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Medicine

Ototoxicity के इलाज के लिए ट्रांस कान दवा का वितरण

Published: March 16, 2018 doi: 10.3791/56564
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1,2, 2
1Department of Surgery, Division of Otolaryngology, Southern Illinois University School of Medicine, 2Department of Pharmacology, Southern Illinois University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

हम कोक्लीअ में ट्रांस कान मार्ग के माध्यम से दवाओं के स्थानीयकृत प्रशासन के लिए एक तकनीक प्रस्तुत करते हैं । इस मार्ग के माध्यम से दवा वितरण सिस्प्लैटिन जैसे कीमोथेरेपी दवाओं के विरोधी कैंसर प्रभावकारिता के साथ हस्तक्षेप नहीं होता ।

Abstract

सुरक्षात्मक एजेंटों के प्रणालीगत प्रशासन दवा प्रेरित ototoxicity के इलाज के लिए संभावना है कि इन सुरक्षात्मक एजेंटों प्राथमिक दवाओं की कीमोथेरेपी प्रभावकारिता के साथ हस्तक्षेप कर सकता द्वारा सीमित है । यह दवा सिस्प्लैटिन, जिसका विरोधी कार्रवाई antioxidants द्वारा तनु जो सुनवाई हानि के खिलाफ पर्याप्त सुरक्षा प्रदान कर रहे है के लिए विशेष रूप से सच है । अंय वर्तमान या संभावित otoprotective एजेंटों एक समान समस्या पैदा कर सकता है, अगर प्रशासित प्रणालीबद्ध । कोक्लीअ के लिए सीधे विभिन्न जैव-तार्किक या सुरक्षात्मक एजेंटों के आवेदन सीमित प्रणालीगत दुष्प्रभावों के साथ स्थानीय रूप से इन एजेंटों के उच्च स्तर के लिए अनुमति होगी । इस रिपोर्ट में, हम कोक्लीअ के लिए विभिन्न दवाओं या जैविक रिएजेंट के वितरण की एक ट्रांस-कान विधि प्रदर्शित करते हैं, जो कोक्लीअ पर बुनियादी विज्ञान अनुसंधान को बढ़ाने और क्लीनिक में otoprotective एजेंटों के उपयोग के निर्देशन का एक सरल तरीका प्रदान करना चाहिए । यह रिपोर्ट ट्रांस-कान दवा वितरण की एक विधि का ब्यौरा देती है और इस तकनीक को सिस्प्लैटिन ototoxicity के इलाज के लिए प्रायोगिक पशुओं में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किए जाने के उदाहरण प्रदान करती है ।

Introduction

परिधीय श्रवण प्रणाली ऐसी सिस्प्लैटिन और aminoglycoside एंटीबायोटिक दवाओं के रूप में अति संवेदनशील है । सिस्प्लैटिन ऐसे डिम्बग्रंथि, वृषण, और सिर और गर्दन के कैंसर के रूप में ठोस ट्यूमर, की एक किस्म के उपचार के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया कीमोथेरेपी एजेंट है । Ototoxicity इस दवा के उपयोग के साथ अनुभवी खुराक सीमित है और काफी आम है, प्रभावित रोगियों के 75-100% का इलाज किया1. carboplatin और oxaliplatin के रूप में अंय दवाओं, सिस्प्लैटिन2,3,4,5के लिए विकल्प के रूप में उभरा है, लेकिन उनकी उपयोगिता कुछ कैंसर तक ही सीमित है ।

प्रारंभिक अध्ययन सिस्प्लैटिन और एमिनोग्लीकोसाइड्स द्वारा उत्पादित ototoxicity मध्यस्थता में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) की महत्वपूर्ण भूमिका को दिखाया गया है । बाद के अध्ययनों से पता चला कि NADPH oxidase के NOX3 isoform ROS में कोक्लीअ का प्राथमिक स्रोत है, और सिस्प्लैटिन6,7से सक्रिय है । ROS की पीढ़ी कोशिकाओं के एंटीऑक्सीडेंट बफर क्षमता समझौता, सेलुलर झिल्ली की वृद्धि की लिपिड peroxidation के लिए अग्रणी8. इसके अलावा, सिस्प्लैटिन हाइड्रॉक्सिल कण जो अत्यधिक विषाक्त एल्डिहाइड 4-hydroxynonenal (4-HNE), कोशिका मृत्यु9,10के एक सर्जक उत्पंन का उत्पादन बढ़ जाती है । इन निष्कर्षों के आधार पर, सिस्प्लैटिन ototoxicity के उपचार के लिए कई एंटीऑक्सीडेंट की जांच की गई है । इनमें एन-एसिटाइल cysteine (एनएसी), सोडियम thiosulfate (अनुसूचित जनजाति), amifostine, और डी-methionine शामिल हैं । हालांकि, एंटीऑक्सीडेंट थेरेपी की एक प्रमुख चिंता यह है कि इन antioxidants सिस्प्लैटिन कीमोथेरेपी प्रभावकारिता को कम जब प्रणालीबद्ध के माध्यम से11 सिस्प्लैटिन की बातचीत एंटीऑक्सीडेंट अणुओं में thiol समूहों के साथ प्रशासित सकता है ।

एंटीऑक्सीडेंट थेरेपी के साथ इन समस्याओं को ध्यान में रखते हुए, इस अध्ययन का लक्ष्य कोक्लीअ को सुनने के नुकसान को कम करने के लिए antioxidants और अंय दवाओं देने के ट्रांस कान मार्ग की जांच की थी । नीचे वर्णित औषधि और लघु हस्तक्षेप (एसआई) आरएनए का ट्रांस-कान मार्ग, विशेष रूप से आशाजनक दिखाई देता है ।

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Protocol

पुरुष Wistar चूहों के अनुसार स्वास्थ्य पशु उपयोग के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों और एक दक्षिणी इलिनोइस विश्वविद्यालय चिकित्सा प्रयोगशाला पशु देखभाल और उपयोग समिति के स्कूल द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के साथ संभाल रहे थे । श्रवण brainstem प्रतिक्रिया (ABR) चूहों पर किया गया था जबकि संज्ञाहरण के तहत दवा प्रशासन से पहले और 72 ज ट्रांस कान दवा वितरण के प्रभाव को सत्यापित करने के बाद.

1. श्रवण Brainstem प्रतिसाद (ABR)

नोट: ABR माप श्रवण परीक्षण उपकरण और सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एकत्र किया गया । ABR क्षमता या उच्च आवृत्ति आठवें कपाल तंत्रिका (वेव मैं और द्वितीय) और anteroventral कॉकलियर नाभिक (वेव III), पार्श्व lemniscus (वेव IV) सहित अंय उच्च श्रवण मस्तिष्क स्टेम संरचनाओं द्वारा उत्पंन तरंगों का प्रतिनिधित्व करता है, और अवर colliculus (वेव वी) । इन तरंगों विलंबता के आधार पर विभेदित कर रहे हैं । ABR माप पहले12के रूप में वर्णित किया गया था ।

  1. Anesthetize चूहों के मिश्रण के साथ 90 मिलीग्राम/केजी ketamine और 17 मिलीग्राम/xylazine वाया intraperitoneal इंजेक्शन । पैर की अंगुली-चुटकी पलटा के माध्यम से संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें । लागू नेत्र स्नेहन (या खनिज तेल गिरता है) दोनों आंखों को सुखाने से आंखों को रोकने और संज्ञाहरण के दौरान अल्सर से बचने के लिए ।
  2. एक नियंत्रित ध्वनिक बूथ के अंदर एक हीटिंग पैड (37 डिग्री सेल्सियस) पर प्रवण स्थिति में चूहे प्लेस । फ़ेलोशिप परीक्षण उपकरण बाहर स्थित है और बूथ के बगल में ।
  3. स्टेनलेस स्टील इलेक्ट्रोड तदनुसार डालें: जमीन इलेक्ट्रोड रियर पार्श्व में, दोनों कानों के बीच सकारात्मक इलेक्ट्रोड सीधे खोपड़ी के ऊपर, और प्रत्येक कान के pinna नीचे नकारात्मक इलेक्ट्रोड.
  4. 8, 16, और 32 kHz पर एक 5 एमएस टोन फट के रूप में उच्च आवृत्ति ट्रांसड्यूसर का उपयोग ध्वनिक उत्तेजनाओं लागू करें । शोर ध्वनि दबाव स्तर (dB SPL) के रूप में उत्तेजना तीव्रता का निर्धारण । यह 10 डीबी spl पर शुरू होता है और एक 10 डीबी कदम आकार के साथ 90 डीबी SPL तक पहुंचता है । एक आवेग परिशुद्धता ध्वनि स्तर मीटर का उपयोग कर 90-डीबी SPL की एक अधिकतम उत्पादन के लिए ध्वनि तीव्रता जांचना ।
    नोट: परीक्षा परिणाम परिधीय सुनवाई अंग, कोक्लीअ, और aforementioned श्रवण संरचनाओं की अखंडता का एक संकेत देता है । waveforms के भीतर उत्पन्न कर रहे हैं 15 उत्तेजना इनपुट के एमएस और लहरों की विलंबता संचालन समय पर निर्भर करता है, जो बारी में तीन महत्वपूर्ण कारकों द्वारा विनियमित है: मस्तिष्क की मात्रा, तीव्रता, और ध्वनि की आवृत्ति. श्रवण क्षमता पैदा की निर्माता द्वारा प्रदान की सॉफ्टवेयर का उपयोग कर दर्ज की गई ।
  5. महत्वपूर्ण रूप से दहलीज के रूप में 0.5 µV आयाम के दो अलग waveforms (द्वितीय और III) पैदा कर सकते हैं जो न्यूनतम तीव्रता पर विचार करें.
    नोट: थ्रेशोल्ड शिफ्ट उपचार करने से पहले प्राप्त सीमा के साथ तुलना में उपचार के बाद मापा सीमा में अंतर का प्रतिनिधित्व करता है ।

2. ट्रांस-कान इंजेक्शन

  1. ड्रग ट्रांस-tympanically को व्यवस्थापित करने के लिए, चूहे को बाएँ पार्श्व decubitus स्थिति में रखें.
    1. कान नहर में 2.5 mm डिस्पोजेबल कान specula डालें ।
    2. एक शल्य क्षेत्र के उपयोग के साथ, specula इतना है कि कान झिल्ली दिखाई है स्थिति ।
    3. एक 29 जी एक्स ½, 0.5 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करना, ऊपर के 50 µ एल ड्रा [r]-N-फिनाइल isopropyl adenosine (r-पिया) समाधान (1 µ m), 8-Cyclopentyl-1, 3-dipropylxanthine (DPCPX) सॉल्यूशन (3 µ मी), या सिरना सॉल्यूशन (0.9 µ G) इंजेक्ट करने के लिए (5 इकाइयां) ।
    4. सुई को कान झिल्ली के पूर्वकाल अवर क्षेत्र के लिए निर्देशित करने के लिए specula का उपयोग करें ।
    5. सुई के साथ झिल्ली के माध्यम से एक छेद प्रहार और 1.2.3 में वर्णित दवाओं प्रशासन । 15 मिनट के लिए इस स्थिति में चूहे को आराम करने की अनुमति दें ।
      नोट: 50 µ एल कान झिल्ली के पीछे फिट करने के लिए पर्याप्त मात्रा में होना चाहिए । प्रशासन के बाद कोई भी द्रव कान नहर में नहीं लगना चाहिए ।
    6. दाएं पार्श्व decubitus स्थिति में चूहे प्लेस और दूसरे कान में प्रशासन के लिए 1.2.5 के माध्यम से 1.2.1 कदम दोहराएं ।
  2. सिस्प्लैटिन intraperitoneally प्राप्त चूहों के लिए, लापरवाह स्थिति में एक हीटिंग पैड पर 37 डिग्री सेल्सियस पर चूहे की जगह ।
    1. एक 21 जी X 3/तितली सुई (12 "लंबाई टयूबिंग) का उपयोग करना, सिस्प्लैटिन आकर्षित (11 मिलीग्राम/किलो, बाँझ फॉस्फेट बफर खारा में 1 मिलीग्राम/
    2. एक सिरिंज पंप का उपयोग करना, 30 मिनट से अधिक intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से सिस्प्लैटिन (1 मिलीग्राम/
      नोट: 250 जी चूहे के लिए यह मात्रा लगभग 0.1 मिलीलीटर प्रति मिनट की दर से 2.75 मिलीलीटर होगी ।
  3. इन प्रक्रियाओं में संज्ञाहरण की गहराई की निगरानी करने के लिए जारी रखें । एक बार सिस्प्लैटिन प्रशासन पूरा हो जाता है, चूहे को प्रवण स्थिति में पिंजरे में वापस जगह, यकीन है कि वहां कुछ भी नहीं है अपनी सांस लेने बाधा ।
  4. पूरी तरह से बरामद जब तक चूहे की निगरानी ।

3. कोक्लीअ विच्छेदन और Decalcification

  1. अंतिम ABR के बाद (72 घंटे के बाद), anesthetize के मिश्रण से चूहे को 90 मिलीग्राम/केजी ketamine और 17 मिलीग्राम/intraperitoneal इंजेक्शन वाया xylazine । एक पैर की अंगुली चुटकी पलटा के साथ संज्ञाहरण की पुष्टि करें । Euthanize वाया चूहा decapitation ।
  2. पहले13वर्णित के रूप में लौकिक हड्डी बाहर काटना ।
  3. 4% में कोक्लीअ प्लेस paraformaldehyde में 1x पंजाब समाधान में एक 7 मिलीलीटर ग्लास जुटाना शीशी (पूरी तरह से कोक्लीअ को कवर) । 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सर्द । paraformaldehyde निकालें और कमरे के तापमान पर 1x पंजाबियों के साथ धो लें ।
  4. पंजाबियों निकालें और EDTA (पीएच 7.3) के एक 120 मिमी समाधान के साथ पूरी तरह से ट्यूब भरें । कमरे के तापमान पर एक रोटेटर पर रखें और 2 से 3 सप्ताह के लिए decalcification की अनुमति दें, EDTA समाधान को प्रतिदिन बदलते रहें ।

4. Cryosectioning

  1. decalcification के पूरा होने पर, पूरी तरह से निंनलिखित समाधानों में कोक्लीअ विसर्जित (7 एमएल प्रत्येक) 24 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एच: 10% सुक्रोज, 20% सुक्रोज, 20% सुक्रोज के 1:1 मिश्रण, और इष्टतम काटने तापमान (OCT) यौगिक एंबेडिंग ।
  2. ताजा OCT यौगिक भरें और पूरी तरह से एक 15 मिमी x 15 मिमी x 5 मिमी डिस्पोजेबल एंबेडिंग मोल्ड में कोक्लीअ को कवर करने के लिए जगह है । इसके पक्ष पर कोक्लीअ ओरिएंट इतना है कि यह एंबेडिंग मोल्ड के नीचे समानांतर है, के रूप में Whitlon एट अलद्वारा वर्णित है । 14
  3. तुरंत सूखी बर्फ पर मोल्ड प्लेस को अक्टूबर जमना और स्टोर-80 डिग्री सेल्सियस रात भर ।
  4. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 0.01% पाली में माइक्रोस्कोप स्लाइड-L Lysine स्लाइड निकालें, कुल्ला नहीं है, और रात भर सूखी अनुमति देते हैं । cryosections के लिए इन स्लाइड का उपयोग करें ।
  5. -80 ° c फ्रीजर से अक्टूबर में कोक्लीअ निकालें और सूखी बर्फ पर जगह है । एक तेज microtome ब्लेड का प्रयोग (एल एक्स डब्ल्यू: 80 मिमी x 8 मिमी, मोटाई 0.25 mm, 34 डिग्री के कोण काटने), धारा 10 µm पर OCT ब्लॉकों एक cryostat का उपयोग कर-30 डिग्री सेल्सियस । दो अनुभाग प्रति स्लाइड रखें ।
  6. 4 ° c पर स्लाइड प्रशीतित जब समाप्त हो गया ।

5. Immunohistochemistry

  1. स्लाइड पर एक ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड धुंधला डिश में जगह एक रैक । 1x पंजाबियों की 350 मिलीलीटर के साथ पकवान भरें और 5 मिनट के लिए स्लाइड धो तीन बार कमरे के तापमान पर ।
  2. पकवान से स्लाइड निकालें और एक सूखी पोंछ का उपयोग कर ऊतक आसपास के क्षेत्र से शुष्क, जा रहा है सुनिश्चित करने के लिए बंद ऊतक सूखी नहीं ।
    1. एक तरल अवरुद्ध कलम का उपयोग करना, ऊतक अनुभाग के चारों ओर एक सर्कल ड्रा ।
  3. ब्लॉक 10% सामांय (गधा) सीरम, 1% ईओण डिटर्जेंट युक्त समाधान अवरुद्ध की 150 µ एल जोड़ने के द्वारा कमरे के तापमान पर 1 ज के लिए ऊतक, और 1x पंजाब में 1% BSA ।
  4. बंद अतिरिक्त अवरुद्ध समाधान नल और 10% सामांय (गधा) सीरम, 0.1% ईओण डिटर्जेंट, और प्राथमिक एंटीबॉडी के 150 µ एल के साथ एक humidified चैंबर में 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात ऊतक गर्मी (नीचे नोट देखें) 1x पंजाब में ।
    नोट: निंनलिखित एंटीबॉडी के लिए, इन कमजोर पड़ने का इस्तेमाल किया गया: चित्रा 2 और 3के लिए, पी STAT1 Ser727 1:300 । चित्रा 4के लिए, पी-STAT1 Ser727, 1:100 और TRPV1 1:100 ।
  5. स्लाइड को शीशे के माइक्रोस्कोप में रखें स्लाइड पर दाग वाली डिश slide रैक । 1x पंजाबियों की 350 मिलीलीटर के साथ पकवान भरें और 5 मिनट के लिए स्लाइड धोने के कमरे के तापमान पर तीन बार ।
  6. माध्यमिक एंटीबॉडी एक humidified कक्ष में अंधेरे में कमरे के तापमान पर 2 से 3 घंटे के लिए 1x पंजाब में 0.01% ईओण डिटर्जेंट और 10% सामांय (गधा) सीरम युक्त समाधान में पतला के साथ मशीन ।
    नोट: निंनलिखित माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए, इन कमजोर पड़ने का इस्तेमाल किया गया: चित्रा 2 और 3, गधा विरोधी खरगोश आईजीजी 1:600 के लिए । चित्रा 4के लिए, Rhodamine (TRITC) गधा विरोधी खरगोश आईजीजी 1:500 और गधा विरोधी बकरी आईजीजी 1:500 ।
  7. स्लाइड को शीशे के माइक्रोस्कोप में रखें स्लाइड पर दाग वाली डिश slide रैक । 1x पंजाबियों की 350 मिलीलीटर के साथ पकवान भरें और 5 मिनट के लिए स्लाइड धोने के कमरे के तापमान पर तीन बार ।
  8. स्लाइड से अतिरिक्त लिक्विड टैप करें, और स्लाइड को टिशू के चारों ओर ड्राई वाइप से सुखाएं । सीधे ऊतक पर DAPI के साथ बढ़ते एजेंट की एक बूंद जोड़कर स्लाइड माउंट । धीरे से शीर्ष पर coverslip जगह है, सुनिश्चित करना है कि कोई बुलबुले के नीचे का गठन कर रहे हैं, और स्लाइड अंधेरे में कमरे के तापमान पर रात भर इलाज के लिए अनुमति देते हैं । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड की दुकान ।
  9. फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर छवि स्लाइड. इमेजिंग के लिए पराबैंगनीकिरण का प्रयोग करें इस प्रकार है: DAPI के लिए यूवी लेजर, गधा विरोधी खरगोश आईजीजी के लिए 488 एनएम लेजर, और rhodamine TRITC के लिए 543 एनएम लेजर ।

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Representative Results

ABR प्रतिक्रियाओं तीन दिन में चूहों में मापा सिस्प्लैटिन प्रशासन ने थ्रेसहोल्ड में एक महत्वपूर्ण उन्नयन दिखाया. इन थ्रेसहोल्ड के उंनयन काफी ट्रांस कान [आर]-N-phenylisopropyladenosine (आर-पिया), adenosine एक1 रिसेप्टर एगोनिस्ट15, सिस्प्लैटिन से पहले के साथ प्रशासित चूहों में कम था । adenosine एक1 रिसेप्टर में आरपिया की कार्रवाई की विशिष्टता अवलोकन द्वारा प्रदर्शन किया गया था कि यह 8 द्वारा antagonized था-Cyclopentyl-1, 3-dipropylxanthine (DPCPX), एक एक एक1 रिसेप्टर-विशिष्ट विरोधी16. यह दवा potentiated सिस्प्लैटिन-प्रेरित ABR थ्रेसहोल्ड पाली (चित्रा 1ए) । उत्पादन सुनवाई हानि के अपने प्रभाव के समान, सिस्प्लैटिन भी नुकसान/बाहरी बालों की कोशिकाओं को नुकसान (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी [SEM स्कैनिंग द्वारा मूल्यांकन]) (चित्रा 1बी) । SEM छवियों के रूप में पहले17वर्णित प्राप्त किया गया । यह प्रभाव आर-पिया (चित्रा 1सी) के ट्रांस-कान प्रशासन द्वारा काफी कम किया गया था । इसके अलावा, हम बताते है कि ट्रांस-कान आर-पिया कोक्लीअ में बेसल और सिस्प्लैटिन-प्रेरित पी-STAT1 immunoreactivity कम कर देता है, इस दवा (चित्रा 2) के विरोधी भड़काऊ संपत्ति को प्रतिबिंबित करता है ।

ट्रांस-कान मार्ग का उपयोग siRNAs जैसे वितर्कों के लिए भी किया जा सकता है, जिसका परिणाम लाभकारी प्रभाव होता है । ट्रांस-कान प्रशासन STAT1 सिरना चूहों को प्रभावी ढंग से कम STAT1 और पी STAT1 स्तर और सिस्प्लैटिन द्वारा इस प्रतिलेखन कारक के सक्रियण अवरुद्ध (चित्रा 3) ।

अतिरिक्त अध्ययनों से पता चलता है कि NOX3 mRNA के लिए एक और सिरना के ट्रांस-कान प्रशासन दवाओं की क्षमता को कम capsaicin जैसे क्षणिक रिसेप्टर संभावित vanilloid 1 (TRPV1) चैनल और पी-STAT1 के रूप में कुछ बहाव मध्यस्थों, वृद्धि ( चित्रा 4) । इन मध्यस्थों capsaicin-प्रेरित सुनवाई नुकसान में फंसा रहे हैं18.

Figure 1
चित्रा 1: ट्रांस-कान प्रशासन के आर-पिया सिस्प्लैटिन कम सुनवाई हानि प्रेरित और बाहरी बाल कोशिकाओं के नुकसान के खिलाफ की रक्षा की । ए ABR थ्रेसहोल्ड से पहले चूहों में मापा गया और 72 एच उन्हें सिस्प्लैटिन के साथ इलाज के बाद (11 मिलीग्राम/केजी, आईएफसआई) ट्रांस कान प्रशासन के आर-पिया या DPCPX + आर-पिया. ABR दहलीज के सिस्प्लैटिन प्रेरित उंनयन को एक1AR एगोनिस्ट, R-पिया द्वारा तनु के लिए दिखाया गया था । एक1AR विरोधी, DPCPX के सह-प्रशासन, ABR दहलीज पर आर पिया के प्रभाव को उलट दिया और काफी ABR सभी आवृत्तियों परीक्षण पर सिस्प्लैटिन द्वारा उत्पादित पाली ऊंचा । तीर शूंय ABR थ्रेशोल्ड shift इंगित करता है । ख. सिस्प्लैटिन उपचार बाहरी बाल कोशिकाओं (OHC) (सफेद तीर) के रूप में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) स्कैनिंग द्वारा प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण नुकसान दिखाया । आरपिया सिस्प्लैटिन-प्रेरित क्षति के खिलाफ OHCs की रक्षा की, जबकि DPCPX आरपिया के सुरक्षात्मक प्रभाव तनु । C. the बार ग्राफ SEM Bमें दिखाया छवियों के मात्रात्मक विश्लेषण से पता चलता है । त्रुटि पट्टियां माध्य की मानक त्रुटि इंगित करती हैं । तारांकन (*) और (* *) वाहन या सिस्प्लैटिन उपचार समूहों से सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं, क्रमशः, जबकि (* * *) R-पिया + सिस्प्लैटिन-इलाज चूहों (p से एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर इंगित करता है < 0.05, n = 5) । यह आंकड़ा कौर एट अल से अनुकूलित किया गया था । 19 अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : ट्रांस-कान एडमिनिस्ट्रेशन ऑफ ए1एआर एगोनिस्ट, आर-पिया, Immunoreactivity में कम सिस्प्लैटिन-बढी पी-STAT1 कोक्लीअ । चूहों सिस्प्लैटिन की एक intraperitoneal खुराक (11 मिलीग्राम/), जो बढ़ पी-STAT1 Ser727 immunoreactivity, 72 एच पोस्ट दवा प्रशासन में मूल्यांकन प्रशासित रहे थे । हालांकि, ट्रांस-कान आर-पिया के साथ 1 एच के उपचार पी-STAT1 immunoreactivity में इस वृद्धि को कुंद कर रहे हैं । एक1एआर विरोधी, DPCPX के सह-उपचार, एगोनिस्ट के साथ पी-STAT1 immunoreactivity के निषेध उलट । नीले दाग DAPI-सना हुआ नाभिक का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि हरी धुंधलान पी-STAT1 immunolabeling का प्रतिनिधित्व करता है । OHC और डीसी क्रमशः बाहरी बाल कोशिका और Deiter के सेल का प्रतिनिधित्व करते हैं । सफ़ेद तीर OHCs की तीन पंक्तियों को इंगित करते हैं । निचले बाएँ फलक में दिखाए गए स्केल बार 10 µm है । यह आंकड़ा कौर एट अल से अनुकूलित किया गया था । 19 अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : STAT1 सिरना के ट्रांस-कान प्रशासन सिस्प्लैटिन-प्रेरित पी-STAT1 के स्तर को अवरुद्ध कर दिया । कॉकलियर सिस्प्लैटिन के साथ प्रशासित चूहों से पृथक वर्गों (11 मिलीग्राम/किग्रा, आईएफसआई) 72 के लिए एच दिखाया बढ़ा Ser727 p-STAT1 immunoreactivity में OHCs. ट्रांस-कान STAT1 सिरना (0.9 मिलीग्राम) पी-STAT1 immunoreactivity में सिस्प्लैटिन-प्रेरित वृद्धि के साथ पूर्व उपचार, जबकि तले हुए उपचार कोई प्रभाव नहीं दिखाया । नीले दाग DAPI-सना हुआ नाभिक का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि हरी धुंधलान पी-STAT1 immunolabeling का प्रतिनिधित्व करता है । सफ़ेद तीर OHCs की तीन पंक्तियों को इंगित करते हैं । स्केल बार निचले सही पैनल में दिखाया 10 µm उपाय । यह आंकड़ा कौर एट अल से अनुकूलित किया गया था । 20 अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : NOX3 सिरना का ट्रांस-कान इंजेक्शन चूहे STAT1 में TRPV1 और पी-कोक्लीअ के स्तर को कम करता है । Anesthetized चूहों के तले सिरना (हाथापाई) या NOX3 siRNAs ट्रांस कान इंजेक्शन द्वारा प्रशासित किया गया था, जो दो दिनों के बाद ट्रांस द्वारा कान के capsaicin इंजेक्शन के लिए 24 ज. अलग cochleae इन जानवरों से पी-STAT1 के लिए दाग थे Ser727 व TRPV1 immunoreactivity. Capsaicin दोनों TRPV1 (ग्रीन) और पी-STAT1 Ser727 (लाल) immunoreactivity में 24 ज में stria vascularis (SVA), बाहरी बाल कोशिकाओं (OHC), और सर्पिल नाड़ीग्रंथि (एसजी) कोशिकाओं में वृद्धि हुई । हालांकि, पशु NOX3 सिरना के साथ इलाज पी-STAT1 Ser727 और TRPV1 immunolabeling के किसी भी दिखाई प्रेरण नहीं दिखा था । स्केल बार्स (निचला दायां फलक) 50 और 10 µm को प्रीसेट के लिए दर्शाते हैं । यह आंकड़ा Mukherjea एट अल से अनुकूलित किया गया था । 18 अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

ट्रांस कान प्रशासन मार्ग दवाओं और अंय एजेंटों के कोक्लीअ जो अंयथा महत्वपूर्ण प्रणालीगत दुष्प्रभाव उपज सकता है अगर प्रणालीबद्ध प्रशासन के स्थानीयकृत प्रसव के लिए अनुमति देता है । औषधि प्रशासन की इस पद्धति से काफी अधिक मात्रा में प्रणालीगत मार्ग के माध्यम से प्राप्त किया जाएगा कार्रवाई की साइट के लिए दवाओं के तेजी से उपयोग की अनुमति देता है । परिणाम यहां प्रस्तुत है और पहले प्रकाशित दिखाया है कि ट्रांस कान प्रशासन [आर]-N-फिनाइल isopropyl adenosine (आर-पिया) कोक्लीअ से सिस्प्लैटिन-प्रेरित बाहरी बाल कोशिका हानि (चित्रा 1)19 संरक्षित और सूजन के प्रेरण STAT1 प्रतिलेखन कारक के कम सक्रियण द्वारा प्रदर्शन के रूप में (सिस्प्लैटिन या के साथ इलाज उन लोगों की तुलना में-पिया + DPCPX + सिस्प्लैटिन) ( चित्रा 2)19। इन लाभों को इस दवा द्वारा वहन हानि सुनवाई से संरक्षण के लिए योगदान कर सकते हैं । पिछले अनुभव के आधार पर, हम केवल एक दवा प्रशासन की जरूरत है जोर । इससे यह संकेत मिल सकता है कि दवा मध्य कान में रखी गई है और कोक्लीअ में तीन दिन से अधिक सुरक्षा प्रदान करने के लिए धीरे से लिया जा सकता है इन जानवरों ototoxicity के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं । इस तकनीक वर्तमान में भीतरी कान में अंय दवाओं देने के लिए oto-protectants के रूप में उनकी प्रभावकारिता निर्धारित किया जा रहा है ।

दवाओं के अलावा, siRNAs के ट्रांस-कान प्रशासन अपने प्रोटीन के स्तर को कम करने और oto संरक्षण प्रदान करने के लिए चयनात्मक RNAs के प्रभावी पछाड़ना प्रदान कर सकते हैं18,20. फिर, इन siRNAs कम विषाक्तता प्रदान अगर वे कोक्लीअ की निकटता में वितरित कर रहे हैं । पछाड़ना की अवधि तीन दिनों तक (हमारी मूल्यांकन अवधि की सीमा) तक थी. महत्वपूर्ण बात, siRNAs के अलावा इस तरह के सिस्प्लैटिन के रूप में ototoxic दवाओं, द्वारा उनके इसी प्रोटीन की प्रेरण ब्लॉक । पछाड़ना की अवधि कुछ हद तक extracellular द्रव में nucleases की बहुतायत दिया आश्चर्य की बात है, और कोशिकाओं और कॉकलियर कोशिकाओं में इन अणुओं को प्राप्त करने में संभावित कठिनाई । हालांकि, प्रोटीन और oto के दोनों पछाड़ना के प्रदर्शन-सुरक्षा मतलब होगा कि इन siRNAs प्रभावी सांद्रता पर कोक्लीअ तक पहुंच रहे हैं ।

लाभ के बावजूद ऊपर वर्णित है, इस तकनीक की कुछ सीमाएं प्रत्याशित हैं । ये प्रक्रिया शुरू करने से पहले प्रयोगात्मक पशुओं anesthetizing के लिए की जरूरत शामिल हैं । दवाओं के मध्य कान में उच्च सांद्रता पर प्रशासित किया जाना चाहिए के बाद से केवल एक छोटा सा अंश (~ 1-10%) perilymph तक पहुंचने के लिए अनुमानित है । इसके अलावा, लागू दवाओं या जैविकों के वितरण के आधार पर अधिक ध्यान केंद्रित है, जहां सबसे बड़ा प्रभाव मनाया जाता है ।

हालांकि यहां प्रस्तुत एजेंटों की ट्रांस-कान डिलीवरी चूहों तक ही सीमित थी, ऐसे में दवा वितरण की एक समान विधि उन मरीजों में prophylactically इस्तेमाल की जा सकती है जो दवाओं के साथ कीमोथेरेपी की उम्मीद कर रहे हैं जैसे सिस्प्लैटिन । यह प्रत्याशित है कि दवा के वितरण की इस पद्धति को तेजी से मनुष्यों के लिए अपनाया जा सकता है जो प्रयोगात्मक पशुओं में दवा प्रेरित सुनवाई हानि के इलाज में प्रभावकारिता दिखाया है यौगिकों की एक बड़ी संख्या स्क्रीन करने के लिए ।

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Disclosures

ब्याज का कोई विरोध नहीं घोषित ।

Acknowledgments

इस आलेख में वर्णित कार्य एक NCI RO1 CA166907, NIDCD RO1-DC ००२३९६ और RO3 DC011621 द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketathesia (100 mg/ml) 10 ml Henry Schein 56344 Controlled substance 
AnaSed Injection/Xylazine (20 mg/ml) 20 ml Henry Schein 33197
2.5 mm disposable ear specula Welch Allyn 52432
Surgical Scope Zeiss
29 G X 1/2 insulin syringe Fisher Scientific 14-841-32  Can be purchased through other vendors
cis-Diammineplatinum(II) dichloride Sigma Aldrich P4394 TOXIC - wear proper PPE
Harvard 50-7103 Homeothermic Blanket Control Unit Harvard Apparatus Series 863
Excel International 21 G X 3/4 butterfly needle Fisher 14-840-34  Can be purchased through other vendors
BSP Single Speed Syringe Pump Brain Tree Sci, Inc BSP-99
Pulse Sound Measurement System Bruel & Kjaer Pulse 13 software
High-Frequency Module Bruel & Kjaer 3560C
1/8″ Pressure-field Microphone —-Type 4138 Bruel & Kjaer bp2030
High Frequency Transducer Intelligent Hearing System M014600
Opti-Amp Power Transmitter Intelligent Hearing System M013010P
SmartEP ABR System Intelligent Hearing System M011110
Disposable Subdermal EEG Electrodes CareFusion 019-409700
16% Formaldehyde, Methanol-free Fisher Scientific 28908 TOXIC - wear proper PPE 
7 mL Borosilicate Glass Scintillation Vial Fisher Scientific 03-337-26 Can be purchased through other vendors
EDTA Fisher Scientific BP118-500 Can be purchased through other vendors
Sucrose Fisher Scientific S5-500 Can be purchased through other vendors
Tissue Plus OCT Compound Fisher Scientific 4585
CryoMolds (15 mm x 15 mm x 5mm) Fisher Scientific 22-363-553 Can be purchased through other vendors
Microscope Slides (25mm x 75mm) MidSci 1354W Can be purchased through other vendors
Coverslips (22 x 22 x 1) Fisher Scientific 12-542-B Can be purchased through other vendors
Poly-L-Lysine Solution (0.01%) EMD Millipore A-005-C Can be purchased through other vendors
HM525 NX Cryostat Thermo Fischer Scientific 956640
MX35 Premier Disposable Low-Profile Microtome Blades Thermo Fischer Scientific 3052835
Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack Fisher Scientific 08-812
Super Pap Pen Liquid Blocker Ted Pella, Inc. 22309
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121 Can be purchased through other vendors
TritonX-100 Acros 21568 Can be purchased through other vendors
BSA Sigma Aldrich A7906 Can be purchased through other vendors
Phospho-Stat1 (Ser727) antibody Cell Signaling 9177
VR1 Antibody (C-15) Santa Cruz sc-12503
DyLight 488 Donkey anti Rabbit Jackson Immuno Research 711-485-152 Discontinued
DyLight 488 Donkey anti Goat Jackson Immuno Research 705-485-003 Discontinued
Rhodamine (TRTIC) Donkey anti Rabbit Jackson Immuno Research 711-025-152 Discontinued
ProLong® Diamond Antifade Mountant w/ DAPI Thermo Fisher P36971
(−)-N6-(2-Phenylisopropyl)adenosine Sigma Aldrich P4532
8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine Sigma Aldrich C101
siRNA pSTAT1 Qiagen Custome Made Kaur et al. 201120
siRNA NOX3 Qiagen Custome Made Kaur et al. 201120
Scrambled Negative Control siRNA Qiagen 1022076 Kaur et al. 201120

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References

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मेडिसिन अंक 133 Ototoxicity कोक्लीअ ट्रांस-कान सिस्प्लैटिन NOX3 STAT1 TRPV1
Ototoxicity के इलाज के लिए ट्रांस कान दवा का वितरण
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Sheehan, K., Sheth, S., Mukherjea,… More

Sheehan, K., Sheth, S., Mukherjea, D., Rybak, L. P., Ramkumar, V. Trans-Tympanic Drug Delivery for the Treatment of Ototoxicity. J. Vis. Exp. (133), e56564, doi:10.3791/56564 (2018).

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