Summary
Мы представляем технику для локализованных отправления наркотиков через транс барабанные маршрут в улитке. Доставка лекарств через этот маршрут не будет мешать эффективность противораковых химиотерапевтических препаратов, таких как цисплатин.
Abstract
Системного администрирования защитных агентов для лечения лекарственно индуцированные ототоксичность ограничивается возможность, что эти защитные агенты могут вмешиваться химиотерапевтических эффективность основных препаратов. Это особенно верно для наркотиков цисплатин, чьи действия противоопухолевых являются аттенуированных антиоксидантов, которые обеспечивают адекватную защиту от потери слуха. Других текущих или потенциальных otoprotective агентов может представлять подобную проблему, если управление системно. Применение различных биологических или защитных агентов непосредственно к улитки позволит высокий уровень этих агентов локально ограниченных системных побочных эффектов. В настоящем докладе мы демонстрируем транс барабанные метод доставки различных наркотиков или биологических реагентов улитки, которая должна укрепить основные научные исследования на улитки и предоставляют простой способ направления использования otoprotective агентов в клиниках. В настоящем докладе подробно метод доставки транс барабанные лекарств и приводятся примеры того, как этот метод успешно использовался в подопытных животных для лечения цисплатином ототоксичность.
Introduction
Периферического отдела слуховой системы изысканно чувствительна к наркотикам как цисплатин и аминогликозидами антибиотики. Цисплатин является широко используемым химиотерапевтического агента для лечения целого ряда солидных опухолей, например, яичников, яичек и головы и шеи рак. Ототоксичность опытных с использованием этого препарата дозу ограничения и довольно часто, затрагивающие 75-100% больных лечение1. Другие препараты, такие как карбоплатин и Оксалиплатин, появились как альтернативы цисплатин2,3,4,5, однако их полезность ограничена несколько рака.
Ранние исследования показали важную роль реактивнооксигенных видов (ров) в посредничестве ототоксичность, цисплатина и аминогликозидов. Последующие исследования показали, что NOX3 изоформы NADPH оксидаза является основным источником рос в улитке и управляется цисплатин6,7. Поколение ROS компромиссов антиоксидантной способности клеток, приводит к буферизации увеличилась перекисного окисления липидов клеточных мембран8. Кроме того цисплатин увеличивает производство гидроксильных радикалов, которые генерируют высокотоксичных альдегид 4-hydroxynonenal (4-HNE), инициатор клеток смерть9,10. Основываясь на этих выводах, были рассмотрены несколько антиоксидантов для лечения цисплатином ототоксичность. К ним относятся N-ацетил-цистеин (NAC), натрия тиосульфат (STS), Амифостин и D-метионина. Однако серьезную озабоченность антиоксидантной терапии является, что эти антиоксиданты могут уменьшить цисплатин химиотерапии эффективность при приеме системно11 через взаимодействие цисплатина с тиоловых групп в молекулах антиоксидант.
С учетом этих проблем с антиоксидантной терапии цель данного исследования заключалась в изучении транс барабанные маршрут доставки антиоксидантов и других препаратов улитки сократить потери слуха. Транс барабанные маршрут наркотиков и короткие вмешательства (Си) РНК, описанные ниже, представляется особенно многообещающим.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Руководящие принципы и протоколом, утвержденным Южного Иллинойса университета Школа медицины лабораторных животных ухода и использовать Комитет использовать мужской Wistar, которую крыс были обработаны в соответствии с национальными институтами здоровья животных. Ответ слуховой ствола мозга (ABR) была исполнена на крысах при под анестезией до введения препарата и 72 ч после проверить эффект транс барабанные лекарств.
1. слуховые мозга ответ (ABR)
Примечание: ABR измерения были собраны с использованием слухового тестирования оборудования и программного обеспечения. ABR представляет вызванные потенциалы или высокочастотных волн, генерируемых восьмого черепного нерва (волны I и II) и других выше слуховой мозг стволовых структур, включая улитковый ядра anteroventral (волна III), боковые lemniscus (волна IV) и уступает colliculus (волна V). Эти волны дифференцированы в зависимости от задержки. ABR измерения были выполнены как описано ранее12.
- Анестезировать крыс с смесь 90 мг/кг кетамина и 17 мг/кг Ксилазина через внутрибрюшинной инъекции. Подтвердите глубины анестезии через мыс щепотка рефлекс. Применить глазные смазки (или минеральное масло капли) в оба глаза, чтобы предотвратить высыхание глаза и избежать изъязвления во время анестезии.
- Место крыса в лежачем положении на грелку (37 ° C) внутри контролируемой акустической стенд. Испытательное оборудование аудиологии находится вне и рядом стенд.
- Вставить электродов из нержавеющей стали соответственно: земли электрода в тылу пашины, положительный электрод между двух ушей прямо на вершине черепа и отрицательные электроды ниже Пинна каждого уха.
- Примените акустических стимулов, с помощью высокочастотных преобразователей как взрыв тона 5 мс на 8, 16 и 32 кГц. Определение интенсивности стимула как уровень звукового давления в децибелах (дБ SPL). Это начинается в 10 дБ SPL и достигает 90 дБ SPL с размером 10-dB шаг. Калибровки звука интенсивности для максимальной мощностью 90-dB SPL с помощью импульсной точности измеритель уровня звука.
Примечание: Результат теста дает представление о целостности органа периферического слуха, улитки и вышеупомянутые слуховой структур. Сигналы генерируются в течение 15 мс стимул ввода и задержка волн зависит от проводимости время, которое в свою очередь регулируется от трех важнейших факторов: объем мозга, интенсивности и частоты звука. Слуховых вызванных потенциалов были записаны с помощью программного обеспечения, поставляемого изготовителем. - Рассмотрим минимальной интенсивности, которая может вызвать два различных сигналов (II и III) 0.5 мкВ амплитуды как порог видное место.
Примечание: Сдвиг порога представляет собой разницу в порог, измеренная после лечения по сравнению с порога, полученные до начала лечения.
2. Транс барабанные инъекции
- Чтобы препарат транс tympanically, место крыса в положение левой боковой пролежни.
- Вставьте 2,5 мм Одноразовые ушные Корнцанги в ушной канал.
- С использованием хирургического область позиция корнцанги, так что барабанная перепонка видна.
- С помощью 29 G X ½, шприц 0,5 мл инсулина, составить 50 мкл [R] - N - фенил изопропиловый аденозина (R-Пиа) раствор (1 мкм), 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX) раствора (3 мкм) или siRNA раствор (0,9 мкг) для вставки (5 единиц).
- Используйте Корнцанги направлять иглу в регионе передней нижней барабанной перепонки.
- Засуните отверстие через мембрану с иглой и назначать лекарственные средства, упомянутые в 1.2.3. Разрешить крысы на отдых в этом положении в течение 15 мин.
Примечание: 50 мкл должна быть адекватной тома помещалось барабанной перепонки. Не жидкость должна быть в канал уха после администрации. - Место крыса в правой боковой пролежни позицию и повторите шаги 1.2.1 через 1.2.5 для администрации в другом ухе.
- Для крыс, получавших цисплатин внутрибрюшинно место крыса в лежачем положении на грелку на 37 ° C.
- С помощью 21 G X 3/4 Бабочка иглы (12" длиной трубы), составить цисплатин (11 мг/кг, 1 мг/мл раствора в стерильных фосфатный буфер [PBS]).
- С помощью насоса шприца, администрировать цисплатин (1 мг/мл) через внутрибрюшинной инъекции более 30 мин.
Примечание: Крыса 250г объем будет 2,75 мл со скоростью примерно 0,1 мл / мин.
- Продолжать следить за глубины анестезии на протяжении этих процедур. После завершения цисплатин администрация место крыса обратно в клетке в лежачем положении, убедившись, что нет ничего, чтобы воспрепятствовать ее дыхание.
- Контролировать крыс до тех пор, пока полностью выздоровел.
3. улитки диссекции и декальцинации
- После окончательного ABR (после 72 ч) анестезировать Крыса с смесь 90 мг/кг кетамина и 17 мг/кг Ксилазина через внутрибрюшинной инъекции. Подтвердите анестезии с ног щепотка рефлекс. Усыпить крыс через обезглавливание.
- Проанализируем, височной кости, как описано ранее,13.
- Место улитки в параформальдегида 4% в 1 x PBS решение в пузырек 7-ОД стеклом сцинтилляционные (полностью охватывающих улитки). Поставить в холодильник на ночь при 4 ° C. Удаление параформальдегида и мыть с ПБС при комнатной температуре.
- Удаление PBS и полностью заполнить трубу с 120-мм раствором ЭДТА (рН 7.3). Место на вращателе при комнатной температуре и позволяют декальцинации для 2-3 недели, изменив решение ЭДТА ежедневно.
4. Cryosectioning
- По завершении декальцинации полностью погрузите улитки в следующие решения (7 мл) на 24 ч в 4 ° C: 10% сахарозы, 20%-ая сахароза, 1:1 смесь 20%-ая сахароза, и оптимального раскроя температуры (OCT) внедрение комплекса.
- Место свежие октября соединения для заполнения и полностью покрывают улитки в 15 x 15 мм x 5 мм одноразовые, встраивание формы. Ориентируйте улитки на его стороне, так что это параллельно нижней части встраивание формы, как описано в Whitlon и др. 14
- Сразу же место плесень на сухой лед в OCT и храните при температуре-80 ° C на ночь.
- Погружать Микроскоп слайды в 0.01% поли-L-лизин при комнатной температуре за 30 мин удалить слайды, не промыть и позволяют для высыхания на ночь. Используйте эти слайды для cryosections.
- Удаление улитки в октября из морозильной камеры-80 ° C и поместите его на сухой лед. Используя острые микротом лезвия (L x ш: 80 мм x 8 мм, толщиной 0,25 мм, угол резки 34 °), раздел OCT блоков на 10 мкм, с использованием криостата при-30 ° C. Место два раздела на слайд.
- Охладите слайды на 4 ° C, когда закончите.
5. иммуногистохимии
- Место слайды в стекло микроскопа, окрашивание блюдо на коммуникационном слайд. Заполнить блюдо с 350 мл ПБС и мыть слайды для 5 минут три раза при комнатной температуре.
- Удаление слайдов из блюдо и высушить область, окружающие ткани, с помощью сухой очистки, будучи не забудьте высушить ткань.
- С помощью жидкого блокировки ручки, нарисуйте круг вокруг секции ткани.
- Блокировать ткани на 1 ч при комнатной температуре, добавляя 150 мкл блокирования решения, содержащие 10% нормальной (осел) сыворотки, 1% неионогенных моющего средства и 1% BSA в однократном ПБС.
- Кран избыток блокирования решения и инкубировать ткани на ночь при 4 ° C в камере увлажненный с 150 мкл 10% нормальной (осел) сыворотки, 0.1% неионогенных моющего средства, и основное антитело (см. Примечание ниже) и в однократном ПБС.
Примечание: Для следующих антител, использовались эти разведения: Рисунок 2 и 3, p-STAT1 Ser727 1: 300. Рисунок 4, p-STAT1 Ser727, масштаба 1: 100 и 1: 100 TRPV1. - Место слайды в стекло микроскопа, окрашивание блюдо на коммуникационном слайд. Заполнить блюдо с 350 мл ПБС и мыть слайды 5 минут три раза при комнатной температуре.
- Проинкубируйте с вторичные антитела, разбавленный раствор, содержащий неионогенные 0,01% моющего средства и 10% нормальной (осел) сыворотки в однократном ПБС для 2-3 ч при комнатной температуре в камере увлажненный в темноте.
Примечание: Для следующих вторичные антитела, использовались эти разведения: Рисунок 2 и 3, осел анти кролик IgG 1: 600. На рисунке 4родамин (TRITC) осла анти кролик IgG 1: 500 и осел анти коза IgG 1: 500. - Место слайды в стекло микроскопа, окрашивание блюдо на коммуникационном слайд. Заполнить блюдо с 350 мл ПБС и мыть слайды 5 минут три раза при комнатной температуре.
- Коснитесь значка лишнюю жидкость со слайда и сухой слайд насухо вокруг ткани. Смонтируйте слайды, добавив одну каплю установки агента с DAPI непосредственно на ткани. Медленно место coverslip на вершине, обеспечивая, что нет пузырьков образуются под и позволяют слайды для лечения на ночь при комнатной температуре в темноте. Хранить слайды при 4 ° C.
- Изображения слайдов с помощью конфокальной микроскопии. Использование лазеров для визуализации следующим: УФ лазер для DAPI, 488 нм лазер для осла анти кролик IgG и 543 Нм лазер для родамин TRITC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ABR ответы измеряется в крыс на три дня следующей администрации цисплатин показал значительное повышение в пороговых значений. Высота этих порогов был значительно сокращен в крыс с транс барабанные [R] - N - phenylisopropyladenosine (R-Пиа), аденозин1 рецептора агонистом15, до цисплатин. Специфичность действия R-Пиа в аденозин,1 рецептора была продемонстрирована наблюдения, что он был омрачает, 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX), А1 антагонист рецепторов конкретных16. Этот препарат потенцированные цисплатин индуцированной ABR порог изменения (рис. 1А). Подобно эффекту производства потери слуха, цисплатин также увеличение потери/повреждения наружной волосковых клеток (оценены растровая электронная микроскопия [МДж]) (рис. 1Б). SEM изображения были получены как описано17. Этот эффект был значительно сокращен транс барабанные отправления R-Пиа (рис. 1C). Кроме того, мы показываем, что транс барабанные R-Пиа Уменьшает базальную и цисплатин индуцированной p-STAT1 иммунореактивности в улитке, отражающие противовоспалительные свойства данного препарата (рис. 2).
Транс барабанные маршрут может также использоваться для администрирования биопрепараты как малые интерферирующие РНК, которые приводят в благотворное воздействие. Транс барабанные администрация STAT1 siRNA крыс эффективно сократить уровни STAT1 и p-STAT1 и заблокирован активации этого фактора транскрипции цисплатин (рис. 3).
Дополнительные исследования показывают, что транс барабанные отправления другого siRNA для NOX3 мРНК сократило возможности наркотики например капсаицин увеличить некоторые течению посредников, таких как Переходный рецепторный потенциал vanilloid 1 канал (TRPV1) и p-STAT1 ( Рисунок 4). Эти посредники оказываются причастными капсаицин индуцированной слуха потери18.
Рисунок 1: транс барабанные отправления R-Пиа сократить потери слуха, цисплатин индуцированной и защищены от потери внешнего волосковых клеток. A. ABR пороги были измерены в крыс до и 72 ч после обработки их с цисплатином (11 мг/кг, и.п.) после транс барабанные отправления R-Пиа или DPCPX + R-Пиа. Цисплатин индуцированной высота порога ABR было показано, быть аттенуированных A1AR агонист, R-Пиа. Совместное управление A1AR антагонист, DPCPX, отменил действие R-Пиа на пороге ABR и значительно повышенные, которую переносит ABR произведенной цисплатина на всех частоты испытания. Стрелка указывает сдвиг порога нулевого ABR. Б. лечение цисплатином показал значительный ущерб внешней волосковых клеток (OHC) (белая стрелка), как это продемонстрировано растровая электронная микроскопия (SEM). R-Пиа защищенный OHCs против цисплатин индуцированного повреждения, тогда как DPCPX ослабленных защитный эффект R-Пиа. C. Гистограмма показывает количественный анализ изображений SEM, показано в B. Планки погрешностей указывают Среднеквадратичная ошибка среднего значения. Звездочки (*) и (*) свидетельствуют о статистически значимой разницы от автомобиля или цисплатин лечения групп, соответственно, в то время как (*) указывает статистически значимой разницы от R-Пиа + цисплатин лечение крыс (p < 0,05, n = 5). Эта цифра была адаптирована из Каур и др. 19 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Транс барабанные отправления1AR агонист, R-Пиа, снижение иммунореактивности цисплатин повышенная p-STAT1 в улитке. Крысам вводили внутрибрюшинного дозы цисплатина (11 мг/кг), который увеличил p-STAT1 Ser727 иммунореактивности, начисленных на 72 h пост лекарствами. Однако 1 h предварительной обработки с транс барабанные R-Пиа затуплены это увеличение в иммунореактивности p-STAT1. Совместное лечение A1AR антагонист, DPCPX, наряду с агонистом вспять ингибирование иммунореактивности p-STAT1. Блю, пятная представляет DAPI-окрашенных ядер, тогда как зеленый пятнать представляет p-STAT1 immunolabeling. OHC и DC представляют собой внешние волос клетка и клетка Deiter, соответственно. Белые стрелки указывают три строки OHCs. Линейки, отображаемые в нижней левой панели — 10 мкм. Эта цифра была адаптирована из Каур и др. 19 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Транс барабанные администрации STAT1 siRNA уровни заблокирован цисплатин-индуцированной p-STAT1. Улитковый секций, изолированных от крыс, управляемых с цисплатином (11 мг/кг, и.п.) за 72 ч показал увеличение Ser727 иммунореактивности p-STAT1 в OHCs. Предварительная обработка с транс барабанные STAT1 малых интерферирующих РНК (0,9 мг) ослаблены цисплатин индуцированной увеличением иммунореактивности p-STAT1, тогда как кинулись лечения показал никакого эффекта. Блю, пятная представляет DAPI-окрашенных ядер, тогда как зеленый пятнать представляет p-STAT1 immunolabeling. Белые стрелки указывают три строки OHCs. Линейки, показаны в нижней правой панели меры 10 мкм. Эта цифра была адаптирована из Каур и др. 20 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Транс барабанные инъекций NOX3 siRNA уменьшает TRPV1 и p-STAT1 уровни в улитке крыса. Наркотизированных крыс были administered кинулись siRNA (схватка) или малые интерферирующие РНК NOX3 по Транс барабанные инъекции, которые последовали два дня спустя транс барабанные инъекции капсаицина для изолированных cochleae 24 ч. от этих животных были витражи для p-STAT1 SER727 и TRPV1 иммунореактивности. Капсаицин увеличилась TRPV1 (зеленый) и p-STAT1 Ser иммунореактивности727 (красный) на 24 ч в каннелюры vascularis (SVA), внешние клетки волос (OHC) и спиральные клетки ганглии (SG). Однако животных, предварительно обработанных с NOX3 малых интерферирующих РНК не показывают каких-либо видимых индукции p-STAT1 Ser727 и TRPV1 immunolabeling. Масштаб баров (Нижняя правая панель) представляют собой 50 и 10 мкм для вставки. Эта цифра была адаптирована из Mukherjea и др. 18 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Транс барабанные администрирования маршрут позволяет для локализованных доставки наркотиков и других агентов улитки, которые могли бы в противном случае производят значительные системные побочные эффекты, если управление системно. Этот метод введения препарата позволяет быстрый доступ препаратов на сайт действий при значительно более высоких дозах, чем будет достигнуто через системный маршрут. Здесь представлены и опубликованы ранее показали, что транс барабанные администрация [R] - N - фенил изопропиловый аденозина (R-Пиа) защищены улитки цисплатин индуцированной внешние клетки волос потери (рис. 1)19 и индукции воспаления, как свидетельствует уменьшение активации STAT1 транскрипционного фактора (по сравнению с теми относились с цисплатином или R-Пиа + DPCPX + цисплатин) (Рисунок 2)19. Эти преимущества могут способствовать защите сайта от потери слуха, обеспечиваемой этот препарат. Основываясь на предыдущем опыте, мы утверждать, что необходим только один лекарствами. Это может означать, что препарат сохраняется в среднем ухе и медленно могут быть приняты в улитки для обеспечения защиты в течение трех дней, которые оцениваются эти животные для ототоксичность. Этот метод используется в настоящее время для доставки других наркотиков во внутреннее ухо, чтобы определить их эффективность как ото протравителями.
Помимо лекарств транс барабанные отправления малые интерферирующие РНК может обеспечить эффективное нокдаун селективного РНК, чтобы уменьшить их уровень протеина и обеспечить ОТО защита18,20. Опять же эти малые интерферирующие РНК обеспечит меньше токсичность, если они поставляются в непосредственной близости от улитки. Продолжительность нокдаун был до трех дней (предел нашей оценки периода). Важно отметить, что добавление малые интерферирующие РНК блокирует индукции их соответствующего белка ототоксических препаратов, таких как цисплатин. Продолжительность нокдаун удивляет, учитывая обилие nucleases в внеклеточной жидкости и клетки и потенциальные трудности в получении этих молекул в улитковый клетки. Однако демонстрация обоих нокдаун белков и ОТО защита будет означать, что эти малые интерферирующие РНК достигают улитки на эффективных концентрациях.
Несмотря на преимущества, описанные выше предполагается, что определенные ограничения этой техники. К ним относятся потребность в обезболивающих подопытных животных до начала процедуры. Препараты должны проводиться при более высоких концентрациях в среднего уха, поскольку лишь небольшая часть (~ 1-10%), как ожидается, достичь перилимфе. Кроме того распределение препаратах или биопрепараты является более сосредоточены на базе, где наблюдается наибольшее воздействие.
Хотя транс барабанные доставки агентов, представленные здесь был ограничен крыс, аналогичный метод доставки лекарств может быть использован профилактически у больных, которые ожидают химиотерапии препаратами как цисплатин. Предполагается, что этот метод доставки лекарств может быть принят быстро для людей, чтобы экран большое количество соединений, которые показали эффективность в лечении потери слуха, лекарственно индуцированные в подопытных животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конфликта интересов не объявлен.
Acknowledgments
Работа, описанная в этой статье была поддержана NCI RO1 CA166907, NIDCD RO1-DC 002396 и RO3 DC011621.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketathesia (100 mg/ml) 10 ml | Henry Schein | 56344 | Controlled substance |
| AnaSed Injection/Xylazine (20 mg/ml) 20 ml | Henry Schein | 33197 | |
| 2.5 mm disposable ear specula | Welch Allyn | 52432 | |
| Surgical Scope | Zeiss | ||
| 29 G X 1/2 insulin syringe | Fisher Scientific | 14-841-32 | Can be purchased through other vendors |
| cis-Diammineplatinum(II) dichloride | Sigma Aldrich | P4394 | TOXIC - wear proper PPE |
| Harvard 50-7103 Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | Series 863 | |
| Excel International 21 G X 3/4 butterfly needle | Fisher | 14-840-34 | Can be purchased through other vendors |
| BSP Single Speed Syringe Pump | Brain Tree Sci, Inc | BSP-99 | |
| Pulse Sound Measurement System | Bruel & Kjaer | Pulse 13 software | |
| High-Frequency Module | Bruel & Kjaer | 3560C | |
| 1/8″ Pressure-field Microphone —-Type 4138 | Bruel & Kjaer | bp2030 | |
| High Frequency Transducer | Intelligent Hearing System | M014600 | |
| Opti-Amp Power Transmitter | Intelligent Hearing System | M013010P | |
| SmartEP ABR System | Intelligent Hearing System | M011110 | |
| Disposable Subdermal EEG Electrodes | CareFusion | 019-409700 | |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | Fisher Scientific | 28908 | TOXIC - wear proper PPE |
| 7 mL Borosilicate Glass Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-26 | Can be purchased through other vendors |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | Can be purchased through other vendors |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Can be purchased through other vendors |
| Tissue Plus OCT Compound | Fisher Scientific | 4585 | |
| CryoMolds (15 mm x 15 mm x 5mm) | Fisher Scientific | 22-363-553 | Can be purchased through other vendors |
| Microscope Slides (25mm x 75mm) | MidSci | 1354W | Can be purchased through other vendors |
| Coverslips (22 x 22 x 1) | Fisher Scientific | 12-542-B | Can be purchased through other vendors |
| Poly-L-Lysine Solution (0.01%) | EMD Millipore | A-005-C | Can be purchased through other vendors |
| HM525 NX Cryostat | Thermo Fischer Scientific | 956640 | |
| MX35 Premier Disposable Low-Profile Microtome Blades | Thermo Fischer Scientific | 3052835 | |
| Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack | Fisher Scientific | 08-812 | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | Can be purchased through other vendors |
| TritonX-100 | Acros | 21568 | Can be purchased through other vendors |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | Can be purchased through other vendors |
| Phospho-Stat1 (Ser727) antibody | Cell Signaling | 9177 | |
| VR1 Antibody (C-15) | Santa Cruz | sc-12503 | |
| DyLight 488 Donkey anti Rabbit | Jackson Immuno Research | 711-485-152 | Discontinued |
| DyLight 488 Donkey anti Goat | Jackson Immuno Research | 705-485-003 | Discontinued |
| Rhodamine (TRTIC) Donkey anti Rabbit | Jackson Immuno Research | 711-025-152 | Discontinued |
| ProLong® Diamond Antifade Mountant w/ DAPI | Thermo Fisher | P36971 | |
| (−)-N6-(2-Phenylisopropyl)adenosine | Sigma Aldrich | P4532 | |
| 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine | Sigma Aldrich | C101 | |
| siRNA pSTAT1 | Qiagen | Custome Made | Kaur et al. 201120 |
| siRNA NOX3 | Qiagen | Custome Made | Kaur et al. 201120 |
| Scrambled Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Kaur et al. 201120 |
References
- McKeage, M. J. Comparative adverse effect profiles of platinum drugs. Drug Saf. 13 (4), 228-244 (1995).
- Boulikas, T., Vougiouka, M. Cisplatin and platinum drugs at the molecular level. Oncol Rep. 10 (6), 1663-1682 (2003).
- Fouladi, M., et al. Phase II study of oxaliplatin in children with recurrent or refractory medulloblastoma, supratentorial primitive neuroectodermal tumors, and atypical teratoid rhabdoid tumors: a pediatric brain tumor consortium study. Cancer. 107 (9), 2291-2297 (2006).
- Pasetto, L. M., D'Andrea, M. R., Rossi, E., Monfardini, S. Oxaliplatin-related neurotoxicity: how and why. Crit Rev Oncol Hematol. 59 (2), 159-168 (2006).
- Ardizzoni, A., et al. Cisplatin- versus carboplatin-based chemotherapy in first-line treatment of advanced non-small-cell lung cancer: an individual patient data meta-analysis. J Natl Cancer Inst. 99 (11), 847-857 (2007).
- Banfi, B., Malgrange, B., Knisz, J., Steger, K., Dubois-Dauphin, M., Krause, K. H. NOX3, a superoxide-generating NADPH oxidase of the inner ear. J Biol Chem. 279 (44), 46065-46072 (2004).
- Mukherjea, D., Whitworth, C. A., Nandish, S., Dunaway, G. A., Rybak, L. P., Ramkumar, V. Expression of the kidney injury molecule 1 in the rat cochlea and induction by cisplatin. Neuroscience. 139 (2), 733-740 (2006).
- Rybak, L. P., Husain, K., Morris, C., Whitworth, C., Somani, S. Effect of protective agents against cisplatin ototoxicity. Am J Otol. 21 (4), 513-520 (2000).
- Lee, J. E., et al. Role of reactive radicals in degeneration of the auditory system of mice following cisplatin treatment. Acta Otolaryngol. 124 (10), 1131-1135 (2004).
- Lee, J. E., et al. Mechanisms of apoptosis induced by cisplatin in marginal cells in mouse stria vascularis. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 66 (3), 111-118 (2004).
- Lawenda, B. D., Kelly, K. M., Ladas, E. J., Sagar, S. M., Vickers, A., Blumberg, J. B. Should supplemental antioxidant administration be avoided during chemotherapy and radiation therapy. J Natl Cancer Inst. 100 (11), 773-783 (2008).
- Akil, O., Oursler, A. E., Fan, K., Lustig, L. R. Mouse auditory brainstem response testing. Bio Protoc. 6 (6), 1768 (2016).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J. Vis. Exp. (107), e53561 (2016).
- Whitlon, D. S., Szakaly, R., Greiner, M. A. Cryoembedding and sectioning of cochleas for immunocytochemistry and in situ hybridization. Brain Res Brain Res Protoc. 6 (3), 159-166 (2001).
- Londos, C., Cooper, D. M., Wolff, J. Subclasses of external adenosine receptors. Proc Natl Acad Sci. 77 (5), 2551-2554 (1980).
- Lohse, M. J., Klotz, K. N., Lindenborn-Fotinos, J., Reddington, M., Schwabe, U., Olsson, R. A. 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX)--a selective high affinity antagonist radioligand for A1 adenosine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 336 (2), 204-210 (1987).
- Rybak, L. P., Whitworth, C., Scott, V., Weberg, A. D., Bhardwaj, B. Rat as a potential model for hearing loss in biotinidase deficiency. Ann Otol Rhinol Laryngol. 100 (4), Pt 1 294-300 (1991).
- Mukherjea, D., et al. NOX3 NADPH oxidase couples transient receptor potential vanilloid 1 to signal transducer and activator of transcription 1-mediated inflammation and hearing loss. Antioxid Redox Signal. 14 (6), 999-1010 (2011).
- Kaur, T., et al. Adenosine A1 receptor protects against cisplatin ototoxicity by suppressing the NOX3/STAT1 inflammatory pathway in the cochlea. J Neurosci. 36 (14), 3962-3977 (2016).
- Kaur, T., Mukherjea, D., Sheehan, K., Jajoo, S., Rybak, L. P., Ramkumar, V. Short interfering RNA against STAT1 attenuates cisplatin-induced ototoxicity in the rat by suppressing inflammation. Cell Death Dis. 2 (180), (2011).
