Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक उल्टे ऊर्ध्वाधर आक्रमण परख है कि एक तीन आयामी सेटिंग में कोशिकाओं के प्रवास और आक्रमण क्षमताओं को यों तो सेल microenvironment के संरक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह परख दुर्लभ के लिए उपयुक्त है और/
Abstract
हालांकि 3 डी आक्रमण परख विकसित किया गया है, चुनौती उनके microenvironment की अखंडता को प्रभावित किए बिना कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए रहता है । ऐसे Boyden चैंबर के रूप में पारंपरिक 3d परख की आवश्यकता है कि कोशिकाओं को मूल संस्कृति स्थान से विस्थापित कर रहे है और एक नए वातावरण में चले गए । न केवल यह सेलुलर प्रक्रियाओं है कि microenvironment के लिए आंतरिक है बाधित करता है, लेकिन यह अक्सर कोशिकाओं के नुकसान में परिणाम । इन समस्याओं को विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है जब कोशिकाओं है कि या तो दुर्लभ हैं, या अत्यंत उनके microenvironment के प्रति संवेदनशील से निपटने । यहां, हम एक 3 डी आक्रमण परख कि दोनों चिंताओं से बचा जाता है के विकास का वर्णन । इस परख में, कोशिकाओं को एक छोटे से अच्छी तरह से और एक ECM एक chemoattractant युक्त मैट्रिक्स कोशिकाओं के ऊपर रखी है भीतर चढ़ाया जाता है । यह कोई सेल विस्थापन की आवश्यकता है, और कोशिकाओं को मैट्रिक्स में ऊपर की ओर आक्रमण करने की अनुमति देता है । इस परख में, सेल आक्रमण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेल आकृति विज्ञान कोलेजन जेल के भीतर मूल्यांकन किया जा सकता है । इस परख का उपयोग करना, हम दुर्लभ और संवेदनशील कोशिकाओं के इनवेसिव क्षमता की विशेषता; संकर कोशिकाओं स्तन कैंसर कोशिकाओं MCF7 और mesenchymal/multipotent स्टेम/स्ट्रोमा कोशिकाओं (MSCs) के बीच संलयन से उत्पंन ।
Introduction
कोशिका गतिशीलता कोशिकाओं की एक सामान्य विकासात्मक और शारीरिक प्रक्रिया है । हालांकि, पैटर्न में परिवर्तन और कोशिकाओं की क्षमता को स्थानांतरित करने और आक्रमण भड़काऊ रोगों और कैंसर मेटास्टेसिस1,2,3सहित रोग की स्थिति के साथ जुड़े रहे हैं । मेटास्टेसिस यकीनन कैंसर में सबसे खराब समझ वाला पहलू है. metastasize करने के लिए, कैंसर कोशिकाओं अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स (ECM) नीचा करना चाहिए, स्थानीय ऊतक और intravasate पर आक्रमण । एक बार संचलन में, कैंसर की कोशिकाओं को दूर साइट, extravasate और फार्म का माध्यमिक ट्यूमर के लिए प्रसार होगा । इसलिए, कोशिकाओं की क्षमता ECM नीचा करने के लिए, विस्थापित करने के लिए, और आक्रमण करने के लिए अपने मेटास्टेटिक क्षमता से संबंधित है । विभिंन दृष्टिकोण का विश्लेषण और कोशिकाओं के प्रवास और आक्रमण क्षमताओं को यों तो विकसित किया गया है । सबसे अधिक इस्तेमाल किया दृष्टिकोण घाव हीलिंग परख, समय चूक माइक्रोस्कोपी, और Boyden चैंबर परख शामिल हैं । घाव हीलिंग परख4 और समय चूक माइक्रोस्कोपी सरल और सुविधाजनक परख कि सेल प्रवास में प्रारंभिक अंतर्दृष्टि देना होगा । हालांकि, दोनों 2d परख है कि 3 डी वातावरण में जो कोशिकाओं में मौजूद vivo मेंप्रतिबिंबित नहीं कर रहे हैं । अध्ययनों से पता चला है कि कोशिकाओं को एक 2d एक5,6की तुलना में एक 3 डी वातावरण के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया । इसके अलावा, घाव भरने परख को पुन: पेश करने के लिए और मात्रात्मक परिणाम7,8,9उपज मुश्किल है । कोशिका अपवर्जन क्षेत्र परख, जो घाव भरने की परख के एक 3 डी संशोधन है, एक और अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक परख है, लेकिन यह ऐसी संकर सेल फ्यूजन की घटनाओं से जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं के रूप में संख्या में कम कोशिकाओं के लिए उपयुक्त नहीं है10,11 .
Boyden चैंबर परख एक 3 आयामी परख कि सेलुलर अध्ययन के लिए प्रासंगिक microenvironments प्रदान करता है । तथापि, यह कोशिकाओं को अपने मूल microenvironment से हटाया जा करने की आवश्यकता है और Boyden परख प्रणाली के ऊपरी कक्ष में जमा किया जा करने के लिए विस्थापित और मध्यम से युक्त chemoattractant की ओर नीचे आक्रमण । इस 3 डी दृष्टिकोण उनके microenvironment और/या संख्या10,11,12में सीमित करने के लिए संवेदनशील कोशिकाओं के प्रवास और आक्रमण की क्षमता का विश्लेषण करने में उपयुक्त नहीं है । एक नए दृष्टिकोण सेल प्रवास और आक्रमण का विश्लेषण करने के लिए microfluidic ढाल चैंबर परख13है । हालांकि उपयुक्त और विश्वसनीय प्रवास और आक्रमण के अध्ययन में, इस परख और अधिक महंगा है और तकनीकी रूप से एक ठेठ प्रयोगशाला के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है । हम यहां एक सरल औंधा ऊर्ध्वाधर आक्रमण परख कि उनके microenvironment और/या संख्या में प्रतिबंधित करने के लिए संवेदनशील कोशिकाओं सहित कई सेल प्रकार के साथ संगत है का वर्णन । इस परख हुप्स एट अल द्वारा प्रस्तावित प्रोटोकॉल से अनुकूलित किया गया । 14. इस परख में, कोशिकाओं को अपने मूल microenvironment में रहते है और उनके प्रवास और आक्रमण पर नजर रखी है के रूप में वे एक chemoattractant11युक्त कोलेजन जेल में ऊपर की ओर कदम । इस परख reproducible है और अनुकूलित किया गया है और 35 में मांय-mm संस्कृति पकवान । यह अलग अलग कोशिका संस्कृति के आकार, अलग मैट्रिक्स या आसंजन की ताकत, और विभिंन chemoattractants सहित परख शर्तों को अनुकूलित किया जा सकता है । इस परख दवा डिस्कवरी प्रक्रिया में प्रारंभिक स्क्रीनिंग के लिए एक इन विट्रो मंच के रूप में सेवा कर सकता है ।
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Protocol
नोट: इस प्रोटोकॉल McArdle एट अल में वर्णित है. 11. एक समयरेखा चित्रा 1में प्रदान की जाती है ।
1. कल्चरल प्लेट तैयार करना
- 15 मिनट के लिए 1 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड (HCl) के 1 मिलीलीटर के साथ एक 10 मिमी ग्लास-नीचे अच्छी तरह से युक्त 35 मिमी संस्कृति पकवान धो गिलास नीचे की hydrophobicity को कम करने के लिए ।
- सभी एचसीएल से छुटकारा पाने के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के 1 मिलीलीटर के साथ दो बार संस्कृति प्लेट धो लें ।
- संस्कृति प्लेट दो बार 70% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर के साथ धो लो ।
- सेल विशिष्ट संस्कृति मध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ संस्कृति प्लेट कुल्ला (यहां, उपयोग α-मेम 10% गर्मी निष्क्रिय FBS और 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड के साथ पूरक) ।
नोट: संस्कृति माध्यम से युक्त इलाज संस्कृति प्लेट अगले दिन तक 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidifier के साथ सह2 मशीन में संग्रहित किया जा सकता है । - कोशिकाओं को विकसित (MSCs और MCF-7 सह संस्कृति) इलाज ग्लास में 35 मिमी संस्कृति डिश के नीचे अच्छी तरह से 100% प्रवाह के लिए । सह-संस् कृत 35,000 एमएससी कोशिकाओं और 75,000 MCF7 कोशिकाओं के लिए 24 ज.
2. कोलेजन जेल की तैयारी
- स्टोर micropipette pipetting फ्रीजर में कोलेजन जेल के लिए इस्तेमाल के लिए संपर्क पर कोलेजन के बहुलकीकरण को रोकने के सुझाव ।
नोट: यह सबसे अहम कदम है । - निर्धारित चूहे पूंछ कोलेजन का एक मात्रा मैं कोलेजन स्टॉक की एकाग्रता के आधार पर इस्तेमाल किया जाएगा । इस परख के लिए कोलेजन जेल के 100 µ एल तैयार करें ।
नोट: चूहे पूंछ कोलेजन का उच्च एकाग्रता मैं शेयर बेहतर काम करता है । 10x है Dulbecco संशोधित ईगल के माध्यम की मात्रा का निर्धारण कोलेजन तदनुसार पतला करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । - बर्फ चूहे पूंछ कोलेजन पर गठबंधन (3.8 µ जी/एमएल स्टॉक), 10x है Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम और 1x सेल संस्कृति मध्यम 2% भ्रूण गोजातीय सीरम और 2.4 मिलीग्राम/एमएल की कोलेजन की एक अंतिम एकाग्रता के लिए उपयुक्त chemoattractant के साथ पूरक ।
- मिश्रण करने के लिए जोड़ें सोडियम बिकारबोनिट के 4.5% समाधान के लिए कोलेजन जेल बेअसर ।
नोट: सोडियम बिकारबोनिट समाधान की मात्रा अंय रिएजेंट के सटीक पीएच के आधार पर भिंन हो सकते है जोड़ा । यह करने के लिए तटस्थ समाधान सुनिश्चित करने के लिए पीएच स्ट्रिप्स के साथ मिश्रण का परीक्षण करने के लिए सबसे अच्छा है, या संस्कृति माध्यम में एक पीएच संकेतक का उपयोग करें । - ग्लास के भीतर कोशिकाओं पर कोलेजन मिश्रण के 80 µ एल रखना-संस्कृति पकवान के नीचे अच्छी तरह से ।
- polymerize के लिए एक सह में 30 मिनट के लिए कोलेजन जेल की अनुमति दें2 मशीन 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidifier के साथ ।
- कवर कम सीरम के साथ सेल माध्यम के 2 मिलीलीटर के साथ कोलेजन जेल (2%) और एक humidifier के साथ एक सह में 37 ° c में कोशिकाओं को एक CO2 मशीन में मशीन 24, 48, या 72 एच के लिए ।
सावधानी: थाली देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए गिलास नीचे से अलग से कोलेजन जेल को रोकने के ।
3. कोलेजन जेल की तैयारी का एक चूहा पूंछ कोलेजन शेयर का उपयोग करने का उदाहरण 3.8 µ g/mL
- बर्फ पर, गठबंधन ११४.५ µ के एल चूहे पूंछ कोलेजन, 16.6 µ एल के 10x DMEM, और ३३.१ µ एल युक्त संस्कृति माध्यम के chemoattractant.
- सोडियम बिकारबोनिट के १४.० µ एल के साथ कोलेजन मिश्रण बेअसर ।
- चरण 2.5 में के रूप में जारी रखें ।
4. कोशिकाओं की इमेजिंग
- धीरे पकवान से मीडिया को हटा दें ।
- धीरे से जेल से कुल्ला-पंजाब के 1 मिलीलीटर ।
- 15 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को ठीक करें ।
- पंजाबियों की 1 मिलीलीटर के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें ।
- कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए DAPI समाधान (100 एनजी/एमएल) के साथ कोशिकाओं दाग ।
- छवि विभिंन स्थानों पर एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं और 400 µm z-ढेर 16 µm चरणों में प्रत्येक स्थान की छवियां ले । इस्तेमाल किया सूक्ष्मदर्शी एक डिस्क स्कैनिंग इकाई है कि फोकल इमेजिंग एक सफेद प्रकाश, चाप उत्तेजना स्रोत का उपयोग कर सक्षम बनाता है । एक 20X 0.75 के संख्यात्मक एपर्चर के साथ उपयोग लेंस का प्रयोग करें ।
- छवियों का पुनर्गठन ।
- एक दिया जेल (लगभग 25 छवियों) के लिए छवियों को खोलें और ढेर करने के लिए छवि → ढेर → छवियों पर क्लिक करके एक छवि ढेर बना । पहली छवि जेल के नीचे से संबंधित (z = 0 µm), दूसरी छवि z दिशा (z = 16 µm) में पहला कदम से मेल खाती है, तीसरी छवि z दिशा (z = 32 µm) में दूसरे चरण के लिए संगत है । प्रत्येक छवि गहराई में प्रत्येक नाभिक का आकलन और गहराई है जिस पर नाभिक उस विशेष सेल के लिए आक्रमण की गहराई के रूप में तेजी से ध्यान में था नामित ।
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Representative Results
हम एक गिलास नीचे और चूहे पूंछ कोलेजन के साथ एक 35 मिमी संस्कृति पकवान का इस्तेमाल किया है और विकसित करने के लिए एक इन विट्रो 3 डी आक्रमण परख प्रोटोकॉल में अनुकूलन । इस परख का प्रयोग, हमें पता चला है कि स्तन कैंसर की कोशिकाओं MCF7 और एमएससी कोशिकाओं को कोलेजन जेल में आक्रमण कर सकता है 0.04 ± 1.8 µm की एक औसत दूरी, और ४१.३ ± ७६.० µm के बाद क्रमशः 48 जब IGF1 (18.6 एनजी/एमएल) chemoattractant के रूप में इस्तेमाल किया गया था (चित्रा 2) । इससे भी महत्वपूर्ण बात, हमें पता चला है कि एमएससी और MCF7 कोशिकाओं है, जो दुर्लभ कोशिकाओं रहे हैं, कोलेजन जेल में आक्रमण के रूप में अच्छी तरह से फ्यूजन उत्पादों । उनके आक्रमण की औसत दूरी 48 में एच 10.7 ± 12.4 µm जब IGF एनजी पर मैं/एमएल chemoattractant (चित्रा 2) के रूप में इस्तेमाल किया गया था । MCF7 और MSCs के बीच आक्रमण क्षमता में अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था (P < 0.01)11। फ्यूजन उत्पादों और MCF7 या MCSs में से एक के आक्रमण की क्षमता के बीच अंतर सांख्यिकीय महत्वपूर्ण नहीं था । हालांकि, इस परख लगातार पता चला है कि कैंसर सेल फ्यूजन उत्पादों माता पिता के कैंसर की कोशिकाओं, MCF7 से अधिक प्रवासी और इनवेसिव क्षमता थी ।
कोशिकाओं को उनकी आकृति विज्ञान और मात्रा 48 एच पोस्ट जेल बहुलकीकरण (चित्रा 3ए) द्वारा दिखाए गए के रूप में प्रयोगों के दौरान स्वस्थ रहे । उल्टे ऊर्ध्वाधर आक्रमण परख डिजाइन के साथ, सेल प्रवास और आक्रमण के कैनेटीक्स (चित्रा 3बी, 4) का विश्लेषण किया जा सकता है और सेल आकृति विज्ञान (चित्रा 4) का मूल्यांकन किया जा सकता है ।
चित्र 1 : उल्टे ऊर्ध्वाधर आक्रमण परख डिजाइन की समयरेखा कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 : कैंसर सेल फ्यूजन उत्पादों के आक्रमण की क्षमता । कैंसर सेल फ्यूजन उत्पादों की आक्रमण क्षमता औंधा ऊर्ध्वाधर आक्रमण परख का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है । संख्या तीन अलग सह संस्कृतियों और उनके पैतृक सेल लाइनों से चार स्वतंत्र संलयन उत्पादों की औसत आक्रमण क्षमता का प्रतिनिधित्व प्रत्येक परख के भीतर आठ विभिंन क्षेत्रों से विश्लेषण किया । यह प्रयोग तपसिल में किया गया । Tukey की एचएसडी पोस्ट हॉक टेस्ट के साथ ANOVA । * * P < 0.01. त्रुटि पट्टियां मानक विचलन (SD) का प्रतिनिधित्व करती हैं । यह आंकड़ा 11से अनुकूलित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 : सेल व्यवहार्यता और Z उल्टे ऊर्ध्वाधर आक्रमण परख की श्रृंखला ।
क) 20X उज्ज्वल क्षेत्र छवियां दो दिनों के बाद कोलेजन जेल के तहत कोशिकाओं की आकृति विज्ञान दिखा । बाएं से दाएं MCF7 और एमएससी सह संस्कृति, MCF7, और एमएससी; ख) z श्रृंखला के प्रतिनिधित्व दो स्थानों (मैं और द्वितीय) नीचे से ऊपर एक डिश के भीतर दिखा । लगातार छवियों के अलावा 16 µm हैं । 3.8% FBS का प्रयोग एक chemoattractant के रूप में किया गया । दोनों पैनलों पर हरे घेरे कोशिकाओं हमलावर संकेत; ध्यान दें, जेल के नीचे ध्यान से और शीर्ष जेल में ध्यान में, जेल में हमला । दोनों पैनलों पर लाल वृत्त z श्रृंखला (गैर-आक्रमण कक्ष) की निचली परत पर शेष कक्षों का संकेत देते हैं । स्केल बार (a): 15 µm; स्केल बार (b): 10 µm । यह आंकड़ा 11से अनुकूलित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : उल्टे ऊर्ध्वाधर आक्रमण परख में सेल आकृति विज्ञान । कोलेजन जेल में नीचे से एक स्थान पर MSCs के आकृति विज्ञान (z = 0 µm) z = 20 µm. 3.8% FBS एक chemoattractant के रूप में इस्तेमाल किया गया था । लंबे तीर एक जेल में हमला एमएससी के संलग्न इंगित करता है । arrowhead एक एमएससी, जो जेल के नीचे के साथ गठबंधन किया है इंगित करता है, और हमलावर नहीं है । नीले रंग से पता चलता है परमाणु DAPI दाग जबकि लाल phalloidin दाग actin रेशा से पता चलता है । यह आंकड़ा 11से अनुकूलित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
यहां, हम एक सरल औंधा ऊर्ध्वाधर आक्रमण परख जो कोशिकाओं है कि दुर्लभ है और/या उनके microenvironment पर निर्भर सहित सेल प्रकार की एक किस्म के लिए सुविधाजनक है वर्णन । इस 3 डी आक्रमण परख में, कोशिकाओं को अपने मूल microenvironment में रहते है और एक chemoattractant युक्त कोलेजन जेल द्वारा कवर कर रहे हैं । कोशिकाओं तो पलायन और कोलेजन में आक्रमण । इस परख में, कोशिकाओं दाग और जेल के भीतर आसानी से निगरानी की जा सकती है । सादगी और इस परख के reproducibility यह एक 3 डी प्रणाली में कैंसर सेल प्रवास और आक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक सुविधाजनक उपकरण बनाता है । हालांकि, मजबूत chemoattractants के लिए संस्कृति पकवान के नीचे करने के लिए कोशिका अपनत्व को तोड़ने के लिए आवश्यक लग रहे हो ।
हम 35 मिमी संस्कृति पकवान में उल्टे ऊर्ध्वाधर आक्रमण परख अनुकूलित । इस संस्कृति पकवान एक 10 मिमी गिलास नीचे अच्छी तरह से जो अच्छी तरह से इमेजिंग के लिए फिट है । इस संस्कृति पकवान की एक सीमा कोलेजन जेल की काफी राशि के लिए एक परख प्रदर्शन की आवश्यकता है । एक इमेजिंग के साथ संगत डिजाइन के साथ छोटे संस्कृति व्यंजन ढूँढना अधिक किफायती होगा । जेल 35 मिमी डिश डिजाइन के लिए उपयुक्त परत बहुत अपनी ताकत के कारण नाजुक है और आसानी से थाली के नीचे से अलग कर सकते है अगर ध्यान से नहीं संभाला । एक अलग सेल संस्कृति डिजाइन कोलेजन जेल परत की स्थिरता लेकिन कोलेजन जेल ताकत और सेल व्यवहार्यता के बीच अनुकूलता में सुधार हो सकता है अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
इन सीमाओं के बावजूद, उल्टे ऊर्ध्वाधर आक्रमण परख कई अंय 3 डी आक्रमण परख प्रारूपों की तुलना में लाभ प्रस्तुत करता है । मुख्य लाभ यह है कि कोशिकाओं को अपने मूल संस्कृति वातावरण में रहते हैं, जो Boyden चैंबर परख में मामला नहीं है । यह प्रोटोकॉल कोशिका microenvironment को संरक्षित रखता है जो इसरो द्वारा नियंत्रित कोशिकाओं के लिए लाभप्रद है जैसे स्टेम सेल15। यह परख भी सेल क्षति या कोशिकाओं है कि नाजुक है या दुर्लभ10,11के लिए विशेष रूप से नुकसान सेल रोकता है । इसके अलावा, इस परख के साथ, सेल आकृति विज्ञान और संबद्ध कैनेटीक्स जेल, जो Boyden चैंबर परख के साथ संभव नहीं है के भीतर मूल्यांकन किया जा सकता है । इसके अलावा, गैर शारीरिक पाली कार्बोनेट या Boyden चैंबर परख प्रणाली के के रूप में फिल्टर औंधा ऊर्ध्वाधर आक्रमण परख में प्रयोग नहीं किया जाता है । उल्टे ऊर्ध्वाधर आक्रमण परख एक स्थिर डिजाइन है, यह vivo गतिशील वातावरण में है कि microfluidic आक्रमण परख डिजाइन प्रदान करता है की नकल नहीं है, लेकिन यह एक सरल, कम चुनौतीपूर्ण और लागत प्रभावी 3 डी वातावरण की मात्रा प्रदान करता है एक संरक्षित और नियंत्रित microenvironment में सेल प्रकार की एक किस्म के प्रवास और आक्रमण ।
उल्टे ऊर्ध्वाधर आक्रमण परख pathophysiological अध्ययन में कई संभावित अनुप्रयोगों है । यह दृष्टिकोण एक में इन विट्रो मंच के रूप में सेवा करने के लिए भ्रूण के विकास के दौरान सेल गतिशीलता अध्ययन कर सकता है, घाव भरने, और/या भड़काऊ प्रतिक्रियाओं3। माइग्रेशन और आक्रमण के दौरान ECM और अन्य सेल प्रकारों के साथ सेल इंटरैक्शन भी इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके जांचा जा सकता है. यह परख भी विरोधी मेटास्टेटिक दवाओं की प्रारंभिक दवा स्क्रीनिंग के लिए एक उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व कर सकता है । अंग विशिष्ट कैंसर मेटास्टेसिस का एक मॉडल प्रणाली के रूप में अच्छी तरह से उल्टे ऊर्ध्वाधर आक्रमण परख का उपयोग कर विकसित किया जा सकता है ।
उल्टे ऊर्ध्वाधर आक्रमण परख को चुनौती है कि उनके मूल microenvironment से कुछ कोशिकाओं के विस्थापन Boyden चैंबर परख प्रणाली में प्रस्तुत को दरकिनार विकसित किया गया था । यह परख आसान है, विश्वसनीय है, और reproducible; यह लचीला है और संवेदनशील और दुर्लभ कोशिका प्रकार सहित सेल प्रकार की एक विस्तृत विविधता के इनवेसिव क्षमता यों तो इस्तेमाल किया जा सकता है । इस परख के लिए प्रवासी मैट्रिक्स क्षरण से जुड़े गतिविधि का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है और भी विभिंन मैट्रिक्स सब्सट्रेट पर चयनात्मक अपमानजनक गतिविधि का अध्ययन अनुकूलित किया जा सकता है ।
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Disclosures
लेखकों ने ऐलान किया है कि कोई प्रतिस्पर्धा हित मौजूद नहीं है.
Acknowledgments
यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था (NIMHD-G12MD007581) RCMI के माध्यम से-जैक्सन राज्य विश्वविद्यालय में पर्यावरण स्वास्थ्य के लिए केंद्र और अमेरिका के रक्षा विभाग, आइडिया अवार्ड 11-1-0205 ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MatTek P35G-1.5-10C | MatTek Corporation, Ashland, MA | P35G-1.5-10-C | mattek glass bottom dishes |
| Rat tail collagen I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | Collagen gel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | H1758 | HCl |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 10010023 | PBS |
| 10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | D2429 | 10X DMEM |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | S5761 | NaHCO3 |
| Confocal Fluorescent microscope | Olympus America, Center Valley, PA, USA | Olympus IX81 | Confocal microscope |
| Defined Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA | SH30070.03 | FBS |
| Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope | Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA | 40x NA 0.8 objective | MPLSM |
| Imaris software | Bitplane Inc. Zurich, CH | Imaris 7.5.2 | Imaris software |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | D9542 | DAPI |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 50980487 | PFA |
| α-minimum essential medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | M0894 | |
| MDA-MB-231 | ATCC; Manassas, VA, USA | HBT-22 | |
| MSC | Trivedi and Hematti, 2007 | ||
| 20X lens UPLAPO | Olympus America, Center Valley, PA, USA | 36-064 | Olympus UPLSAPO 20X Objective |
References
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