Summary
Vi presenterar en teknik för lokaliserade administrering av läkemedel genom trans-trumhinna rutten in i cochlean. Drogen leverans via denna väg skulle inte störa mot cancer effekten av de kemoterapeutiska läkemedel såsom cisplatin.
Abstract
Den systemisk administreringen av skyddande läkemedel att behandla läkemedelsinducerad ototoxicitet begränsas av möjligheten att dessa skyddsmedel kan störa kemoterapeutiska effekten av de primära läkemedel. Detta är särskilt sant för det läkemedlet cisplatin, vars cancer handlingar är försvagade av antioxidanter som ger tillräckligt skydd mot hörselskador. Andra aktuella eller potentiella otoprotective medel kan utgöra ett liknande problem, om den ges systemiskt. Tillämpningen av olika biologicals eller skyddande läkemedel direkt till innerörat skulle möjliggöra höga nivåer av dessa agenter lokalt med begränsad systemiska biverkningar. I den här rapporten visar vi en trans-trumhinna metod för leverans av olika droger eller biologiska reagenser till snäckan, som bör förbättra grundläggande vetenskap forskning på snäckan och tillhandahålla ett enkelt sätt att styra användningen av otoprotective ombud i klinikerna. Denna rapport beskriver en metod för trans-trumhinna drogen leverans och ger exempel på hur denna teknik har använts framgångsrikt i försöksdjur för att behandla cisplatin ototoxicitet.
Introduction
Perifera hörselsystemet är utsökt känslig för läkemedel såsom cisplatin och aminoglykosid antibiotika. Cisplatin är en allmänt använd kemoterapeutiska medel för behandling av en mängd solida tumörer, cystor, testikelcancer och huvud och hals cancer. Ototoxicitet upplevt med användning av denna drog dosbegränsande och ganska vanligt, som påverkar 75-100% av patienterna behandlades1. Andra läkemedel, såsom karboplatin och oxaliplatin, har dykt upp som alternativ till cisplatin2,3,4,5, men deras användbarhet är begränsat till några cancerformer.
Tidiga studier har visat den kritiska rollen av reaktiva syreradikaler (ROS) medla den ototoxicitet producerad av cisplatin och aminoglykosider. Senare undersökningar visade att den NOX3 isoformen av NADPH-oxidas är den primära källan för ROS i hörselsnäckan, och aktiveras av cisplatin6,7. Generering av ROS kompromisser ökad antioxidant buffrande kapacitet av celler, vilket leder till lipidperoxidation av cellulära membran8. Dessutom ökar cisplatin produktionen av hydroxylradikaler som genererar mycket giftiga aldehyd 4-hydroxynonenal (4-HNE), en initiativtagare till cell död9,10. Baserat på dessa fynd, har flera antioxidanter undersökts för behandling av cisplatin ototoxicitet. Dessa inkluderar N-acetylcystein (NAC), natriumtiosulfat (STS), amifostin och D-metionin. Ett stort bekymmer av antioxidant behandling är dock att dessa antioxidanter skulle kunna minska cisplatin kemoterapeutiska effekt när det administreras systemiskt11 genom samverkan av cisplatin med thiol grupper i antioxidant molekyler.
Med tanke på problemen med antioxidant terapi var målet med denna studie att undersöka trans-trumhinna administreringsväg levererar antioxidanter och andra droger till snäckan att minska hörselnedsättning. Trans-trumhinna rutten av drog- och kort stör (si) RNA, beskrivs nedan, visas särskilt lovande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Manliga Wistar råttor har hanterats i enlighet med National Institutes of Health djuret använder riktlinjer och ett protokoll som godkänts av Southern Illinois University skola av medicin laboratorium djur hand och använda kommittén. Auditiv hjärnstammen svar (ABR) utfördes på råttor medan under anestesi före drug administration och 72 h efter för att kontrollera effekten av trans-trumhinna drogen leverans.
1. auditiv hjärnstammen svar (ABR)
Obs: ABR mätningar samlades in med hjälp av auditiv testutrustning och programvara. ABR representerar evoked potentials eller högfrekventa vågor som genereras av den åttonde kranialnerven (våg I och II) och andra högre auditiv hjärnstammen strukturer inklusive anteroventral cochlear nucleus (wave III), laterala lemniscus (wave IV) och sämre colliculus (wave V). Dessa vågor är differentierade beroende på latensen. ABR mätningar utfördes som tidigare beskrivits12.
- Söva råttor med en blandning av 90 mg/kg ketamin och 17 mg/kg xylazin via intraperitoneal injektion. Bekräfta djup anestesi via tå-nypa reflex. Gälla oftalmologiska smörjning (eller mineralolja droppar) båda ögonen till att ögonen torkar och undvika sår under anestesi.
- Placera råtta i liggande position på en värmedyna (37 ° C) inuti en kontrollerad akustiska monter. Audiologi testutrustning ligger utanför och bredvid båset.
- Infoga rostfria elektroder med detta: marken elektroden i baksidan flanken, den positiva elektroden mellan två öronen direkt ovanpå skallen och negativa elektroderna nedanför pinna av varje öra.
- Gäller akustiska stimuli med högfrekvent givare som en 5 ms tone burst på 8, 16 och 32 kHz. Fastställa stimulus intensitet som ljudtrycksnivå i decibel (dB SPL). Detta börjar vid 10 dB SPL och når 90-dB SPL med en 10-dB stegstorlek. Kalibrera ljud stödnivåerna till en maximal effekt på 90-dB SPL använder en impuls precision ljudnivåmätare.
Obs: Testresultatet ger en indikation av perifera förhandlingen organ, snäckan och de ovannämnda auditiva strukturerna integritet. Vågformerna genereras inom 15 ms av stimulans input och fördröjning av vågorna beror på överledningstiden, som i sin tur regleras av tre kritiska faktorer: volymen av hjärnan, intensiteten och frekvensen av ljudet. Auditory evoked potentials spelades in med hjälp av programvara som tillhandahålls av tillverkaren. - Överväga den minimisstyrka som kan framkalla två olika vågformer (II och III) av 0,5 µV amplitud som tröskel framträdande.
Obs: Tröskelvärdet Skift representerar skillnaden i tröskeln mätt efter behandling jämfört med den tröskel som erhållits före behandling.
2. Trans-trumhinna injektioner
- För att administrera läkemedlet trans-tympanically, placera råtta i vänstra laterala decubitus position.
- Infoga 2,5 mm disponibla öra specula i hörselgången.
- Med användning av en kirurgisk räckvidd, position i specula så att trumhinnan syns.
- Med en 29 G X ½, 0,5 mL insulinspruta, rita upp 50 µL av den [R] - N - fenyl isopropyl adenosin (R-PIA) lösning (1 µM), 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX) (3 µM), eller lösningen siRNA (0.9 µg) att injicera (5 enheter).
- Använd specula för att rikta nålen till den främre sämre regionen av trumhinnan.
- Peta ett hål genom membranet med nålen och administrera de läkemedel som nämns i 1.2.3. Låt råttan att vila i den här positionen i 15 min.
Obs: 50 µL bör vara tillräcklig volym att passa bakom trumhinnan. Ingen vätska bör i hörselgången efter administrering. - Placera råtta i rätt laterala decubitus position och upprepa steg 1.2.1 genom 1.2.5 för administrationen i det andra örat.
- För råttor får cisplatin intraperitonealt, placera råtta i ryggläge på en värmedyna vid 37 ° C.
- Med hjälp av en 21 G X 3/4 fjäril nål (längd slang 12 ”), utarbeta cisplatin (11 mg/kg, 1 mg/mL lösning i sterila fosfat buffert saltlösning [PBS]).
- Med en sprutpump, administrera cisplatin (1 mg/mL) via intraperitoneal injektion över 30 min.
Obs: För en 250-g råtta vore volymen 2,75 mL med en hastighet av cirka 0,1 mL per minut.
- Fortsätta att övervaka djup anestesi under dessa förfaranden. När cisplatin administration är klar, placera råtta tillbaka i buren i liggande läge, se till att det finns ingenting som hindrar dess andning.
- Övervaka råtta tills återhämtat sig helt.
3. snäckan dissektion och urkalkning
- Efter den slutliga ABR (efter 72 h), söva råtta med en blandning av 90 mg/kg ketamin och 17 mg/kg xylazin via intraperitoneal injektion. Bekräfta anestesi med en tå-nypa reflex. Avliva den råtta via halshuggning.
- Dissekera ut tinningbenet som tidigare beskrivits13.
- Placera snäckan i 4% PARAFORMALDEHYD 1 x PBS lösning i en injektionsflaska för scintillation av 7-mL glas (helt täcker cochlean). Kylskåp över natten vid 4 ° C. Ta bort PARAFORMALDEHYD och tvätta med 1 x PBS i rumstemperatur.
- Ta bort PBS och fyll röret helt med en 120 mM EDTA (pH 7,3). Placera på en rotator i rumstemperatur och låt urkalkning i 2 till 3 veckor, ändra EDTA-lösningen dagligen.
4. kryosnitt
- Efter slutförandet av urkalkning, helt fördjupa snäckan i följande lösningar (7 mL) under 24 timmar vid 4 ° C: 10% sackaros, 20% sackaros, 1:1 blandning av 20% sackaros och optimal skärtemperatur (ULT) inbäddning förening.
- Placera färsk OCT förening att fylla och helt täcka snäckan i en 15 x 15 mm x 5 mm disponibla inbäddning mögel. Orient snäckan på sin sida så att den är parallell med botten av inbäddning mögel, som beskrivs av Whitlon et al. 14
- Placera omedelbart mögel på torris att stelna ULT och förvaras vid-80 ° C över natten.
- Fördjupa objektglas i 0,01% Poly-L-lysin i rumstemperatur i 30 min. ta bort bilderna, inte skölj och låt torka över natten. Använda dessa bilder för kryosnitt.
- Ta bort snäckan i okt från frysen-80 ° C och placera den på torris. Med hjälp av en vass mikrotomen blad (L x W: 80 mm x 8 mm, tjocklek 0,25 mm, skärvinkel av 34 °), avsnitt OCT block på 10 µm med en kryostat vid-30 ° C. Placera två sektioner per bild.
- Kylskåp diabilder vid 4 ° C när du är klar.
5. immunohistokemi
- Placera glasen i en glas-objektglas färgning maträtt på en objektglashållaren. Fyll skålen med 350 mL av 1 x PBS och tvätta bilderna för 5 min tre gånger i rumstemperatur.
- Ta bort bilderna från skålen och torka av området kring vävnaden med hjälp av en torr torka, att vara säker på att inte torka av vävnaden.
- Använder en flytande blockerande penna, rita en cirkel runt avsnittet vävnad.
- Blockera vävnaden för 1 h i rumstemperatur genom att lägga till 150 µL blockerande lösning innehållande 10% normal (åsna) serum, 1% Nonjonaktivt rengöringsmedel och 1% BSA i 1 x PBS.
- Tryck ut överflödig blockerande lösning och inkubera vävnaden övernattning på 4 ° C i en fuktig kammare med 150 µL 10% normal (åsna) serum, 0,1% Nonjonaktivt rengöringsmedel och primär antikropp (se kommentaren nedan) i 1 x PBS.
Obs: För följande antikroppar, dessa utspädningar användes: för diagram 2 och 3, p-STAT1 Ser727 1:300. Figur 4, p-STAT1 Ser727, 1: 100 och TRPV1 1: 100. - Placera glasen i glas objektglas färgning maträtt på en objektglashållaren. Fyll skålen med 350 mL av 1 x PBS och tvätta objektglas för 5 min tre gånger i rumstemperatur.
- Inkubera med sekundära antikropparna utspätt i en lösning som innehåller nonjonaktivt rengöringsmedel för 0,01% och 10% normal (åsna) serum i 1 x PBS för 2 till 3 h i rumstemperatur i en fuktig kammare i mörkret.
Obs: För följande sekundära antikroppar, dessa utspädningar användes: för diagram 2 och 3, åsna anti-kanin IgG 1:600. För figur 4, rodamin (TRITC) åsna anti-kanin IgG 1: 500 och åsna anti get IgG 1: 500. - Placera glasen i glas objektglas färgning maträtt på en objektglashållaren. Fyll skålen med 350 mL av 1 x PBS och tvätta objektglas för 5 min tre gånger i rumstemperatur.
- Tryck på överflödig vätska utanför bilden, och torka i bilden med en torr torka runt vävnaden. Montera bilder genom att tillsätta en droppe av montering agent med DAPI direkt på vävnaden. Långsamt placera täckglaset på topp, att säkerställa att inga bubblor bildas under, och låt bilderna ska bota över natten i rumstemperatur i mörkret. Lagra bilder vid 4 ° C.
- Bild bilder med hjälp av konfokalmikroskopi. Använda laser för imaging som följer: UV-laser för DAPI, 488 nm laser för Donkey anti-kanin IgG och 543 nm laser för rodamin TRITC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ABR svar mätt i råttor på tre dagar efter administrering av cisplatin visade en signifikant förhöjning i trösklar. Höjning av tröskelvärdena var signifikant reducerad hos råttor som administreras med trans-trumhinna [R] - N - phenylisopropyladenosine (R-PIA), adenosin en1 receptoragonist15, före cisplatin. Specificiteten av handlingen av R-PIA på den adenosin en1 receptor visades av observationen att det var motverkas av 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX), en A1 receptor-specifik antagonist16. Denna drog förstärkte cisplatin-inducerad ABR tröskel Skift (figur 1A). Liknar dess effekt att producera hörselnedsättning, cisplatin också ökat den förlust/skadan på yttre hårceller (bedömd med svepelektronmikroskopi [SEM]) (figur 1B). SEM-bilder erhölls som tidigare beskrivna17. Denna effekt minskade avsevärt genom trans-trumhinna administrering av R-PIA (figur 1C). Vi visar dessutom att trans-trumhinna R-PIA minskar basal och cisplatin-inducerad p-STAT1 immunoreaktivitet i hörselsnäckan, reflekterande antiinflammatoriska egenskapen av denna drog (figur 2).
Trans-trumhinna rutten kunde också användas för att administrera biologics såsom siRNAs, vilket resulterar i positiva effekter. Trans-trumhinna administrering av STAT1 siRNA till råttor effektivt reducerade STAT1 och p-STAT1 nivåer och blockerade aktiveringen av denna transkriptionsfaktor av cisplatin (figur 3).
Ytterligare studier visar att minskade trans-trumhinna administrering av en annan siRNA för NOX3 mRNA förmåga droger såsom capsaicin öka vissa nedströms medlare, såsom övergående receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) kanal och p-STAT1 ( Figur 4). Dessa mediatorer är inblandade i capsaicin-nedsatt hörsel förlust18.
Figur 1: Trans-trumhinna administrering av R-PIA minskas Cisplatin hörselnedsättning och skyddas mot förlust av yttre hårceller. A. ABR tröskelvärden mättes hos råttor före och 72 h efter att behandla dem med cisplatin (11 mg/kg, i.p.) trans-trumhinna administrering av R-PIA eller DPCPX + R-PIA. Cisplatin-inducerad behörighetshöjning ABR tröskel visades att dämpas av den A1AR agonist, R-PIA. Samtidig administrering av A1AR antagonisten, DPCPX, omvända effekten av R-PIA på ABR tröskeln och avsevärt förhöjd ABR skiftar produceras av cisplatin alls de frekvenser som testas. Pilen anger noll ABR tröskel SKIFT. B. Cisplatin behandling visade betydande skador på de yttersta hårcellerna (OHC) (vit pil) som framgår av svepelektronmikroskopi (SEM). R-PIA skyddade OHCs mot cisplatin-inducerad skada, medan DPCPX försvagade den skyddande effekten av R-PIA. C. stapeldiagrammet visar kvantitativ analys av SEM bilderna visas i B. Felstaplar visar standardavvikelsen för medelvärdet. Asterisker (*) och (*) anger en statistiskt signifikant skillnad från fordonet eller cisplatin behandlingsgrupperna, respektive, medan (*) visar en statistiskt signifikant skillnad från R-PIA + cisplatin-behandlade råttor (p < 0,05, n = 5). Denna siffra var anpassad från Kaur o.a. 19 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Trans-trumhinna administrering av en1AR Agonist, R-PIA, minskad Cisplatin-ökad p-STAT1 immunoreaktivitet i hörselsnäckan. Råttor administrerades en intraperitoneal dos av cisplatin (11 mg/kg), vilket ökat p-STAT1 Ser727 immunoreaktivitet, bedömas på 72 h post drug administration. Dock 1 h förbehandling med trans-trumhinna R-PIA trubbiga denna ökning i p-STAT1 immunoreaktivitet. Samtidig behandling av A1AR antagonisten, DPCPX, tillsammans med agonist omvända hämning av p-STAT1 immunoreaktivitet. Blå färgning är DAPI-färgade kärnor, medan grön färgning representerar p-STAT1 immunolabeling. OHC och DC representerar yttre hår cell och Deiter's cell, respektive. Vita pilar visar de tre raderna i OHCs. Skalstapeln visas i den nedersta vänstra panelen är 10 µm. Denna siffra var anpassad från Kaur o.a. 19 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Trans-trumhinna Administration av STAT1 siRNA blockerade Cisplatin-inducerad p-STAT1 nivåer. Cochlear sektioner isolerade från råttor som administreras med cisplatin (11 mg/kg, i.p.) för 72 h visade ökad Ser727 p-STAT1 immunoreaktivitet i OHCs. Förbehandling med trans-trumhinna STAT1 siRNA (0,9 mg) försvagade cisplatin-inducerad ökning av p-STAT1 immunoreaktivitet, medan äggröra behandling visade ingen effekt. Blå färgning är DAPI-färgade kärnor, medan grön färgning representerar p-STAT1 immunolabeling. Vita pilar visar de tre raderna i OHCs. Skalstapeln visas i den nedersta högra panelen mäter 10 µm. Denna siffra var anpassad från Kaur o.a. 20 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Trans-trumhinna injektion av NOX3 siRNA minskar TRPV1 och p-STAT1 nivåer i råtta hörselsnäckan. Sövda råttor var administrerade kodade siRNA (scramble) eller NOX3 siRNAs av trans-trumhinna injektionerna, som följdes två dagar senare av trans-trumhinna injektioner av capsaicin för 24 h. isolerade cochleae från dessa djur var färgas för p-STAT1 Ser727 och TRPV1 immunoreaktivitet. Kapsaicin ökade både TRPV1 (grön) och p-STAT1 Ser727 (röd) immunoreaktivitet på 24 h i stria vascularis (SVA), yttre hårceller (OHC) och spiral ganglion (SG) celler. Djur som förbehandlats med NOX3 siRNA visade dock inte någon synlig induktion av p-STAT1 Ser727 och TRPV1 immunolabeling. Skala staplarna (nedre högra panelen) representerar 50 och 10 µm för inläggningar. Denna siffra var anpassad från Mukherjea et al. 18 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den trans-trumhinna administrationssätt möjliggör lokaliserade leverans av droger och andra medel till snäckan som annars kunde producera betydande systemiska biverkningar om det administreras systemiskt. Denna metod av Läkemedelsverket tillåter snabb tillgång av droger till platsen för åtgärd vid betydligt högre doser än skulle uppnås genom systemisk rutten. Resultaten presenteras här och publicerade tidigare visade att trans-trumhinna administrering av [R] - N - fenyl isopropyl adenosin (R-PIA) skyddade snäckan från cisplatin-inducerad yttre hår cell förlust (figur 1)19 och induktion av inflammation vilket framgår av minskat aktivering av STAT1 transkriptionsfaktor (jämfört med dem som behandlades med cisplatin eller R-PIA + DPCPX + cisplatin) (figur 2)19. Dessa fördelar kan bidra till skyddet från hörselnedsättning som ges av denna drog. Baserat på tidigare erfarenhet, hävda vi enda Läkemedelslära behövs. Detta kan tyda på att läkemedlet finns kvar i mellanörat och kunde sakta tas upp in i cochlean att ge skydd under de tre dagar som dessa djur bedöms för ototoxicitet. Denna teknik används för närvarande att leverera andra droger i innerörat att avgöra deras effektivitet som oto-protectants.
Förutom läkemedel, kan trans-trumhinna administrering av siRNAs ge effektiv Nedslagning av selektiv RNAs att minska deras proteinnivåer och ge oto-skydd18,20. Återigen, dessa siRNAs skulle ge mindre toxicitet om de levereras i närheten av cochlean. Varaktigheten av överväldigande var upp till tre dagar (gränsen för vår bedömningsperioden). Tillägg av siRNAs blockerar allt, induktion av deras motsvarande protein som Ototoxiska läkemedel, såsom cisplatin. Varaktigheten av överväldigande är något förvånande med tanke på överflödet av nukleaser i extracellulär vätska och i celler och den potentiella svårigheten med att få dessa molekyler till cochlear celler. Demonstration av båda Nedslagning av proteiner och oto-skydd skulle dock innebära att dessa siRNAs når snäckan på effektiva koncentrationer.
Trots de fördelar som beskrivs ovan, förväntas vissa begränsningar av denna teknik. Dessa inkluderar behovet av anesthetizing de experimentella djur innan du startar proceduren. Läkemedel måste administreras vid högre koncentrationer i mellanörat eftersom bara en bråkdel (~ 1-10%) förväntas nå perilymph. Fördelningen av tillämpad droger eller biologicals är dessutom mer koncentrerad vid basen där de största effekterna observeras.
Medan trans-trumhinna leverans av agenter som presenteras här var begränsad till råttor, kan en liknande metod av drogen leverans användas profylaktiskt patienter väntar kemoterapi med läkemedel såsom cisplatin. Det förväntas att denna drog leveranssätt kunde antas snabbt till människor att screena ett stort antal föreningar som har visat effekt vid behandling av läkemedelsinducerad hörselnedsättning hos försöksdjur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Någon intressekonflikt förklarade.
Acknowledgments
Det arbete som beskrivs i denna artikel stöddes av en NCI RO1 CA166907, NIDCD RO1-DC 002396 och RO3 DC011621.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketathesia (100 mg/ml) 10 ml | Henry Schein | 56344 | Controlled substance |
| AnaSed Injection/Xylazine (20 mg/ml) 20 ml | Henry Schein | 33197 | |
| 2.5 mm disposable ear specula | Welch Allyn | 52432 | |
| Surgical Scope | Zeiss | ||
| 29 G X 1/2 insulin syringe | Fisher Scientific | 14-841-32 | Can be purchased through other vendors |
| cis-Diammineplatinum(II) dichloride | Sigma Aldrich | P4394 | TOXIC - wear proper PPE |
| Harvard 50-7103 Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | Series 863 | |
| Excel International 21 G X 3/4 butterfly needle | Fisher | 14-840-34 | Can be purchased through other vendors |
| BSP Single Speed Syringe Pump | Brain Tree Sci, Inc | BSP-99 | |
| Pulse Sound Measurement System | Bruel & Kjaer | Pulse 13 software | |
| High-Frequency Module | Bruel & Kjaer | 3560C | |
| 1/8″ Pressure-field Microphone —-Type 4138 | Bruel & Kjaer | bp2030 | |
| High Frequency Transducer | Intelligent Hearing System | M014600 | |
| Opti-Amp Power Transmitter | Intelligent Hearing System | M013010P | |
| SmartEP ABR System | Intelligent Hearing System | M011110 | |
| Disposable Subdermal EEG Electrodes | CareFusion | 019-409700 | |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | Fisher Scientific | 28908 | TOXIC - wear proper PPE |
| 7 mL Borosilicate Glass Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-26 | Can be purchased through other vendors |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | Can be purchased through other vendors |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Can be purchased through other vendors |
| Tissue Plus OCT Compound | Fisher Scientific | 4585 | |
| CryoMolds (15 mm x 15 mm x 5mm) | Fisher Scientific | 22-363-553 | Can be purchased through other vendors |
| Microscope Slides (25mm x 75mm) | MidSci | 1354W | Can be purchased through other vendors |
| Coverslips (22 x 22 x 1) | Fisher Scientific | 12-542-B | Can be purchased through other vendors |
| Poly-L-Lysine Solution (0.01%) | EMD Millipore | A-005-C | Can be purchased through other vendors |
| HM525 NX Cryostat | Thermo Fischer Scientific | 956640 | |
| MX35 Premier Disposable Low-Profile Microtome Blades | Thermo Fischer Scientific | 3052835 | |
| Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack | Fisher Scientific | 08-812 | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | Can be purchased through other vendors |
| TritonX-100 | Acros | 21568 | Can be purchased through other vendors |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | Can be purchased through other vendors |
| Phospho-Stat1 (Ser727) antibody | Cell Signaling | 9177 | |
| VR1 Antibody (C-15) | Santa Cruz | sc-12503 | |
| DyLight 488 Donkey anti Rabbit | Jackson Immuno Research | 711-485-152 | Discontinued |
| DyLight 488 Donkey anti Goat | Jackson Immuno Research | 705-485-003 | Discontinued |
| Rhodamine (TRTIC) Donkey anti Rabbit | Jackson Immuno Research | 711-025-152 | Discontinued |
| ProLong® Diamond Antifade Mountant w/ DAPI | Thermo Fisher | P36971 | |
| (−)-N6-(2-Phenylisopropyl)adenosine | Sigma Aldrich | P4532 | |
| 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine | Sigma Aldrich | C101 | |
| siRNA pSTAT1 | Qiagen | Custome Made | Kaur et al. 201120 |
| siRNA NOX3 | Qiagen | Custome Made | Kaur et al. 201120 |
| Scrambled Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Kaur et al. 201120 |
References
- McKeage, M. J. Comparative adverse effect profiles of platinum drugs. Drug Saf. 13 (4), 228-244 (1995).
- Boulikas, T., Vougiouka, M. Cisplatin and platinum drugs at the molecular level. Oncol Rep. 10 (6), 1663-1682 (2003).
- Fouladi, M., et al. Phase II study of oxaliplatin in children with recurrent or refractory medulloblastoma, supratentorial primitive neuroectodermal tumors, and atypical teratoid rhabdoid tumors: a pediatric brain tumor consortium study. Cancer. 107 (9), 2291-2297 (2006).
- Pasetto, L. M., D'Andrea, M. R., Rossi, E., Monfardini, S. Oxaliplatin-related neurotoxicity: how and why. Crit Rev Oncol Hematol. 59 (2), 159-168 (2006).
- Ardizzoni, A., et al. Cisplatin- versus carboplatin-based chemotherapy in first-line treatment of advanced non-small-cell lung cancer: an individual patient data meta-analysis. J Natl Cancer Inst. 99 (11), 847-857 (2007).
- Banfi, B., Malgrange, B., Knisz, J., Steger, K., Dubois-Dauphin, M., Krause, K. H. NOX3, a superoxide-generating NADPH oxidase of the inner ear. J Biol Chem. 279 (44), 46065-46072 (2004).
- Mukherjea, D., Whitworth, C. A., Nandish, S., Dunaway, G. A., Rybak, L. P., Ramkumar, V. Expression of the kidney injury molecule 1 in the rat cochlea and induction by cisplatin. Neuroscience. 139 (2), 733-740 (2006).
- Rybak, L. P., Husain, K., Morris, C., Whitworth, C., Somani, S. Effect of protective agents against cisplatin ototoxicity. Am J Otol. 21 (4), 513-520 (2000).
- Lee, J. E., et al. Role of reactive radicals in degeneration of the auditory system of mice following cisplatin treatment. Acta Otolaryngol. 124 (10), 1131-1135 (2004).
- Lee, J. E., et al. Mechanisms of apoptosis induced by cisplatin in marginal cells in mouse stria vascularis. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 66 (3), 111-118 (2004).
- Lawenda, B. D., Kelly, K. M., Ladas, E. J., Sagar, S. M., Vickers, A., Blumberg, J. B. Should supplemental antioxidant administration be avoided during chemotherapy and radiation therapy. J Natl Cancer Inst. 100 (11), 773-783 (2008).
- Akil, O., Oursler, A. E., Fan, K., Lustig, L. R. Mouse auditory brainstem response testing. Bio Protoc. 6 (6), 1768 (2016).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J. Vis. Exp. (107), e53561 (2016).
- Whitlon, D. S., Szakaly, R., Greiner, M. A. Cryoembedding and sectioning of cochleas for immunocytochemistry and in situ hybridization. Brain Res Brain Res Protoc. 6 (3), 159-166 (2001).
- Londos, C., Cooper, D. M., Wolff, J. Subclasses of external adenosine receptors. Proc Natl Acad Sci. 77 (5), 2551-2554 (1980).
- Lohse, M. J., Klotz, K. N., Lindenborn-Fotinos, J., Reddington, M., Schwabe, U., Olsson, R. A. 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX)--a selective high affinity antagonist radioligand for A1 adenosine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 336 (2), 204-210 (1987).
- Rybak, L. P., Whitworth, C., Scott, V., Weberg, A. D., Bhardwaj, B. Rat as a potential model for hearing loss in biotinidase deficiency. Ann Otol Rhinol Laryngol. 100 (4), Pt 1 294-300 (1991).
- Mukherjea, D., et al. NOX3 NADPH oxidase couples transient receptor potential vanilloid 1 to signal transducer and activator of transcription 1-mediated inflammation and hearing loss. Antioxid Redox Signal. 14 (6), 999-1010 (2011).
- Kaur, T., et al. Adenosine A1 receptor protects against cisplatin ototoxicity by suppressing the NOX3/STAT1 inflammatory pathway in the cochlea. J Neurosci. 36 (14), 3962-3977 (2016).
- Kaur, T., Mukherjea, D., Sheehan, K., Jajoo, S., Rybak, L. P., Ramkumar, V. Short interfering RNA against STAT1 attenuates cisplatin-induced ototoxicity in the rat by suppressing inflammation. Cell Death Dis. 2 (180), (2011).
