Summary
Wir präsentieren Ihnen eine Technik für lokalisierte Verabreichung von Medikamenten durch die Trans-Trommelfells Route in die Cochlea. Drug-Delivery über diesen Weg würden die Anti-Krebs-Wirksamkeit von Chemotherapeutika wie Cisplatin nicht beeinträchtigen.
Abstract
Der systemischen Verabreichung der Schutzmittel, Medikamenten-induzierten Ototoxizität zu behandeln ist begrenzt durch die Möglichkeit, dass diese Schutzmittel mit der chemotherapeutischen Wirksamkeit der primären Medikamente stören könnten. Dies gilt insbesondere für das Medikament Cisplatin, deren Anti-Krebs-Aktionen durch Antioxidantien gedämpft, die ausreichenden Schutz vor Verlust der Hörfähigkeit zu bieten. Andere aktuelle oder potenzielle Otoprotective Agenten könnte ein ähnliches Problem aufwerfen, wenn systemisch verabreicht. Die Anwendung verschiedener Biologicals oder Schutzstoffe direkt an die Cochlea würde hohe dieser Wirkstoffe lokal mit begrenzten systemischen Nebenwirkungen ermöglichen. In diesem Bericht zeigen wir eine Trans-Trommelfells Methode der Lieferung von verschiedenen Drogen oder biologische Reagenzien der Cochlea, sollten grundlegende Wissenschaftsforschung auf der Cochlea und bieten eine einfache Möglichkeit, die Verwendung von Otoprotective Agenten in den Kliniken zu leiten. Dieser Bericht beschreibt eine Methode des Trans-Trommelfells Drug-Delivery und bietet Beispiele dafür, wie diese Technik erfolgreich bei Versuchstieren eingesetzt hat, um Cisplatin Ototoxizität zu behandeln.
Introduction
Die peripheren Hörsystems ist exquisit empfindlich auf Medikamente wie Cisplatin und Aminoglykosid-Antibiotika. Cisplatin ist ein weit verbreitetes Chemotherapeutikum zur Behandlung von einer Vielzahl von soliden Tumoren, wie Eierstöcke, Hoden und Kopf und Hals-Tumoren. Ototoxizität erlebt mit der Verwendung dieser Droge ist Dosis-Begrenzung und durchaus üblich, 75-100 % der Patienten betroffen1behandelt. Andere Drogen, wie z. B. Carboplatin und Oxaliplatin, entstanden als Alternativen zu Cisplatin2,3,4,5, aber ihre Nützlichkeit ist auf wenige Krebsarten beschränkt.
Frühe Studien haben die kritische Rolle von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) gezeigt, bei der Vermittlung der Ototoxizität von Cisplatin und Aminoglykoside produziert. Nachfolgende Studien zeigten, dass die NOX3 Isoform von NADPH-Oxidase die primäre Quelle von ROS in der Cochlea ist und durch Cisplatin6,7aktiviert. Die Generation der ROS Kompromisse stieg das Antioxidans Pufferkapazität der Zellen, was zu Lipidperoxidation von Zellmembranen8. Cisplatin erhöht darüber hinaus die Produktion von Hydroxyl-radikale die hochgiftigen Aldehyd 4-Hydroxynonenal (4-HNE), Initiator der Zelle Tod9,10erzeugen. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen, wurden mehrere Antioxidantien für die Behandlung von Cisplatin Ototoxizität untersucht. Dazu gehören D-Methionin, N-Acetyl-Cystein (NAC), Natriumthiosulfat (STS) und Amifostine. Ein Hauptanliegen der antioxidative Therapie ist jedoch, dass diese Antioxidantien Cisplatin chemotherapeutischen Wirksamkeit bei11 durch das Zusammenspiel von Cisplatin mit Thiol-Gruppen in den antioxidativen Molekülen systemisch verabreicht senken könnte.
Angesichts dieser Probleme mit antioxidative Therapie war das Ziel dieser Studie zu prüfen, die Trans-Trommelfell Weg der Bereitstellung von Antioxidantien und anderen Drogen zu der Cochlea, Verlust der Hörfähigkeit zu reduzieren. Der Trans-Trommelfell Weg von Drogen und kurze Einmischung (Si) RNA, wie unten beschrieben, scheint besonders Erfolg versprechend.
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Protocol
Männliche Wistar Ratten in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Tier behandelt wurden verwenden Richtlinien und ein Protokoll vom südlichen Illinois Universität Schule von Medizin Laboratory Animal Care and verwenden Committee genehmigt. Auditory Brainstem Response (ABR) wurde an Ratten während der Narkose vor der Medikamentengabe und 72 h nach durchgeführt, um zu überprüfen, die Wirkung von Trans-Trommelfells Drug-Delivery.
1. auditory Brainstem Response (ABR)
Hinweis: ABR-Messungen wurden mit dem auditiven Test-Equipment und Software gesammelt. ABR steht für evozierte Potentiale oder Hochfrequenz-Wellen erzeugt durch den achten Hirnnerven (wave I und II) und andere höhere auditive Hirnstamm Strukturen einschließlich Anteroventral cochlear Nucleus (Welle III), seitlicher Lemniscus (Welle IV) und minderwertig Colliculus (Welle V). Diese Wellen unterscheiden sich je nach der Latenz. ABR Messungen wurden bereits12beschrieben.
- Ratten mit einer Mischung aus 90 mg/kg Ketamin und 17 mg/kg Xylazin über intraperitoneale Injektion zu betäuben. Bestätigen Sie die Tiefe der Narkose über Zeh-Prise Reflex. Wenden Sie ophthalmologische Schmierung (oder Mineralöl Tropfen an) auf beiden Augen, die Augen vor dem Austrocknen zu verhindern und zu vermeiden Geschwürbildung während der Narkose
- Legen Sie die Ratte in Bauchlage auf ein Heizkissen (37 ° C) innerhalb einer kontrollierten akustischen Stand. Audiologie Prüfeinrichtungen befindet sich außerhalb und neben dem Stand.
- Edelstahl-Elektroden entsprechend einfügen: der Masseelektrode im hinteren Flanke, die positive Elektrode zwischen den beiden Ohren direkt oben auf dem Schädel und der negativen Elektroden unterhalb der Pinna jedes Ohr.
- Gelten Sie akustische Reize mit Hochfrequenz-Wandler als ein 5 ms Ton Burst auf 8, 16 und 32 kHz. Stimulus Intensitäten als Dezibel Schalldruck (dB SPL) zu bestimmen. Dies beginnt bei 10 dB SPL und 90 dB SPL mit einer Schrittweite von 10 dB erreicht. Die soliden Intensitäten zu einer maximalen Leistung von 90 dB SPL mit einer Impuls Präzision-Schallpegelmesser zu kalibrieren.
Hinweis: Das Testergebnis gibt Aufschluss über die Integrität der periphere Hörorgan, der Cochlea und die vorgenannten auditiven Strukturen. Die Wellenformen werden innerhalb von 15 ms Impuls Eingabe generiert und die Latenz der Wellen hängt Wärmeleitung Zeit, die wiederum von drei kritischen Faktoren geregelt ist: Volumen des Gehirns, die Intensität und die Frequenz des Tones. Akustische evozierte Potentialen verzeichneten mit vom Hersteller mitgelieferten Software. - Betrachten Sie die minimale Intensität, die zwei verschiedene Wellenformen (II und III) von 0,5 µV Amplitude prominent als Schwellenwert hervorrufen kann.
Hinweis: Verschiebung der Schwelle entspricht der Differenz in der Schwelle nach Behandlung im Vergleich mit dem Schwellwert erhalten vor der Behandlung gemessen.
2. Trans-Trommelfells Injektionen
- Um das Medikament Trans-tympanically zu verwalten, legen Sie die Ratte in der linken seitlichen Dekubitus-Position.
- Einweg-Ohrtrichter 2,5 mm in den Gehörgang einsetzen.
- Positionieren Sie mit dem Einsatz eines OP-Bereichs der Spekula so, dass das Trommelfell sichtbar ist.
- Mit einem 29 X ½, 0,5 mL Insulin Spritze, 50 µL [R] - N - Phenyl Isopropyl Adenosin aufzustellen (R-PIA) Lösung (1 µM), 8-Cyclopentyl-1,3-Dipropylxanthine (DPCPX)-Lösung (3 µM) oder SiRNA-Lösung (0,9 µg), (5 Stück) zu injizieren.
- Verwenden der Spekula, die Nadel auf die minderwertige Frontzahnbereich das Trommelfell.
- Poke ein Loch durch die Membran mit der Nadel und verabreichen der Medikamente in 1.2.3 erwähnt. Lassen Sie die Ratte in dieser Position für 15 min ruhen.
Hinweis: 50 µL sollte ausreichend Volumen hinter dem Trommelfell zu passen. Nach der Verabreichung sollte keine Flüssigkeit im Gehörgang sein. - Legen Sie die Ratte in der rechten seitlichen Dekubitus positionieren und wiederholen Sie die Schritte 1.2.1 bis 1.2.5 für die Verwaltung in das andere Ohr.
- Legen Sie für Ratten intraperitoneal Cisplatin empfangen die Ratte in der Rückenlage auf ein Heizkissen bei 37 ° C.
- Mit einer 21 X 3/4 Schmetterling Nadel (Länge Schlauch 12"), Cisplatin (11 mg/kg, 1 mg/mL Lösung in sterilen Phosphat Puffer Kochsalzlösung [PBS]) aufzustellen.
- Über eine Spritzenpumpe, verwalten Sie Cisplatin (1 mg/mL) über intraperitoneale Injektion über 30 min.
Hinweis: Für eine 250-g-Ratte würde das Volumen 2,75 mL mit einer Rate von etwa 0,1 mL / min. betragen.
- Auch die Tiefe der Narkose während dieser Verfahren zu verfolgen. Wenn Cisplatin Verwaltung abgeschlossen ist, legen Sie die Ratte zurück in den Käfig in Bauchlage, sicherstellen, dass gibt es nichts, ihre Atmung behindern.
- Überwachen Sie die Ratte bis vollständig erholt.
(3) Cochlea Dissection und Entkalkung
- Im Anschluss an die letzte ABR (nach 72 h) die Ratte mit einer Mischung aus 90 mg/kg Ketamin und 17 mg/kg Xylazin über intraperitoneale Injektion zu betäuben. Anästhesie mit einem Zeh-Prise Reflex zu bestätigen. Die Ratte über Enthauptung einschläfern.
- Sezieren Sie, Felsenbein bereits13beschrieben.
- 4 % Paraformaldehyd in 1 x PBS-Lösung in einem 7-mL-Glas funkeln Fläschchen (vollständig bedeckt die Cochlea) entgegenbringen Sie Cochlea. Im Kühlschrank über Nacht bei 4 ° C. Entfernen Sie Paraformaldehyd zu und waschen Sie mit 1 X PBS bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie PBS zu und füllen Sie das Rohr vollständig zu, mit einer 120-mM-Lösung von EDTA (pH 7,3). Legen Sie auf ein Rotator bei Raumtemperatur und ermöglichen Sie Entkalkung für 2 bis 3 Wochen, täglich wechselnden die EDTA-Lösung zu.
(4) Kryoschneiden
- Nach dem Abschluss der Entkalkung komplett zu halten der Cochlea in den folgenden Lösungen (7 mL) für 24 h bei 4 ° C: 10 % Saccharose, 20 % Saccharose, 1:1 Mischung aus 20 % Saccharose und optimale Arbeitstemperatur (OCT) zusammengesetzte einbetten.
- Legen Sie frische OCT Verbindung zu füllen und vollständig bedecken die Cochlea in ein 15 x 15 mm x 5 mm Einweg Form einbetten. Richten Sie die Cochlea auf seiner Seite, so dass es parallel zum Boden der einbettenden Form, wie von Whitlon Et al.beschrieben. 14
- Legen Sie die Form sofort auf Trockeneis, das Office-Anpassungstool zu festigen und über Nacht bei-80 ° C lagern.
- Tauchen Objektträger in 0,01 % Poly-L-Lysin bei Raumtemperatur für 30 min. entfernen die Folien nicht ausspülen und über Nacht trocknen lassen. Verwenden Sie diese Folien für Cryosections.
- Entfernen der Cochlea im Oktober aus dem-80 ° C Gefrierschrank und legen Sie es auf Trockeneis. Mit einem scharfen Mikrotom Klinge (L x b: 80 mm x 8 mm, Stärke 0,25 mm, Schnittwinkel von 34°), Abschnitt die OCT-Blöcke bei 10 µm mit einem Kryostaten bei-30 ° C. Legen Sie zwei Abschnitte pro Folie.
- Kühlen Sie Folien bei 4 ° C, wenn Sie fertig sind.
5. Immunohistochemistry
- Legen Sie die Folien in einen Glas-Objektträger Färbung Gericht auf einem Dia-Gestell. Füllen Sie die Schale mit 350 mL 1 X PBS und waschen Sie der Objektträger für 5 min bei Raumtemperatur dreimal.
- Die Folien aus der Schale entfernen und das Gebiet rund um das Gewebe mit einem trockenen Tuch, wobei Sie nicht auf das Gewebe trocknen trocknen.
- Mit einem flüssigen blockierende Stift, zeichnen Sie einen Kreis um den Gewebe-Abschnitt.
- Blockieren Sie das Gewebe für 1 h bei Raumtemperatur durch Zugabe von 150 µL blocking Lösung mit 10 % Normal (Esel) Serum, 1 % nichtionische Reinigungsmittel und 1 % BSA mit 1 X PBS-Puffer.
- Tippen Sie auf Ausschalten überschüssige blockierende Lösung und inkubieren Sie das Gewebe über Nacht bei 4 ° C in eine feuchte Kammer mit 150 µL Serum 10 % Normal (Esel), 0,1 % nichtionische Reinigungsmittel und primären Antikörper (siehe Hinweis unten) mit 1 X PBS-Puffer.
Hinweis: Für die folgenden Antikörper wurden diese Verdünnungen verwendet: für Abbildung 2 und 3, p-STAT1 Ser727 1: 300. Abbildung 4, p-STAT1 Ser727, 1: 100 und TRPV1 1: 100. - Legen Sie die Folien in Färbung Gericht auf eine Folie Rack Glas-Objektträger. Füllen Sie die Schale mit 350 mL 1 X PBS und waschen Sie Folien für 5 min bei Raumtemperatur dreimal.
- Mit der Sekundärantikörper verdünnt in eine Lösung mit 0,01 % nichtionische Waschmittel und 10 % Normal (Esel) Serum mit 1 X PBS-Puffer für 2 bis 3 h bei Raumtemperatur in eine feuchte Kammer im Dunkeln inkubieren.
Hinweis: Für die folgenden Sekundärantikörper wurden diese Verdünnungen verwendet: für Abbildung 2 und 3, Esel IgG Anti-Kaninchen-1:600. Abbildung 4Rhodamine (TRITC) Esel Anti-Kaninchen IgG 1: 500 und Esel Anti-Ziege IgG 1: 500. - Legen Sie die Folien in Färbung Gericht auf eine Folie Rack Glas-Objektträger. Füllen Sie die Schale mit 350 mL 1 X PBS und waschen Sie Folien für 5 min bei Raumtemperatur dreimal.
- Tippen Sie auf überschüssige Flüssigkeit aus der Folie, und trocknen Sie die Folie mit einem trockenen Tuch auf das Gewebe. Montieren Sie Folien durch Zugabe von einem Tropfen des Montage-Agents mit DAPI direkt auf das Gewebe. Langsam oben, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen, darunter entstehen legen Sie das Deckglas auf und lassen Sie die Folien über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln zu heilen. Speichern von Folien bei 4 ° C.
- Bildfolien mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Laser Imaging-wie folgt zu verwenden: UV-Laser für DAPI, 488 nm Laser für Esel IgG Anti-Kaninchen und 543 nm Laser für Rhodamin TRITC.
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Representative Results
ABR Reaktionen gemessen bei Ratten an drei Tagen nach Cisplatin-Verabreichung eine deutliche Erhöhung Schwellen zeigte. Höhe dieser Schwellen wurde deutlich reduziert, bei Ratten verabreicht mit Trans-Trommelfell [R] - N - Phenylisopropyladenosine (R-PIA), Adenosin1 Rezeptor Agonist15, vor Cisplatin. Die Spezifität des Handelns der R-PIA an der Adenosin-Rezeptor1 zeigte sich durch die Beobachtung, dass es durch 8-Cyclopentyl-1,3-Dipropylxanthine (DPCPX), ein A-1 -Rezeptor-spezifischen Antagonisten-16antagonisiert war. Dieses Medikament potenzierte Cisplatin-induzierten ABR Schwelle Schichten (Abbildung 1A). Ähnlich wie seine Wirkung zur Herstellung von Hörverlust, Cisplatin erhöht auch die Schäden, die äußeren Haarzellen (bewertet von Rasterelektronenmikroskopie [SEM]) (Abbildung 1B). REM-Bilder wurden wie zuvor beschrieben17erhalten. Dieser Effekt war deutlich reduziert durch Trans-Trommelfells Gabe von R-PIA (Abbildung 1C). Darüber hinaus zeigen wir, dass Trans-Trommelfell R-PIA reduziert basale und Cisplatin-induzierten p-STAT1 Immunoreactivity in der Cochlea, reflektieren die entzündungshemmende Eigenschaft dieser Droge (Abbildung 2).
Die Trans-Trommelfells Route könnte auch zur Biologics wie SiRNAs, verwalten die wohltuende Wirkung führen. Trans-Trommelfell Verwaltung von STAT1 SiRNA an Ratten effektiv reduzierten STAT1 und p-STAT1 und blockiert die Aktivierung dieser Transkriptionsfaktor von Cisplatin (Abbildung 3).
Weitere Studien zeigen, dass die Trans-Trommelfell Einnahme von eine andere SiRNA für die NOX3 mRNA die Fähigkeit der reduziert Medikamente wie Capsaicin erhöhen einige nachgelagerten Mediatoren wie Transienten Rezeptor potential Vanilloid 1 (TRPV1)-Kanal und p-STAT1 ( Abbildung 4). Diese Mediatoren sind in Capsaicin-induzierte Gehör Verlust18verwickelt.
Abbildung 1: Trans-Trommelfells Verwaltung der R-PIA reduziert Cisplatin-induzierten Hörverlust und geschützt gegen Verlust der äußeren Haarzellen. A. ABR Schwellenwerte wurden gemessen bei Ratten vor und 72 h nach Behandlung mit Cisplatin (11 mg/kg, i.p.) nach Trans-Trommelfells Verabreichung von R-PIA oder DPCPX + R-PIA. Cisplatin-induzierten Erhöhung des ABR Schwelle konnte gezeigt werden, um die A-1AR-Agonist, Rabgeschwächt werden-PIA. Die gleichzeitige Gabe von der A1AR Antagonist, DPCPX, umgekehrt die Wirkung von R-PIA an ABR Schwelle und deutlich erhöhte die ABR verschiebt sich produziert von Cisplatin auf allen Frequenzen getestet. Der Pfeil zeigt Null ABR Schwelle Verschiebung. B. Cisplatin Behandlung zeigten erhebliche Schäden an der äußeren Haarzellen (OHC) (weißer Pfeil), wie gezeigt durch Rasterelektronenmikroskopie (SEM). R-PIA OHCs gegen Cisplatin-induzierten Schäden geschützt, während DPCPX die schützende Wirkung von Rgedämpft-PIA. C. das Balkendiagramm zeigt die Quantitative Analyse der SEM Bilder in Bgezeigt. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwerts. Sternchen (*) und (*) geben einen statistisch signifikanten Unterschied von Fahrzeug oder Cisplatin Behandlungsgruppen, bzw. während (*) einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen R angibt-PIA + Cisplatin behandelten Ratten (p < 0,05, n = 5). Diese Zahl wurde von Kaur Et al. 19 mit Erlaubnis. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Trans-Trommelfells Verwaltung eine1AR-Agonisten, R-PIA, reduziert Cisplatin-erhöhte p-STAT1 Immunoreactivity in der Cochlea. Ratten wurden verabreicht eine intraperitoneale Dosis von Cisplatin (11 mg/kg), die erhöhte p-STAT1 Ser727 Immunoreactivity, bei 72 h Post Drug Administration bewertet. Jedoch 1 h eine Vorbehandlung mit Trans-Trommelfells R-PIA stumpf dieser Anstieg in p-STAT1 Immunoreactivity. Mitbehandlung der A-1AR Antagonist, DPCPX, zusammen mit Agonist umgekehrt die Hemmung der p-STAT1 Immunoreactivity. Blaue Färbung stellt DAPI-gefärbten Kernen, während grüne Färbung p-STAT1 Immunolabeling darstellt. OHC und DC stehen äußere Haarzellen und Deiter Zelle, beziehungsweise. Weiße Pfeile zeigen die drei Reihen von OHCs. Maßstabsleiste gezeigt im unteren linken Bereich ist 10 µm. Diese Zahl wurde von Kaur Et al. 19 mit Erlaubnis. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Trans-Trommelfells Verwaltung von STAT1 SiRNA blockiert Cisplatin-induzierten p-STAT1 Ebenen. Cochlea-Abschnitte isoliert von Ratten verabreicht mit Cisplatin (11 mg/kg, i.p.) 72 h zeigte erhöhte Ser727 p-STAT1 Immunoreactivity in OHCs. Vorbehandlung mit Trans-Trommelfells STAT1 SiRNA (0,9 mg) abgeschwächt Cisplatin-induzierten Anstieg des p-STAT1 Immunoreactivity, während verschlüsselt Behandlung zeigte keine Wirkung. Blaue Färbung stellt DAPI-gefärbten Kernen, während grüne Färbung p-STAT1 Immunolabeling darstellt. Weiße Pfeile zeigen die drei Reihen von OHCs. Der Maßstab in der unteren rechten Seite gezeigten misst 10 µm. Diese Zahl wurde von Kaur Et al. 20 mit Erlaubnis. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Trans-Trommelfells Injektion NOX3 SiRNA reduziert TRPV1 und p-STAT1 Ebenen in der Ratte Cochlea. Anästhesierten Ratten wurden verabreicht Rührei SiRNA (Scramble) oder NOX3 SiRNAs durch die Trans-Trommelfells Injektionen, zwei Tage später gefolgt von Trans-Trommelfells Injektionen von Capsaicin für 24 Std. isolierten Cochleae von diesen Tieren wurden für p-STAT1 gebeizt Ser727 und TRPV1 Immunoreactivity. Capsaicin erhöht TRPV1 (grün) und p-STAT1 Ser727 (rot) Immunoreactivity um 24 Uhr in der Stria Vascularis (SVA), äußeren Haarzellen (OHC) und Spirale Ganglienzellen (SG). Vorbehandelt mit NOX3 SiRNA Tiere zeigen sichtbaren Induktion von p-STAT1 Ser727 und TRPV1 Immunolabeling jedoch nicht. Maßstabsbalken (untere rechte Abbildung) sind 50 und 10 µm für Einsätze. Diese Zahl wurde von Mukherjea Et al. 18 mit Erlaubnis. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die Trans-Trommelfells Applikationsweges ermöglicht eine lokalisierte Lieferung von Arzneimitteln und sonstigen Erfüllungsgehilfen der Cochlea, die andernfalls erheblichen systemische Nebenwirkungen wenn systemisch verabreicht produzieren könnte. Diese Methode der Gesundheitsbehörde ermöglicht schnellen Zugriff von Medikamenten, um den Ort des Geschehens bei deutlich höheren Dosen, als durch die systemische Route erreicht werden würde. Ergebnisse hier vorgestellt und veröffentlicht zuvor gezeigt, dass Trans-Trommelfells Verwaltung von [R] - N - Phenyl Isopropyl Adenosin (R-PIA) geschützt die Cochlea von Cisplatin-induzierten äußeren Haarzelle Verlust (Abbildung 1)19 und Induktion von Entzündungen wie durch verminderte Aktivierung von STAT1 Transkriptionsfaktor (im Vergleich zu den behandelten mit Cisplatin oder R-PIA + DPCPX + Cisplatin) (Abbildung 2)19. Diese Vorteile könnten zum Schutz vor Gehörschäden durch dieses Medikament gewährt beitragen. Basierend auf bisherigen Erfahrungen, behaupten wir, dass nur eine Medikamentengabe erforderlich ist. Dies könnte darauf hinweisen, dass das Medikament im Mittelohr bleibt und langsam werden in die Cochlea aufgenommen könnte Schutz in den drei Tagen, die diese Tiere bewertet werden zur Ototoxizität zu bieten. Diese Technik wird derzeit verwendet, andere Drogen ins Innenohr zu bestimmen, ihre Wirksamkeit als Oto-restriktiv zu liefern.
Neben Medikamenten bieten Trans-Trommelfells Verwaltung von SiRNAs effektive Knockdown von selektiven RNAs zu reduzieren ihre Protein-Ebene und die Oto-Schutz18,20. Wiederum würde diese SiRNAs weniger Toxizitäten bieten, wenn sie in die Nähe der Cochlea geliefert werden. Die Dauer des Zuschlages betrug bis zu drei Tagen (die Grenze unserer Bewertung-Periode). Wichtig ist, blockiert die Zugabe von SiRNAs die Induktion der ihr entsprechenden Protein durch ototoxische Medikamente, wie z. B. Cisplatin. Die Dauer des Zuschlages ist etwas überraschend angesichts der Fülle von Nukleasen in extrazellulären Flüssigkeit und in den Zellen und die potenziellen Schwierigkeiten, diese Moleküle in die Cochlea-Zellen. Jedoch würde die Demonstration der beiden Knockdown von Proteinen und Oto-Schutz bedeuten, dass diese SiRNAs die Cochlea an wirksamen Konzentrationen erreichen.
Trotz der oben beschriebenen Vorteile sind gewisse Einschränkungen dieser Technik zu erwarten. Dazu gehören die Notwendigkeit für die Versuchstiere vor Beginn des Verfahrens zu betäuben. Medikamente müssen bei höheren Konzentrationen ins Mittelohr verabreicht werden, da nur ein Bruchteil (~ 1-10 %) erwartet wird, um die Perilymphe zu erreichen. Darüber hinaus ist die Verteilung der angewandten Medikamente oder Biologicals konzentrierter an der Basis, wo die größten Effekte beobachtet werden.
Während Trans-Trommelfells Lieferung von Agenten, die hier vorgestellten Ratten beschränkt war, könnte eine ähnliche Methode des Drug-Delivery prophylaktisch bei Patienten angewendet werden, die Chemotherapie mit Medikamenten wie Cisplatin erwarten. Es wird erwartet, dass diese Methode der Drug-Delivery rasch angenommen werden könnte, für den Menschen eine große Anzahl von Verbindungen auf den Bildschirm die Wirksamkeit bei der Behandlung von Medikamenten-induzierten Hörverlust bei Versuchstieren gezeigt haben.
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Disclosures
Kein Interessenkonflikt erklärt.
Acknowledgments
Die in diesem Artikel beschriebene Arbeiten wurde durch ein NCI RO1 CA166907, NIDCD RO1-DC 002396 und RO3 DC011621 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketathesia (100 mg/ml) 10 ml | Henry Schein | 56344 | Controlled substance |
| AnaSed Injection/Xylazine (20 mg/ml) 20 ml | Henry Schein | 33197 | |
| 2.5 mm disposable ear specula | Welch Allyn | 52432 | |
| Surgical Scope | Zeiss | ||
| 29 G X 1/2 insulin syringe | Fisher Scientific | 14-841-32 | Can be purchased through other vendors |
| cis-Diammineplatinum(II) dichloride | Sigma Aldrich | P4394 | TOXIC - wear proper PPE |
| Harvard 50-7103 Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | Series 863 | |
| Excel International 21 G X 3/4 butterfly needle | Fisher | 14-840-34 | Can be purchased through other vendors |
| BSP Single Speed Syringe Pump | Brain Tree Sci, Inc | BSP-99 | |
| Pulse Sound Measurement System | Bruel & Kjaer | Pulse 13 software | |
| High-Frequency Module | Bruel & Kjaer | 3560C | |
| 1/8″ Pressure-field Microphone —-Type 4138 | Bruel & Kjaer | bp2030 | |
| High Frequency Transducer | Intelligent Hearing System | M014600 | |
| Opti-Amp Power Transmitter | Intelligent Hearing System | M013010P | |
| SmartEP ABR System | Intelligent Hearing System | M011110 | |
| Disposable Subdermal EEG Electrodes | CareFusion | 019-409700 | |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | Fisher Scientific | 28908 | TOXIC - wear proper PPE |
| 7 mL Borosilicate Glass Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-26 | Can be purchased through other vendors |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | Can be purchased through other vendors |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Can be purchased through other vendors |
| Tissue Plus OCT Compound | Fisher Scientific | 4585 | |
| CryoMolds (15 mm x 15 mm x 5mm) | Fisher Scientific | 22-363-553 | Can be purchased through other vendors |
| Microscope Slides (25mm x 75mm) | MidSci | 1354W | Can be purchased through other vendors |
| Coverslips (22 x 22 x 1) | Fisher Scientific | 12-542-B | Can be purchased through other vendors |
| Poly-L-Lysine Solution (0.01%) | EMD Millipore | A-005-C | Can be purchased through other vendors |
| HM525 NX Cryostat | Thermo Fischer Scientific | 956640 | |
| MX35 Premier Disposable Low-Profile Microtome Blades | Thermo Fischer Scientific | 3052835 | |
| Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack | Fisher Scientific | 08-812 | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | Can be purchased through other vendors |
| TritonX-100 | Acros | 21568 | Can be purchased through other vendors |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | Can be purchased through other vendors |
| Phospho-Stat1 (Ser727) antibody | Cell Signaling | 9177 | |
| VR1 Antibody (C-15) | Santa Cruz | sc-12503 | |
| DyLight 488 Donkey anti Rabbit | Jackson Immuno Research | 711-485-152 | Discontinued |
| DyLight 488 Donkey anti Goat | Jackson Immuno Research | 705-485-003 | Discontinued |
| Rhodamine (TRTIC) Donkey anti Rabbit | Jackson Immuno Research | 711-025-152 | Discontinued |
| ProLong® Diamond Antifade Mountant w/ DAPI | Thermo Fisher | P36971 | |
| (−)-N6-(2-Phenylisopropyl)adenosine | Sigma Aldrich | P4532 | |
| 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine | Sigma Aldrich | C101 | |
| siRNA pSTAT1 | Qiagen | Custome Made | Kaur et al. 201120 |
| siRNA NOX3 | Qiagen | Custome Made | Kaur et al. 201120 |
| Scrambled Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Kaur et al. 201120 |
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