Summary
Denne undersøgelse viser den nytte og brugervenlighed kvantitative cellemembranen udvidelse måling og dens sammenhæng med selvklæbende kapacitet af celler. Som et repræsentativt eksempel viser vi her at Dickkopf-relaterede proteiner 3 (DKK3) fremmer øget lobopodia dannelse og celle klæbeevne i binyrebarkhormon karcinom celler i vitro.
Abstract
Cellens membran udvidelse repertoire modulerer forskellige maligne opførsel af kræftceller, herunder deres klæbende og vandrende potentialer. Evne til præcist klassificere og kvantificere celle udvidelser og måle effekten på en celle klæbende kapacitet er afgørende for at bestemme hvordan celle signalering begivenheder indvirkning kræft celle adfærd og aggressivitet. Vi beskriver her, in vitro- design og brug af en celle udvidelse kvantificering metode sammen med en vedhæftning kapacitet analyse i en etableret i vitro model for binyrebarkhormon karcinom (ACC). Specifikt, tester vi virkningerne af DKK3, en formodede tumor suppressor og en Pro differentiering faktor, på membran udvidelse Fænotypen af ACC cellelinie, SW-13. Vi foreslår disse assays til giver relativt enkel, pålidelig og let fortolkelige målinger til måler disse egenskaber under forskellige forsøgsbetingelser.
Introduction
Dysregulated WNT signalering spiller en afgørende rolle i binyrebarkhormon maligniteter1. De metoder, der anvendes i denne undersøgelse undersøge, om hæmning af DKK3, en negativ regulator af WNT signalering, repræsenterer et dedifferentiation arrangement i binyrebarken og fremmer tumordannelse inden for rammerne af celle-udvidelse repertoire ændringer. DKK3 er en 38 kDa udskilles glycoprotein med en N-terminale signal peptid og tidligere undersøgelser har vist at dens tvungen udtryk resulterede i celle cyklus anholdelse, hæmmede aggressiv ondartet adfærd, og vendt epitel-mesenkymale overgangen2.
Den maligne opførsel af binyrebarkhormon karcinom (ACC) og andre kræftformer er del, påvirket af evne til tumorceller at interface med de omkringliggende overflader, herunder den ekstracellulære matrix, som til gengæld letter tumor celle invasion og migration3. Rollen specifikke cellemembranen udvidelser i kræft progression er demonstreres i stigende grad i forskellige sammenhænge, primært via dannelsen af filopodia. For eksempel har overekspression af L-type calcium kanaler vist sig at fremkalde filopodia dannelse og fremme tumor celle invasion4. Fascin, en actin bindende protein minimalt udtrykt i normalt væv, er ligeledes også overexpressed i kræftceller i forening med filopodia dannelse5. Lobopodia dannelse muliggør ikke-maligne fibroblaster overflytte effektivt gennem det ekstra-cellulære matrix, men det har vist sig at fibrosarcoma celler er afhængige af metalloproteinase aktivitet i stedet for lobopodia til at lette celle migration og invasion6. Vi har vist, at tumor undertrykkerne, herunder Ras association domæne familie 1 isoform en (RASSF1A) og DKK3, kan funktionen til at ændre cytoskeletal elementer og fremme lamellipodia dannelse og styne invasive egenskaber7,8.
Som sådan, er det kritisk at karakterisere effekten af gener involveret i carcinogenese og deres forhold til cellemembranen udvidelse ændringer, specielt vurdering af filopodia, lobopodia og lamellipodia dannelse under prøvningsbetingelser. Nuværende state-of-the-art teknikker omfatter brug af stadig mere avancerede mikroskopi metoder, fluorescerende mærkning, og/eller komplekse edb-algoritmer til dataopsamling og fortolkning. Mens disse metoder til at give nye og stærke analytiske værktøjer, begrænser deres kompleksitet deres udbredte anvendelse og tilpasningsevne i celle biologi eksperimenter. Desuden er præcis kvantificering og observation af ændringer i celle udvidelse morfologi ikke typisk målte9,10. Derimod introducerer vi en teknik, som nøjagtigt kvantificerer celle udvidelse ændringer ved hjælp af standard mikroskopiske teknikker og let fleksibel in vitro- metoder. Disse metoder også kvantificere hver celle forlængelse skrive samtidig for hver celle, analyseres og afgøre overordnede ændringer i cellens membran udvidelse repertoire. Vi viser også, hvordan disse ændringer kan relateres til celle vedhæftning egenskaber.
Som en eksperimenterende eksempel, vil vi bruge en tidligere oprettet cellelinie af SW-13, udpeget SW-DDK3, der har været stabilt transfekteret med pCMV6-post/DKK3 plasmid vektorer og constitutively overexpresses DKK3, en differentiering faktor i binyrerne. Non-transfekteret SW-13 celler og SW-13 celler stabilt transfekteret med tomme vektor (pCMV6-post), udpeget SW-Neo, vil tjene som eksperimentelle kontrolelementer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. udvidelse cellebanker
- Vedligeholde SW-13, SW-Neo og SW-DKK3 celler i en standard befugtet inkubator ved 37.0 ° C og 5% CO2 i Dulbeccos modificerede Eagle Medium suppleret med 10% føtal bovint serum og 10.000 U/mL penicillin og streptomycin (udpeget som 'vækstmediet').
- Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer og plade 5.000 celler pr. brønd til SW-13, SW-Neo og SW-DKK3 linjer i separate 6-godt plader og vokse natten over i vækstmediet på sterilt glas coverslips.
- Efter overnatning vækst, for hver brønd Aspirér vækstmediet, vaske cellerne med 1 mL varm fosfatbufferet saltopløsning (PBS), og derefter lave cellerne med 1 mL af 3,7% formaldehyd i 10 min.
- Aspirat formaldehyd og pletten celler i hver brønd med 1 mL 0,05% krystalviolet i 30 min. vask overskydende hårfarve væk ved hjælp af tre vasker 1 mL deioniseret vand.
Bemærk: Afhængigt af farvestof optagelse, flere ekstra vasker kan være nødvendigt at fjerne baggrunden farvning for at fremme celle visualisering.- Bruger fine tippes pincet, hente coverslips og placere dem ansigt ned på et mærket glas dias med et drop klar montering reagens.
- Under et lysmikroskop tilfældigt vælge 20 visninger af ikke-overlappende celler fra hver coverslip til celle udvidelse assay.
- Tage mikrofotografier på 400 x forstørrelse af hver synsfelt. Direkte tælle antallet af hver type af forlængelse for hvert af de 20 repræsentative celler.
Bemærk: som sådan 20 isolerede celler bør undersøges for hver testet betingelse at sikre pålidelige resultater. Filopodia blev defineret af cellulære extensions med en base af 5 mikron eller mindre og en enkelt apex. Lobopodia blev defineret af cellulære extensions med en base af 5 til 20 micron længde indeholdende udvidelser med flere apices. Lamellipodia blev defineret af celle-udvidelser, der er større end 20 mikrometer i længde og med eller uden apices. Afhængigt af hvilken testet celle størrelser af celle extensions kan variere og kan kræve finjustering for at identificere parametre.
- Tage mikrofotografier på 400 x forstørrelse af hver synsfelt. Direkte tælle antallet af hver type af forlængelse for hvert af de 20 repræsentative celler.
- Bestemme det gennemsnitlige antal af hver celle forlængelse i hver celletype (dvs., SW-13, SW-Neo, SW-DDK) på tværs af 6 brøndene undersøges.
- Brug af en en-vejs variansanalyse (ANOVA) statistiske test, sammenligne forskelle i den gennemsnitlige procentdel af cellemembranen udvidelser blandt de forskellige test celletyper.
2. Friktionskoefficienten Assay
- Vedligeholde SW-13, SW-Neo og SW-DKK3 celler i en standard befugtet inkubator på 37.0 ° C og 5% CO2 i vækstmediet.
- Ved hjælp af en hemocytometer, tælle og plade 100.000 celler af SW-13, SW-Neo og SW-DKK3 pr. brønd i separate 6-godt plader og vokse natten over i vækstmediet.
- Seed 6-godt plader til hver celletype testet, ved hjælp af en plade for hver af de 6 udpegede tid testet nedenfor.
NOTE: Tidspunkter kan variere for forskellige celletyper.
- Efter natten inkubation, vaske cellerne med varm PBS én gang og derefter tilføje 0,5 mL af 1 x ikke-enzymatiske celle dissociation løsning til hver brønd.
- Swirl plade til at sprede den celle dissociation løsning. Opsug den udpegede plade på definerede tidspunkter (dvs. 1, 2, 3, 5, 10 og 15 min) og derefter vaskes med 1 mL varm PBS løsning tre gange.
- Mellem vasker, forsigtigt trykke pladerne for at frigøre løst tilknyttede celler.
- Opsug eventuelle resterende PBS og fix celler forbliver knyttet til plade med 1 mL af 3,7% formaldehyd i 10 min.
- Pletten celler med 1 mL 0,05% krystalviolet i 30 min og derefter vaske overskydende farvestof væk med 1 mL deioniseret vand. Titreres vask for at fremme celle visualisering.
Bemærk: Afhængigt af farvestof optagelse, flere ekstra vasker kan være nødvendigt at fremme celle visualisering. - Ved hjælp af et lysmikroskop på 100 x forstørrelse, tælle de resterende tilknyttede celler i hver brønd for hver plade.
Bemærk: Brug af gennemsigtige herskere eller mærkning fine pen guider på undersiden af pladen vil bidrage til at undgå gentagne optælling af de samme celler. - Bestemme det gennemsnitlige antal tilknyttede celler pr. brønd for hver plade.
- Sammenligne antallet af celle detachement mellem SW-13, SW-Neo og SW-DDK3 celler i den givne periode ved hjælp af en to-vejs ANOVA statistiske test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Benytter de ovenfor assays, blev virkningerne af DKK3 overekspression på celle udvidelse morfologi og celle vedhæftning egenskaber testet i den etablerede ACC cellelinie SW-13, in vitro. Celler overekspression DKK3 blev genereret af stabilt transfecting SW-13 celler med Myc-DDK mærket pCMV6-post/DKK3 plasmid vektorer og udpeget som SW-DKK3. Ligeledes blev celler stabilt transfekteret med tomme vektor pCMV6-posten oprettet som en Transfektion og passaging kontrol og defineret som SW-Neo. SW-13 celler blev brugt som en ekstra forælder-celle kontrol. Overekspression af DKK3 i SW-DKK3 blev bekræftet af kvantitative real-time PCR og Western blot teknikker8.
Kort, var testet celler SW-13, SW-Neo og SW-DKK3 dyrkes natten over i 6 godt plader på cover underkjoler. Celler blev derefter fast med formaldehyd og farves med krystalviolet. Udvidelse cellebanker blev derefter kvantificeres under mikroskopi pr. de parametre, der er beskrevet ovenfor. På analyse, SW-DKK3 celler, vises en mere differentieret fænotype bemærket af øget lobopodia og flerstrenget celle polaritet (p = 0,01, en-vejs ANOVA, figur 1 og figur 2), tyder på en mangel på retningsbestemt motilitet. Derimod forældrenes SW-13 og SW-Neo celler vedligeholdes polaritet og vises større filopodia arrangeret i en planar orientering (p = 0,01, en-vejs ANOVA, figur 1 og figur 2)8.
At afgøre, om øget lobopodia dannelse ændret celleegenskaber vedhæftet fil, vi udførte en celle vedhæftning assay. Kort, celler blev dyrket natten over og celle løsrivelse blev udført med ikke-enzymatiske celle dissociation løsning på progressive gang intervaller op til 15 min. celler blev derefter fast med formaldehyd, farves med krystalviolet og tælles ved hjælp af en lys mikroskop. SW-DKK3 celler viste en betydeligt større vedhæftede affinitet i forhold til SW-13 og SW-Neo celler (p < 0,01, 2-vejs ANOVA, figur 3). Disse resultater viser, at DKK3 fremmer lobopodia formation, hvilket igen fremmer celle vedhæftet fil8.
Figur 1: tvungen udtryk af DKK3 ændrer cellemembranen extensions. SW-13 (A), SW-Neo (B)og SW-DKK3 (C) celler blev dyrket på glas coverslips, fast med formaldehyd, farves med krystalviolet og afbildet. Mikrofotografier er taget med et lysmikroskop på 400 x forstørrelse. SW-13 og SW-Neo celler dannes for det meste filopodia (røde pilespidser) og lamellipodia (blå arc) celle udvidelser. Derimod dannes SW-DKK3 celler mere lobopodia (små grønne buer), med i nærheden af manglende lamellipodia, og meget få filopodia. Mens SW-13 (A) og SW-Neo (B) cellerne synes at være polariseret (orange pil) med filopodia inden for frontviden og lamellipodia ved lagging kant, celler SW-DKK3 (C) viste jævnt fordelte flerstrenget lobopodia. Eksperimenter blev udført i to eksemplarer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: DKK3 fremmer lobopodia dannelse. Den relative repræsentation af filopodia, lobopodia og lamellipodia pr. celle for hver celletype blev beregnet ved tabulerer celle udvidelser på individuelle celler. Celler i tyve mikrofotografier af tilfældigt taget mikroskopifeltets udsigt (400 x forstørrelse) SW-13, SW-Neo og SW-kr. blev brugt til kvantificering. Fejllinjer angivet standardafvigelse og (*) angiver p < 0,01 ved hjælp af en en-vejs ANOVA repræsenterer en betydelig stigning i antallet af lobopodia i SW-DKK celler. Ialt 20 celler blev undersøgt for hver testet celletype og eksperimenter blev udført i to eksemplarer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: DKK fremmer celle vedhæftning. Et hundrede tusinde SW-13, SW-Neo og SW-DKK3 celler pr. brønd af 6-godt plader fik lov til at vokse natten over og blev behandlet for udstationering på angivne tidspunkt punkter (x-akse). Cellerne resterende vedlagte var fast, farves og tælles og procenter af celler resterende vedlagte blev plottet (y-aksen). Fejllinjer angiver standardafvigelsen og (*) angiver p < 0,01 og (*) angiver p < 0,001 ved hjælp af en 2-vejs ANOVA repræsenterer en betydelig stigning i SW-DKK celle vedhæftet fil styrke. Hvert forsøg i gang med 100.000 celler og eksperimenter blev udført i to eksemplarer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en in vitro- kvantitativ metode for at karakterisere celle extensions med lethed, par pit-falls og pålidelige reproducerbarhed, der kan anvendes til forskellige prøvningsbetingelser. Derudover kan simple, kvantificerbare vedhæftning og/eller motilitet assays udføres samtidigt for at korrelere potentielle funktionel betydning af observerede ændringer i cellens membran udvidelser.
Disse metoder kan fremsætte nogle potentielle begrænsninger. Først, de kriterier, der angives her til at identificere forskellige typer af celle udvidelser er baseret på binyrebarkhormon SW-13 celle morfologi og dermed sandsynligvis brug for raffinement i klassificering parametre når de påføres andre celler typer og/eller eksperimentelle betingelser. Yderligere, i længere tid-kursus eksperimenter, de potentielle påvirkninger af cellemembranen udvidelse ændringer på cellecyklus og celledød skal overvejes.
Andet, protokollen kan stole på potentielle individualiseret gerning som eksaminator, som kunne begrænse den assay reproducerbarhed på grund af indbyrdes observatør variation. Det høje antal celler, der er undersøgt for hver test-gruppe sandsynligvis overvinder en del af denne skævhed; specielt, når 20 celler er undersøgt for hver analyse. Inddragelse af flere personer til at udføre udvidelsen kald i en blindet mode foreslås for at afbøde potentielle subjektive kaldende bias.
Endelig bør udvises forsigtighed ved knytte ændringer i celle udvidelse klasse switch med ændringer i vedhæftet fil ejendomme, hvor en forenklet version af vedhæftning egenskaber kunne være resultatet af ændret præference for vedhæftet fil undergrundens snarere end det ændrede affinitet for den testede undergrundens. Kobling celle udvidelse klasse switch med migration eller invasion i forbindelse af forskellige ekstra-cellulære matrix komponenter kunne præcisere observerede vedhæftning egenskaber.
Afslutningsvis giver protokollen skitseret her en enkel og pålidelig metode til at måle den funktionelle betydning af cellemembranen udvidelse switch under forskellige betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Ohse Grant Foundation finansieret dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11965-092 | Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin |
| Deulbeco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | 1X solution, used directly |
| 3.7% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute stock solution |
| 0.05% crystal violet | Harleco | 192-12 | Dilute stock solution |
| De-ionized water | NA | NA | NA |
| Microscope with 400X magnification | NA | NA | NA |
| 6-well plates | Corning | 353046 | NA |
| Cell dissociation solution non-enzymatic 1X | Sigma-Aldrich | C5914 | 1X solution, used directly |
References
- Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management. Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).
- Veeck, J., Dahl, E. Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3. Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
- Jacquemet, G., et al. L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling. Nat Commun. 7, 13297 (2016).
- Machesky, L. M., Li, A. Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis. Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).
- Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells. J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).
- Korah, R., et al. Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma. Molecular cancer. 12, 87 (2013).
- Cheng, J. Y., et al. A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis. BMC cancer. 17 (1), 164 (2017).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
- Cliffe, A., et al. Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration. Nat Commun. 8, 14905 (2017).
