड़ू का उपयोग कर पूंछ पोंछ ।
    5. सुई ०.५ भ्रूण समकक्ष (ee) या 1 ee एकल सेल-एजीएम के निलंबन नसों में एक १.० सीसी सिरिंज के साथ विकिरणित माउस की पूंछ नस में.
      नोट: सेल पंजाबियों के साथ निलंबित कर दिया और प्रति प्राप्तकर्ता ०.५ मिलीलीटर पंजाबियों एक उपयुक्त मात्रा है । एक सुई के 25 गेज या 26 गेज आकार एक १.० सीसी सिरिंज के साथ इंजेक्शन के लिए प्रयोग किया जाता है. कोई हवा सिरिंज में पेश किया जा सकता है । रक्तस्राव रोकने के लिए इंजेक्शन साइट को एंटीसेप्टिक झाड़ू से दबाएं ।
    6. ग्यारह दिनों के बाद प्रत्यारोपण, Bouin & #39 में प्राप्तकर्ता चूहों की तिल्ली लीजिए और ठीक करें; s समाधान (15 मिलीलीटर १.२२% Picric एसिड संतृप्त जलीय समाधान, 2 मिलीलीटर ४०% मेथनॉल और 1 मिलीलीटर एसिटिक एसिड) 1-2 दिनों के लिए और एक और 1-2 दिनों के लिए ८०% शराब के साथ धो लें । तिल्ली macroscopically में दिखाई देने वाली कालोनियों की गणना और प्रति ee कालोनियों की संख्या निर्धारित करें ।
      & #8203; नोट: Bouin & #39; s निर्धारण, उपयुक्त संरक्षण पहनें.
  2. लंबी अवधि के प्रत्यारोपण परख
    1. के बाद 2-3 & #160;d ays explant संवर्धन, AGMs जमा करें और एकल सेल-सस्पेंशन तैयार करके २०० & #181; एल collagenase (पंजाब में ०.१%) के लिए 20 min.
      2. के लिए
    2. घातक विकिरण प्रदर्शन (9 Gy एक्स-रे के) 8-करने के लिए 10 सप्ताह पुराने पुरुष C57BL/6 चूहों 4-5 hrs सेल इंजेक्शन से पहले.
    3. अपनी गतिविधि को प्रतिबंधित करने के लिए एक निरोधक में विकिरणित माउस डाल दिया.
    4. एक कपास ७५% शराब में डूबी को नस के vasodilatation को बढ़ावा देने के झाड़ू का उपयोग कर पूंछ पोंछ ।
      5. < li > ०.५ भ्रूण के समतुल्य (ee) या 1 ee एकल सेल-एजीएम के निलंबन नसों में एक विकिरणित माउस की पूंछ नस में एक १.० सीसी सिरिंज के साथ सुई. एजीएम 2 & #215 के साथ प्रति प्राप्तकर्ता 1 ee की एक खुराक पर इंजेक्ट कर रहे हैं; 10 5 अस्थि मज्जा कोशिकाओं (सीडी 45.1 पृष्ठभूमि).
      नोट: कोई हवा सिरिंज में पेश किया जा सकता है । रक्तस्राव रोकने के लिए इंजेक्शन साइट को एंटीसेप्टिक झाड़ू से दबाएं ।
    5. चार महीने के बाद प्रत्यारोपण, प्राप्तकर्ता की अस्थि मज्जा इकट्ठा और FACS द्वारा पुनर्गठन परख के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं । केवल प्राप्तकर्ताओं को & #8805; 10% दाता-व्युत्पंन chimerism को सफल पुनर्गठन का प्रदर्शन माना जाता है ।

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Representative Results

हाल ही में एक प्रकाशन की रिपोर्ट endothelial सेल व्युत्पंन सेरोटोनिन एजीएम13में समर्थक अपोप्तोटिक मार्ग बाधा से HSCs के अस्तित्व को बढ़ावा देता है । HSC विकास पर सेरोटोनिन के बढ़ावा देने के प्रभाव की पुष्टि करने के लिए, Fluoxetine शामिल किया गया था । एक चयनात्मक सेरोटोनिन पुनः ले अवरोधक (SSRI) के रूप में, Fluoxetine परिधीय ऊतकों16,17,18में सेरोटोनिन पुनः अवशोषण को बाधित करने के लिए प्रदर्शन किया गया है. एजीएम explant कल्चरल सिस्टम का उपयोग करते हुए HSC के विकास पर Fluoxetine के प्रभाव को ऊपर प्रस्तुत प्रक्रिया का पालन करते हुए जांचा गया । अभिव्यक्ति विश्लेषण Runx1 की वृद्धि की अभिव्यक्ति दिखाई, जो HSC विकास के लिए एक निर्णायक जीन के रूप में परिभाषित किया गया है19, Fluoxetine में इलाज AGMs में mRNA और प्रोटीन के स्तर पर क्रमशः (चित्रा 2एक और २ बी). Fluoxetine भी काफी BFU-E, CFU-जीएम, और CFU-GEMM (चित्रा 2सी और चित्रा 2डी) सहित एजीएम में HSCs की कॉलोनी गठन की क्षमता में वृद्धि कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, vivo में ट्रांसप्लांटेशन परिणामों से पता चला कि Fluoxetine के साथ इलाज एजीएम में HSCs विकिरणित वयस्क प्राप्तकर्ताओं में तिल्ली कालोनियों की संख्या में वृद्धि कर सकते हैं (चित्रा 2ई).

Figure 1
चित्र 1 . एजीएम संरचना और explant संस्कृति प्रणाली के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । 
(क) एजीएम explant कल्चर का उपयोग करने के लिए फ्लो चार्ट systemto HSCs डेवलपमेंट पर रसायनों के प्रभाव की जांच करता है. संक्षेप में, AGMs भ्रूण और M5300 दीर्घकालिक संस्कृति माध्यम में पतला रसायनों के साथ हवा तरल अंतरफलक पर फिल्टर पर संस्कृति से विच्छेदित कर रहे हैं । 2-3 दिन बाद, प्रसंस्कृत AGMs एकत्र किए जाते हैं और टेम संबंधित जीन, कॉलोनी गठन की क्षमता, और पुनर्जनसंख्या क्षमता की अभिव्यक्ति की जाँच करने के लिए उपयोग किया जाता है. एजीएम, महाधमनी-gonad-mesonephros; CFU-सी, कॉलोनी-संस्कृति में इकाइयों का गठन; CFU-एस, कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां-तिल्ली । (ख) एजीएम की संरचना इस आरेख में दिखाई जाती है. A, पृष्ठीय महाधमनी; मुझे, mesenchyme; छ, gonad; मी, mesonephros. (ग) एजीएम की आकृति विज्ञान । एजीएम ई 10.5 पर आसपास के mesenchymal कोशिकाओं के साथ भ्रूण शरीर के caudal आधा से अलग है । स्केल पट्टियां = 1 मिमी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 . HSC विकास पर Fluoxetine के प्रभाव का पता लगाने के लिए एजीएम explant कल्चरल सिस्टम का आवेदन । (क) 10 µ m पर Fluoxetine के साथ इलाज AGMs में Runx1 का mRNA स्तर मात्रात्मक रीयल-टाइम पीसीआर द्वारा पाया गया. Student ' s t test: * *, P & #60; ०.०१. परिणाम के रूप में प्रस्तुत कर रहे है मतलब ± SEM । (ख) पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण आगे Fluoxetine के साथ इलाज AGMs में प्रोटीन के स्तर पर Runx1 की वृद्धि की अभिव्यक्ति की पुष्टि की । (ग) प्रतिनिधि छवियां BFU-E, CFU-GM और CFU-GEMM की आकृति विज्ञान को दर्शाती हैं । स्केल बार्स = १०० µm. ) (D) CFU-सी की परख से पता चला कि Fluoxetine ट्रीटमेंट से हर प्रकार की कॉलोनियों की संख्या बढ़ सकती है । एक भ्रूण समतुल्य (ee) किया जाता था । Student ' s t test: *, P & #60; ०.०५; * *, प & #60; 0.01. परिणाम के रूप में प्रस्तुत कर रहे है मतलब ± SEM. (ई) CFU-Fluoxetine के साथ इलाज AGMs के साथ एस परख से पता चला कि Fluoxetine विकिरणित वयस्क प्राप्तकर्ताओं की तिल्ली में कालोनियों की संख्या में वृद्धि कर सकते हैं । स्केल पट्टियां = १.५ mm .1 ee का उपयोग किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यह सर्वविदित है कि अस्थि मज्जा में परिपक्व HSCs विकिरणित प्राप्तकर्ताओं के रक्त प्रणाली को फिर से आबाद कर सकते हैं । इन कार्यात्मक HSCs के विपरीत, माउस भ्रूण के एजीएम में उभरते HSCs अपरिपक्व हैं । प्रत्यक्ष ट्रांसप्लांटेशन परिणाम दिखाया है कि मैं प्रकार (ve-सीएडी+ CD45- CD41+) और प्रकार द्वितीय (VE-पाजी+ CD45+) पूर्व HSCs कोई पुनर्गठन की क्षमता20के अधिकारी । एजीएम explant संस्कृति प्रणाली का लाभ उठाते हुए, एजीएम क्षेत्र में नवजात HSCs प्रत्यारोपण परख4,20में प्राप्तकर्ताओं का पुनर्गठन कर सकते हैं । इसके अलावा, माउस भ्रूण के अंतर्गर्भाशयी विकास के कारण, vivo में प्रयोगों को KO चूहों में बिगड़ा hematopoiesis बचाव करने के लिए असुविधाजनक हैं । एजीएम explant संस्कृति एक वैकल्पिक प्रणाली है, जो अच्छी तरह से बचाव के प्रयोगों के लिए अनुकूल है, बस रसायनों को जोड़कर (विकास कारकों और साइटोकिंस) मध्यम13,15में । एजीएम के अलावा, जर्दी थैली और भ्रूण जिगर भी इस प्रणाली को7के साथ संस्कृति हो सकता है ।

इस प्रयोग की शुरुआत में, फिल्टर और स्टेनलेस स्टील के जाल की सख्त नसबंदी के संक्रमण से बचने के लिए काफी महत्वपूर्ण है । इससे भी महत्वपूर्ण बात, संस्कृति में महत्वपूर्ण कदम को विच्छेदित एजीएम एयर तरल अंतरफलक पर फिल्टर पर प्रसंस्कृत बनाने के लिए है । बहुत अधिक माध्यम होगा एजीएम के कारण लिक्विड में कल्चरल हो जाएगा और यह खोखली भी हो सकती है, जबकि बहुत कम मीडियम आमसभा को शुष्क कर देगा. संवर्धन के दौरान, सेल मशीन की उचित नमी को बनाए रखने के लिए भी मध्यम के वाष्पीकरण को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है ।

इस explant संस्कृति प्रणाली के आगे सुधार वास्तव में vivo मेंHSCs के विकास की नकल करने के लिए, एक साथ organoid संस्कृति तकनीक में हाल ही में प्रगति के साथ21, बहुत hematopoiesis अध्ययन में अपने आवेदन का विस्तार होगा, से HSC स्व-नवीकरण, बहु वंश विभेद, और HSC-रोग मॉडलिंग और दवा की खोज के लिए आला संपर्क ।

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Disclosures

लेखकों का कोई परस्पर विरोधी वित्तीय हित नहीं है.

Acknowledgments

हम चित्रा तैयारी में मदद के लिए Suwei गाओ धंयवाद । यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (८१५३०००४, ३१४२५०१६) और चीन के विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (2016YFA0100500) से अनुदान द्वारा समर्थित था । जीएल प्रयोगों प्रदर्शन और पांडुलिपि का मसौदा तैयार किया; F.L. ने पांडुलिपि का सम्पादन किया । दोनों लेखकों ने अंतिम पांडुलिपि पढ़ी और उसे मंजूरी दी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
durapore 0.65 µm filters Millipore R5BA63787 AGM explant culture
M5300 long-term culture medium Stem Cell Technologies 5300 AGM explant culture
Trizol  Tiangen 5829 RNA extration
M-MLV reverse transcriptase Promega 90694 reverse transcription
SYBR Green Qiagen A6002 quantatitive real-time PCR
protease inhibitor Roche 55622 Protein extration
collagenase Sigma C2674 digestion of AGM tissues
MethoCult GF M3434 medium Stem Cell Technologies 3434 CFU-C assay
ultra-low attachment 24-well plates Costar 3473 CFU-C assay
C57BL/6 CD45.2 mice Beijing HFK Bioscience Co. Ltd CFU-S assay
C57BL/6 CD45.1 mice Beijing HFK Bioscience Co. Ltd Long-term transplantation
phosphate buffered saline Life Technologines 8115284 AGM Collection
Penicillin-Streptomycin solution HyClone SV30010 AGM explant culture
anti-CD45.2-PE-CY7 eBioscience 25-0454-80 Long-term transplantation
anti-CD45-FITC eBioscience 11-0451-81 Long-term transplantation
UV lamp Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD 039-14402 power: 30W
stainless steel mesh AS ONE SHANGHAI Corporation 2-9817-10  aperture diameter: 2.5 mm
hydrocortisone Sigma H0396 selectively diluted into M5300 medium

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक १२९ चूहा hematopoiesis महाधमनी-Gonad-Mesonephros explant संस्कृति कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों में संस्कृति कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों-तिल्ली प्रत्यारोपण
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Lv, J., Liu, F. Application of… More

Lv, J., Liu, F. Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis. J. Vis. Exp. (129), e56557, doi:10.3791/56557 (2017).

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