Summary
Biz bir teknik trans-tympanic rota üzerinden uyuşturucu yerelleştirilmiş yönetim koklea içine için mevcut. Bu rota üzerinden ilaç dağıtım gibi sisplatin kemoterapi ilaçların anti-kanser etkinliği ile müdahale olmaz.
Abstract
Sistemik yönetim ototoksisite ilaçla tedavi etmek için koruyucu ajanlar bu koruyucu ajanlar ile birincil ilaçların etkinliğini kemoterapötik engelleyebilir imkanı ile sınırlıdır. Bu, özellikle antikanser eylemlerini işitme kaybına karşı yeterli koruma sağlamak Antioksidanlar tarafından zayıflatılmış uyuşturucu sisplatin için geçerlidir. Diğer mevcut ya da potansiyel otoprotective temsilcileri benzer bir sorun, sistemik yönetilen doğuracak. Koklea doğrudan çeşitli biyolojik madde veya koruyucu uygulamayı yerel olarak sınırlı sistemik yan etkileri ile bu ajanların yüksek düzeyleri için izin vermez. Bu raporda, çeşitli uyuşturucu veya biyolojik reaktifler teslimat için temel bilim araştırma koklea geliştirmek ve otoprotective ajanlar kliniklerde kullanımını yönlendiren basit bir yol sağlar koklea, trans-tympanic bir yöntemi göstermektedir. Bu rapor trans-tympanic ilaç dağıtım yöntemi ayrıntıları ve nasıl bu tekniği başarıyla deneysel hayvanlarda sisplatin ototoksisite tedavisinde kullanılmaya başlanmıştır kullanım örnekleri sağlar.
Introduction
Periferik işitme sisteminin zarif sisplatin ve aminoglikosite antibiyotik gibi ilaçlar duyarlıdır. Sisplatin solid tümör, yumurtalık, testis ve baş gibi çeşitli tedavisinde yaygın olarak kullanılan bir kemoterapötik ajan olduğunu ve boyun kanserleri. Bu ilaç kullanımı ile deneyimli ototoksisite doz-sınırlayıcı olduğunu ve oldukça yaygın, hastaların % 75-100 etkileyen1ele. Carboplatin ve oxaliplatin'i, gibi diğer ilaçlar sisplatin2,3,4,5alternatif olarak ortaya çıkmıştır, ama bazı kanserler için onların yararlılığı sınırlıdır.
Erken çalışmalar Reaktif oksijen türleri (ROS) kritik rolü sisplatin ve aminoglikozitler tarafından üretilen ototoksisite arabuluculuk göstermiştir. Sonraki çalışmalarda NADPH oksidaz NOX3 izoformu ROS birincil kaynak koklea içinde ve sisplatin6,7tarafından aktif gösterdi. ROS tavizler nesil hücreler lider, kapasiteli tampon antioksidan lipid peroksidasyon hücresel zarları8arttı. Ayrıca, sisplatin yüksek derecede toksik aldehid 4-hydroxynonenal (4-HNE), hücre ölüm9,10başlatıcı oluşturmak hidroksil radikalleri üretimi artar. Bu bulgulara dayanarak, birkaç antioksidanlar sisplatin ototoksisite tedavisi için inceledik. Bu N-asetil sistein (NAC), sodyum thiosulfate (STS), amifostine ve D-metionin içerir. Ancak, antioksidan tedavinin asıl ilgilendiği temel konu bu antioksidanlar sistemik11 sisplatin thiol gruplar halinde antioksidan molekülleri ile etkileşimi aracılığıyla yönetilen zaman sisplatin kemoterapi etkinliğini azaltabilir olduğunu.
Antioksidan tedavisi ile bu sorunların içinde görüş-in bu çalışmanın hedefi, antioksidanlar ve diğer uyuşturucular işitme kaybı azaltmak için koklea teslim etme trans-tympanic rota incelemek için oldu. Uyuşturucu ve kısa (SI) RNA, aşağıda açıklanan engel trans-tympanic güzergahı özellikle umut verici görünüyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Erkek Wistar fareler Ulusal Sağlık Enstitüleri hayvan uygun olarak ele kullanma yönergeleri ve Southern Illinois Üniversitesi okul tıp laboratuvar hayvan bakımı ve kullanmak Komitesi tarafından onaylanmış bir iletişim kuralı. İşitsel beyin sapı davranım Odyometrisi (ABR), trans-tympanic ilaç dağıtım etkisini doğrulamak için önce ilaç idaresi ve 72 h sonra anestezi altında fareler üzerinde gerçekleştirildi.
1. işitsel beyin sapı davranım Odyometrisi (ABR)
Not: ABR ölçümleri işitsel test cihazları ve yazılım kullanılarak toplanmıştır. ABR uyarılmış potansiyeller veya yüksek frekanslı dalgalar sekizinci kranial sinir tarafından oluşturulan temsil eder (dalga ı ve II) ve anteroventral koklear çekirdeği (dalga III), lateral lemniscus (dalga IV) ve inferior gibi daha yüksek diğer işitsel beyin sapı yapıları olacaklar (dalga V). Bu dalgalar gecikme süresi bağlı olarak farklı. ABR ölçümleri12daha önce açıklandığı gibi yapıldı.
- Fareler 90 mg/kg ketamin ve 17 mg/kg xylazine üzerinden mayi enjeksiyon karışımı ile anestezi. Anestezi ile ayak-çimdik refleks derinliği onaylayın. Oftalmik yağlama (veya madeni yağ damla) gözlerinin kurumasını önlemek ve ülserasyon anestezi sırasında önlemek için her iki gözde uygulanır.
- Yüzükoyun kontrollü bir akustik kabin içinde bir Isıtma yastık (37 ° C) üzerinde fareyi yerleştirin. Odyoloji test etme donanımları dışında ve kabine yanında yer alır.
- Paslanmaz çelik elektrotlar buna göre ekle: zemin elektrot arka kanat, doğrudan kafatası tepesine iki kulak ve her kulak pinna aşağıda negatif elektrotlar arasında pozitif elektrot.
- Akustik uyaranlara 5 ms sesi patlama 8, 16 ve 32 kHz olarak yüksek frekans dönüştürücü kullanarak uygulayın. Uyarıcı yoğunluklarda desibel ses basınç seviyesi (dB SPL) belirleyin. Bu 10 dB SPL başlar ve 90 dB SPL bir 10-dB adım boyu ile ulaşır. Bir dürtü hassas ses seviyesi ölçer kullanarak 90 dB SPL maksimum çıkış ses yoğunluklarda kalibre.
Not: Test sonucu periferik işitme organı, koklea ve söz konusu işitsel yapıları bütünlüğünü bir göstergesi verir. Dalga biçimleri uyarıcı giriş 15 ms içinde oluşturulur ve sırayla üç kritik faktörler tarafından düzenlenir ve tel zaman dalgalar gecikme süresi bağlıdır: beyin, yoğunluğu ve frekans ses hacmi. İşitsel uyarılmış potansiyeller yazılım üreticisi tarafından sağlanan kullanarak kaydedildi. - İki farklı dalga biçimleri (II ve III) 0.5 µV genlik, eşik olarak belirgin uyandırmak en düşük yoğunluk göz önünde bulundurun.
Not: Eşik üst karakter sonra tedavi tedavi öncesi elde edilen eşik ile karşılaştırıldığında ölçülen eşik farkı temsil eder.
2. Trans-Tympanic enjeksiyon
- Trans-tympanically ilacı vermek için fareyi sol yanal dekübitus pozisyonda yerleştirin.
- 2.5 mm tek kullanımlık kulak ayna kulak kanalı içine yerleştirin.
- Böylece kulak zarı görülebilir bir cerrahi kapsam kullanımı ile Ayna getirin.
- 29 G X ½, 0.5 mL insülin şırınga, kullanarak çizdiğiniz [R] - N - fenil izopropil adenozin 50 µL kadar (R-PIA) çözüm (1 µM), 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX) çözüm (3 µM) veya (5 adet) enjekte siRNA çözüm (0.9 µg).
- Kulak zarı ön alt bölgeye iğne yönlendirmek için ayna kullanın.
- İğne ile membran delik poke ve 1.2.3 içinde belirtilen uyuşturucu yönetmek. Fareyi 15 dakika bu pozisyonda dinlenmek izin verir.
Not: 50 µL kulak zarı sığdırmak için yeterli güç olması gerekir. Hiçbir sıvı içinde belgili tanımlık kulak kanal yönetim sonra olmalıdır. - Fareyi sağ yanal dekübitus getirin ve diğer kulakta Yönetim için adımları 1.2.1 1.2.5 aracılığıyla yineleyin yerleştirin.
- Sisplatin intraperitoneally alma sıçanlara sırtüstü pozisyonda 37 ° C'de bir Isıtma yastık üzerinde fareyi yer
- 21 G X 3/4 kullanarak iğne (12" uzunluğu boru) cevap ver, sisplatin (11 mg/kg, 1 mg/mL steril fosfat tampon serum [PBS] çözümde) çekmek.
- Bir şırınga pompa kullanarak, sisplatin (1 mg/mL) ile mayi enjeksiyon 30 dk yönetmek.
Not: 250 g sıçan için birimin 2.75 mL yaklaşık 0.1 mL min başına oranında olacaktır.
- Bu yordamları boyunca anestezi derinliği izlemeye devam edin. Sisplatin yönetim tamamlandıktan sonra fare geri onun nefes engel bir şey olmadığına emin yapma yüzükoyun, kafeste yerleştirin.
- Tamamen iyileşti kadar fare izleyin.
3. koklea diseksiyon ve kalsiyumun
- (Sonra 72 h) son ABR fareyi 90 mg/kg ketamin ve 17 mg/kg xylazine üzerinden mayi enjeksiyon karışımı ile anestezi. Anestezi ayak-çimdik refleks ile onaylayın. İşten çıkarma yolu ile sıçan ötenazi.
- Temporal13daha önce açıklandığı gibi kemik incelemek.
- Koklea (koklea tamamen kaplayan) 7-mL cam mercek şişe çözümde PBS x 1 %4 paraformaldehyde yerleştirin. Gecede 4 ° C'de soğutmak Paraformaldehyde kaldırmak ve oda sıcaklığında 1 x PBS ile yıkayın.
- PBS çıkartın ve tüp tamamen EDTA (pH 7.3) 120-mM çözüm ile doldurun. Oda sıcaklığında bir rotator yerleştirin ve 2-3 hafta, EDTA çözüm her gün değişen incelemelerine izin.
4. Cryosectioning
- Kalsiyumun tamamlandığında, aşağıdaki çözümleri (7 mL her) koklea 24 h 4 ° c % 10 Sükroz, % 20 Sükroz, % 20 sukroz ve bileşik katıştırma en uygun kesme sıcaklık (OCT) 1:1 karışımı için tamamen bırakın.
- Taze OCT bileşik doldurup tamamen koklea içinde bir 15 x 15 mm x 5 mm kalıp katıştırma tek kullanımlık kapak koyun. Koklea kendi tarafında Whitlon ve arktarafından açıklandığı gibi gömme kalıp alt paralel gelecek şekilde yönlendirin. 14
- Hemen kalıp OKT kuvvetlendirmek ve-80 ° C'de gecede depolamak için Kuru Buza koyun.
- Mikroskop slaytları % 0,01 bırakın Poly-L lizin, oda sıcaklığında 30 dk. Kaldır slaytları, değil durulayın ve kuru gecede için izin. Bu slayt için cryosections kullanın.
- Koklea Ekim-80 ° C dondurucudan çıkarın ve kuru buza yerleştirin. Bir keskin microtome bıçak (L x W: 80 mm x 8 mm, kalınlık 0.25 mm, kesme açısı 34 °), kullanarak bölüm 10 µm-30 ° C'de bir cryostat kullanarak, OCT blokları Slayt başına iki bölüme yerleştirin.
- Ne zaman tamamlanmak 4 ° C'de slaytlar buzdolabında bekletin.
5. immünhistokimya
- Slaytları bir slayt raf tabak boyama cam mikroskop kaymak yerleştirin. Çanak 350 mL 1 x PBS ile doldurulması ve 5 min için slaytlar üç kez oda sıcaklığında yıkayın.
- Slaytlar çanağı kaldırmak ve doku kuru değil emin olmak bir Kuru Temizleme işlemi kullanarak doku çevresi kapalı kuru.
- Sıvı engelleme kalemi, doku bölümü bir daire çizin.
- Oda sıcaklığında 1 h için doku 150 µL % 10 normal (eşek) serum, % 1 Noniyonik deterjan ve 1 x PBS % 1 BSA içeren engelleme çözümün ekleyerek engellemek.
- Dokunun fazla engelleme çözüm ve doku gecede 4 ° C'de % 10 normal (eşek) serum, % 0,1 Noniyonik deterjan ve birincil antikor (aşağıdaki nota bakın) 150 µL ile oksijen odasında kuluçkaya 1 x PBS içinde.
Not: Aşağıdaki antikorlar için bu dilutions kullanıldı: Şekil 2 ve 3, p-STAT1 Ser727 1:300. Şekil 4, p-STAT1 Ser727, 1: 100 ve TRPV1 1: 100. - Slaytları bir slayt raf tabak boyama cam mikroskop kaymak yerleştirin. Çanak 350 mL 1 x PBS ile doldurulması ve slaytlar 5 min için üç kez oda sıcaklığında yıkayın.
- % 0,01 Noniyonik deterjan ve 1 x PBS oksijen odası karanlık oda sıcaklığında 2-3 h için % 10 normal (eşek) serum içeren bir çözüm içinde seyreltilmiş ikincil antikorlar ile kuluçkaya.
Not: Aşağıdaki ikincil antikorlar için bu dilutions kullanıldı: Şekil 2 ve 3, Anti-tavşan eşek IgG 1:600. Şekil 4için 1:500 rodamine (TRITC) eşek Anti-tavşan IgG ve eşek Anti-keçi IgG 1:500. - Slaytları bir slayt raf tabak boyama cam mikroskop kaymak yerleştirin. Çanak 350 mL 1 x PBS ile doldurulması ve slaytlar 5 min için üç kez oda sıcaklığında yıkayın.
- Aşırı sıvı slaydın dışına dokunun ve slayt etrafında doku kuru bir bezle kurulayın. Slaytlar DAPI montaj aracıyla doğrudan doku üzerine bir damla ekleyerek bağlayın. Yavaş yavaş üzerine hava kabarcığı yok altında kurulan sağlanması, coverslip yerleştirin ve slaytlar gecede karanlık oda sıcaklığında tedavi sağlar. Slaytları 4 ° C'de depolama
- Görüntü confocal mikroskobu kullanarak slaytlar. Aşağıdaki gibi görüntüleme için lazer kullanır: UV lazer DAPI, 488 nm lazer için anti-tavşan eşek IgG ve 543 nm lazer rodamine TRITC için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ABR yanıt-e doğru üç gün aşağıdaki sisplatin yönetim önemli bir ayrıcalık eşikleri gösterdi de, fareler ölçülür. Bu eşikleri yükselmesine önemli ölçüde azaltılmış trans-tympanic [R] - N - phenylisopropyladenosine ile yönetilen Sıçanlarda (R-PIA), adenozin bir1 reseptör agonist15, sisplatin önce. Reylem özgüllük-1 reseptör gösterdi bu 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine tarafından (DPCPX), bir A1 özel reseptör antagonisti16kızıştırdım gözlem tarafından adenozin, PIA. Bu ilaç sisplatin kaynaklı ABR eşik vardiya (şekil 1A) potentiated. Benzer şekilde işitme kaybı üreten etkisi, sisplatin da kayıp/hasar (elektron mikroskobu [SEM] tarayarak değerlendirildi) dış saç hücrelere artırdı (şekil 1B). SEM görüntüleri önceden açıklanan17olarak elde edilmiştir. Bu etkisi önemli ölçüde R, trans-tympanic yönetimi tarafından düşürüldü-PIA (şekil 1C). Ayrıca, biz bu trans-tympanic göster: R-PIA bu ilaç (Şekil 2) anti-inflamatuar özelliğini yansıtan koklea, Bazal ve sisplatin kaynaklı p STAT1 immunoreactivity azaltır.
Trans-tympanic yolu da destekte yararlı etkilere çift gibi yönetmek için kullanılabilir. Etkili bir şekilde STAT1 ve p-STAT1 düzeyleri azalır ve sisplatin (şekil 3) tarafından Bu transkripsiyon faktörü aktivasyonu bloke STAT1 siRNA fareler için Trans-tympanic yönetim.
Başka bir siRNA trans-tympanic yönetim NOX3 mRNA için yeteneği azalmış ek çalışmalar göstermek geçici reseptör potansiyel vanilloid gibi bazı aşağı akım arabulucu artırmak için kapsaisin gibi 1 (TRPV1) kanal ve p-STAT1 ( ilaçlar Şekil 4). Bu aracılar kapsaisin bağlı işitme kaybı18' karıştığı.
Resim 1: Trans-tympanic İdaresi R-PIA azaltılmış sisplatin bağlı işitme kaybı ve dış saç hücreleri kaybına karşı korumalı. A. ABR eşikleri ölçülen de, fareler ve 72 h önce sisplatin (11 mg/kg, IP) ile tedavi sonra R, trans-tympanic yönetimi takip-PIA ya da DPCPX + R-PIA. Sisplatin kaynaklı yükselmesine ABR eşik A1AR agonist Rtarafından zayıflatılmış için gösterildi-PIA. A1AR antagonisti DPCPX, ortak yönetim R-PIA etkisini ABR eşiğe göre ters ve önemli ölçüde yükseltilmiş ABR vardiya sisplatin tarafından hiç test Frekanslar üretilen. Ok sıfır ABR eşik üst karakter gösterir. B. sisplatin tedavisi elektron mikroskobu (SEM) tarama tarafından gösterildiği gibi dış saç hücreleri (OHC) (beyaz ok) için önemli hasar gösterdi. R-PIA DPCPX Rkoruyucu etkisi zayıflatılmış ise OHCs sisplatin kaynaklı zararlara karşı korumalı-PIA. C. çubuk grafik Bgösterilen SEM görüntüleri kantitatif analizini gösterir. Hata çubukları ortalama standart hatasını gösterir. Yıldız işareti (*) (*) gösterir ve araç veya sisplatin tedavisi grubu, istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık sırasıyla, (*) Ristatistiksel olarak anlamlı bir farklılık gösterirken-PIA + sisplatin tedavi fareler (p < 0,05, n = 5). Bu rakam Kaur ve ark. adapte oldu 19 iznine sahip. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 :1AR Agonist, R, Trans-tympanic yönetimi-PIA, azaltılmış sisplatin-artan p-STAT1 Immunoreactivity koklea içinde. Fareler yönetilen sisplatin (11 mg/kg), p-STAT1 Ser727 immunoreactivity, 72 h sonrası ilaç idaresi değerlendirildi artan mayi bir doz. Ancak, 1 h Önarıtma trans-tympanic R-PIA blunted bu artış p-STAT1 immunoreactivity. A1AR antagonist, DPCPX, agonist birlikte eş tedavisi p-STAT1 immunoreactivity inhibisyonu ters. Yeşil boyama p-STAT1 immunolabeling ise mavi boyama çekirdeği, DAPI lekeli temsil eder. OHC ve DC dış saç hücre ve Deiter'ın hücre sırasıyla temsil eder. Beyaz ok OHCs üç satırları gösterir. Alt sol panel gösterilen ölçek 10 µm çubuktur. Bu rakam Kaur ve ark. adapte oldu 19 iznine sahip. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Trans-tympanic yönetim STAT1 siRNA bloke sisplatin kaynaklı p-STAT1 düzeyleri. Koklear bölümler için 72 h (11 mg/kg, IP) sisplatin ile yönetilen fareler gelen izole OHCs içinde artan Ser727 p-STAT1 immunoreactivity gösterdi. Trans-tympanic STAT1 zayıflatılmış siRNA (0.9 mg) sisplatin kaynaklı artış ile p-STAT1 immunoreactivity, ön arıtma ise tedavi etkisi gösterdi karıştırılmış. Yeşil boyama p-STAT1 immunolabeling ise mavi boyama çekirdeği, DAPI lekeli temsil eder. Beyaz ok OHCs üç satırları gösterir. 10 µm alt sağdaki bölmede gösterilen ölçek çubuğu ölçer. Bu rakam Kaur ve ark. adapte oldu 20 iznine sahip. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Trans-tympanic enjeksiyon NOX3 siRNA TRPV1 azaltır ve sıçan koklea seviyelerinde p-STAT1. Yönetilen şifreli siRNA (scramble) imzalat sıçan olduğunu ya da iki gün sonra bu hayvanlardan kapsaisin 24 h izole cochleae için trans-tympanic enjeksiyonu tarafından izledi trans-tympanic enjeksiyon tarafından NOX3 çift p-STAT1 için lekeli Ser727 ve TRPV1 immunoreactivity. Kapsaisin TRPV1 (yeşil) ve p-STAT1 Ser727 (kırmızı) immunoreactivity çekirdeğiyle vascularis (SVA), dış saç hücreleri (OHC) ve sarmal (SG) ganglion hücrelerinin 24 h arttı. Ancak, NOX3 siRNA ile ön işleme hayvanlar p-STAT1 Ser727 ve TRPV1 immunolabeling görünür herhangi bir indüksiyon belli etmedi. Ölçek çubuklar (alt doğru kapı aynası) 50 ve 10 µm insets için gösterir. Bu rakam Mukherjea ve ark. adapte oldu 18 iznine sahip. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aksi takdirde önemli sistemik yan sistemik yönetilen etkiler üretmek olabilir koklea yerelleştirilmiş teslim edilmesi, uyuşturucu ve diğer aracıları için trans-tympanic yönetim yolu sağlar. Bu yöntemi ilaç idaresi, sistemik yönlendirme yolu elde daha anlamlı olarak daha yüksek dozda uyuşturucu eylem siteye hızlı erişim sağlar. Burada sunulan ve yayınlanan sonuçları daha önce gösterdi [R] - N - fenil izopropil adenozin, trans-tympanic o Yönetimi (R-PIA) koklea sisplatin kaynaklı dış saç hücre kaybı (şekil 1)19 korumalı indüksiyon tarafından gösterildiği gibi enflamasyon yayınladıklarını STAT1 transkripsiyon faktörü aktivasyonu (sisplatin veya Rile tedavi ile karşılaştırıldığında-PIA + DPCPX + sisplatin) (Şekil 2)19. Bu avantajlar için koruma işitme kaybı bu ilaç tarafından tanınan katkıda bulunabileceğini. Önceki deneyimlerine dayanarak, tek bir ilaç idaresi gerekli iddia. Bu ilaç orta kulak korunur ve yavaş yavaş koklea ototoksisite bu hayvanların değerlendirilir üç gündür aşırı koruma sağlamak için alınabilirdi gösterebilir. Bu teknik oto-protectants onların etkinliğini belirlemek için iç kulak içine diğer ilaçlar sunmak için kullanılıyor.
Uyuşturucu ek olarak, çift, trans-tympanic yönetimi seçici RNA'ların onların protein seviyesini azaltır ve oto-koruma18,20sağlamak için etkili nakavt sağlayabilir. Yine, koklea yakınlık içinde teslim edilir eğer bu çift daha az toksisite sağlayacaktır. Nakavt süresi 3 gün oldu (bizim değerlendirme süresi sınırı). Önemlisi, çift eklenmesi gibi sisplatin ototoksik ilaçlar tarafından karşılık gelen onların protein indüksiyon engeller. Nakavt süresi ekstraselüler sıvı ve hücreleri ve potansiyel güçlük içinde bu moleküller koklear hücrelere getting nükleaz bolluk verilen biraz şaşırtıcıdır. Ancak, her iki nakavt proteinler ve oto-koruma gösteri bu çift etkili konsantrasyonlarda koklea erişmeye çalıştığınız anlamına gelir.
Yukarıda açıklanan kazançları rağmen bu tekniğin bazı sınırlamalar beklenmektedir. Bu yordama başlamadan önce deneysel hayvan anesthetizing için ihtiyaç bulunmaktadır. Sadece küçük bir bölümü (~ 1-%10) perilymph ulaşmak için beklenen bu yana uyuşturucu orta kulak içine daha yüksek konsantrasyonlarda yönetilmesi gerekir. Buna ek olarak, uygulanan ilaçlar ya da biyolojik madde dağılımı daha yoğun vasıl belgili tanımlık temel nerede en büyük etkileri gözlenmektedir.
Burada sunulan ajanların Trans-tympanic teslim fareler için sınırlı iken, ilaç dağıtım a benzer yöntem önlem olarak sisplatin gibi ilaçlarla kemoterapi bekliyoruz hastalarda kullanılabilir. Bu yöntemi, ilaç dağıtım hızla deneysel hayvanlarda uyuşturucu kaynaklı işitme kaybı tedavisinde etkinliğini göstermiştir bileşikler çok sayıda ekran insanlara kabul tahmin edilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbir çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu makalede açıklanan çalışma ncı RO1 CA166907, NIDCD RO1-DC 002396 ve RO3 DC011621 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketathesia (100 mg/ml) 10 ml | Henry Schein | 56344 | Controlled substance |
| AnaSed Injection/Xylazine (20 mg/ml) 20 ml | Henry Schein | 33197 | |
| 2.5 mm disposable ear specula | Welch Allyn | 52432 | |
| Surgical Scope | Zeiss | ||
| 29 G X 1/2 insulin syringe | Fisher Scientific | 14-841-32 | Can be purchased through other vendors |
| cis-Diammineplatinum(II) dichloride | Sigma Aldrich | P4394 | TOXIC - wear proper PPE |
| Harvard 50-7103 Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | Series 863 | |
| Excel International 21 G X 3/4 butterfly needle | Fisher | 14-840-34 | Can be purchased through other vendors |
| BSP Single Speed Syringe Pump | Brain Tree Sci, Inc | BSP-99 | |
| Pulse Sound Measurement System | Bruel & Kjaer | Pulse 13 software | |
| High-Frequency Module | Bruel & Kjaer | 3560C | |
| 1/8″ Pressure-field Microphone —-Type 4138 | Bruel & Kjaer | bp2030 | |
| High Frequency Transducer | Intelligent Hearing System | M014600 | |
| Opti-Amp Power Transmitter | Intelligent Hearing System | M013010P | |
| SmartEP ABR System | Intelligent Hearing System | M011110 | |
| Disposable Subdermal EEG Electrodes | CareFusion | 019-409700 | |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | Fisher Scientific | 28908 | TOXIC - wear proper PPE |
| 7 mL Borosilicate Glass Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-26 | Can be purchased through other vendors |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | Can be purchased through other vendors |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Can be purchased through other vendors |
| Tissue Plus OCT Compound | Fisher Scientific | 4585 | |
| CryoMolds (15 mm x 15 mm x 5mm) | Fisher Scientific | 22-363-553 | Can be purchased through other vendors |
| Microscope Slides (25mm x 75mm) | MidSci | 1354W | Can be purchased through other vendors |
| Coverslips (22 x 22 x 1) | Fisher Scientific | 12-542-B | Can be purchased through other vendors |
| Poly-L-Lysine Solution (0.01%) | EMD Millipore | A-005-C | Can be purchased through other vendors |
| HM525 NX Cryostat | Thermo Fischer Scientific | 956640 | |
| MX35 Premier Disposable Low-Profile Microtome Blades | Thermo Fischer Scientific | 3052835 | |
| Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack | Fisher Scientific | 08-812 | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | Can be purchased through other vendors |
| TritonX-100 | Acros | 21568 | Can be purchased through other vendors |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | Can be purchased through other vendors |
| Phospho-Stat1 (Ser727) antibody | Cell Signaling | 9177 | |
| VR1 Antibody (C-15) | Santa Cruz | sc-12503 | |
| DyLight 488 Donkey anti Rabbit | Jackson Immuno Research | 711-485-152 | Discontinued |
| DyLight 488 Donkey anti Goat | Jackson Immuno Research | 705-485-003 | Discontinued |
| Rhodamine (TRTIC) Donkey anti Rabbit | Jackson Immuno Research | 711-025-152 | Discontinued |
| ProLong® Diamond Antifade Mountant w/ DAPI | Thermo Fisher | P36971 | |
| (−)-N6-(2-Phenylisopropyl)adenosine | Sigma Aldrich | P4532 | |
| 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine | Sigma Aldrich | C101 | |
| siRNA pSTAT1 | Qiagen | Custome Made | Kaur et al. 201120 |
| siRNA NOX3 | Qiagen | Custome Made | Kaur et al. 201120 |
| Scrambled Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Kaur et al. 201120 |
References
- McKeage, M. J. Comparative adverse effect profiles of platinum drugs. Drug Saf. 13 (4), 228-244 (1995).
- Boulikas, T., Vougiouka, M. Cisplatin and platinum drugs at the molecular level. Oncol Rep. 10 (6), 1663-1682 (2003).
- Fouladi, M., et al. Phase II study of oxaliplatin in children with recurrent or refractory medulloblastoma, supratentorial primitive neuroectodermal tumors, and atypical teratoid rhabdoid tumors: a pediatric brain tumor consortium study. Cancer. 107 (9), 2291-2297 (2006).
- Pasetto, L. M., D'Andrea, M. R., Rossi, E., Monfardini, S. Oxaliplatin-related neurotoxicity: how and why. Crit Rev Oncol Hematol. 59 (2), 159-168 (2006).
- Ardizzoni, A., et al. Cisplatin- versus carboplatin-based chemotherapy in first-line treatment of advanced non-small-cell lung cancer: an individual patient data meta-analysis. J Natl Cancer Inst. 99 (11), 847-857 (2007).
- Banfi, B., Malgrange, B., Knisz, J., Steger, K., Dubois-Dauphin, M., Krause, K. H. NOX3, a superoxide-generating NADPH oxidase of the inner ear. J Biol Chem. 279 (44), 46065-46072 (2004).
- Mukherjea, D., Whitworth, C. A., Nandish, S., Dunaway, G. A., Rybak, L. P., Ramkumar, V. Expression of the kidney injury molecule 1 in the rat cochlea and induction by cisplatin. Neuroscience. 139 (2), 733-740 (2006).
- Rybak, L. P., Husain, K., Morris, C., Whitworth, C., Somani, S. Effect of protective agents against cisplatin ototoxicity. Am J Otol. 21 (4), 513-520 (2000).
- Lee, J. E., et al. Role of reactive radicals in degeneration of the auditory system of mice following cisplatin treatment. Acta Otolaryngol. 124 (10), 1131-1135 (2004).
- Lee, J. E., et al. Mechanisms of apoptosis induced by cisplatin in marginal cells in mouse stria vascularis. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 66 (3), 111-118 (2004).
- Lawenda, B. D., Kelly, K. M., Ladas, E. J., Sagar, S. M., Vickers, A., Blumberg, J. B. Should supplemental antioxidant administration be avoided during chemotherapy and radiation therapy. J Natl Cancer Inst. 100 (11), 773-783 (2008).
- Akil, O., Oursler, A. E., Fan, K., Lustig, L. R. Mouse auditory brainstem response testing. Bio Protoc. 6 (6), 1768 (2016).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J. Vis. Exp. (107), e53561 (2016).
- Whitlon, D. S., Szakaly, R., Greiner, M. A. Cryoembedding and sectioning of cochleas for immunocytochemistry and in situ hybridization. Brain Res Brain Res Protoc. 6 (3), 159-166 (2001).
- Londos, C., Cooper, D. M., Wolff, J. Subclasses of external adenosine receptors. Proc Natl Acad Sci. 77 (5), 2551-2554 (1980).
- Lohse, M. J., Klotz, K. N., Lindenborn-Fotinos, J., Reddington, M., Schwabe, U., Olsson, R. A. 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX)--a selective high affinity antagonist radioligand for A1 adenosine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 336 (2), 204-210 (1987).
- Rybak, L. P., Whitworth, C., Scott, V., Weberg, A. D., Bhardwaj, B. Rat as a potential model for hearing loss in biotinidase deficiency. Ann Otol Rhinol Laryngol. 100 (4), Pt 1 294-300 (1991).
- Mukherjea, D., et al. NOX3 NADPH oxidase couples transient receptor potential vanilloid 1 to signal transducer and activator of transcription 1-mediated inflammation and hearing loss. Antioxid Redox Signal. 14 (6), 999-1010 (2011).
- Kaur, T., et al. Adenosine A1 receptor protects against cisplatin ototoxicity by suppressing the NOX3/STAT1 inflammatory pathway in the cochlea. J Neurosci. 36 (14), 3962-3977 (2016).
- Kaur, T., Mukherjea, D., Sheehan, K., Jajoo, S., Rybak, L. P., Ramkumar, V. Short interfering RNA against STAT1 attenuates cisplatin-induced ototoxicity in the rat by suppressing inflammation. Cell Death Dis. 2 (180), (2011).
