Summary
Questo protocollo descrive l'utilizzo coltivate Aorta-gonade-Mesonephros per analisi di espressione, unità formanti colonia in cultura e milza e ricostituzione a lungo termine per determinare l'effetto di fattori regolatori e vie di segnalazione su staminali ematopoietiche sviluppo delle cellule. Questo è stato dimostrato come un sistema efficace per lo studio della funzione e biologia delle cellule staminali ematopoietiche.
Abstract
La limitazione dell'utilizzo di embrioni di topo per studi di ematopoiesi è l'inconveniente aggiunto nelle operazioni, che è in gran parte dovuto lo sviluppo intrauterino dell'embrione. Anche se sono convincenti dati genetici da topi knockout (KO), non è realistico per generare topi KO per i geni tutti come necessario. Inoltre, esibendosi in vivo gli esperimenti di salvataggio per consolidare i dati ottenuti da topi KO non è conveniente. Per superare queste limitazioni, la cultura di espianto Aorta-gonade-Mesonephros (AGM) è stata sviluppata come un sistema appropriato per studiare lo sviluppo di cellule staminali ematopoietiche (HSC). Soprattutto per gli esperimenti di salvataggio, può essere utilizzato per recuperare l'ematopoiesi alterata in topi KO. Con l'aggiunta di prodotti chimici appropriati nel mezzo, la segnalazione alterata può essere riattivata o vie di up-regolato possono essere inibite. Con l'uso di questo metodo, molti esperimenti possono essere eseguite per identificare i regolatori critici dello sviluppo di HSC, compreso HSC correlati espressione genica a livelli di mRNA e proteina, capacità di formazione di Colonia e la capacità di ricostituzione. Questa serie di esperimenti sarebbe utile nel definire i meccanismi di fondo essenziali per lo sviluppo di HSC nei mammiferi.
Introduction
Cellule staminali ematopoietiche (HSCs) sono cellule staminali adulte tessuto-specifici che possiedono multilineare potenziale compreso degli eritrociti, mieloidi e cellule linfoidi come pure la capacità di auto-rinnovarsi. Recenti studi hanno dimostrato che i primi HSCs è sorto da una popolazione endoteliale specializzata, nota come endotelio hemogenic (HE), attraverso l'endoteliale di transizione ematopoietico (EHT) presso la parete ventrale dell'aorta dorsale1,2 ,3,4. Una volta formato regione aorta-gonade-mesonephros (AGM) da embrionali (E) 10.5 a 12.5 in embrione di topo, HSCs migrare nel fegato fetale per espansione e infine colonizzare il midollo osseo per mantenere l'ematopoiesi adulto per tutta la vita di un individuo 5 , 6. anche se questo è stato studiato per molti anni, i meccanismi di fondo di HSC emersione e sviluppo rimangono in modo incompleto capiti.
A differenza di fecondazione in vitro e sviluppo di embrioni di zebrafish, lo sviluppo intrauterino degli embrioni del mouse rende lo studio dell'emopoiesi definitiva durante l'embriogenesi molto più scomodo. Anche se gli esperimenti genetici, utilizzando topi knockout (KO) sono comunemente utilizzati, la mancanza di alcuni topi KO anche limita il loro uso nel campo della ricerca ematopoietico. Inoltre, in vivo gli esperimenti di salvataggio non sono facilmente eseguiti nei topi KO. Dal 1996, la cultura di espianto AGM è stata sviluppata per gli studi ematopoietici dai pionieri nel campo7. Con l'aiuto di questo sistema di coltura, tessuti ventrale della regione AGM sono stati identificati per promuovere attività HSC, mentre tessuti dorsale esercitano un opposto effetto8,9. Il sistema di coltura explant AGM è stato applicato anche per determinare i ruoli di serotonina, Mpl, SCF, BMP e Hedgehog signaling in HSC sviluppo10,11,12,13, 14. la cosa importante, è anche un metodo popolare usato per salvare ematopoietici difetti in embrioni mutanti13,15.
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Protocol
tutte le procedure tra cui animali soggetti sono state approvate dal comitato etico di recensione all'Istituto di zoologia, Accademia delle scienze cinese, Beijing, China.
1. preparazione dei materiali
- sterilizzare il 0,65 µm filtri con raggi ultravioletti raggi prodotti sotto i raggi ultravioletti ray lampada sul banco pulito per 4 h e capovolgere i filtri dopo il segno di 2 h.
Nota: Quando si lavora con luce UV, indossare una protezione appropriata. - Sterilizzare le maglie in acciaio inox con la sterilizzatrice autoclave a 121 ° C per 30 min.
Nota: Una certa altezza della maglia dell'acciaio inossidabile è necessaria per supportare i filtri all'interfaccia aria-liquido e questo può essere realizzato con il filo sulla mesh in acciaio ( Figura 1 A). - Fluoxetine diluire ad una concentrazione finale di 10 µM nella M5300 a lungo termine cultura medio e mescolare in modo uniforme.
Nota: Per una piastra a 6 pozzetti, terreno di coltura a lungo termine 2 mL M5300 è adatto per ogni pozzetto. Idrocortisone a 10 -6 M può essere diluito in modo selettivo nel medium. - Trasferire supplementato con fluoxetina a 10 µM in piastre da 6 pozzetti o piatti e mettere le maglie in acciaio inossidabile sterilizzato nel medium.
- Lavare i 0,65 µm filtri con acqua bollente due volte per 3 minuti ogni volta nella piastra di coltura di cellule di vetro per la sterilizzazione. Dopo ogni lavaggio, inserire i filtri in tampone fosfato salino (PBS) per 2 minuti e posto sul bagnato filtri in acciaio inox maglie in piedi all'interfaccia aria-liquido come mostrato in Figura 1 A [schematica nel centro della].
Nota: Acqua bollente può essere generato con la sterilizzatrice autoclave per raggiungere l'asepsi e l'apparecchiatura dovrebbe essere presa fuori dell'autoclave in modo tempestivo per evitare una diminuzione della temperatura.
2. AGM Explant Culture
- attentamente separare le regioni AGM da embrioni e 10.5 o E11 con il forcipe.
- Striscia uteri dai topi incinto con le forbici per dissezione e separare gli embrioni dagli uteri.
- Togliere il sacco vitellino, il cordone ombelicale e visceri dal corpo dell'embrione.
- Rimuovere con cautela il nervo dorsale tessuti e tessuti muscolari circostanti.
- Cut off i tessuti con il forcipe presso il sito degli arti anteriori e posteriori e separare la regione AGM dal corpo dell'embrione. figure 1 B-C Visualizza la rappresentazione schematica e la morfologia dell'AGM dissecata.
- Explant le assemblee dissecate separatamente sui filtri all'interfaccia aria-liquido ( Figura 1 A) e cultura 5% CO 2 a 37 ° C per 2-3 giorni.
Nota: Non posizionare il AGM dissecata sul filo della maglia d'acciaio e assicurarsi che i filtri siano all'interfaccia aria-liquido durante la coltura. Oltre l'AGM, sacco vitellino e fegato fetale possono essere coltivate con questo sistema 7.
3. Analisi dell'espressione
- livello di mRNA
- raccogliere le assemblee coltivate in 1 mL di PBS e centrifugare a 4 ° C, 310 x g per 6 min.
- Dopo aver rimosso il supernatante, RNA totale è estratto dalle assemblee raccolte con una soluzione monofasica di fenolo, secondo il produttore ' istruzioni s.
- RNA totale (2 µ g) quindi è inverso trascritto usando il transcriptase di M-MLV per ottenere cDNA come modello. L'analisi di PCR quantitative in tempo reale sono eseguite con SYBR Green e Gapdh viene utilizzato come controllo interno.
- Livello della proteina
- raccogliere l'AGM coltivate come descritto sopra al punto 3.1.1.
- Preparare la proteina da AGM coltivate con il buffer di lisi delle cellule (10 mM Tris-HCl 10 mM NaCl e 0,5% NP-40) contenente l'inibitore della proteasi e uso per macchiarsi occidentale per rilevare il livello della proteina come precedentemente descritto 13.
4. Unità formanti colonie nell'analisi della cultura (CFU-C)
- dopo la coltura per 2-3 giorni, raccogliere le regioni AGM in salino di 1 mL tamponato fosfato (PBS) e centrifugare a 4 ° C, 310 x g per 6 minuti e dissociare con collagenasi 200 µ l (0,1% in PBS) 37 ° C.
Nota: Il tempo necessario per collagenasi generare singole sospensioni di cellule è circa 20 minuti. Agitare il tubo contenente AGM ogni 5 minuti possono accelerare il processo di digestione. Collagenasi di 0,1% 200 µ l viene utilizzato per ogni AGM e 200 µ l di siero di 10% viene utilizzato per interrompere la reazione. - Cultura singole sospensioni di cellule nel mezzo di M3434 in piastre da 24 pozzetti attacco ultra-basso.
Nota: Per evitare contaminazioni, penicillina-streptomicina soluzione possa essere selettivamente aggiunta nel mezzo. Perché il mezzo di M3434 è viscoso, una 1,0 cc una siringa senza ago è usata per mischiare le cellule e le medie. - Dopo 7 - 10 giorni la coltura a 37 ° C in 5% CO 2, il numero per ogni tipo di colonie compreso Burst forming unit--eritroidi (BFU-E), CFU-granulo-monocito (CFU-GM) e CFU-granulociti, eritrociti, macrofagi, megacariocita (CFU-GEMM) si distinguono basata sulla morfologia e ha segnato con un microscopio invertito ( Figura 2 C).
5. In Vivo Dosaggio di trapianto
- formanti colonie (CFU-S) unità-milza dosaggio
- dopo 2 - 3 giorni di coltura explant, raccogliere le assemblee e preparare sospensioni di cellule singole incubando con collagenasi 200 µ l (0,1% in PBS) per 20 min.
- Eseguire irradiazione letale (9 Gy di raggi x) di 8 - ai 10 - settimana-vecchi topi C57BL/6 maschi 4-5 ore prima dell'iniezione di cellule.
- Mettere il mouse irradiato in un dispositivo di ritenuta per limitare la sua attività.
- Pulire la coda usando un batuffolo di cotone intriso di alcool di 75% per promuovere la vasodilatazione della vena.
- Iniettare 0,5 embrione equivalente (ee) o sospensioni di cellule singole 1 ee di AGM per via endovenosa nella vena della coda di topo irradiato con una siringa da 1,0 cc.
Nota: Le cellule sono sospesi con PBS e 0,5 mL di PBS per ogni destinatario è un volume adeguato. Un ago di calibro 25 o 26 gauge dimensione viene utilizzato per l'iniezione con una siringa cc 1,0. Aria non può essere introdotto nella siringa. Premere il sito di iniezione con un tampone antisettico per fermare l'emorragia. - Undici giorni post trapianto, raccogliere e difficoltà le milze dei topi destinatari a Bouin ' s soluzione (soluzione acquosa di acido picrico 1,22% saturata 15 mL, 2 mL di metanolo al 40% e 1 mL di acido acetico) per 1-2 giorni e lavare con 80% di alcol per un altro 1-2 giorni. Contare le colonie visibili nella milza in modo macroscopico e determinare il numero di colonie per ee.
Nota: Bouin ' fissativo s, indossare una protezione appropriata.
- Analisi a lungo termine di trapianto
- dopo 2-3 giorni explant coltura, raccogliere le assemblee e preparare sospensioni di cellule singole incubando con collagenasi 200 µ l (0,1% in PBS) per 20 min.
- Eseguire irradiazione letale (9 Gy di raggi x) di 8 - ai 10 - settimana-vecchi topi C57BL/6 maschi 4-5 ore prima dell'iniezione di cellule.
- Mettere il mouse irradiato in un dispositivo di ritenuta per limitare la sua attività.
- Pulire la coda usando un batuffolo di cotone intriso di alcool di 75% per promuovere la vasodilatazione della vena. < lHo > iniettare 0,5 embrione equivalente (ee) o 1 ee singola cellula-sospensioni di AGM per via endovenosa nella vena della coda di un topo irradiato con una siringa cc 1,0. AGM sono iniettati ad una dose di 1 ee per ogni destinatario con 2 × 10 5 le cellule del midollo osseo (CD45.1 sfondo).
Nota: L'aria non può essere introdotto nella siringa. Premere il sito di iniezione con un tampone antisettico per fermare l'emorragia. - Quattro mesi post-trapianto, raccogliere il midollo osseo del destinatario e utilizzarlo per il dosaggio di ricostituzione di FACS. Solo i destinatari con ≥ 10% chimerismo donatore-derivati sono considerati ad esporre la ricostituzione successo.
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Representative Results
Una recente pubblicazione segnalata serotonina derivato da cellule endoteliale promuove la sopravvivenza di HSCs inibendo la via di pro-apoptotica del AGM13. Per confermare l'effetto di promozione della serotonina sullo sviluppo di HSC, Fluoxetine è stato inclusa. Come un inibitore della ricaptazione di serotonina (SSRI), Fluoxetine è stata dimostrata di inibire il riassorbimento di serotonina in tessuti periferici16,17,18. Utilizzando l'AGM explant sistema di coltura, è stato esaminato l'effetto della fluoxetina sullo sviluppo di HSC seguendo la procedura di cui sopra. Le analisi di espressione ha mostrate l'espressione aumentata di Runx1, che è definita come un gene fondamentale per lo sviluppo HSC19, in assemblee Fluoxetine-trattati a livelli di mRNA e proteina, rispettivamente (Figura 2A e 2B). Fluoxetina può aumentare anche notevolmente la capacità di formazione di Colonia di HSCs in AGM, inclusi BFU-E, CFU-GM e CFU-GEMM (Figura 2C e 2 di figuraD). Inoltre, in vivo trapianto risultati hanno mostrato che HSCs in AGM trattati con fluoxetina può aumentare il numero di colonie di milza nei destinatari adulti irradiati (Figura 2E).
Figura 1 . Rappresentazione schematica della struttura AGM ed espianto della coltura sistema.
(A) il diagramma di flusso per l'utilizzo il quantico di cultura explant AGM esaminare l'effetto di sostanze chimiche per lo sviluppo di HSCs. Brevemente, assemblee sono sezionate da embrioni e coltivate sui filtri all'interfaccia aria-liquido con sostanze chimiche diluite in terreno di coltura a lungo termine di M5300. 2 - 3 giorni più tardi, le assemblee coltivate sono raccolti e utilizzate per esaminare l'espressione di geni correlati ematopoietici, Colonia formazione possibilità e capacità di ripopolamento. AGM, aorta-gonade-Mesonefro; CFU-C, formanti colonie unità nella cultura; CFU-S, formanti colonie unità-milza. (B) la struttura del AGM è illustrata in questo schema. Un, aorta dorsale; Me, mesenchima; G, gonade; M, Mesonefro. (C) la morfologia dell'AGM. L'AGM è separato dalla metà caudale del corpo embrionale con le cellule mesenchymal circostanti alle e 10.5. Scala bar = 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Applicazione dell'AGM explant sistema di coltura per rilevare l'effetto della fluoxetina sullo sviluppo di HSC. (A) il livello di mRNA di Runx1 in assemblee trattati con fluoxetina a 10 µM è stato rilevato dalla PCR quantitativa in tempo reale. Test t di Student: * *, P < 0,01. I risultati sono presentati come media ± SEM. (B) Western blotting ulteriori analisi hanno confermato che l'espressione aumentata di Runx1 al livello della proteina nella AGMs trattati con fluoxetina. (C) le immagini rappresentative mostrano la morfologia di BFU-E, CFU-GM e CFU-GEMM. Barre della scala = 100 µm. (D) CFU-C analisi ha indicato che il trattamento della fluoxetina può aumentare il numero di ciascun tipo di Colonia. È stato utilizzato un embrione equivalente (ee). Test t di Student: *, P < 0,05; * *, P < 0.01.The risultati sono presentati come media ± SEM. (E) CFU-S dosaggio con assemblee trattate con fluoxetina ha mostrato che il Fluoxetine può aumentare il numero delle colonie nella milza dei destinatari adulti irradiati. Scala bar = 1,5 mm. 1 ee è stato utilizzato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
È noto che HSCs maturo nel midollo osseo può ripopolare il sistema sangue di destinatari irradiati. A differenza di questi HSCs funzionale, le HSCs emergenti in AGM degli embrioni del mouse sono immaturi. Risultati di trapianto diretto ha mostrato quel tipo mi (VE-cad+ CD45– CD41+) e tipo II (VE-cad+ CD45+) pre-HSCs possedere nessuna capacità di ricostituzione20. Sfruttando il sistema di coltura explant AGM, il nascente HSCs nella regione AGM può ricostituire i destinatari a trapianto dosaggio4,20. Inoltre, a causa dello sviluppo intrauterino dell'embrione del mouse, gli esperimenti in vivo per salvare l'ematopoiesi alterata in topi KO sono scomodi da eseguire. La cultura di espianto AGM è un sistema alternativo, che è adatto per gli esperimenti di salvataggio, semplicemente aggiungendo le sostanze chimiche (fattori di crescita e citochine) le medie13,15. Oltre l'AGM, il sacco vitellino e fegato fetale può essere coltivati anche con questo sistema7.
All'inizio di questo esperimento, la sterilizzazione rigorosa di filtri e maglie in acciaio inox è molto importante per evitare la contaminazione. Ancora più importante, il passaggio fondamentale nella cultura è quello di rendere l'AGM dissecata coltivate sui filtri all'interfaccia aria-liquido. Troppo medio causerà l'AGM di essere colta nel liquido e può essere decaduto, considerando che troppo piccola media renderà l'AGM asciutto. Durante la coltura, mantenendo la corretta umidità dell'incubatrice cella è anche importante per evitare l'evaporazione del fluido.
Ulteriore miglioramento di questo explant sistema cultura per simulare veramente lo sviluppo di HSCs in vivo, insieme con gli avanzamenti recenti nella organoid cultura tecniche21, amplierà notevolmente l'applicazione negli studi di ematopoiesi, da Differenziazione di auto-rinnovamento, multi-lignaggio HSC e l'interazione di HSC-nicchia scoperta di modellazione e droga di malattia.
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Disclosures
Gli autori non hanno nessun conflitto di interessi finanziario.
Acknowledgments
Ringraziamo Suwei Gao per aiuto nella preparazione di figura. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Foundation Natural Science of China (81530004, 31425016) e il Ministero della scienza e tecnologia della Cina (2016YFA0100500). J.L. eseguito gli esperimenti e redatto il manoscritto; F.L. modificato il manoscritto. Entrambi gli autori letto ed approvato il manoscritto finale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| durapore 0.65 µm filters | Millipore | R5BA63787 | AGM explant culture |
| M5300 long-term culture medium | Stem Cell Technologies | 5300 | AGM explant culture |
| Trizol | Tiangen | 5829 | RNA extration |
| M-MLV reverse transcriptase | Promega | 90694 | reverse transcription |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | quantatitive real-time PCR |
| protease inhibitor | Roche | 55622 | Protein extration |
| collagenase | Sigma | C2674 | digestion of AGM tissues |
| MethoCult GF M3434 medium | Stem Cell Technologies | 3434 | CFU-C assay |
| ultra-low attachment 24-well plates | Costar | 3473 | CFU-C assay |
| C57BL/6 CD45.2 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | CFU-S assay | |
| C57BL/6 CD45.1 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Long-term transplantation | |
| phosphate buffered saline | Life Technologines | 8115284 | AGM Collection |
| Penicillin-Streptomycin solution | HyClone | SV30010 | AGM explant culture |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Long-term transplantation |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Long-term transplantation |
| UV lamp | Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | power: 30W |
| stainless steel mesh | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | aperture diameter: 2.5 mm |
| hydrocortisone | Sigma | H0396 | selectively diluted into M5300 medium |
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