Summary
Presentamos una técnica de administración localizada de fármacos a través de la ruta trans-timpánica en la cóclea. Administración de fármacos por esta vía no interferiría con la eficacia de la lucha contra el cáncer de los medicamentos quimioterapéuticos como el cisplatino.
Abstract
La administración sistémica de agentes protectores para el tratamiento de ototoxicidad inducida por drogas es limitada por la posibilidad de que estos agentes protectores podrían interferir con la eficacia quimioterapéutica de las drogas primarias. Esto es especialmente cierto para el medicamento cisplatino, cuyas acciones contra el cáncer son atenuadas por antioxidantes que ofrecen protección adecuada contra pérdida de oído. Otros agentes otoprotective actual o potencial podrían plantear un problema similar, si se administra sistémicamente. Altos niveles de estos agentes locales con limitados efectos secundarios sistémicos permitiría la aplicación de diversos biológicos o agentes protectores directamente a la cóclea. En este informe, se demuestra un método de trans-timpánica de la entrega de varias drogas o reactivos biológicos a la cóclea, que debe mejorar la investigación en ciencias básicas en la cóclea y proporcionan una forma sencilla de ordenar el uso de agentes otoprotective en las clínicas. Este informe detalla un método de entrega de drogas trans-timpánica y proporciona ejemplos de cómo esta técnica se ha utilizado con éxito en animales de experimentación para el tratamiento de la ototoxicidad del cisplatino.
Introduction
El sistema auditivo periférico es exquisitamente sensible a drogas como el cisplatino y aminoglucósidos antibióticos. Cisplatino es un agente quimioterapéutico ampliamente utilizado para el tratamiento de una variedad de tumores sólidos, tales como cabeza, ovárico y testicular y cáncer de cuello. Ototoxicidad experimentada con el uso de esta droga es dosis limitantes y bastante común, que afecta a 75-100% de los pacientes tratados1. Otros fármacos como el carboplatino y el oxaliplatino, han surgido como alternativas a cisplatino2,3,4,5, pero su utilidad es limitada a unos pocos tipos de cáncer.
Los primeros estudios han demostrado el papel fundamental de las especies reactivas del oxígeno (ROS) en la mediación de la ototoxicidad por cisplatino y aminoglucósidos. Estudios posteriores demostraron que la isoforma NOX3 de la NADPH oxidasa es la principal fuente de ROS en la cóclea y se activa con cisplatino6,7. La generación de compromisos ROS el antioxidante protegiendo la capacidad de las células, conduciendo a mayor peroxidación lipídica de las membranas celulares8. Además, cisplatino aumenta la producción de radicales hidroxilo que generan altamente tóxico aldehino 4-hydroxynonenal (4-HNE), iniciador de la célula muerte9,10. Basado en estos resultados, se han examinado varios antioxidantes para el tratamiento de la ototoxicidad del cisplatino. Estos incluyen D-metionina, N-acetilcisteína (NAC), tiosulfato de sodio (STS) y amifostina. Sin embargo, una preocupación importante de la terapia antioxidante es que estos antioxidantes podrían reducir la eficacia de quimioterapia cisplatino cuando se administra sistémicamente11 a través de la interacción de cisplatino con grupos tiol en las moléculas antioxidantes.
En vista de estos problemas con la terapia antioxidante, el objetivo de este estudio fue examinar la ruta trans-timpánica de brindar antioxidantes y otras drogas a la cóclea para reducir la pérdida de la audición. La ruta trans-timpánica de droga y corto interfiriendo (si) ARN, se describe a continuación, aparece particularmente prometedor.
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Protocol
Macho Wistar ratas fueron manejadas según el animal de institutos nacionales de salud utilice las directrices y un protocolo aprobado por el Southern Illinois Universidad Escuela de medicina laboratorio Animal cuidado y uso. Respuesta auditiva del médula oblonga (ABR) fue realizado en ratas mientras que bajo anestesia antes de la administración de drogas y 72 h después para comprobar el efecto de la entrega de drogas trans-timpánica.
1. respuesta auditivas del médula oblonga (ABR)
Nota: Mediciones de ABR se recopilaron utilizando el equipo de prueba auditiva y el software. ABR representa potenciales evocados o las ondas de alta frecuencia generadas por el octavo nervio craneal (onda I y II) y otras estructuras de tronco cerebral auditivo más alto incluyendo núcleo coclear anteroventral (onda III), la lemnisco lateral (onda IV) y la inferior colliculus (onda V). Estas ondas se diferencian dependiendo de la latencia. ABR las mediciones se realizaron como se describe anteriormente12.
- Anestesiar ratas con una mezcla de 90 mg/kg ketamina y 17 mg/kg xilacina por inyección intraperitoneal. Confirmar la profundidad del reflejo de anestesia a través del dedo del pie-pinch. Aplicar lubricante oftálmico (o unas gotas de aceite mineral) en ambos ojos para evitar que se seque los ojos y evitar ulceración durante la anestesia.
- Colocar la rata en la posición prona en una almohadilla caliente (37 ° C) dentro de una cabina acústica controlada. Equipo de prueba de audiología se encuentra fuera y al lado de la cabina.
- Inserte los electrodos de acero inoxidable en consecuencia: el electrodo de tierra en la parte posterior del flanco, el electrodo positivo entre los dos oídos directamente en la cima del cráneo y los electrodos negativos por debajo de la oreja de cada oído.
- Aplicar estímulos acústicos utilizando transductores de alta frecuencia como una ráfaga de tono de 5 ms a 8, 16 y 32 kHz. Determinar las intensidades de estímulo como nivel decibelios de presión sonora (dB SPL). Esto comienza en 10 dB SPL y llega a 90 dB SPL con un tamaño de paso de 10 dB. Calibrar las intensidades de sonido para una salida máxima de 90 dB SPL con un impulso precisión sonómetro.
Nota: El resultado da una indicación de la integridad del órgano de la audición periférica, la cóclea y las mencionadas estructuras auditivas. Las formas de onda se generan dentro del ms 15 de entrada del estímulo y la latencia de las ondas depende de tiempo de conducción, que a su vez está regulada por tres factores críticos: volumen del cerebro, la intensidad y la frecuencia del sonido. Potenciales evocados auditivos fueron registrados utilizando el software proporcionado por el fabricante. - Considerar la intensidad mínima que puede evocar dos formas de onda diferentes (II y III) de amplitud mV 0.5 como umbral prominente.
Nota: Cambio de umbral representa la diferencia en el umbral medido después del tratamiento en comparación con el umbral obtenido antes del tratamiento.
2. Trans-timpánica inyecciones
- Para administrar el fármaco trans-tympanically, colocar la rata en la posición de decúbito lateral izquierdo.
- Insertar espéculos desechables de 2,5 mm en el conducto auditivo externo.
- Con el uso de un endoscopio quirúrgico, coloque el espéculo para que la membrana del tímpano es visible.
- Usando un 29 X 1/2, jeringa de insulina de 0,5 mL, elaborar con 50 μl de la adenosina de isopropilo fenil [R] - N-(R-PIA) solución (1 μm), 8-Cyclopentyl-1, 3-dipropylxanthine (DPCPX) solución (3 μm) o siRNA (0,9 μg) para inyectar (5 unidades).
- Utilice los espéculos para dirigir la aguja en la región anterior inferior de la membrana timpánica.
- Hágale un agujero a través de la membrana con la aguja y administrar los medicamentos mencionados en 1.2.3. Permitir que la rata descanse en esta posición durante 15 minutos.
Nota: 50 μl debe ser el volumen adecuado para caber detrás de la membrana timpánica. Ningún líquido debe estar en el canal auditivo después de la administración. - Colocar la rata en el derecho decúbito lateral posición y repita los pasos 1.2.1 a través de 1.2.5 para la administración en la otra oreja.
- Para las ratas recibiendo cisplatino intraperitoneal, colocar la rata en la posición supina sobre una almohadilla térmica a 37 ° C.
- 21 X 3/4 en mariposa aguja (tubería de longitud de 12"), elaboración de cisplatino (11 mg/kg, 1 mg/mL de solución en solución salina estéril de fosfato buffer [PBS]).
- Utilizando una bomba de jeringa, administrar cisplatino (1 mg/mL) mediante inyección intraperitoneal 30 min más.
Nota: Para una rata de 250 g, el volumen sería 2,75 mL a una velocidad de aproximadamente 0,1 mL por minuto.
- Seguir controlar la profundidad de la anestesia a lo largo de estos procedimientos. Una vez completada la administración de cisplatino, vuelva a colocar la rata en la jaula en la posición propensa, asegurándose de que no haya nada que obstruya su respiración.
- Seguimiento de la rata hasta que se recuperó completamente.
3. cóclea disección y descalcificación
- Después de la final ABR (después de 72 h), anestesiar la rata con una mezcla de 90 mg/kg ketamina y 17 mg/kg xilacina por inyección intraperitoneal. Confirmar la anestesia con un reflejo del pellizco del dedo del pie. Eutanasia a la rata mediante decapitación.
- Disección del hueso temporal como se describió anteriormente13.
- Coloque la cóclea en paraformaldehído al 4% en solución en un vial de centelleo de vidrio de 7 mL (cubriendo por completo la cóclea) de PBS 1 x. Refrigerar durante la noche a 4 ° C. Paraformaldehido de quitar y lavar con 1 x PBS a temperatura ambiente.
- Quitar PBS y llenar completamente el tubo con una solución de 120 mM de EDTA (pH 7.3). Colocar en un agitador a temperatura ambiente y permiten la descalcificación durante 2 a 3 semanas, cambiando la solución de EDTA diariamente.
4. Cryosectioning
- Tras la descalcificación, sumerja completamente la cóclea de las siguientes soluciones (7 mL) durante 24 h a 4 ° C: 10% de sacarosa, sacarosa al 20%, 1:1 mezcla de sacarosa al 20% y la temperatura de corte óptimo (OCT) incrustación compuesto.
- Lugar fresco OCT compuesto para rellenar y cubrir completamente la cóclea en un 15 x 15 mm x 5 mm desechables molde de incrustación. Oriente la cóclea a su lado para que sea paralelo al fondo del molde de incrustación, descrito por Whitlon et al. 14
- Inmediatamente Coloque el molde en hielo seco para solidificar el OCT y almacenar a-80 ° C durante la noche.
- Sumerja el portaobjetos en 0.01% poli L lisina a temperatura ambiente durante 30 minutos quite las diapositivas, no enjuague y permita que seque durante la noche. Utilizar estas diapositivas para cryosections.
- Quite la cóclea en OCT del congelador de-80 ° C y coloque en hielo seco. Usando una cuchilla de micrótomo sharp (L x W: 80 mm x 8 mm, espesor de 0.25 mm, ángulo de corte de 34 °), sección de los bloques de la OCT en 10 μm con un criostato a-30 ° C. Coloque dos secciones por diapositiva.
- Refrigere diapositivas a 4 ° C una vez terminada.
5. inmunohistoquímica
- Coloque los portaobjetos en un portaobjetos de vidrio plato en una parrilla de tinción. Llene el plato con 350 mL de 1 x PBS y lavar los portaobjetos durante 5 minutos tres veces a temperatura ambiente.
- Quite las diapositivas del plato y seque el área que rodea el tejido usando un trapo seco, asegurándose de que no se seque el tejido.
- Usando una pluma líquida bloqueo, dibuje un círculo alrededor de la sección de tejido.
- Bloquear el tejido por 1 h a temperatura ambiente, agregar 150 μL de solución de bloqueo que contiene suero 10% normal (burro), detergente no iónico 1% y 1% de BSA en PBS 1 x.
- Toque el bloqueo exceso e incubar el tejido durante la noche a 4 ° C en una cámara humidificada con 150 μL de suero normal de 10% (burro), detergente no iónico 0.1% y anticuerpo primario (véase la nota de abajo) en PBS 1 x.
Nota: Para los siguientes anticuerpos, se utilizaron las diluciones: figura 2 y 3, p-STAT1 Ser727 1:300. Figura 4, p-STAT1 Ser727, 1: 100 y 1: 100 de TRPV1. - Coloque el portaobjetos en el portaobjetos de vidrio plato en una parrilla de tinción. Llene el plato con 350 mL de 1 x PBS y lave el portaobjetos durante 5 minutos tres veces a temperatura ambiente.
- Incubar con anticuerpos secundarios diluidos en una solución que contiene 0,01% de detergente no iónico y suero normal (burro) de 10% en PBS 1 x durante 2 a 3 h a temperatura ambiente en una cámara humidificada en la oscuridad.
Nota: Para los siguientes anticuerpos secundarios, se utilizaron las diluciones: figura 2 y 3, burro anti-conejo IgG de 1: 600. Figura 4, rodamina (TRITC) burro anti-conejo IgG de 1: 500 y 1: 500 de IgG de anti-cabra burro. - Coloque el portaobjetos en el portaobjetos de vidrio plato en una parrilla de tinción. Llene el plato con 350 mL de 1 x PBS y lave el portaobjetos durante 5 minutos tres veces a temperatura ambiente.
- Aprovechar el exceso de líquido fuera de la diapositiva y secar el portaobjetos con un paño seco alrededor del tejido. Montaje de diapositivas agregando una gota del agente montaje con DAPI directamente sobre el tejido. Lentamente, colocar el cubreobjetos encima, asegurando que no hay burbujas se forman por debajo y deje que los portaobjetos curar durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad. Almacenar diapositivas a 4 ° C.
- Diapositivas de imagen usando microscopia confocal. Uso de láseres para la proyección de imagen como sigue: láser UV de 543 nm láser de rodamina TRITC, DAPI y 488 nm láser de burro anti-conejo IgG.
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Representative Results
Respuestas ABR medición en ratas a los tres días siguientes administración de cisplatino mostraron una elevación significativa en los umbrales. Elevación de los umbrales se redujo significativamente en ratas administradas con trans-timpánica [R] - N - phenylisopropyladenosine (R-PIA), adenosina1 receptor agonista15, antes del cisplatino. La especificidad de la acción de R-PIA en la adenosina receptor1 fue demostrado por la observación que se antagoniza por 8-Cyclopentyl-1, 3-dipropylxanthine (DPCPX), un antagonista de los receptores específicos de1 A16. Este fármaco potencia inducida por cisplatino ABR umbral los cambios (figura 1A). Similares a su efecto de producir pérdida de audición, cisplatino aumenta también el pérdida o daños a las células de pelo exteriores (evaluada por microscopía electrónica de barrido [SEM]) (figura 1B). Se obtuvieron imágenes de SEM como se describió anteriormente17. Este efecto se redujo significativamente con administración trans-timpánica de R-PIA (figura 1C). Además, mostramos que trans-timpánica R-PIA reduce immunoreactivity p-STAT1 basal y la inducida por el cisplatino en la cóclea, lo que refleja la propiedad antiinflamatoria de esta droga (figura 2).
La ruta trans-timpánica podría utilizarse también para administrar productos biológicos como siRNAs, que resultan en efectos beneficiosos. Administración trans-timpánica de STAT1 siRNA a ratas con eficacia reduce niveles de STAT1 y p-STAT1 y bloqueando la activación de este factor de transcripción de cisplatino (figura 3).
Estudios adicionales muestran que la administración trans-timpánica de siRNA otro para el mRNA NOX3 redujo la capacidad de las drogas como capsaicina para aumentar algunos mediadores aguas abajo, como vaniloides potencial transitorio del receptor 1 (TRPV1) canal y p-STAT1 ( Figura 4). Estos mediadores están implicados en la pérdida de audición inducida por capsaicina18.
Figura 1: Administración Trans-timpánica de R-PIA reduce la pérdida de audición inducida por el cisplatino y protegidos contra la pérdida de células de pelo externas. A. umbrales ABR se midieron en ratas antes y 72 h después de tratamiento con cisplatino (11 mg/kg, i.p.) tras la administración de trans-timpánica de R-PIA o DPCPX + R-PIA. Inducida por cisplatino elevación del umbral ABR fue demostrado para ser atenuada por el agonista A1AR R-PIA. La administración concomitante de los antagonistas de A1AR, DPCPX, revirtió el efecto de R-PIA en umbral ABR y significativamente elevados que cambios de la ABR producción por cisplatino en todos las frecuencias de prueba. La flecha indica el cambio de umbral de cero ABR. B. tratamiento cisplatino mostró un daño significativo a las células de pelo externas (OHC) (flecha blanca) según lo demostrado por microscopía electrónica de barrido (SEM). R-PIA protegido el CCE contra daño inducido por el cisplatino, mientras que DPCPX atenúa el efecto protector de R-PIA. C. el gráfico de barras muestra el análisis cuantitativo de las imágenes de SEM que se muestra en B. Las barras de error indican el error estándar de la media. Asteriscos (*) y (*) indica una diferencia estadísticamente significativa de los grupos de tratamiento de vehículos o cisplatino, respectivamente, mientras que (*) indica una diferencia estadísticamente significativa de R-PIA + ratas tratados con cisplatino (p < 0.05, n = 5). Esta figura fue adaptada de Kaur et al. 19 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Trans-timpánica administración de un agonista1AR, R-PIA, redujo cisplatino aumenta p-STAT1 Immunoreactivity en la cóclea. Las ratas se administraron una dosis intraperitoneal de cisplatino (11 mg/kg), que aumentó STAT1 p Ser727 immunoreactivity, durante la administración de drogas 72 h post. Sin embargo, tratamiento previo de 1 h con trans-timpánica R-PIA blunted este aumento en p-STAT1 immunoreactivity. Co tratamiento de A1AR antagonista, DPCPX, junto con el agonista invierte la inhibición del immunoreactivity p STAT1. Coloración azul representa núcleos teñidos de DAPI, mientras que la coloración verde representa p STAT1 inmunomarcación. Sobre la cabeza y DC representan externo células de pelo y células de Deiter, respectivamente. Las flechas blancas indican las tres hileras de CCE. Barra de escala que se muestra en la parte inferior izquierda es 10 μm. Esta figura fue adaptada de Kaur et al. 19 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Administración Trans-timpánica de STAT1 siRNA niveles inducida por cisplatino bloqueado p-STAT1. Cocleares secciones aisladas de ratas administradas con cisplatino (11 mg/kg, i.p.) 72 h demostraron mayor Ser727 p STAT1 immunoreactivity en CCE. Tratamiento previo con trans-timpánica STAT1 siRNA (0,9 mg) atenuada inducida por cisplatino incremento immunoreactivity p STAT1, considerando que el revuelto no mostró ningún efecto del tratamiento. Coloración azul representa núcleos teñidos de DAPI, mientras que la coloración verde representa p STAT1 inmunomarcación. Las flechas blancas indican las tres hileras de CCE. La barra de escala que se muestra en el panel derecho inferior mide 10 μm. Esta figura fue adaptada de Kaur et al. 20 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Inyección timpánica Trans de NOX3 siRNA TRPV1 disminuye y los niveles de p-STAT1 en la cóclea de la rata. Anestesiado de ratas fueron administrada siRNA codificado (scramble) o NOX3 siRNAs por las inyecciones trans-timpánico, que fue seguido dos días más tarde por inyecciones trans-timpánica de la capsaicina para cócleas aislado de 24 h. de estos animales fueron manchadas para p-STAT1 Ser727 y el immunoreactivity de la TRPV1. La capsaicina aumenta TRPV1 (verde) y p-STAT1 immunoreactivity de727 (rojo) de Ser a las 24 h en células ganglionares (SG) de espiral, estría vascular (SVA) y células de pelo externas (OHC). Sin embargo, animales pretratados con NOX3 siRNA no mostró ninguna inducción visible de STAT1 p Ser727 y TRPV1 inmunomarcación. Barras de escala (inferior derecha) representan 10 y 50 μm para inserciones. Esta figura fue adaptada de Mukherjea et al. 18 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La vía de administración trans-timpánica permite la entrega localizada de fármacos y otros agentes a la cóclea que de lo contrario podría producir efectos secundarios sistémicos significativos si se administra sistémicamente. Este método de administración permite el rápido acceso de drogas al sitio de acción a dosis significativamente mayores que se lograría a través de la vía sistémica. Resultados aquí presentados y publicados previamente demostraron que la administración trans-timpánica de adenosina de isopropilo fenil [R] - N-(R-PIA) protege la cóclea de la célula de pelo externa inducida por cisplatino pérdida (figura 1)19 y la inducción de la inflamación según lo demostrado por activación del factor de transcripción STAT1 (en comparación con aquellos tratados con cisplatino o R-PIA + DPCPX + cisplatino) (figura 2)19. Estos beneficios podrían contribuir a la protección de pérdida de la audición de esta droga. Basado en experiencia previa, afirmamos que la FDA solo es necesario. Esto podría indicar que el fármaco queda retenido en el oído medio y podría poco a poco se tomará en la cóclea para proporcionar la protección durante los tres días que estos animales son evaluados por ototoxicidad. Esta técnica se utiliza actualmente para administrar otros medicamentos en el oído interno para determinar su eficacia como oto-fumigadores.
Además de drogas, administración trans-timpánica de siRNAs puede proporcionar efectiva caída de RNAs selectivas para reducir sus niveles de proteína y proporcionan protección oto18,20. Una vez más, estos siRNAs proporcionaría menos toxicidad si se entregan en la proximidad de la cóclea. La duración de la caída fue de hasta tres días (el límite de nuestro período de evaluación). Lo importante es la adición de siRNAs bloquea la inducción de la proteína correspondiente por ototóxicos, como el cisplatino. La duración de la caída es algo sorprendente dada la abundancia de nucleasas en líquido extracelular y en las células y la potencial dificultad en conseguir estas moléculas en las células cocleares. Sin embargo, demostración de ambos precipitación de proteínas y oto-protección implica que estos siRNAs llegan a la cóclea en concentraciones eficaces.
A pesar de los beneficios descritos anteriormente, se prevén ciertas limitaciones de esta técnica. Estos incluyen la necesidad de anestesiar a los animales experimentales antes de comenzar el procedimiento. Medicamentos se deben administrar en altas concentraciones en el oído medio ya que sólo una pequeña fracción (~ 1-10%) se prevé llegar a la perilinfa. Además, la distribución de drogas aplicadas o productos biológicos está más concentrada en la base donde se observan los mayores efectos.
Mientras que trans-timpánica entrega de agentes presentados aquí se limitó a las ratas, un método similar del fármaco podría utilizarse como profilaxis en pacientes que están esperando la quimioterapia con drogas como el cisplatino. Se prevé que este método de entrega de la droga podría adoptarse rápidamente a los seres humanos para un gran número de compuestos que han demostrado eficacia en el tratamiento de la pérdida de audición inducida por el fármaco en animales de experimentación.
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Disclosures
Ningún conflicto de interés declarado.
Acknowledgments
El trabajo descrito en este artículo fue apoyado por NCI to1 CA166907, NIDCD to1-DC 002396 y DC011621 RO3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketathesia (100 mg/ml) 10 ml | Henry Schein | 56344 | Controlled substance |
| AnaSed Injection/Xylazine (20 mg/ml) 20 ml | Henry Schein | 33197 | |
| 2.5 mm disposable ear specula | Welch Allyn | 52432 | |
| Surgical Scope | Zeiss | ||
| 29 G X 1/2 insulin syringe | Fisher Scientific | 14-841-32 | Can be purchased through other vendors |
| cis-Diammineplatinum(II) dichloride | Sigma Aldrich | P4394 | TOXIC - wear proper PPE |
| Harvard 50-7103 Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | Series 863 | |
| Excel International 21 G X 3/4 butterfly needle | Fisher | 14-840-34 | Can be purchased through other vendors |
| BSP Single Speed Syringe Pump | Brain Tree Sci, Inc | BSP-99 | |
| Pulse Sound Measurement System | Bruel & Kjaer | Pulse 13 software | |
| High-Frequency Module | Bruel & Kjaer | 3560C | |
| 1/8″ Pressure-field Microphone —-Type 4138 | Bruel & Kjaer | bp2030 | |
| High Frequency Transducer | Intelligent Hearing System | M014600 | |
| Opti-Amp Power Transmitter | Intelligent Hearing System | M013010P | |
| SmartEP ABR System | Intelligent Hearing System | M011110 | |
| Disposable Subdermal EEG Electrodes | CareFusion | 019-409700 | |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | Fisher Scientific | 28908 | TOXIC - wear proper PPE |
| 7 mL Borosilicate Glass Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-26 | Can be purchased through other vendors |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | Can be purchased through other vendors |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Can be purchased through other vendors |
| Tissue Plus OCT Compound | Fisher Scientific | 4585 | |
| CryoMolds (15 mm x 15 mm x 5mm) | Fisher Scientific | 22-363-553 | Can be purchased through other vendors |
| Microscope Slides (25mm x 75mm) | MidSci | 1354W | Can be purchased through other vendors |
| Coverslips (22 x 22 x 1) | Fisher Scientific | 12-542-B | Can be purchased through other vendors |
| Poly-L-Lysine Solution (0.01%) | EMD Millipore | A-005-C | Can be purchased through other vendors |
| HM525 NX Cryostat | Thermo Fischer Scientific | 956640 | |
| MX35 Premier Disposable Low-Profile Microtome Blades | Thermo Fischer Scientific | 3052835 | |
| Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack | Fisher Scientific | 08-812 | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | Can be purchased through other vendors |
| TritonX-100 | Acros | 21568 | Can be purchased through other vendors |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | Can be purchased through other vendors |
| Phospho-Stat1 (Ser727) antibody | Cell Signaling | 9177 | |
| VR1 Antibody (C-15) | Santa Cruz | sc-12503 | |
| DyLight 488 Donkey anti Rabbit | Jackson Immuno Research | 711-485-152 | Discontinued |
| DyLight 488 Donkey anti Goat | Jackson Immuno Research | 705-485-003 | Discontinued |
| Rhodamine (TRTIC) Donkey anti Rabbit | Jackson Immuno Research | 711-025-152 | Discontinued |
| ProLong® Diamond Antifade Mountant w/ DAPI | Thermo Fisher | P36971 | |
| (−)-N6-(2-Phenylisopropyl)adenosine | Sigma Aldrich | P4532 | |
| 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine | Sigma Aldrich | C101 | |
| siRNA pSTAT1 | Qiagen | Custome Made | Kaur et al. 201120 |
| siRNA NOX3 | Qiagen | Custome Made | Kaur et al. 201120 |
| Scrambled Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Kaur et al. 201120 |
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