Summary
In dit protocol tonen we de toepassing van seriële-sectie Elektronentomografie ophelderen van mitochondriale structuur in Drosophila indirecte vlucht spier.
Abstract
Mitochondriën zijn cellulaire krachtpatsers die produceren van ATP, lipiden en metabolieten, alsmede het regelen van calcium-homeostase en cel dood. De unieke cristae-rijke dubbel membraan ultrastructuur van dit organel is elegant ingericht meerdere om taken te vervullen door het partitioneren van biomoleculen. Mitochondriale ultrastructuur is nauw verbonden met verschillende functies; de fijne details van deze structuur-functie relaties zijn echter pas beginnen te worden beschreven. Hier tonen we de toepassing van seriële-sectie Elektronentomografie ophelderen van mitochondriale structuur in Drosophila indirecte vlucht spier. Seriële-sectie Elektronentomografie kan worden aangepast aan het bestuderen van een cellulaire structuur in drie dimensies.
Introduction
Elektronenmicroscopie is een waardevol instrument om te studeren het structurele kader subcellular vergaderingen en organellen die cellulaire processen uitvoeren. Methoden zijn ontwikkeld voor het behoud van de ultrastructuur van weefsels of cellen door chemische fixatie met aldehyden of door hoge druk bevriezing (HPF) gevolgd door het bevriezen van substitutie (FS)1,2. De ingesloten specimen blokken kunnen vervolgens worden gesegmenteerd, gekleurd en waargenomen met een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM). Het HPF model kan ook worden verwerkt onder cryo-voorwaarde, zoals door cryo-segmenteren of door gerichte ion beam (FIB) frezen en waargenomen door cryo-EM3,4.
Maar dun-sectie EM informatieve morfologische inzichten biedt, kunnen de resulterende 2D-afbeeldingen alleen de ultrastructuur van een bepaalde doorsnede onthullen. Hoe ultrastructuur is georganiseerd in een 3D-volume blijft het oog wordt onttrokken. Om te visualiseren cellulaire ultrastructuur in drie dimensies, een elektron tomografie methode ontwikkeld waar serie tilt opnamen werden verworven en terug naar verwachting genereren een tomografische reconstructie5 (Figuur 1). Een dubbele tilt-reeks kan worden verzameld door het monster 90° draaien en het verwerven van een tweede reeks van tilt. Dit zal missen-wedge artefacten die het gevolg zijn van beperkte monsterneming hoeken en verbetering van de resolutie van de tomogram minimaliseren.
Hier beschrijven we de toepassing van seriële-sectie Elektronentomografie te bestuderen van mitochondriale ultrastructuur van Drosophila indirecte vlucht spier (IFM)6,7,8,9 . Met het oog op een 3D-reconstructies die betrekking hebben op hele mitochondriën (ongeveer 2,5 µm dik), zijn seriële secties verkregen van Drosophila IFM weefsel blokken. Tomograms van elke sectie werden verzameld afzonderlijk met behulp van de software van de collectie van de automatische gegevens. Tomografische reconstructies zijn gegenereerd en seriële tomograms werden samen met de IMOD-pakket te verkrijgen van een gereconstrueerde volume van een hele mitochondrion. De gekoppelde tomograms werden geanalyseerd door 3D-software. De dichtheid van mitochondriale cristae waren gesegmenteerd voor het genereren van een segmentatie-model dat bleek de organisatie in drie dimensies.
Protocol
1. sectie Drosophila weefsels met behulp van een vibrerende microtoom Blade
- Anesthetize van Drosophila op ijs en elke één vlieg in 1 mL 4% lage smeltende agarose in fosfaatbuffer onder te dompelen. Toestaan agarose te stollen op het ijs. Meestal werden 4-6 vliegen verwerkt.
- Gebruik een vibrerende microtoom blade afdeling agarose gel ingesloten Drosophila in plakjes met dikte van 100 µm te onderdompelen in kleefpoeders oplossing met 2,5% Glutaaraldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer.
Opmerking: Vibratome segmenteren verdient de voorkeur omdat het weefsel platform meer intact in vergelijking met andere methoden blijft. Als alternatief, ontleden pincet kan worden gebruikt om te ontleden IFM in de kleefpoeders oplossing met 2,5% Glutaaraldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer.
2. voorbereiding van de EM Specimens door de hogedruk invriezen en Freeze substitutiemethode (HPF/FS)
- Wassen weefselsecties in 3 druppels (~ 150 µL) van fosfaatbuffer, gevolgd door 2 druppels (~ 100 µL) van fosfaatbuffer met 20% BSA. Plaatst u vervolgens secties in gouden dragers voor HPF gevuld met buffer en 20% BSA.
- Het laden van het monster met vervoerders in een hogedruk vriezer volgens het handboek van de gebruiker.
- Na het invriezen, dragers van de houder onder vloeibare stikstof uitstoot en overbrenging naar een freeze-vervanging apparaat afgekoeld tot-140 ° C.
- Voer het bevriezen-substitutie-protocol zoals wordt weergegeven in tabel 1, met de FS cocktail met 2% Glutaaraldehyde, osmium tetroxide van 2% en 0,1% uranyl acetaat in aceton.
- Zorgvuldig verwijderen van de specimens van de luchtvaartmaatschappijen met een naald en insluiten van specimens in de hars bij kamertemperatuur. De hars bij 65 ° C gedurende 16 h polymeriseren.
Opmerking: FS protocollen moeten worden gewijzigd om voor te bereiden van andere soorten monsters. HPF/FS heeft de voorkeur te behouden de ultrastructuur en het verlies van mobiele inhoud te minimaliseren.- U kunt ook een chemische fixatie-protocol toepassen. Herstellen van specimens met 2,5% Glutaaraldehyde 's nachts, wassen met buffers dan fix met 1% osmium tetroxide voor 2 h. wassen en uitdrogen met oplopende concentraties van ethanol en dan infiltreren en insluiten van specimens in Spurr van hars voor actinemonomeren bij 65 ° C gedurende 16 h.
3. Prepareer Serial-secties van de Specimens Elektronentomografie
- Trim de specimen blokken om het gewenste blok gezicht dat weefsel bevat bloot te stellen.
- Voorbehandeling gouddeeltjes (10 nm diameter) met 1% BSA voor 30 min. Wash en gouddeeltjes in PBS buffer op te schorten. Overlay gouddeeltjes op koperen slot rasters bekleed met koolstof film maken fiducial markeringen.
- Kijk onder TEM hebben voldoende fiducial markers (markeringen voor ten minste 5-10) in het gezichtsveld van tomografie overname.
- Gesneden seriële secties, 200-250 nm in dikte, met behulp van een ultramicrotome.
- Seriële secties op slot rasters met een perfecte lus voor dunne secties verzamelen.
- Vlek van de secties met Reynold van lood citraat gedurende 10 minuten.
- Overlay een tweede laag van fiducial gouddeeltjes op de bovenkant van de secties.
4. het verzamelen van Double-tilt Elektronentomografie
- Laden van het raster op een dual-axis tomografie-houder en invoegen in de transmissie-elektronenmicroscoop op 200 kV.
- Hiermee lijnt u de Microscoop op de eucentric focus.
- De software van de collectie van de automatische gegevens instellen Aanpassen en uitlijnen van de elektronenbundel bij de Multi-Scale imaging instelling. Raadpleeg de gebruikershandleiding voor operatie detail10 (Figuur 2).
- Verwerven camera donkere en lichte verwijzingen in een leeg gebied zonder koolstof film onder de instelling van de collectie tomografie.
- Het verzamelen van een raster atlas bij lage vergroting. Selecteer mitochondriën op seriële secties als doelen voor tomografie collectie.
- Verwerven van een tilt-serie van-60 ° tot + 60 ° met stappen van 2 ° op as-A voor elk doel.
Opmerking: De tilt hoeken zal mechanisch worden beperkt door het ontwerp van de monsterhouder. De houder zal het blokkeren van de lichtbundel op hoog tilt hoeken. - Het verzamelen van de tweede reeks van de tilt, de monsterhouder 90° te draaien. Verwerven van een nieuwe atlas. Selecteer de overeenkomende posities en het verwerven van de tilt serie over as-B voor elk doel.
Opmerking: Andere softwarepakketten, zoals SerialEM en Xplore3D, zijn beschikbaar voor automatische gegevensverzameling.
5. reconstrueren 3D Tomograms en Segment sub volumes met behulp van Software
- Tomograms van de dual-axis tilt beelden met behulp van de IMOD software11te reconstrueren.
- Raadpleeg de gebruikershandleiding voor details van de bewerking.
- Hiermee lijnt u de individuele tilt-serie van de posities van gouden fiducial markers. Reconstrueren van tomograms door de methode terug projectie of door de methode van het gelijktijdige iteratieve wederopbouw techniek (SIRT) voor beide as-A en -as-B, respectievelijk (Figuur 3).
- Combineren van tomograms van As-A en -as-B voor het genereren van een double-tilt tomogram met verminderde ontbrekende wig artefact.
- Gezamenlijk dubbel-kantel tomograms voor seriële secties te verkrijgen van reconstructies die betrekking hebben op hele mitochondrion volume. Model van de kloof tussen seriële secties door de IMOD-programma.
- Trim de gekoppelde tomograms en bin naar een gewenste formaat voor volume segmentatie.
- Analyseren van gekoppelde seriële tomograms met behulp van 3D-software.
- Raadpleeg de gebruikershandleiding voor details van de bewerking.
- Het filteren van de tomograms met een Gaussiaans filter (of andere gewenste methode) te verbeteren van het contrast van functies en verminderen achtergrond dichtheden.
- Segment de ultrastructuur van mitochondriën handmatig of automatisch.
- Segmentatie modellen dat inspectie in 3D weergeven
- Genereren van films met behulp van tools beschikbaar in 3D.
Representative Results
We toegepast seriële-sectie Elektronentomografie om structurele kenmerken van mitochondriale cristae te analyseren die de energetische toestand en veroudering weerspiegelt. We toonden dat mitochondria van Drosophila IFM een geïntegreerde vormen cristae en matrix netwerk in 3D (Figuur 4)7. Daarnaast geaccumuleerde mutant vliegen met mitochondriale DNA replicatie defect en een versnelde veroudering fenotype mitochondriën die onderafdelingen van ui-achtige wervelende kern (Figuur 5)7.
Figuur 1: illustratie van elektron tomografie wederopbouw uit een serie tilt. In het experiment, wordt een elektronenbundel doorgegeven door middel van een 3D-object als het object wordt bewogen tot verschillende graden. Voor elke voorwaarde die tilt, is een 2D-projectie gegenereerd en gevangen met een camera. De 2D projecties vervolgens terug naar verwachting reconstrueren van het 3D-object gebaseerd op de stelling van het midden segment. In de afbeelding is hetzelfde proces weergegeven voor een oorspronkelijke 2D-afbeelding die naar verwachting in één dimensie onder verschillende hoeken van de tilt. De projecties van de 1D worden vervolgens gebruikt om te reconstrueren van de 2D-afbeelding. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: automatische gegevensverzameling. Een image viewer weergave van software tonen de atlas van een raster van de sleuf met seriële secties, Multi-Scale targeting van mitochondriën en verworven kantelen beelden. Schaal bar = 500 µm (linker bovenste paneel), 100 µm (linker onderste paneel), 1 µm (rechtervenster). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Serial-sectie Elektronentomografie van een één mitochondrion in Drosophila indirecte vlucht spier. 2D microfoto van (A) en (B) 3D tomograms van seriële secties die betrekking hebben op het gehele volume van een mitochondrion. (C) de gekoppelde seriële-sectie tomograms naar verwachting een Langsdoorsnede, maken met de z-as verticaal weergegeven. Met name weefsel afdelen geleid tot verlies van materiaal, waardoor hiaten tussen gekoppelde tomograms. Schaal bar = 500 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: geïntegreerde intra-mitochondriën cristae en matrix netwerk geopenbaard in 3D. (A) segmenten van mitochondriale elektron tomografische reconstructies tonen Hiermee schakelt u tussen lamellaire membranen via de z-as. (B) illustraties van de waargenomen cristae schakelen patronen van rechts overhandigde en/of linkshandige spiralen. Tomografische segmentatie (C) ter illustratie van een linkshandige spiraal in 3D (D) Cristae schakelen patronen werden geanalyseerd en kleur-gerenderde op het model van de segmentatie (E, F). Tomografische segment laterale matrix confluentie (donkere dichtheden, rood gemarkeerd) tonen over cristae membranen (witte dichtheden). (G) segmentatie model van de tomogram in (E) weergegeven: laterale matrix confluentie (in rood) en representatieve cristae (in grijs). Schaal bar = 50 nm (A), 200 nm (C), en 300 nm (D, E, F, G). Het cijfer was de herdruk van Jiang et al. 7 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: mitochondriën met ui-achtige wervelende cores opgebouwd in vliegen met mitochondriale DNA replicatie defecten tijdens veroudering. Representatieve tomografische segmenten en de bijbehorende segmentatie (juiste panelen) met een transversale weergave (boven) en een Langsdoorsnede weergave (onder) voor een wervelende core. Segmentatie van het volume wordt aangegeven door willekeurige kleur rendering te markeren de wervelende kern. Schaal bar: 200 nm. Het cijfer was de herdruk van Jiang et al. 7 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Stap | Temp | Tijd | Oplossing | |||
| 1 | -140 ° C tot-9 0 ° C | 30 min | Vloeibare stikstof | |||
| 2 | -90 ° C | 96 hr | FS cocktail | |||
| 3 | -90 ° C tot-60 ° C | 6 hr (5 ° C/uur) | FS cocktail | |||
| 4 | -60 ° C | 12 hr | FS cocktail | |||
| 5 | -60 ° C tot-25 ° C | 7 hr (5 ° C/uur) | FS cocktail | |||
| 6 | -25 ° C | 12 hr | FS cocktail | |||
| 7 | -25 ° C tot 0 ° C | 5 hr (5 ° C/uur) | FS cocktail | |||
| 8 | 0 ° C | 1 hr x 3 keer | Aceton | |||
| 9 | Kamer temp | Hars infiltratie | ||||
Tabel 1: Freeze-substitutie protocol.
Discussion
In dit protocol beschrijven we een geoptimaliseerde workflow voor de toepassing van de seriële-sectie Elektronentomografie om te bestuderen van 3D mitochondriale ultrastructuur van Drosophila indirecte vlucht spier. Behoud van ultrastructuur in de steekproef is de primaire technische uitdaging voor dit type analyse. Om het beste bewaren ultrastructuur twee methodologische werden stappen opgenomen. Eerst, weefsel werd bemonsterd door segmenteren met trillende blade microtoom teneinde de weefsel-architectuur zo veel mogelijk. Ten tweede, een HPF/FS-protocol werd geoptimaliseerd voor organel ultrastructuur behouden tijdens de voorbereiding van ingesloten specimen blokken. Exemplaren werden bevroren onder hoge druk, die verlaagt het vriespunt van water en vermindert de vorming van ijskristallen die schade toebrengen aan ultrastructuur1. Exemplaren zo dik als 0,1 mm kan worden ogenblikkelijk verglaasd, en vervolgens om te bevriezen van de vervanging voor het genereren van specimen blokken voor EM analyse onderworpen. Het verbeterde behoud van ultrastructuur door HPF/FS werd opgemerkt, in vergelijking met chemische fixatie methoden. Met behulp van deze reeks stappen voor de bereiding van de monsters, is behoud van mitochondriale dubbele membranen en cristae membranen drastisch verbeterd.
Verkrijgen van seriële secties van het specimen is de meest uitdagende stap van de methode. Als de elektronenbundel heeft beperkte penetratie vermogen, de dikte van de sectie is beperkt tot ofwel 250 nm of 500 nm met behulp van een TEM op 200 kV of 300 kV, respectievelijk. Omdat de dikte van een mitochondrion kan meer dan 2 µm, zijn seriële secties vereist voor het verkrijgen van volledige volume reconstructies. Herstellen van een voldoende aantal seriële secties te omvatten een hele organel is echter een technische uitdaging. Trimmen van het blok gezicht om zo plat mogelijk tussen de basen van het trapezium, kunt een raster slot geschikt voor meer secties en dus de dekking van grotere volumes. Bovendien, verhoogt het gebruik van een perfecte lus voor dunne secties het slagingspercentage van de overdracht van de seriële secties aan het raster.
Seriële-sectie Elektronentomografie kan worden bereikt met EM kern standaarduitrusting. De methode heeft echter enkele onvermijdelijke beperkingen die uit technische beperkingen voortvloeien. Dat materiaal is een onvermijdelijk verloren tussen seriële secties, waardoor hiaten in de gekoppelde wederopbouw. Ten tweede is het ontbrekende wig artefact, die ontstaat als gevolg van de beperkte tilt hoeken die haalbaar zijn. Deze beperking treedt op omdat de monsterhouder niet kan worden omgezet in een volledige omwenteling zonder te blokkeren van de elektronenbundel. Ondanks deze beperkingen biedt seriële-sectie Elektronentomografie voldoende resolutie te onthullen van cellulaire en organel ultrastructuur in 3D.
Voor kleinere schaal imaging is cryo-Elektronentomografie een opkomende technologie die kan worden gebruikt voor het verkrijgen van de structuur van macromoleculaire complexen en assemblages in situ bij nm of sub angstrom resolutie in combinatie met sub-tomografische wederopbouw3. In deze aanvraag, zijn cellen uitgedund door segmenteren of door gerichte ion beam frezen onder vloeibare stikstof. De tomograms zijn verzameld onder cryo-voorwaarden waar moleculaire structuren zijn bewaard gebleven vlakbij de geboortestaat zonder chemische fixatie, uitdroging of insluiten. Aan de andere kant van de schaal is het seriële blok-face scanning elektronenmicroscopie voor het analyseren van grote weefsel volumes ten koste van de resolutie, een aantrekkelijk modaliteit hoewel het vereist een specifiek instrument4.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
De studies werden uitgevoerd in de kern van de EM op het Instituut voor cellulaire en Organismic biologie en de cryo-EM-kern van de Academia Sinica, Taipei, Taiwan. Het werk werd gesteund door de Academia Sinica en de meeste.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | Tissue sectioning |
| high-pressure freezer | Leica | EM HPM100 | Specimen preparation |
| freeze-substitution device | Leica | EM AFS2 | Specimen preparation |
| ultramicrotome | Leica | EM UC7 | Ultra-thin sectioning |
| dual-axis tomography holder | Fischione | Model 2040 | tomography collection |
| transmission electron microscope | FEI | Tecnai F20 | tomography collection |
| CCD | Gatan | UltraScan 1000 | tomography collection |
| Leginon | NRAMM/AMI | tomography collection | |
| IMOD | Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells | Tomography reconstruction | |
| Avizo 3D | FEI | Tomography analysis |
References
- Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure freezing for the preservation of biological structure: theory and practice. J Electron Microsc Tech. 13 (3), 165-174 (1989).
- Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
- Rigort, A., et al. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. J Struct Biol. 172 (2), 169-179 (2010).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).
- Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: from cells to molecules. Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).
- Soto, G. E., et al. Serial section electron tomography: a method for three-dimensional reconstruction of large structures. Neuroimage. 1 (3), 230-243 (1994).
- Jiang, Y. F., et al. Electron tomographic analysis reveals ultrastructural features of mitochondrial cristae architecture which reflect energetic state and aging. SciRep. 7, 45474 (2017).
- Cogliati, S., Enriquez, J. A., Scorrano, L. Mitochondrial Cristae: Where Beauty Meets Functionality. TrendsBiochemSci. 41 (3), 261-273 (2016).
- Friedman, J. R., Nunnari, J. Mitochondrial form and function. Nature. 505 (7483), 335-343 (2014).
- Suloway, C., et al. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J Struct Biol. 167 (1), 11-18 (2009).
- Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).
