Summary
אנו מציגים טכניקה לניהול מקומי של תרופות דרך המסלול טרנס-tympanic לתוך שבלול. משלוח סמים דרך מסלול זה לא להפריע נגד סרטן היעילות של תרופות כימותרפיות כגון ציספלטין.
Abstract
המינהל מערכתית של סוכנים מגן לטיפול ototoxicity תחת השפעת סמים מוגבל על ידי האפשרות כי אלה סוכני המגן עלולה להפריע היעילות כימותרפיות של הסמים העיקרי. זה נכון במיוחד עבור ציספלטין סמים, הקלוש הם שפעולותיהם נגד סרטן על ידי נוגדי חמצון אשר מספקים הגנה נאותה מפני אובדן שמיעה. סוכנים otoprotective הנוכחי או פוטנציאליים אחרים יכול להוות בעיה דומה, אם מנוהל מערכתית. היישום של ביולוגים או מגן סוכנים שונים ישירות אל שבלול תאפשר לקבלת רמות גבוהות של סוכנים אלה באופן מקומי עם תופעות מערכתיות מוגבלת. בדו ח זה, נדגים שיטה טרנס-tympanic משלוח של סמים או ריאגנטים ביולוגיים שונים כדי שבלול, צריך לשפר את מדע בסיסי מחקר על שבלול ומספקות בצורה פשוטה לכוון את השימוש של סוכנים otoprotective המרפאות. דו ח זה מפרט את שיטת משלוח סמים טרנס-tympanic ומספק דוגמאות איך טכניקה זו שימש בהצלחה בחיות ניסיוני לטיפול ototoxicity ציספלטין.
Introduction
מערכת השמיעה היקפיים רגיש להפליא תרופות כמו אנטיביוטיקה ציספלטין ו- aminoglycoside. ציספלטין הוא סוכן כימותרפיות בשימוש נרחב לטיפול של מגוון רחב של גידולים מוצקים, כגון השחלות, האשכים, ראש צוואר סרטן. Ototoxicity מנוסה עם השימוש של תרופה זו במינון-מגבילה, די נפוץ, המשפיעים על 75-100% מהחולים שטופלו1. סמים אחרים, כגון carboplatin oxaliplatin, הופיעו חלופות ציספלטין2,3,4,5כמו, אבל התועלת שלהם היא מוגבלת מספר סוגי סרטן.
לימודי הראו את תפקיד קריטי של מינים חמצן תגובתי (ROS) בתיווכן של ototoxicity המיוצר על ידי ציספלטין ו- aminoglycosides. מחקרים מאוחרים יותר הראו כי איזופורם NOX3 אוקסידאז nadph ל הוא המקור העיקרי של ROS ב שבלול, מופעל על-ידי ציספלטין6,7. הדור של ROS פשרות נוגד חמצון אגירה קיבולת של תאים, המוביל גדל השומנים peroxidation של ממברנות הסלולר8. יתר על כן, ציספלטין מגביר הייצור של רדיקלים הידרוקסיל המניבות אלדהיד רעיל מאוד 4-hydroxynonenal (4-HNE), יזם של התא מות9,10. על סמך ממצאים אלה, מספר חמצון נבדקו לטיפול של ציספלטין ototoxicity. אלה כוללים N-אצטיל-ציסטאין (NAC), נתרן תיוסולפט (STS), amifostine ו- D-מתיונין. עם זאת, הדאגה העיקרית של טיפול נוגד חמצון היא כי נוגדי חמצון אלה יכול להפחית את היעילות כימותרפיות ציספלטין כאשר ניתנת מערכתית11 דרך האינטראקציה של ציספלטין עם קבוצות תיול מולקולות נוגדות חמצון.
על רקע בעיות אלה בטיפול נוגד חמצון, מטרתו של מחקר זה הייתה לבחון את תוואי חוצה-tympanic אספקת חומרים נוגדי חמצון וסמים אחרים שבלול כדי לצמצם את אובדן שמיעה. תוואי חוצה-tympanic סמים ומפריעים קצר (si) RNA, המתוארים להלן, נראה מבטיח במיוחד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Wistar זכר חולדות שטופלו על פי החיה מכוני הבריאות הלאומיים להשתמש הנחיות פרוטוקול אושרה על ידי מינהל דרום אילינוי אוניברסיטת בית הספר של רפואה מעבדה חיה טיפול הוועדה להשתמש. תגובת גזע המוח (ABR) בוצעה על חולדות בזמן תחת הרדמה לפני והתרופות האמריקני ו- 72 h לאחר כדי לאמת את ההשפעה של משלוח סמים טרנס-tympanic.
1. תגובה גזע המוח (ABR)
הערה: ABR מדידות נאספו באמצעות השמיעה ציוד בדיקות תוכנה. ABR מייצג לפוטנציאלים או גלים בתדירות גבוהה שנוצרו על-ידי עצב הגולגולת השמיני (גל I ו- II) ומבנים אחרים גבוהה יותר גזע המוח השמיעתית כולל anteroventral שבלול גרעין (הגל השלישי), lemniscus הלטראלי (הגל הרביעי) נחות רקתי (גל V). הגלים האלה מובחנים בהתאם ההשהיה. ABR מדידות בוצעו כפי שתואר לעיל12.
- עזים ומתנגד חולדות בתערובת של 90 מ"ג/ק"ג קטמין ו- 17 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים באמצעות בקרום הבטן הזרקה. לאשר את עומק ההרדמה באמצעות הבוהן-קמצוץ רפלקס. חלות שתי העיניים כדי למנוע ייבוש העיניים ולהימנע כיבת במהלך הרדמה שימון אופטלמולוגי (או טיפות שמן מינרלי).
- מקם את החולדה במצב שכיבה על כרית החימום (37 מעלות צלזיוס) בתוך תא אקוסטי מבוקרת. ציוד בדיקות audiology ממוקם בחוץ, ליד הביתן.
- הכנס פלדת אל-חלד אלקטרודות בהתאם: לאגף האלקטרודה הקרקע בחלק האחורי, את האלקטרודה החיובית בין שתי האוזניים ישירות על גבי הגולגולת, האלקטרודות שלילי מתחת פינה בכל אוזן.
- החל אקוסטית גירויים באמצעות מתמרים בתדירות גבוהה כמו פרץ הטון 5 ms-8, 16 ו- 32 קילו-הרץ. לקבוע עוצמות הגירוי כמו רמת לחץ קול דציבלים (dB SPL). זה מתחיל ב 10 dB SPL ומגיעה SPL 90-dB עם גודל שלב 10-dB. כיילו את עוצמות הקול הפלט המרבית של SPL 90-dB באמצעות של הדחף דיוק קול מד-רמה.
הערה: תוצאת הבדיקה נותנת אינדיקציה השלמות של האיבר שמיעה היקפית, שבלול, המבנים השמיעה הנ. ואת נוצרים בתוך 15 ms של גירוי קלט ותלוי ההשהיה של הגלים בזמן הולכה, אשר בתורו מוסדר על ידי שלושה גורמים קריטיים: נפח המוח, את העוצמה, וגם את התדירות של הצליל. רופא בכיר נרשמו באמצעות תוכנה המסופקת על ידי היצרן. - שקול את עוצמת מינימום אשר שעלול לעורר שני ואת שונים (II ו- III) של 0.5 µV משרעת כמו הסף באופן בולט.
הערה: המשמרת סף מייצגת את ההבדל בין הסף נמדד לאחר הטיפול לעומת הסף שהושגו לפני הטיפול.
2. טרנס-Tympanic זריקות
- כדי להזריק את הסם טרנס-tympanically, מקם את החולדה במצב חימום הלטראלי השמאלי.
- הכנס specula האוזן חד פעמיות 2.5 מ מ לתוך תעלת האוזן.
- עם השימוש של תחום כירורגי, מקם את specula כך התוף הוא גלוי.
- באמצעות 29 G X ½, מזרק אינסולין 0.5 mL, צייר את µL 50 של האדנוזין איזופרופיל phenyl [R] - N-(R-PIA) פתרון (1 מיקרומטר), 8-Cyclopentyl-1, 3-dipropylxanthine (DPCPX) פתרון (3 מיקרומטר) או פתרון siRNA (0.9 µg) כדי להזריק (5 יחידות).
- השתמש את specula לכוון את המחט לאזור נחות הקדמי התוף.
- דקרו דרך הקרום עם המחט ולפקח על הסמים מוזכרת 1.2.3. לאפשר את החולדה לנוח בתנוחה זו למשך 15 דקות.
הערה: 50 µL צריך להיות לאמצעי הולם להיכנס מאחורי התוף. אין נוזלים צריך להיות בתעלת האוזן לאחר ניהול. - למקם את החולדה הזכות חמצן לרוחב למקם וחזור על שלבים 1.2.1 דרך 1.2.5 עבור ניהול באוזן השנייה.
- עבור עכברים שקיבלו ציספלטין intraperitoneally, למקם את החולדה במצב פרקדן על כרית החימום ב 37 º C.
- שימוש 21 G X 3/4 פרפר המחט (אורך צינורות-12), צייר את ציספלטין (11 מ"ג/ק"ג, 1 מ"ג/מ"ל פתרון סטרילי פוספט תמיסת מלח מאגר [PBS]).
- באמצעות מזרק משאבה, לנהל ציספלטין (1 מ"ג/מ"ל) באמצעות בקרום הבטן הזרקת מעל 30 דקות.
הערה: עכברוש 250-g, אמצעי האחסון יהיה 2.75 מ ל שיעור של-0.1 מ"ל לכל מין.
- נמשיך לעקוב העומק של הרדמה במהלך הליכים אלה. לאחר סיום הממשל ציספלטין, למקם את החולדה חזרה לכלוב במצב שכיבה, מוודא. הכל הולך להכשיל את הנשימה שלה.
- נטר את החולדה עד החלים לחלוטין.
3. שבלול לנתיחה, Decalcification
- בעקבות ABR הסופית (לאחר 72 h), עזים ומתנגד העכברוש בתערובת של 90 מ"ג/ק"ג קטמין ו- 17 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים באמצעות בקרום הבטן הזרקה. לאשר הרדמה עם רפלקס הבוהן-קורט. המתת חסד עכברים באמצעות עריפת ראש.
- שווייץ העצם הטמפורלית כפי שתואר לעיל13.
- מקום שבלול 4% paraformaldehyde 1 x פתרון PBS ב בקבוקון נצנוץ 7-מ"עמ (מכסה לחלוטין שבלול). להכניס למקרר למשך הלילה ב 4 º C. להסיר paraformaldehyde, לשטוף עם PBS x 1 בטמפרטורת החדר.
- הסר PBS ולמלא את הצינור לחלוטין עם פתרון 120 מ של EDTA (pH 7.3). מניחים על מסובב בטמפרטורת החדר ולאפשר decalcification במשך 2-3 שבועות, שינוי הפתרון EDTA מדי יום.
4. Cryosectioning
- עם הסיום של decalcification, המהירה שבלול ב הפתרונות הבאים (7 מ ל כל אחד) במשך 24 שעות ביממה ב 4 ° c: 10% סוכרוז, 20% סוכרוז, 1:1 תערובת של 20% סוכרוז, טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) הטמעה מורכבים.
- במקום OCT טריים תרכובת. כדי למלא ומכסים לחלוטין שבלול ב 15 מ"מ x 15 מ"מ x 5 מ מ חד פעמיות הטבעה עובש. אוריינט שבלול על הצד כך שהוא מקביל לשורש להטבעה, כפי שתואר על ידי Whitlon et al. 14
- מיד במקום העובש על קרח יבש כדי לחזק את ה-OCT ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לטבול שקופיות מיקרוסקופ ב- 0.01% פולי-L ליזין בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות להסיר השקופיות, לא לשטוף, וגם תאפשר לילה יבש. השתמש שקופיות אלה עבור cryosections.
- להסיר שבלול ב אוקטובר מהמקפיא-80 מעלות ומניחים אותו על קרח יבש. בעזרת סכין חדה מיקרוטום (L x w: 80 מ מ x 8 מ מ, עובי 0.25 מ מ, חיתוך בזווית של 34 °), סעיף הבלוקים OCT-10 מיקרומטר באמצעות cryostat ב-30 מעלות צלזיוס. מקום שני מקטעים לכל שקופית.
- להכניס למקרר שקופיות ב 4 ° C בסיום.
5. אימונוהיסטוכימיה
- מקם את השקופיות זכוכית מיקרוסקופ שקופית מכתים מאכל על מתלה שקופיות. למלא את הצלחת עם 350 מ של 1 x PBS ולשטוף את השקופיות עבור 5 דקות שלוש פעמים בטמפרטורת החדר.
- הסר את השקופיות של המנה, לייבש את האזור סביב הרקמה באמצעות מחיקה יבשה, להיות בטוח שלא לייבש את הרקמה.
- באמצעות עט חסימה נוזלי, צייר עיגול מסביב סעיף הרקמה.
- לחסום את הרקמה לשעה בטמפרטורת החדר על-ידי הוספת µL 150 של פתרון חסימה המכיל 10% רגילה (חמור) סרום דטרגנט nonionic 1%, 1% BSA ב- 1 x PBS.
- הקש את עודף פתרון חסימה, דגירה הרקמה בין לילה ב 4 ° C בתוך תא humidified עם 150 µL של 10% רגילה (חמור) בסרום, דטרגנט nonionic 0.1% נוגדן ראשוני (ראה להלן בהערה) ב 1 x PBS.
הערה: עבור הבאים נוגדנים, שימשו דילולים אלה: עבור איור 2 ו- 3, p-STAT1 Ser727 1:300. איור 4, p-STAT1 Ser727, בטחונות, TRPV1 מטריים. - מקם את השקופיות זכוכית מיקרוסקופ בשקופית מכתים מאכל על מתלה שקופיות. למלא את הצלחת עם 350 מ של 1 x PBS ולשטוף שקופיות עבור 5 דקות שלוש פעמים בטמפרטורת החדר.
- דגירה עם נוגדנים משניים מדולל בתמיסה המכילה אבקת nonionic 0.01%, 10% רגילה (חמור) בסרום ב- PBS 1 x עבור 2 עד 3 שעות בטמפרטורת החדר בתוך תא humidified בחושך.
הערה: עבור הנוגדנים משני הבאים, שימשו דילולים אלה: עבור איור 2 ו- 3, 1:600 חמור נגד הארנב אג. איור 4, Rhodamine (TRITC) חמור נגד הארנב אג שבערך, החמור נגד עז אג שבערך. - מקם את השקופיות זכוכית מיקרוסקופ בשקופית מכתים מאכל על מתלה שקופיות. למלא את הצלחת עם 350 מ של 1 x PBS ולשטוף שקופיות עבור 5 דקות שלוש פעמים בטמפרטורת החדר.
- הקש על עודף נוזל מחוץ לשקופית ולאחר יבש השקופית עם מגבון יבש סביב הרקמה. הר השקופיות על-ידי הוספת טיפה אחת של הסוכן הרכבה עם דאפי ישירות על גבי הרקמה. לאט לאט למקם את coverslip עליון, המבטיח כי אין בועות נוצרות מתחת, ולאפשר את השקופיות לרפא ללילה בטמפרטורת החדר בחושך. לאחסן שקופיות ב 4 º C.
- תמונות שקופיות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. משתמשים בלייזר הדמיה כדלקמן: UV לייזר דאפי, 488 ננומטר לייזר עבור החמור נגד הארנב אג של 543 ננומטר לייזר עבור rhodamine TRITC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תגובות ABR שנמדד בחולדות-שלושה ימים הבאים ציספלטין המינהל הראו הגברה משמעותית של ספי. העלאת סף אלו פחתו משמעותית בחולדות עם טרנס-tympanic [R] - N - phenylisopropyladenosine (R-PIA), אדנוזין1 קולטן אגוניסט15, לפני ציספלטין. ייחודה של הפעולה של R-פיא-האדנוזין קולטן1 הודגם על ידי התצפית כי זה היה קומם מאת 8-Cyclopentyl-1, 3-dipropylxanthine (DPCPX), אנטגוניסט קולטן ספציפי1 A16. תרופה זו potentiated ציספלטין-induced ABR הסף משמרות (איור 1א'). בדומה השפעתו של הפקת אובדן שמיעה, ציספלטין גם הגדילה את האובדן/נזק לתאים החיצוני של השיער (מוערך על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים [SEM]) (איור 1B). תמונות SEM התקבלו כפי שתואר לעיל17. אפקט זה צומצם באופן משמעותי על ידי טרנס-tympanic מינהל R-פיא (איור 1C). יתר על כן, אנו מציגים את טרנס-tympanic R-PIA מפחית הבזליים, ציספלטין-induced p-STAT1 immunoreactivity ב שבלול, המשקף את המאפיין אנטי דלקתיות של תרופה זו (איור 2).
המסלול חוצה-tympanic יכול לשמש גם כדי לנהל תכשירים כגון siRNAs, אשר לגרום השפעות מועילות. טרנס-tympanic מינהל STAT1 siRNA חולדות רמות STAT1 ו- p-STAT1 ביעילות חוסמת את ההפעלה של זה גורם שעתוק ציספלטין (איור 3).
מחקרים נוספים מראים כי ניהול טרנס-tympanic של siRNA אחר עבור ה-mRNA NOX3 מופחתת היכולת של תרופות כגון קפסאיצין כדי להגדיל את מספר מתווכים במורד הזרם, כגון vanilloid פוטנציאלי קולטן ארעי (TRPV1) ערוץ 1 ו p-STAT1 ( איור 4). מגשרים אלה הם מעורבים אובדן שמיעה קפסאיצין המושרה18.
איור 1: טרנס-tympanic מינהל R-PIA מופחתת ציספלטין-induced אובדן שמיעה ומוגנים מפני אובדן תאי שיער החיצוני. א ספי ABR נמדדו אצל חולדות לפני ו- 72 h לאחר יתייחסו אליהם עם ציספלטין (11 מ"ג/ק"ג, i.p.) בעקבות טרנס-tympanic מינהל R-פיה או DPCPX + R-PIA. ציספלטין-induced העלאת סף ABR הוצגה להיות הקלוש מאת A1AR אגוניסט, R-PIA. ניהול משותף של אנטגוניסט1AR A, DPCPX, הפוך את ההשפעה של R-פיא על הסף ABR והפיקו משמעותית גבוהות ש-ABR משמרות ציספלטין כלל התדרים נבדק. החץ מצביע על המשמרת סף האפס ABR. B. ציספלטין הטיפול הראו נזק משמעותי תאי השיער החיצוני (OHC) (חץ לבן) כפי שמתואר על-ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM). R-PIA מוגן את OHCs נגד ציספלטין-induced נזק, בעוד DPCPX attenuated ההשפעה המגנה של R-PIA. ג הגרף מציגה ניתוח כמותי של תמונות SEM שמוצג ב'. קווי השגיאה מציינים את שגיאת התקן של הממוצע. כוכביות (*) ו (*) מציינים הבדל משמעותי סטטיסטית בין קבוצות הטיפול הרכב או ציספלטין, בהתאמה, בעוד (*) מצביעה על הבדל משמעותי סטטיסטית מ- R-פיה + חולדות שטופלו ציספלטין (p < 0.05, n = 5). איור זה היה ממאמרו של קאור. et al. 19 בעלי הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : טרנס-tympanic מינהל אגוניסט1AR, R-פיא, מופחתת הגדילה ציספלטין p-STAT1 Immunoreactivity ב שבלול. חולדות נוהלו מנה בקרום הבטן של ציספלטין (11 מ"ג/ק"ג), אשר גדלו p-STAT1 Ser727 immunoreactivity, העריך ב 72 h פוסט והתרופות האמריקני. עם זאת, רעלני 1 h עם טרנס-tympanic R-PIA קהה עלייה זו ב- p-STAT1 immunoreactivity. טיפול משותף של א1AR אנטגוניסט, DPCPX, יחד עם אגוניסט להפוך עיכוב של p-STAT1 immunoreactivity. צביעת התכלת מייצג שהוכתמו דאפי גרעינים, ואילו צביעת ירוק מייצג p-STAT1 immunolabeling. OHC ו- DC מייצגים תא שיער החיצוני, התא של וייפגר, בהתאמה. חיצים לבנים מציינים שלוש שורות OHCs. בר בקנה מידה מוצגים בחלונית השמאלית התחתונה הוא 10 מיקרומטר. איור זה היה ממאמרו של קאור. et al. 19 בעלי הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : ניהול טרנס-tympanic של STAT1 siRNA רמות ציספלטין חסום-induced p-STAT1. שבלולי מקטעים מבודד חולדות מנוהל עם ציספלטין (11 מ"ג/ק"ג, i.p.) על 72 h הראה מוגברת Ser727 p-STAT1 immunoreactivity OHCs. טיפול קדם עם טרנס-tympanic STAT1 siRNA (0.9 מ ג) הקלוש ציספלטין-induced עלייה p-STAT1 immunoreactivity, ואילו מעורבל הטיפול הראה שום השפעה. צביעת התכלת מייצג שהוכתמו דאפי גרעינים, ואילו צביעת ירוק מייצג p-STAT1 immunolabeling. חיצים לבנים מציינים שלוש שורות OHCs. סרגל קנה מידה המוצגים בלוח הימני התחתון מודד 10 מיקרומטר. איור זה היה ממאמרו של קאור. et al. 20 עם הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : SiRNA הזרקה טרנס-tympanic של NOX3 TRPV1 מפחיתה ורמות p-STAT1 ב שבלול עכברוש. חולדות ומורדמת siRNA מנוהל בצורה משובשת (לערבל) או NOX3 siRNAs על ידי זריקות טרנס-tympanic, אשר היה ואחריה יומיים מאוחר יותר זריקות טרנס-tympanic של קפסאיצין עבור cochleae מבודדים 24h. החיות האלה היו מוכתמים עבור p-STAT1 Ser727 , TRPV1 immunoreactivity. קפסאיצין גדל TRPV1 (ירוק) והן p-STAT1 Ser727 (אדום) immunoreactivity ב- 24 שעות ביממה לחריץ vascularis (SVA), תאים שיער החיצוני (OHC), ואת תאי גנגליון (SG) ספירלה. לעומת זאת, בעלי חיים מיוחדים עם NOX3 siRNA לא הראה כל אינדוקציה גלוי של p-STAT1 Ser727 של TRPV1 immunolabeling. סולם ברים (לוח נכון התחתון) מייצגים 50 ו- 10 מיקרומטר עבור כניסות. איור זה הותאם מ. Mukherjea et al. 18 באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המסלול המינהל טרנס-tympanic מאפשר למסירה המותאמות לשפות אחרות של סמים, סוכנים אחרים שבלול אשר יכול לייצר אחרת מערכתית תופעות לוואי משמעותיות אם מנוהל מערכתית. שיטה זו של והתרופות האמריקני מאפשר גישה מהירה של סמים לאתר של פעולה במינון גבוה משמעותית מאשר תושג באמצעות תוואי מערכתי. התוצאות המובאות כאן ופורסמו בעבר הראו כי הממשל טרנס-tympanic של אדנוזין איזופרופיל phenyl [R] - N-(R-PIA) מוגן שבלול מפני אובדן (איור 1) הנוצרות על-ידי ציספלטין תא שיער החיצוני19 ונחלשו אינדוקציה של דלקת כפי שמתואר על-ידי הפעלה של גורם שעתוק STAT1 (בהשוואה לאלו שטופלו ציספלטין או R-פיה + DPCPX + ציספלטין) (איור 2)19. יתרונות אלו יכול לתרום ההגנה מפני אובדן שמיעה המוענקת על ידי התרופה. בהתבסס על ניסיון קודם, נוכל לטעון אחד בלבד והתרופות האמריקאי נדרש. זה יכול להצביע כי התרופה נשמרת באוזן התיכונה, יכול לאט שאפשר לקחת לתוך שבלול כדי לספק הגנה במשך שלושה ימים שבעלי חיים אלה הם העריכו עבור ototoxicity. טכניקה זו נמצא בשימוש כעת כדי לספק תרופות אחרות לתוך האוזן הפנימית כדי לקבוע את היעילות שלהם כמו אוטו-protectants.
בנוסף סמים, טרנס-tympanic מינהל siRNAs יכול לספק נוקאאוט יעיל של RNAs סלקטיבית כדי להפחית את רמות החלבון שלהם ולספק הגנה oto18,20. שוב, אלה siRNAs יספק רעילות פחות אם הם מועברים בקרבתו של שבלול. משך נוקאאוט היה עד שלושה ימים (את הגבול של תקופת ההערכה שלנו). חשוב, התוספת של siRNAs חוסמת את אינדוקציה של חלבון התואם שלהם על ידי תרופות ototoxic, כגון ציספלטין. משך נוקאאוט הוא די מפתיע בהתחשב השפע של nucleases נוזל חוץ-תאי, וכן תאים ואת הקושי פוטנציאל בהעברת מולקולות אלה לתוך תאים שבלול. עם זאת, הפגנה של נוקאאוט שני חלבונים, אוטו-הגנת ירמוז כי siRNAs אלה מגיעות שבלול בריכוזים יעיל.
למרות היתרונות שתוארו לעיל, מגבלות מסוימות של טכניקה זו הם הצפוי. אלה כוללים את הצורך מאלחש את חיות ניסוי לפני הפעלת ההליך. חייב להיות מנוהל סמים בריכוזים גבוהים לתוך האוזן התיכונה מאז רק חלק קטן (~ 1-10%) צפוי להגיע את perilymph. בנוסף, חלוקת תרופות יישומית או ביולוגים הינו מרוכז יותר בבסיס שבו ההשפעה הגדולה ביותר שנצפו.
בעוד טרנס-tympanic משלוח של סוכנים המובאת כאן היה מוגבל לחולדות, שיטה דומה של מסירה סמים יכול לשמש מניעה בחולים אשר מצפים כימותרפיה עם תרופות כגון ציספלטין. הוא צפוי כי שיטה זו של תרופות שיוכלו לאמץ במהירות לבני למסך מספר רב של תרכובות אשר הוכיחו את יעילותם בטיפול בסמים-induced אובדן שמיעה אצל חיות ניסוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
העבודה המתוארות במאמר זה נתמך על ידי NCI RO1 CA166907, NIDCD RO1-DC 002396 RO3 DC011621.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketathesia (100 mg/ml) 10 ml | Henry Schein | 56344 | Controlled substance |
| AnaSed Injection/Xylazine (20 mg/ml) 20 ml | Henry Schein | 33197 | |
| 2.5 mm disposable ear specula | Welch Allyn | 52432 | |
| Surgical Scope | Zeiss | ||
| 29 G X 1/2 insulin syringe | Fisher Scientific | 14-841-32 | Can be purchased through other vendors |
| cis-Diammineplatinum(II) dichloride | Sigma Aldrich | P4394 | TOXIC - wear proper PPE |
| Harvard 50-7103 Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | Series 863 | |
| Excel International 21 G X 3/4 butterfly needle | Fisher | 14-840-34 | Can be purchased through other vendors |
| BSP Single Speed Syringe Pump | Brain Tree Sci, Inc | BSP-99 | |
| Pulse Sound Measurement System | Bruel & Kjaer | Pulse 13 software | |
| High-Frequency Module | Bruel & Kjaer | 3560C | |
| 1/8″ Pressure-field Microphone —-Type 4138 | Bruel & Kjaer | bp2030 | |
| High Frequency Transducer | Intelligent Hearing System | M014600 | |
| Opti-Amp Power Transmitter | Intelligent Hearing System | M013010P | |
| SmartEP ABR System | Intelligent Hearing System | M011110 | |
| Disposable Subdermal EEG Electrodes | CareFusion | 019-409700 | |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | Fisher Scientific | 28908 | TOXIC - wear proper PPE |
| 7 mL Borosilicate Glass Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-26 | Can be purchased through other vendors |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | Can be purchased through other vendors |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Can be purchased through other vendors |
| Tissue Plus OCT Compound | Fisher Scientific | 4585 | |
| CryoMolds (15 mm x 15 mm x 5mm) | Fisher Scientific | 22-363-553 | Can be purchased through other vendors |
| Microscope Slides (25mm x 75mm) | MidSci | 1354W | Can be purchased through other vendors |
| Coverslips (22 x 22 x 1) | Fisher Scientific | 12-542-B | Can be purchased through other vendors |
| Poly-L-Lysine Solution (0.01%) | EMD Millipore | A-005-C | Can be purchased through other vendors |
| HM525 NX Cryostat | Thermo Fischer Scientific | 956640 | |
| MX35 Premier Disposable Low-Profile Microtome Blades | Thermo Fischer Scientific | 3052835 | |
| Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack | Fisher Scientific | 08-812 | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | Can be purchased through other vendors |
| TritonX-100 | Acros | 21568 | Can be purchased through other vendors |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | Can be purchased through other vendors |
| Phospho-Stat1 (Ser727) antibody | Cell Signaling | 9177 | |
| VR1 Antibody (C-15) | Santa Cruz | sc-12503 | |
| DyLight 488 Donkey anti Rabbit | Jackson Immuno Research | 711-485-152 | Discontinued |
| DyLight 488 Donkey anti Goat | Jackson Immuno Research | 705-485-003 | Discontinued |
| Rhodamine (TRTIC) Donkey anti Rabbit | Jackson Immuno Research | 711-025-152 | Discontinued |
| ProLong® Diamond Antifade Mountant w/ DAPI | Thermo Fisher | P36971 | |
| (−)-N6-(2-Phenylisopropyl)adenosine | Sigma Aldrich | P4532 | |
| 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine | Sigma Aldrich | C101 | |
| siRNA pSTAT1 | Qiagen | Custome Made | Kaur et al. 201120 |
| siRNA NOX3 | Qiagen | Custome Made | Kaur et al. 201120 |
| Scrambled Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Kaur et al. 201120 |
References
- McKeage, M. J. Comparative adverse effect profiles of platinum drugs. Drug Saf. 13 (4), 228-244 (1995).
- Boulikas, T., Vougiouka, M. Cisplatin and platinum drugs at the molecular level. Oncol Rep. 10 (6), 1663-1682 (2003).
- Fouladi, M., et al. Phase II study of oxaliplatin in children with recurrent or refractory medulloblastoma, supratentorial primitive neuroectodermal tumors, and atypical teratoid rhabdoid tumors: a pediatric brain tumor consortium study. Cancer. 107 (9), 2291-2297 (2006).
- Pasetto, L. M., D'Andrea, M. R., Rossi, E., Monfardini, S. Oxaliplatin-related neurotoxicity: how and why. Crit Rev Oncol Hematol. 59 (2), 159-168 (2006).
- Ardizzoni, A., et al. Cisplatin- versus carboplatin-based chemotherapy in first-line treatment of advanced non-small-cell lung cancer: an individual patient data meta-analysis. J Natl Cancer Inst. 99 (11), 847-857 (2007).
- Banfi, B., Malgrange, B., Knisz, J., Steger, K., Dubois-Dauphin, M., Krause, K. H. NOX3, a superoxide-generating NADPH oxidase of the inner ear. J Biol Chem. 279 (44), 46065-46072 (2004).
- Mukherjea, D., Whitworth, C. A., Nandish, S., Dunaway, G. A., Rybak, L. P., Ramkumar, V. Expression of the kidney injury molecule 1 in the rat cochlea and induction by cisplatin. Neuroscience. 139 (2), 733-740 (2006).
- Rybak, L. P., Husain, K., Morris, C., Whitworth, C., Somani, S. Effect of protective agents against cisplatin ototoxicity. Am J Otol. 21 (4), 513-520 (2000).
- Lee, J. E., et al. Role of reactive radicals in degeneration of the auditory system of mice following cisplatin treatment. Acta Otolaryngol. 124 (10), 1131-1135 (2004).
- Lee, J. E., et al. Mechanisms of apoptosis induced by cisplatin in marginal cells in mouse stria vascularis. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 66 (3), 111-118 (2004).
- Lawenda, B. D., Kelly, K. M., Ladas, E. J., Sagar, S. M., Vickers, A., Blumberg, J. B. Should supplemental antioxidant administration be avoided during chemotherapy and radiation therapy. J Natl Cancer Inst. 100 (11), 773-783 (2008).
- Akil, O., Oursler, A. E., Fan, K., Lustig, L. R. Mouse auditory brainstem response testing. Bio Protoc. 6 (6), 1768 (2016).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J. Vis. Exp. (107), e53561 (2016).
- Whitlon, D. S., Szakaly, R., Greiner, M. A. Cryoembedding and sectioning of cochleas for immunocytochemistry and in situ hybridization. Brain Res Brain Res Protoc. 6 (3), 159-166 (2001).
- Londos, C., Cooper, D. M., Wolff, J. Subclasses of external adenosine receptors. Proc Natl Acad Sci. 77 (5), 2551-2554 (1980).
- Lohse, M. J., Klotz, K. N., Lindenborn-Fotinos, J., Reddington, M., Schwabe, U., Olsson, R. A. 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX)--a selective high affinity antagonist radioligand for A1 adenosine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 336 (2), 204-210 (1987).
- Rybak, L. P., Whitworth, C., Scott, V., Weberg, A. D., Bhardwaj, B. Rat as a potential model for hearing loss in biotinidase deficiency. Ann Otol Rhinol Laryngol. 100 (4), Pt 1 294-300 (1991).
- Mukherjea, D., et al. NOX3 NADPH oxidase couples transient receptor potential vanilloid 1 to signal transducer and activator of transcription 1-mediated inflammation and hearing loss. Antioxid Redox Signal. 14 (6), 999-1010 (2011).
- Kaur, T., et al. Adenosine A1 receptor protects against cisplatin ototoxicity by suppressing the NOX3/STAT1 inflammatory pathway in the cochlea. J Neurosci. 36 (14), 3962-3977 (2016).
- Kaur, T., Mukherjea, D., Sheehan, K., Jajoo, S., Rybak, L. P., Ramkumar, V. Short interfering RNA against STAT1 attenuates cisplatin-induced ototoxicity in the rat by suppressing inflammation. Cell Death Dis. 2 (180), (2011).
