Summary
Este estudio demuestra la utilidad y la facilidad de la medida de extensión cuantitativa membrana de la célula y su correlación con la capacidad adhesiva de las células. Como un ejemplo, aquí mostramos esa proteína Dickkopf-relacionada 3 (DKK3) promueve la formación mayor lobopodia y adhesividad celular adrenocortical carcinoma de células en vitro.
Abstract
Repertorio de extensión de la membrana celular modula diversos comportamientos malignos de las células cancerosas, incluyendo su potencial adhesivo y migratorias. La capacidad para clasificar y cuantificar extensiones de la célula y medir el efecto sobre la capacidad adhesiva de las células exactamente es fundamental para determinar cómo-señalización celular eventos impacto cáncer célula comportamiento y agresividad. Aquí, describimos el diseño en vitro y el uso de un celular cuantificación método de extensión en conjunto con un análisis de la capacidad de adherencia en un modelo establecido en vitro para carcinoma adrenocortical (ACC). En concreto, ponemos a prueba los efectos de DKK3, un supresor tumoral putativo y un factor de Pro-diferenciación, en el fenotipo de la extensión de la membrana de la línea celular ACC, SW-13. Proponemos estos ensayos para proporcionar relativamente simple, confiable, y métricas fácilmente interpretable para medidas de estas características en diversas condiciones experimentales.
Introduction
Dysregulated WNT de señalización juega un papel crítico en neoplasias adrenocorticales1. Los métodos utilizados en este estudio investigan si silenciamiento de DKK3, un regulador negativo de la señalización de WNT, representa un acto de diferenciación en la corteza suprarrenal y promueve la formación de un tumor en el contexto de los cambios de repertorio de extensión de la célula. DKK3 es un 38 kDa secretada glicoproteína con un péptido de señal N-terminal y estudios anteriores han demostrado que su expresión forzada dio lugar a la detención del ciclo celular, inhibe el comportamiento maligno agresivo e invertida epitelial-mesenquimal transición2.
El comportamiento maligno de carcinoma adrenocortical (ACC) y otros tipos de cáncer es, en parte, influenciada por la capacidad de las células tumorales para interactuar con las superficies circundantes, incluyendo la matriz extracelular, que a su vez facilita la invasión del tumor de la célula y migración3. El papel de extensiones específicas de membrana celular en la progresión del cáncer se está demostrando cada vez más en diversos contextos, principalmente a través de la formación de filopodios. Por ejemplo, la sobreexpresión de los canales de calcio tipo L se ha encontrado para inducir la formación de filopodios y promover tumor células invasión4. Del mismo modo, Fascin, una actina proteína de Unión mínimamente expresada en tejido normal, también es sobreexpresada en células de cáncer en asociación con la formación de filopodios5. Lobopodia formación permite a los fibroblastos no malignos migrar con eficacia a través de la matriz extracelular, sin embargo, se ha demostrado que células de fibrosarcoma dependen de la actividad de la metaloproteinasa reemplaza lobopodia para facilitar la migración celular y invasión de6. Hemos demostrado que el tumor supresores, incluyendo Ras Asociación dominio familia 1 isoforma (RASSF1A) y DKK3, puede funcionar para alterar elementos citoesqueléticos y promover formación lamellipodia y bloquear propiedades invasoras7,8.
Como tal, es fundamental para caracterizar los efectos de los genes implicados en la carcinogénesis y su relación con alteraciones de extensión de la membrana de la célula, específicamente evaluar la formación de filopodios, lobopodia y lamellipodia bajo condiciones de prueba. Técnicas de vanguardia actuales incluyen el uso de métodos cada vez más sofisticados de la microscopia, etiquetado fluorescente o complejos algoritmos para adquisición de datos y la interpretación. Mientras que estos métodos proporcionan nuevas y poderosas herramientas analíticas, su complejidad limita su uso generalizado y la adaptabilidad en los experimentos de biología celular. Además, la cuantificación precisa y la observación de cambios en la morfología de la extensión de la célula no es normalmente medido9,10. Por el contrario, presentamos aquí una técnica que cuantifica con precisión alteraciones de la extensión de la célula usando técnicas microscópicas estándar y fácilmente adaptable en vitro métodos. Estos métodos también cuantificar cada tipo de extensión de la célula simultáneamente para cada célula analizada y determinan los cambios generales en el repertorio de extensión de la membrana de la célula. Mostramos también cómo estos cambios pueden se relacionan con propiedades de adherencia de la célula.
Experimental por ejemplo, usamos una línea celular creado anteriormente de SW-13, señalado SW-DDK3, que ha sido estable transfected con los vectores del plasmid de entrada/pCMV6-DKK3 y constitutivamente overexpresses DKK3, un elemento diferenciador en la glándula suprarrenal. Células SW-13 no transfectadas y SW-13 estable transfectadas con el vector vacío (entrada pCMV6), designado SW-Neo, servirá como controles experimentales.
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Protocol
1. características de la extensión de la célula
- Mantener 13 SW, SW-Neo y células SW-DKK3 en un estándar incubador humedecido a 37,0 ° C y 5% CO2 en medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con suero bovino fetal 10% y 10.000 U/mL de penicilina y estreptomicina (señalado como' crecimiento').
- Contar las células usando un hemocitómetro y 5.000 células por pozo 13 SW, SW-Neo y líneas de SW-DKK3 de la placa en placas de 6 pozos separadas y crecen durante la noche en medio del crecimiento en cubreobjetos de vidrio estéril.
- Crecimiento durante la noche, para cada bien, aspirar el medio de crecimiento, lavar las células con 1 mL de caliente solución salina con tampón fosfato (PBS) y luego fijar las células con 1 mL de formaldehído de 3,7% durante 10 minutos.
- Aspirado formaldehído y tinción de las células en cada pocillo con 1 mL de 0.05% de cristal violeta durante 30 minutos lavar exceso del tinte, utilizando tres lavados de 1 mL de agua desionizada.
Nota: Dependiendo del nivel de la absorción del tinte, varios lavados adicionales pueden necesitarse para eliminar fondo de coloración para promover la visualización de células.- Utilizando pinzas de punta finas, recuperar cubreobjetos y colóquelos cara abajo sobre un portaobjetos de vidrio etiquetados con una gota de reactivo de montaje claro.
- Bajo un microscopio de luz, elegir al azar 20 vistas de células no superpuestos de cada cubreobjetos para el ensayo de extensión de la célula.
- Tomar microfotografías con 400 aumentos de cada campo de visión. Contar directamente el número de cada tipo de extensión para cada una de las 20 células representativas.
Nota: como tal, 20 células aisladas deben examinarse para que cada condición de prueba asegurar resultados confiables. Filopodios fueron definidos por extensiones celulares con una base de 5 micras o menos y un solo ápice. Lobopodia fueron definidos por extensiones celulares con una base de 5 a 20 micras de extensiones que contienen longitud con ápices múltiples. Lamellipodia fueron definidos por extensiones superiores a 20 micras de longitud y con o sin ápices de la célula. Dependiendo del tipo de celular probado, los tamaños de extensiones de la célula pueden variar y requieran refinamiento de identificación de parámetros.
- Tomar microfotografías con 400 aumentos de cada campo de visión. Contar directamente el número de cada tipo de extensión para cada una de las 20 células representativas.
- Determinar el número promedio de cada extensión de la célula en cada tipo de célula (es decir, 13 SW, SW-Neo, SW-DDK) a través de los 6 pozos examinados.
- Usando una prueba estadística de análisis unidireccional de varianza (ANOVA), comparar las diferencias en el porcentaje promedio de las extensiones de la membrana de la célula entre los tipos de células diferentes.
2. ensayo de adhesión
- Mantener 13 SW, SW-Neo y SW-DKK3 células en una incubadora humidificada estándar a 37,0 ° C y 5% de CO2 en un medio de.
- Utilizando un hemocitómetro, contar 100.000 células de 13 SW, SW-Neo y SW-DKK3 por el bien de la placa en placas de 6 pozos separadas y crecer durante la noche en medio de cultivo.
- Placas de 6 pocillos de semillas para cada tipo de célula a prueba, utilizando una placa para cada uno de los 6 puntos de tiempo designado probados por debajo.
Nota: Los puntos de tiempo pueden variar para diferentes tipos de células.
- Después de la incubación durante la noche, lavar las células con PBS caliente una vez luego añada 0,5 mL de 1 x solución de disociación celular no enzimático a cada pocillo.
- Remolino de la placa para distribuir la solución de disociación celular. Aspire la placa señalada en los puntos de tiempo definido (i.e., 1, 2, 3, 5, 10 y 15 min) y luego lavar con 1 mL de solución PBS caliente tres veces.
- Entre lavados, golpee suavemente las placas para separar células libremente conectadas.
- Aspirar cualquier resto de PBS y fijar las células queda conectadas a la placa con 1 mL de formaldehído de 3,7% durante 10 minutos.
- Teñir las células con 1 mL de 0.05% de cristal violeta durante 30 minutos luego lavar exceso de tinte con 1 mL de agua desionizada. Valorar lavado para promover la visualización de la célula.
Nota: Dependiendo del nivel de la absorción del tinte, pueden necesitarse varios lavados adicionales para promover la visualización de células. - Utilizando un microscopio con 100 aumentos, contar las células restantes adjuntadas en cada pozo para cada placa.
Nota: Uso de reglas transparentes o guías de pluma fina en la parte inferior de la placa de la marca ayudará a evitar conteo repetido de las mismas células. - Determinar el número promedio de células conectados por pozo para cada placa.
- Comparar la tasa de desprendimiento celular entre 13 SW, SW-Neo y células SW-DDK3 durante el período de tiempo dado mediante una prueba estadística de ANOVA dos vías.
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Representative Results
Usando el análisis anteriores, los efectos de la sobreexpresión de DKK3 en células extensión morfología y propiedades de adhesión de célula fueron probados en la línea establecida de células ACC SW-13, en vitro. Se generaron células overexpressing DKK3 estable transfectar las células SW-13 con Myc-DDK tagged pCMV6-entrada/DKK3 plasmid vectores y señalado como SW-DKK3. Del mismo modo, las células transfectadas estable con vector vacío pCMV6-entrada fueron creadas como un control de transfección y pases y define como SW-Neo. SW-13 células fueron usadas como un control adicional de la célula de padre. La sobreexpresión de DKK3 en SW-DKK3 fue confirmada por PCR cuantitativa en tiempo real y Western blot técnicas8.
Brevemente, células probadas 13 SW, SW-Neo y SW-DKK3 fueron cultivados durante la noche en 6 placas de pozos en cubreobjetos. Las células fueron fijadas con formaldehído y teñidas con cristal violeta. Características de extensión de la célula entonces se cuantificaron bajo microscopia por los parámetros descritos anteriormente. En el análisis, las células SW-DKK3 muestran un fenotipo distinguido por mayor lobopodia y polaridad celular multidireccional (p = 0,01, ANOVA unidireccional, figura 1 y figura 2), sugestiva de una falta de motilidad direccional. En contraste, las células 13 SW y SW-Neo parentales mantiene polaridad y muestran mayor filopodia dispuesta en una orientación planar (p = 0,01, ANOVA unidireccional, figura 1 y figura 2)8.
Para determinar si lobopodia mayor formación altera propiedades de accesorio de celulares, se realizó un ensayo de adherencia de célula. Brevemente, las células fueron cultivadas durante la noche y desprendimiento de células se realizó con solución de disociación no enzimática de la célula en tiempo progresivo intervalos de hasta 15 minutos las células fueron fijadas con formaldehído, teñidas con cristal violeta y contaron con una luz microscopio. SW-DKK3 células demostraron una afinidad de fijación significativamente mayor en comparación con las células 13 SW y SW-Neo (p < 0.01, ANOVA de 2 vías, figura 3). Estos resultados indican que DKK3 promueve la formación de lobopodia, que a su vez promueve la célula anexo8.
Figura 1: extensiones de la membrana de la célula altera la expresión forzada de DKK3. SW-13 (A), SW-Neo (B)y SW-DKK3 (C) las células fueron cultivadas en cubreobjetos de vidrio, fijadas con formaldehído, teñidas con cristal violeta y reflejadas. Las fotomicrografías se toman utilizando un microscopio con 400 aumentos. Las células 13 SW y SW-Neo forman principalmente filopodios (flecha roja) y extensiones de la célula lamellipodia (arco azul). Por el contrario, SW-DKK3 células formaron más lobopodia (pequeños arcos verdes), con casi total ausencia de lamellipodia y filopodios muy pocos. Mientras que el SW-13 (A) y SW-Neo (B) las células parecen ser polarizadas (flechas naranjas) con filopodios en la vanguardia y lamellipodia en el borde del revestimiento, SW-DKK3 las células (C) mostraron distribuido uniformemente multidireccional lobopodia. Experimentos se realizaron por duplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: DKK3 promueve formación de lobopodia. La representación relativa de filopodia, lobopodia y lamellipodia por la célula para cada tipo de célula se calcularon por tabulación de extensiones de la célula en células individuales. Células en veinte fotomicrografías del campo microscópico al azar tomada de vistas (400 aumentos) 13 SW, SW-Neo y SW-DKK fueron utilizadas para la cuantificación. Barras de error indican la desviación estándar y (*) indica que p < 0.01 usando un ANOVA unidireccional que representa un aumento significativo en número de lobopodia en células SW-DKK. Un total de 20 células fueron examinados para cada tipo de prueba de la célula y los experimentos se realizaron por duplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: DKK promueve la adhesión celular. 100 mil 13 SW, SW-Neo y SW-DKK3 células por pocillo de las placas de 6 pozos se permitieron crecer durante la noche y fueron tratadas para la separación en momentos señalados (eje x). Las células restantes adjunto se fija, manchadas y contaron y los porcentajes de células restantes adjunto fueron trazada (eje y). Barras de error indican la desviación estándar y (*) indica que p < 0.01 (*) indica p < 0.001 utilizando un ANOVA de 2 vías que representa un aumento significativo en SW-DKK fuerza de fijación de la célula. Cada experimento comenzó con 100.000 células y experimentos se realizaron por duplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí describimos un método cuantitativo en vitro para caracterizar extensiones de la célula con facilidad, algunas caídas de hoyo y reproducibilidad confiable que puede ser aplicado para diferentes condiciones de prueba. Por otra parte, ensayos de adhesión y motilidad simple, cuantificables pueden realizarse simultáneamente para correlacionar el potencial significación funcional de las alteraciones observadas en las extensiones de la membrana de la célula.
Sin embargo, estos métodos pueden presentar algunas limitaciones potenciales. En primer lugar, los criterios aquí especificados para identificar diferentes tipos de extensiones de la célula se basan en la morfología de la célula suprarrenal SW-13 y por lo tanto, es probable que necesitan refinamiento en la clasificación de parámetros cuando se aplica a otros tipos de células o condiciones experimentales. Además, en experimentos de tiempo-curso extendidos, deben considerarse las influencias potenciales de membrana celular alteraciones de extensión en el ciclo celular y muerte celular.
En segundo lugar, el protocolo puede depender de potencial individual llamando el examinador, que podría limitar la de reproducibilidad debido a la variación entre observador. El elevado número de células que se examinan para cada grupo de prueba probablemente supera parte de este sesgo; específicamente, cuando se examinan las 20 células para cada ensayo. Inserción de varios individuos para realizar extensión llamar de manera anónima se sugiere para mitigar los posibles sesgos que subjetiva.
Por último, debe tenerse cuidado al asociar cambios en célula extensión clase interruptor con alteraciones en las propiedades de conexión, donde una versión simplificada de las propiedades de adhesión podría ser el resultado de modificar preferencia de sustrato de fijación en lugar de la afinidad alterada para el sustrato probado. La célula extensión clase del interruptor de acoplamiento con migración o invasión en el contexto de los diversos componentes de la matriz extracelular podría clarificar las propiedades de adherencia observada.
En conclusión, el protocolo descrito aquí proporciona un método sencillo y fiable para medir la significación funcional de interruptor de membrana de la célula extensión bajo varias condiciones de prueba.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
La Fundación de la beca de Ohse financiado este trabajo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11965-092 | Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin |
| Deulbeco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | 1X solution, used directly |
| 3.7% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute stock solution |
| 0.05% crystal violet | Harleco | 192-12 | Dilute stock solution |
| De-ionized water | NA | NA | NA |
| Microscope with 400X magnification | NA | NA | NA |
| 6-well plates | Corning | 353046 | NA |
| Cell dissociation solution non-enzymatic 1X | Sigma-Aldrich | C5914 | 1X solution, used directly |
References
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