Summary
Diese Studie zeigt den nutzen und die einfache quantitative Zellmembran Erweiterung Messung und ihre Korrelation zum Klebstoff Kapazität von Zellen. Als ein repräsentatives Beispiel zeigen wir hier der Dickkopf-related Protein 3 (DKK3) fördert erhöhte Pseudopodien Bildung und Zelle Haftfähigkeit in NNR Karzinom-Zellen in Vitro.
Abstract
Die Zellmembran Erweiterung Repertoire moduliert verschiedene bösartige Verhaltensweisen von Krebszellen, einschließlich ihrer Klebe- und wandernden Potenziale. Die Fähigkeit, genau zu klassifizieren und Zelle Erweiterungen zu quantifizieren und die Wirkung auf eine Zelle Klebstoff Kapazität zu messen ist entscheidend für die Bestimmung, wie Zelle Signalisierung Ereignisse Auswirkungen Krebs Zelle Verhalten und Aggressivität. Hier beschreiben wir die in-vitro- Gestaltung und Nutzung einer Zelle Quantifizierung Erweiterungsmethode in Verbindung mit einem Adhäsion Kapazität Assay in einem etablierten in-vitro- Modell für NNR-Karzinom (ACC). Insbesondere prüfen wir die Auswirkungen der DKK3, eine vermeintliche Tumorsuppressor und pro-Differenzierung Faktor auf der Membran Erweiterung Phänotyp der ACC-Zelllinie, SW-13. Wir schlagen diese Tests bieten relativ einfach, zuverlässig und leicht interpretierbare Metriken, misst diese Eigenschaften unter verschiedenen experimentellen Bedingungen.
Introduction
Dysregulated WNT signalisieren spielt eine entscheidende Rolle in der NNR Malignome1. Die in dieser Studie verwendeten Methoden untersuchen, ob Schweigen der DKK3, ein negativer Regulator der WNT signalisieren, stellt eine Entdifferenzierung Ereignis in der Nebennierenrinde und fördert Tumorbildung im Zusammenhang mit der Zelle-Erweiterung Repertoire Änderungen. DKK3 ist eine 38 kDa Glykoprotein mit einer N-terminalen Signalpeptid abgesondert und frühere Studien haben gezeigt, dass seine erzwungene Ausdruck Zellzyklus Festnahme führte, aggressiven bösartigen Verhaltens gehemmt und epitheliale-mesenchymale umgekehrt Übergang2.
Das bösartige Verhalten der NNR-Karzinom (ACC) und anderen Krebsarten ist, im Teil, beeinflusst durch die Fähigkeit der Tumorzellen, Schnittstelle mit der umgebenden Flächen, einschließlich die extrazelluläre Matrix, die wiederum Tumorinvasion Zelle erleichtert und Migration-3. Die Rolle der spezifischen Zellmembran Erweiterungen in Tumorprogression ist zunehmend in verschiedenen Kontexten, vor allem über die Bildung von Filopodien vorgeführt. Zum Beispiel wurde Überexpression des L-Typ-Kalziumkanäle zu induzieren Filopodien Bildung und Förderung der Tumor Zelle Invasion4gefunden. Ebenso ist Fascin, ein Aktin-bindende Protein minimal ausgedrückt in normalem Gewebe auch überexprimieren in Krebszellen in Verbindung mit Filopodien Bildung5. Pseudopodien Bildung ermöglicht nicht-malignen Fibroblasten, effektiv durch die extrazelluläre Matrix zu migrieren, jedoch wurde nachgewiesen, dass Fibrosarkom Zellen abhängig Metalloproteinase Aktivität anstelle von Pseudopodien Zellwanderung zu erleichtern und Invasion-6. Wir haben gezeigt, dass Tumor Entstörer, einschließlich Ras Verband Domäne Familie 1 Isoform (RASSF1A) und DKK3, kann die Funktion zum Zellskelett Elemente zu verändern und Lamellipodia Bildung und stymie invasive Eigenschaften7,8.
Als solches ist es wichtig, die Auswirkungen von Genen, die in der Karzinogenese und ihre Beziehung zur Zellmembran Erweiterung Änderungen, insbesondere Beurteilung Filopodien, Pseudopodien und Lamellipodia Bildung unter Testbedingungen zu charakterisieren. Aktuellen State-of-the-Art-Techniken umfassen die Verwendung von immer ausgefeilteren Mikroskopieverfahren, fluoreszierende Kennzeichnung und/oder komplexe Computer-Algorithmen für die Datenerfassung und Auslegung. Während diese Methoden neue, leistungsstarke Analysetools bieten, schränkt ihre Komplexität ihrer Verbreitung und Anpassungsfähigkeit in Zelle Biologie Experimente. Darüber hinaus ist die exakte Quantifizierung und Beobachtung der Veränderungen der Zellmorphologie Erweiterung nicht in der Regel gemessenen9,10. Im Gegensatz dazu stellen wir Ihnen hier eine Technik, die Zelle Erweiterung Änderungen mit mikroskopischen Standardtechniken und leicht anpassbar in-vitro- Methoden genau quantifiziert. Diese Methoden auch quantifizieren jeden Erweiterungstyp Zelle gleichzeitig für jede Zelle analysiert und Veränderungen in der Zellmembran Erweiterung Repertoire zu bestimmen. Wir zeigen auch, wie diese Veränderungen auf Zelle Adhäsionseigenschaften beziehen können.
Als ein experimentelles Beispiel verwenden wir eine zuvor erstellte Zelllinie SW-13 bezeichneten SW-DDK3, das hat mit pCMV6-Eintrag/DKK3 Plasmid-Vektoren stabil transfiziert wurden und konstitutiv overexpresses DKK3, ein Unterscheidungsmerkmal in der Nebenniere. Non-transfizierten SW 13 und SW-13 Zellen mit leerer Vektor (pCMV6-Eintrag), benannten SW-Neo, stabil transfiziert werden als experimentelle Kontrollen dienen.
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Protocol
1. Erweiterung der Zelleigenschaften
- Pflegen Sie SW 13, SW-Neo und SW-DKK3 Zellen in einem standard befeuchteten Inkubator bei 37,0 ° C und 5 % CO2 in Dulbeccos geändert Eagle Medium mit 10 % fötalen Rinderserum und 10.000 U/mL Penicillin und Streptomycin (bezeichnet als "Wachstumsmedium") ergänzt.
- Zählen von Zellen mit einem Hemocytometer und 5.000 Zellen pro Bohrloch für SW 13, SW-Neo und SW-DKK3 Linien in separaten 6-Well-Platten und wachsen über Nacht im Wachstumsmedium auf sterile Glasdeckgläser.
- Nachdem über Nacht Wachstum, für jedes gut Aspirieren das Wachstumsmedium, waschen Sie Zellen mit 1 mL warmen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und befestigen Sie die Zellen mit 1 mL von 3,7 % Formaldehyd für 10 min.
- Aspirat Formaldehyd und Fleck Zellen in jedem Bohrloch mit 1 mL 0,05 % Kristallviolett für 30 min. Waschen überschüssige Farbstoff mit drei wäscht von 1 mL entionisiertem Wasser.
Hinweis: Abhängig von der Höhe der Farbstoff-Aufnahme, können mehrere zusätzliche Waschungen erforderlich sein, zur Förderung der Zelle Visualisierung Färbung Hintergrund zu entfernen.- Mit feinen Spitzen Pinzette, Abrufen von Deckgläsern und legen Sie sie nach unten auf einen beschrifteten Objektträger mit einem Tropfen klar Montage Reagenz.
- Wählen Sie unter einem Lichtmikroskop nach dem Zufallsprinzip 20 Ansichten von nicht überlappenden Zellen aus jeder Deckglas für die Zelle-Erweiterung-Assay.
- Nehmen Sie Vergößerung bei 400 X Vergrößerung von jedem Sichtfeld. Direkt die Anzahl der jede Art von Erweiterung für jede der 20 repräsentative Zellen.
Hinweis: als solche sollte 20 isolierte Zellen für jede getestete Bedingung um zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten untersucht werden. Filopodien wurden durch zelluläre Erweiterungen mit einem Sockel von 5 μm oder weniger und einem einzigen Spitze definiert. Pseudopodien wurden durch zelluläre Erweiterungen mit einer Grundfläche von 5 bis 20 µm Länge enthält Erweiterungen mit mehreren Spitzen definiert. Lamellipodia wurden durch Zelle-Erweiterungen, die größer als 20 Mikrometer lang und mit oder ohne Spitzen sind definiert. Getestete Zelle abhängig die Größe der Zelle Erweiterungen abweichen und Verfeinerung der Identifikation Parameter erfordern.
- Nehmen Sie Vergößerung bei 400 X Vergrößerung von jedem Sichtfeld. Direkt die Anzahl der jede Art von Erweiterung für jede der 20 repräsentative Zellen.
- Bestimmen Sie die durchschnittliche Anzahl pro Zelle-Verlängerung in jeden Zelltyp (d.h., SW 13, SW-Neo, SW-DDK) über die 6 Brunnen untersucht.
- Mit einem One-Way Varianzanalyse (ANOVA) statistische Test, vergleichen Sie Unterschiede in den durchschnittlichen Anteil der Zellmembran Erweiterungen unter die verschiedenen Zelltypen.
(2) Haftung Assay
- SW 13, SW-Neo und SW-DKK3 Zellen in einem standard befeuchteten Inkubator bei 37,0 ° C und 5 % CO2 im Wachstumsmedium zu erhalten.
- Mit einem Hemocytometer, zählen und 100.000 Zellen von SW 13, SW-Neo und SW-DKK3 pro Bohrloch in separaten 6-Well-Platten und wachsen über Nacht im Wachstumsmedium.
- Samen 6-Well-Platten für jeden Zelltyp mit einer Platte für jede der 6 bezeichneten Zeitpunkten getestet unter getestet.
Hinweis: Die Zeitpunkte können für verschiedene Zelltypen variieren.
- Nach der Inkubation über Nacht einmal waschen Sie Zellen mit warmen PBS, dann fügen Sie 0,5 mL 1 x nicht-enzymatische Zelle Dissoziation Lösung in jede Vertiefung.
- Schwenken Sie die Platte, um die Zelle Dissoziation Lösung zu verbreiten. Aspirieren Sie die dafür vorgesehenen Platte zu definierten Zeitpunkten (z. B. 1, 2, 3, 5, 10 und 15 min) und dann mit warmen PBS-Lösung 1 mL waschen Sie dreimal.
- Zwischen den Waschgängen klopfen Sie leicht die Platten um lose beigefügte Zellen zu lösen.
- Aspirieren Sie alle verbleibenden PBS und Korrektur, die die Zellen bleiben auf der Platte mit 1 mL von 3,7 % Formaldehyd für 10 min angebracht.
- Beflecken Sie Zellen mit 1 mL 0,05 % Kristallviolett für 30 min, dann waschen Sie überschüssige Farbstoff Weg mit 1 mL entionisiertem Wasser. Titrieren Sie waschen Zelle Visualisierung zu fördern.
Hinweis: Abhängig von der Höhe der Farbstoff-Aufnahme, können mehrere zusätzliche Wäschen benötigt, um Zelle Visualisierung zu fördern. - Mit einem Lichtmikroskop bei 100 X Vergrößerung, Graf befestigt die restlichen Zellen in jede Vertiefung für jede Platte.
Hinweis: Verwendung von transparenten Herrscher oder Kennzeichnung feinen Stift Führer auf der Unterseite der Platte hilft zur Vermeidung wiederholter zählen die gleichen Zellen. - Bestimmen Sie die durchschnittliche Anzahl der angeschlossenen Zellen pro Bohrloch für jede Platte.
- Vergleichen Sie die Rate der Zelle Ablösung zwischen SW 13, SW-Neo und SW-DDK3 Zellen im angegebenen Zeitraum mit einem zwei-Wege-ANOVA statistischen Test.
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Representative Results
Unter Verwendung der oben genannten Assays, wurden die Auswirkungen der DKK3 Überexpression auf Verlängerung Zellmorphologie und Zelle Adhäsionseigenschaften in die etablierten ACC-Zellinie SW-13, in Vitrogetestet. DKK3 überexprimierenden Zellen wurden durch stabil transfecting SW-13 Zellen mit Myc-DDK tagged pCMV6-Eintrag/DKK3-Plasmid-Vektoren und als SW-DKK3 erzeugt. Ebenso wurden mit leerer Vektor pCMV6-Eintrag stabil transfizierten Zellen als Transfektion und Passagierung Steuerelement erstellt und definiert als SW-Neo. SW-13 Zellen wurden als zusätzliche Elternzelle Steuerelement verwendet. Überexpression des DKK3 in SW-DKK3 bestätigte sich durch quantitative Real-Time PCR und Western-blot Techniken8.
Kurz, waren getesteten Zellen SW 13, SW-Neo und SW-DKK3 über Nacht in 6-well-Platten auf Deckel rutscht angebaut. Zellen wurden dann mit Formaldehyd fixiert und gefärbt mit Kristallviolett. Erweiterung der Zelleigenschaften wurden dann unter Mikroskopie pro die oben beschriebenen Parameter quantifiziert. Analyse, SW-DKK3 Zellen angezeigt einen differenzierteren Phänotyp von erhöhten Pseudopodien und multidirektionale Zellpolarität festgestellt (p = 0,01, One-Way ANOVA, Abbildung 1 und Abbildung 2), suggestive mangelnder gerichtete Motilität. Im Gegensatz dazu elterliche SW 13 und SW-Neo Zellen gepflegt Polarität und größere Filopodien, angeordnet in einer planaren Ausrichtung angezeigt (p = 0,01, One-Way ANOVA, Abbildung 1 und Abbildung 2)8.
Um festzustellen, ob erhöhte Pseudopodien Bildung Zelle Anlage Eigenschaften verändert, haben wir eine Zelle Adhäsion-Assay durchgeführt. Kurz gesagt, Zellen wurden über Nacht gewachsen und Zelle Ablösung erfolgte mit nicht-enzymatische Zelle Dissoziation Lösung zur progressiven Zeit Abständen bis zu 15 min. Zellen wurden dann mit Formaldehyd fixiert, gefärbt mit Kristallviolett und gezählt, mit einem Licht Mikroskop. SW-DKK3 Zellen zeigten eine deutlich größere Anlage Affinität im Vergleich zu SW-13 und SW-Neo Zellen (p < 0,01, 2-Way ANOVA, Abbildung 3). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass DKK3 Pseudopodien Bildung fördert die Zelle Anlage8wiederum fördert.
Abbildung 1: verstärkte Expression von DKK3 ändert Zellmembran Erweiterungen. SW-13 (A), SW-Neo (B)und SW-DKK3 (C) Zellen wurden auf Glasdeckgläser angebaut, mit Formaldehyd fixiert, gefärbt mit Kristallviolett und abgebildet. Mikrofotos sind mit einem Lichtmikroskop bei 400 X Vergrößerung aufgenommen. SW 13 und SW-Neo Zellen gebildet meistens Filopodien (roten Pfeilspitzen) und Lamellipodia (blauen Bogen) Zelle Erweiterungen. Im Gegensatz dazu bildete SW-DKK3 Zellen mehr Pseudopodien (kleine grüne Bögen), mit in der Nähe von fehlender Lamellipodia, und sehr wenige Filopodien. Während der SW-13 (A) und SW-Neo (B) Zellen polarisierten (orange Pfeile) mit Filopodien an vorderster Front und Lamellipodia am Rande rückständigen scheinen, Zellen SW-DKK3 (C) zeigten gleichmäßig verteilte multidirektionale Pseudopodien. Experimente wurden in zweifacher Ausführung durchgeführt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: DKK3 fördert die Bildung von Pseudopodien. Die relative Darstellung der Filopodien, Pseudopodien und Lamellipodia pro Zelle für jeden Zelltyp durch Tabellieren Zelle Erweiterungen auf einzelne Zellen berechnet. Zellen in zwanzig Mikrofotos von zufällig fotografiert Gesichtsfeld von Ansichten (400 X Vergrößerung) von SW 13, SW-Neo und SW-DKK dienten zur Quantifizierung. Fehlerindikatoren angedeutet Standardabweichung und (*) zeigt p < 0,01 verwenden eine einfache ANOVA, einen deutlichen Anstieg der Zahl der Pseudopodien in SW-DKK Zellen darstellt. Für jeden getesteten Zelltyp wurden insgesamt 20 Zellen untersucht und Experimente wurden durchgeführt in zweifacher Ausfertigung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: DKK fördert Zelladhäsion. Hunderttausend SW 13, SW-Neo und SW-DKK3 Zellen pro Bohrloch des 6-Well Platten über Nacht wachsen durften und wurden für die Ablösung zu festgelegten Zeitpunkten (x-Achse) behandelt. Die verbleibenden angeschlossenen Zellen waren fixiert, fleckig und gezählt und die Prozentsätze der verbleibenden angeschlossenen Zellen wurden aufgetragen (y-Achse). Fehlerbalken zeigen Standardabweichung und (*) zeigt p < 0,01 und (*) zeigt p < 0,001 verwenden eine 2-Wege-ANOVA repräsentieren einen deutlichen Anstieg der SW-DKK Zelle Anlage Stärke. Jedes Experiment begann mit 100.000 Zellen und Experimente wurden durchgeführt in zweifacher Ausfertigung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Hier beschreiben wir eine in-vitro- quantitative Methode zur Charakterisierung von Zelle Erweiterungen mit Leichtigkeit, paar Grube fällt und zuverlässige Reproduzierbarkeit, die für verschiedene Testbedingungen angewendet werden können. Darüber hinaus können einfache, quantifizierbare Haftung und/oder Motilität Assays gleichzeitig durchgeführt werden, um mögliche funktionale Bedeutung der beobachteten Veränderungen in der Zellmembran Erweiterungen zu korrelieren.
Diese Methoden können jedoch einige möglichen Einschränkungen darstellen. Zunächst die Kriterien, die hier angegeben, um verschiedene Arten von Zelle Erweiterungen basieren auf Nebennierenrindeninsuffizienz SW-13 Zellmorphologie und daher wahrscheinlich brauchen Verfeinerung in der Klassifizierung der Parameter, wenn auf andere Arten von Zellen und/oder experimentellen Bedingungen angewendet. Weitere, in längeren Zeitverlauf Experimente, die möglichen Einflüsse der Zellmembran Erweiterung Änderungen auf den Zellzyklus und Zelltod berücksichtigt werden müssen.
Zweitens kann das Protokoll setzen auf mögliche individuelle Aufrufen des Prüfers, die den Assay Reproduzierbarkeit durch Inter Beobachter Variation einschränken könnte. Die hohe Zahl von Zellen, die für jede Testgruppe wahrscheinlich untersucht werden überwindet Bestandteil dieses Vorurteil; speziell, wenn 20 Zellen für jedes Assay untersucht werden. Aufnahme von mehreren Personen Erweiterung Aufruf in einer verblindeten Mode durchführen wird vorgeschlagen, um die mögliche subjektive aufrufenden Vorspannung zu mildern.
Zu guter Letzt Vorsicht geboten, wenn Veränderungen in der Anlage Eigenschaften, wo eine vereinfachte Version der Hafteigenschaften das Ergebnis der könnte Änderungen in Zelle Verlängerung Klasse Schalter zuordnen Vorliebe für Anlage Substrat verändert statt die veränderte Affinität für das getestete Substrat. Kopplung des Zelle Verlängerung Klasse Schalters mit Migrations- oder Invasion im Rahmen der verschiedenen Komponenten der extrazellulären Matrix könnte die beobachteten Haftungseigenschaften klären.
Abschließend sieht das Protokoll hier skizzierten eine einfache und zuverlässige Methode zur Messung der funktionellen Bedeutung der Zellmembran Erweiterung Schalter unter verschiedenen Versuchsbedingungen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Ohse Grant Foundation finanziert diese Arbeit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11965-092 | Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin |
| Deulbeco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | 1X solution, used directly |
| 3.7% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute stock solution |
| 0.05% crystal violet | Harleco | 192-12 | Dilute stock solution |
| De-ionized water | NA | NA | NA |
| Microscope with 400X magnification | NA | NA | NA |
| 6-well plates | Corning | 353046 | NA |
| Cell dissociation solution non-enzymatic 1X | Sigma-Aldrich | C5914 | 1X solution, used directly |
References
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