Summary
Este protocolo descreve um ensaio de invasão vertical invertida que poderia ser usado para quantificar os recursos de migração e invasão de células em uma configuração tridimensional, preservando o microambiente celular. Este ensaio é adequado para células raras e/ou sensíveis.
Abstract
Embora a invasão 3D ensaios têm sido desenvolvidos, persiste o desafio de estudar células sem afetar a integridade do seu microambiente. Ensaios de 3D tradicionais tais como a câmara de Boyden exigem que as células são deslocadas do local cultura original e mudou-se para um novo ambiente. Não só faz isso atrapalhar os processos celulares que são intrínsecos para o microambiente, mas muitas vezes resulta em uma perda de células. Estes problemas são especialmente desafiadoras quando se lida com as células que são raros ou extremamente sensível ao seu microambiente. Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um ensaio de invasão 3D que evita as duas preocupações. Neste ensaio, as células são banhadas dentro de um pequeno bem e uma matriz de ECM contendo um quimiotático é colocada no topo das células. Isto requer nenhum deslocamento de célula e permite que as células invadir para cima dentro da matrix. Neste ensaio, invasão da célula, bem como a morfologia da célula pode ser avaliada dentro do gel de colágeno. Usando este teste, podemos caracterizar a capacidade invasiva das células de raras e sensíveis; as células híbridas resultantes da fusão entre células de câncer de mama MCF7 e mesenquimais/multipotentes haste/estroma células (MSCs).
Introduction
Motilidade celular é um processo fisiológico e de desenvolvimento normal das células. No entanto, as mudanças no padrão e a capacidade das células para migrar e invadir estão associadas com condições patológicas, incluindo doenças inflamatórias e câncer metástase1,2,3. Metástase é, sem dúvida, o aspecto mais mal compreendido em câncer. Para metástase, as células cancerosas deve degradar a matriz extracelular (ECM), invadir o tecido local e intravasate. Uma vez em circulação, as células cancerosas vão divulgar o site distante, extravasate e formar tumores secundários. Portanto, a capacidade das células para degradar o ECM, para migrar e invadir está relacionada ao seu potencial metastático. Diferentes abordagens têm sido desenvolvidos para analisar e quantificar os recursos de migração e invasão de células. As abordagens mais utilizadas incluem a ferida cura ensaio, microscopia de lapso de tempo e o ensaio de câmara Boyden. A ferida cura ensaio4 e tempo lapso microscopia são ensaios simples e convenientes que dariam preliminar insight sobre migração celular. No entanto, ambos são ensaios 2D que não refletem o ambiente 3D, no qual existem células em vivo. Estudos têm mostrado que as células respondem de forma diferente para um ambiente 3D em comparação com um 2D5,6. Além disso, ensaios de cura ferida são difíceis de reproduzir e produzir resultados quantitativos7,8,9. O ensaio da zona de exclusão de célula, que é uma modificação 3D da ferida do ensaio de cura, é um ensaio mais fisiologicamente relevante, mas não é apropriado para células baixas no número como células híbridas resultantes de célula fusão eventos10,11 .
O ensaio de câmara Boyden é um ensaio 3-dimensional que fornece o microambiente relevantes para estudos celulares. No entanto, requer células para ser removido de seu microambiente original e depositados na câmara superior do sistema de ensaio de Boyden, migrar e invadir para baixo em direção a médio contendo quimiotático. Esta abordagem 3D não é apropriada ao analisar a capacidade de migração e invasão de células vulneráveis ao seu microambiente e/ou limitada em número de11,de10,12. É uma abordagem mais recente para analisar a invasão e a migração celular gradiente câmara microfluidic ensaio13. Embora adequados e fiáveis em estudos de migração e invasão, este ensaio é mais caro e pode ser tecnicamente desafiador para um laboratório típico. Descrevemos aqui um ensaio de invasão vertical invertida simples que é compatível com muitos tipos de células, incluindo células sensíveis ao seu microambiente e/ou limitados em número. Este ensaio foi adaptado a partir do protocolo proposto pela Hooper et al 14. neste ensaio, as células permanecem na sua original microambiente e sua migração e invasão é monitorado como eles se movem para cima no gel de colágeno contendo um quimiotático11. Este ensaio é reprodutível e foi otimizado e validado no prato 35mm cultura. Isso pode ser adaptado às condições de ensaio diferentes incluindo tamanhos de cultura de células diferentes, diferentes matrizes ou força de adesão e diferentes quimioatraentes. Este ensaio poderia servir como uma plataforma em vitro para triagem inicial no processo de descoberta de drogas.
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Protocol
Nota: Este protocolo é descrito no McArdle et al . 11. um cronograma é fornecido na Figura 1.
1. preparação da placa de cultura
- Lave o prato de 35mm cultura contendo um vidro de 10 mm-fundo bem com 1 mL de ácido clorídrico de 1 M (HCl) por 15 min abaixar a hidrofobicidade do vidro-fundo.
- Lave a placa de cultura duas vezes com 1 mL de solução salina tampão de fosfato (PBS) para se livrar de todo o HCl.
- Lave a placa de cultura duas vezes com 1 mL de etanol a 70%.
- Lave a placa de cultura com 1 mL de meio de cultura celular específica (aqui, uso α-MEM suplementado com 10% de calor inativada FBS e 1% não aminoácidos essenciais).
Nota: A placa de cultura tratada contendo meio de cultura pode ser armazenada a incubadora de CO2 com um humidificador a 37 ° C até o dia seguinte. - Crescem as células (MSCs e cultura co MCF-7) em vidro-fundo tratado bem do prato 35mm cultura a confluência de 100%. Co cultura 35.000 células MSC e 75.000 de células MCF7 por 24 h.
2. preparação do gel de colágeno
- Armazene as pontas de micropipeta usadas para pipetar o gel de colágeno no congelador para evitar a polimerização do colágeno em cima do contato.
Nota: Este é o passo mais crítico. - Determinar um volume de colágeno de cauda de rato eu deve ser usado com base na concentração do estoque de colágeno. Prepare-se 100 µ l de gel de colágeno para este ensaio.
Nota: Alta concentração de colágeno de cauda de rato que armazeno funciona melhor. Determine o volume de 10 x meio modificado águia de Dulbecco a ser usado para diluir o colágeno em conformidade. - Combine, colágeno de cauda de rato gelo I (3.8 µ g/mL caldo), médio modificado águia de 10 x Dulbecco e 1 x celular cultura suplementado com 2% de soro fetal bovino e o apropriado quimiotático para uma concentração final de colágeno de 2,4 mg/mL.
- Adicione à mistura 4.5% da solução de bicarbonato de sódio para neutralizar o gel de colágeno.
Nota: O volume de solução de bicarbonato de sódio adicionado pode variar de acordo com o pH exato dos outros reagentes. É melhor para testar a mistura com tiras de pH para garantir solução neutra, ou usar um indicador de pH do meio de cultura. - Disponha as células dentro do vidro-fundo bem do prato cultura 80 µ l da mistura de colágeno.
- Permitir que o gel de colágeno polimerizar durante 30 min numa incubadora de CO2 com um humidificador a 37 ° C.
- Cubra o gel de colágeno com 2 mL de meio de celular com soro reduzido (2%) e incube as celulas a 37 ° C, uma incubadora de CO2 com um umidificador para 24, 48 ou 72 h.
Atenção: A placa deve ser manipulada com cuidado para evitar que o gel de colágeno desanexação da parte inferior do vidro.
3. exemplo de preparação de colágeno gel usando um estoque de colágeno de cauda de rato de 3.8 µ g /mL
- No gelo, combine 114.5 µ l de colágeno de cauda de rato, 16,6 µ l de 10 x DMEM e 33,1 µ l de meio de cultura contendo o quimiotático.
- Neutralize a mistura de colágeno com 14,0 µ l de bicarbonato de sódio.
- Continue como na etapa 2.5.
4. imagem latente das células
- Remova cuidadosamente a mídia do prato.
- Lave suavemente o gel com 1 mL de PBS.
- Fixe as células com 1 mL de paraformaldeído 4% por 15 min.
- Lave as células duas vezes com 1 mL de PBS.
- Manche as células com solução DAPI (100 ng/mL) por 20 min em temperatura ambiente.
- As células usando um microscópio confocal em locais diferentes e tomar 400 µm z-pilha imagens de cada local em 16 µm passos da imagem. O microscópio usado tem um disco de unidade que permite que a imagem latente confocal usando uma luz branca, fonte de excitação do arco de digitalização. Use um 20 X lente utilizada com abertura numérica de 0,75.
- Imagens de reconstituir.
- Abrir imagens para um determinado gel (aproximadamente 25 imagens) e criar uma pilha de imagem clicando em imagem → pilhas → imagens de pilha. A primeira imagem que correspondia à parte inferior do gel (z = 0 µm), a segunda imagem correspondeu à primeira etapa na direção z (z = 16 µm), a terceira imagem correspondia à segunda etapa na direção z (z = 32 µm). Avaliar cada núcleo em cada profundidade de imagem e designar a profundidade na qual o núcleo foi em foco mais nítido como a profundidade de invasão para essa célula específica.
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Representative Results
Nós usamos um prato de cultura 35mm com um vidro inferior e rato cauda de colágeno para desenvolver e otimizar uma invasão 3D em vitro ensaio protocolo. Usando este ensaio, nós mostramos aquele peito de células cancerosas MCF7 e MSC células poderiam invadir para o gel de colágeno a uma distância média de 0,04 ± 1,8 µm e 41,3 ± 76.0 µm respectivamente, após 48 h quando IGF1 (18.6 ng/mL) foi usado como quimiotático (Figura 2). Mais importante, nós mostramos que produtos de fusão de MSC MCF7 de células, que são células raras, poderiam invadir para o gel de colágeno também. Sua distância média de invasão em 48 h foi 10,7 µm ± 12,4 quando IGF I na 18,6 ng/mL foi usado como quimiotático (Figura 2). A diferença da capacidade de invasão entre MCF7 e MSCs foi estatisticamente significante (P < 0,01)11. A diferença entre a capacidade de invasão de produtos a fusão e a um dos MCF7 ou MCSs não foi estatisticamente significativa. No entanto, este ensaio consistentemente mostrou que os produtos de fusão de célula de câncer tinham uma maior capacidade migratória e invasiva do que as células de câncer parental, MCF7.
Células permaneceram saudáveis ao longo dos experimentos, como mostrado pela sua morfologia e quantidade 48 h post gel de polimerização (Figura 3a). Com o projeto de ensaio invasão vertical invertida, a cinética da migração celular e a invasão pode ser analisado (Figura 3b, 4) e morfologia da célula pode ser avaliada (Figura 4).
Figura 1 : Cronograma do projeto invasão vertical invertida ensaio Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Capacidade de invasão de produtos de fusão de células de câncer. A capacidade de invasão de produtos de fusão de células de câncer pode ser determinada usando o ensaio de invasão vertical invertida. Os números representam a capacidade de invasão média de quatro produtos independente da fusão de três culturas distintas de co e suas linhas de célula parental, analisadas a partir de oito áreas diferentes dentro de cada ensaio. Este experimento foi realizado em triplicata. ANOVA com teste post hoc de Tukey HSD. * * P < 0,01. Barras de erro representam o desvio padrão (SD). Esta figura foi adaptada da 11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Viabilidade e série Z do ensaio invertido vertical invasão celular.
a) 20 X imagens de campo brilhante, mostrando a morfologia das células sob o gel de colágeno depois de dois dias. Da esquerda para a direita MCF7 e MSC co-cultura, MCF7 e MSC; b) representação da série z, mostrando dois locais (i e ii) dentro de um prato de baixo para cima. Imagens sucessivas são separados 16 µm. 3,8% FBS foi usado como um quimiotático. Verde círculos em ambos os painéis indicam células invasoras; Nota, fora de foco na parte inferior do gel e em foco no top gel, invadindo no gel. Círculos vermelhos em ambos os painéis indicam as células remanescentes na camada inferior da série z (não-invadindo células). Barra de escala (a): 15 µm; Escala da barra (b): 10 µm. Esta figura foi adaptada da 11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Celular morfologia no ensaio de invasão vertical invertida. Morfologia do MSCs no gel de colágeno em um local do fundo (Z = 0 µm) para a Z = 20 µm. 3,8% FBS foi usado como um quimiotático. A seta longa indica o apêndice de um MSC invasoras no gel. A seta indica um MSC, que é alinhado ao longo do fundo do gel e não invasora. O azul mostra a mancha DAPI nuclear, enquanto o vermelho mostra os filamentos de actina faloidina manchado. Esta figura foi adaptada da 11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, descrevemos um ensaio simples invasão vertical invertida que é conveniente para uma variedade de tipos de células, incluindo células que são raras e/ou dependente seu microambiente. Neste ensaio 3D invasão, as células permanecem em seu microambiente original em são cobertas pelo gel de colágeno contendo um quimiotático. As células então migram e invadem em colágeno. Neste ensaio, as células podem ser manchadas e facilmente monitoradas dentro do gel. A simplicidade e a reprodutibilidade deste teste o torna uma ferramenta conveniente para estudar a migração de células de câncer e invasão em um sistema 3D. No entanto, fortes quimioatraentes parecem ser necessárias para quebrar a afinidade da célula para o fundo do prato a cultura.
Nós aperfeiçoamos o ensaio de invasão vertical invertida no prato 35mm cultura. Este prato de cultura tem um vidro de 10 mm-fundo bem que está bem equipado para a imagem latente. Uma limitação deste prato de cultura é a considerável quantidade de gel de colágeno necessário para realizar um ensaio. Encontrar pratos de cultura menores com um design compatível com imagens seria mais econômicos. A camada de gel apropriada para a concepção de 35mm prato é muito delicada devido a sua força e pode facilmente separar da parte inferior da placa se não for tratada com cuidado. Um projeto de cultura de célula diferente pode melhorar a estabilidade da camada de gel de colágeno... mas a compatibilidade entre a viabilidade de força e célula de gel de colágeno deve ser otimizada.
Apesar dessas limitações, o ensaio de invasão vertical invertida apresenta muitas vantagens em comparação com outros formatos de ensaio 3D da invasão. A principal vantagem é que as células permanecem em seu ambiente de cultura original, que não é o caso no ensaio de câmara de Boyden. Este protocolo preserva o microambiente celular que é vantajoso para células rigorosamente controladas pelo seu microambiente como células-tronco15. Este ensaio também previne danos celulares ou perda de celular, especialmente para as células que são delicados ou raro10,11. Além disso, com este ensaio, a morfologia celular e cinética associada puderam ser avaliadas dentro do gel, que não é possível com o ensaio de câmara Boyden. Além disso, o policarbonato não-fisiológica ou polipropileno filtro do sistema de ensaio de Boyden câmara não é usado no ensaio de invasão vertical invertida. O ensaio de invasão vertical invertida é uma concepção estática, não imitam na vivo ambiente dinâmico que oferece o design de ensaio microfluidic invasão, mas fornece um mais simples, menos desafiador e cost-effective de ambiente 3D para quantificar migração e invasão de uma variedade de tipos de células em um microambiente preservada e controlada.
O ensaio de invasão vertical invertida tem muitas aplicações potenciais em estudos fisiopatológicos. Esta abordagem poderia servir como uma plataforma em vitro para o estudo da motilidade celular durante o desenvolvimento embrionário, ferida cura e/ou de respostas inflamatórias3. Interação da célula com o ECM e outros tipos de células durante a migração e invasão também poderia ser investigada usando este protocolo. Este ensaio também pode representar uma ferramenta útil para o rastreio de drogas inicial das drogas antimetastáticos. Um modelo de sistema de metástase de câncer órgão específico poderia ser desenvolvido usando o ensaio de invasão vertical invertida também.
O ensaio de invasão vertical invertida foi desenvolvido para contornar o desafio que o deslocamento de algumas células de seu microambiente original apresenta o sistema de ensaio de câmara Boyden. Este ensaio é fácil, confiável e reprodutível; é flexível e pode ser usado para quantificar o potencial invasivo de uma grande variedade de tipos de células, incluindo os tipos de células sensíveis e raro. Este ensaio pode ser aplicado para detectar a atividade migratória associada com degradação da matriz e também pode ser adaptado para estudar a atividade degradante seletiva em substratos de matriz diferente.
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Disclosures
Os autores declararam que nenhum interesse de concorrente existe.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (NIMHD-G12MD007581), através do RCMI-centro de saúde ambiental da Universidade de estado de Jackson e o departamento E.U. de defesa, prêmio Idea 11-1-0205.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MatTek P35G-1.5-10C | MatTek Corporation, Ashland, MA | P35G-1.5-10-C | mattek glass bottom dishes |
| Rat tail collagen I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | Collagen gel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | H1758 | HCl |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 10010023 | PBS |
| 10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | D2429 | 10X DMEM |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | S5761 | NaHCO3 |
| Confocal Fluorescent microscope | Olympus America, Center Valley, PA, USA | Olympus IX81 | Confocal microscope |
| Defined Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA | SH30070.03 | FBS |
| Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope | Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA | 40x NA 0.8 objective | MPLSM |
| Imaris software | Bitplane Inc. Zurich, CH | Imaris 7.5.2 | Imaris software |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | D9542 | DAPI |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 50980487 | PFA |
| α-minimum essential medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | M0894 | |
| MDA-MB-231 | ATCC; Manassas, VA, USA | HBT-22 | |
| MSC | Trivedi and Hematti, 2007 | ||
| 20X lens UPLAPO | Olympus America, Center Valley, PA, USA | 36-064 | Olympus UPLSAPO 20X Objective |
References
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