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Bioengineering

海綿骨の機械的性質を測定するためミリ スケール曲げテスト システム

Published: October 11, 2017 doi: 10.3791/56571
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1School of Engineering, Brown University

Summary

特注の機械式試験装置を用いたサブミリ スケール繊維の 3 点曲げ試験を実行するためのプロトコルを提案します。デバイスは、10 N まで 20 µN に至る力を測定することができます、したがってさまざまな繊維のサイズに対応することができます。

Abstract

多くは生物学的構造 (LBBSs) を負荷、羽軸、スピキュールなど-小さい (< 1 mm) がない顕微鏡。これらの LBBSs の曲げ性状の測定は、その顕著な機械的機能の起源を理解するため重要です。

10-5から 10 の1 N と変位に至る 10-7 10-2メートルに至るまで強制的に測定できる特注機械式試験装置を用いた 3 点曲げ試験を行うためのプロトコルについて述べる。この機械の試験装置の主な利点は、異なる LBBSs の力と変位の容量を簡単に調整できることです。デバイスの動作原理は、原子間力顕微鏡のそれに似ています。すなわち、力は、片持ち梁の端に接続されている負荷のポイントによって、LBBS に適用されます。荷重点変位は光ファイバー光ファイバー変位センサーによる測定、測定された片持梁剛性を用いた力に変換します。デバイスの力の範囲は、異なる剛性のカンチレバーを使用して調整できます。

海綿Euplectella aspergillumの骨格要素の 3 点曲げ試験を実行することによって、デバイスの機能を説明します。骨格の要素-スピキュールとして知られている-、直径約 50 μ m シリカ繊維であります。≈1.3 mm スパン 3 点曲げ冶具上、スピキュールを取り付けテスト装置を調整するための手順について述べるし、曲げテストします。スピキュールと応用力の位置の変形にかかる力を測定します。

Introduction

負荷軸受シェルや骨などの生物学的構造 (LBBSs) のアーキテクチャを研究することによってエンジニアは強くてタフな1である新しい複合材料を開発しました。LBBSs および対応する生体の顕著な機械的性質の複雑な内部アーキテクチャ2に関連していることが示されています。ただし、LBBS アーキテクチャと機械的性質との関係は完全には理解されていません。LBBS の力学応答を測定は、そのアーキテクチャがその機械的性質を高める方法を理解することの第一歩です。

ただし、LBBS の力学的応答の測定に使用するテストの種類、その力学的機能と一貫性のあることが重要です。たとえば、羽は空力負荷をサポートする必要があります、ので羽梗の主な機能曲げ剛性3を提供することです。したがって、曲げ試験の力学的応答を測定するため一軸引張試験をお勧めします。実際には、多くの LBBSs、羽軸3など草茎4、およびスピキュール5,6,7,8-主に曲げによる変形します。これは、これらの LBBSs が細い-すなわち、その長さが、幅や深さよりもはるかに大きい。ただし、これらの LBBSs の曲げ試験を行うために、やりがいが軍と彼らが失敗するまで耐えることができる変位 10 10-2範囲2 N と 10-4 10-3 m、それぞれ3,4,5,7,8します。 したがって、これらの機械のテスト実行に使用するデバイスがそれぞれ ≈10-5 N と ≈10-7 m (センサーの最大測定可能な力と変位のすなわち、0.1%) の力と変位の解像度を持つ必要があります。

商業的に利用可能な大規模な機械テスト システム通常測定できない力と変位この解像度で。彼らが測定できる最大の力 (それぞれ変位) はより小さい原子間力顕微鏡を用いた9,10や微小電気機械システム ベース11試験装置には、適切な解像度がありますが、LBBS が耐えることができる最大フォース (それぞれ変位)。したがって、これらの LBBSs、エンジニアおよび科学者で曲げ試験を実行する特注機械テスト デバイス5,7,12,13に頼らなければなりません。これらのカスタム デバイスの主な利点は、力と変位の大きい範囲を格納できることです。ただし、建設、これらのデバイスの操作でも記載されていません、文学。

プロトコルは、10-5から 10 の1 N と変位に至る 10-7 10-2メートルに至るまで強制的に測定できる特注機械式試験装置を用いた 3 点曲げ試験を実行する説明です。補足資料は、機械的試験装置のコンポーネントのすべてのディメンションを含む、技術的な図面を提供しています。この機械的試験装置の主な利点は、力と変位の範囲を異なる LBBSs に合わせて簡単に調整できることです。デバイスの動作原理は、原子間力顕微鏡9のそれに似ています。このデバイスは、標本をステンレス板にカット溝を配置 (図 1A ~ C参照)。1278 ± 3 μ m を光学顕微鏡写真からトレンチのスパンを測定 (平均 ± 標準偏差; n = 10)。トレンチ端部曲げ試験 (参照してください図 1、およびD) 中に供試体をサポートします。この試料ステージは、3 軸翻訳段階に添付、ウェッジは海溝のスパンに中間に位置する、アルミ ウェッジの下に配置 (図 1C参照)。ステージを移動することによって、 Equation 1 (参照してください図 1 a、およびC) の方向を曲げないように供試体を引き起こしているウェッジを押し込ま標本。

我々 は、負荷ポイント (LP) としてウェッジを含むデバイスのコンポーネントおよび負荷ポイント チップ (LPT) とウェッジを参照してください。LP は、カンチレバーの変位が、ファイバー光ファイバー変位センサー (FODS) で測定の最後に添付されます。対象は LP の上面にあるミラーから反射される赤外光を発する (図 1B参照)、対象に光ファイバーで送受信。洗練されたシリコンウェハーの ≈5 の mm の正方形の部分は LP ミラーとして使用され、エポキシを使用して LP に貼付されています。対象は、光を反射して放出の強度を比較することによって変位を測定します。カンチレバーの剛性と変位を使用して計算力、 Equation 2 、供試体との対話によるくさびによって経験されます。カンチレバーの変位は、くさびの下に試験片の断面の変位を計算する使用もEquation 3。カンチレバ型力センサーは、ミクロとマクロ力学試験研究10、11,12,13,14の数で使用されています。ここで示した特定の設計は、接着剤の接触実験14を実行するために使用される機械的試験装置から適応。似たようなデザインは、市販のマイクロ トライボメータ15,16で使用されています。

Figure 1
図 1: 特注の機械式試験装置の概要。(A) A コンピューター支援設計レンダリング デバイスの。ステージのコンポーネントが緑色でハイライトされます。サブアセンブリ (片持梁、ロード ポイント (LP)) の検出力は、赤色でハイライトされます。A (B) は (A) のビューを拡大しました。LP ミラーは、対象の下に LP の上面に青色で、LPM のラベルは。(C) 翻訳段階の運動を記述するために使用される座標系。Th を平準化プロトコルの手順 1.9 e ステージ、 Equation 1 LP ミラーの表面に垂直なベクトルと一致する方向を作った。変形、スピキュールと計測変位を示す三点曲げ構成の (D) の模式図Equation 49とEquation 50。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

海綿Euplectella aspergillum6,7.の骨格要素の 3 点曲げ試験を実行することによってデバイスの機能を実証します。このスポンジのスケルトンは、フィラメント、スピキュール (図 2A参照) と呼ばれるアセンブリです。Spicules は ≈50 μ m 厚い、シリカ6主に構成。バイオシリカ ベースのスピキュールは、普通、Homoscleromorpha、および Hexactinellida のクラスに属するスポンジで発見されます。Hexactinellida クラスに属するE. aspergillumなどのスポンジは「ガラス スポンジ"とも呼ばれますガラス スポンジのスピキュールは、主にシリカから構成される、それはシリカが多くの場合どちらかコラーゲン17,18またはキチン19,20から成る有機マトリックスに含まれていることを示されています。,21. この有機基質シリカ鉱物18,20の重要な役割を果たしています。さらに、いくつかの骨片の有機基質もカルシウム22のバイオミネラリゼーションのテンプレートとして機能します。シリカ内で配布されているほか、有機マトリックスはまたスピキュールのシリカを分割、同心の円筒ラメラ6,23異なる層を形成できます。それはこの同心円状、層状アーキテクチャがスピキュールの変形動作6,7,8,24,25,26 に影響を与えることが示されています。.その結果、スピキュールの機械的プロパティは、化学反応の組み合わせによって決定されます (すなわち。、シリカ-タンパク質複合体の化学構造) とは建築27。化学構造とガラス海綿骨片のアーキテクチャの両方調査24,28,29の下にまだあります。

E. aspergillumのスピキュールのほとんどは、フォーム硬い骨格のケージに一緒に接合されています。しかし、スケルトンの基部 (図 2A参照) アンカー スピキュールとして知られている非常に長い (≈10 cm) スピキュールの房があります。アンカー スピキュールの小さいセクションで 3 点曲げ試験を行うためのプロトコルについて述べる。

プロトコルの手順 1で組み立てと特注の機械式試験装置のコンポーネントの位置揃え、手順を説明します。手順 2と4プロトコルの力と曲げ試験における変位を計算するために使用のキャリブレーション データを生成するための手順を提供します。手順 3で、スピキュールのセクションを準備し、テスト ・ フィクスチャにそれをマウントするための手順を示します。スピキュール セクションの曲げ試験を行うための手順は、手順 5に記載されています。最後に、代表結果セクションでステップ 2と4で得られた校正データを使ってステップ 5で得られた曲げ試験データと共に計算Equation 2、 Equation 3 。

Figure 2
断面およびE. aspergillum スピキュールを検査するため図 2: プロシージャ。(A) E. aspergillumのスケルトン。フリースタンディング アンカー スピキュールの房は、スケルトンのベースに表示されます。スケール バーは ~ 25 mm (B) 単一のアンカー スピキュールは赤 #00000 クロテン ブラシを使用して、かみそりの刃を使用して断面の顕微鏡スライドの場所で開催されます。スケール バーは 〜 12 mm (C) 試料ステージの塹壕に配置されますE. aspergillumスピキュールのセクションあります。トレンチ端部とトレンチ リッジそれぞれティールと、オレンジ色でハイライトされます。トレンチ リッジに対して、スピキュールをプッシュすることで、その軸がトレンチ端部に垂直であることを確認します。(D) A スピキュール セクションが破損しているし、捨てられるべき場合を決定する方法を記述するプロトコルの手順 3.4で説明した検査手順を通過する骨片の顕微鏡写真。A (E) プロトコルの手順 3.4で説明した検査手順が失敗するシリカ層の大部分を不足している多くの亀裂を含む骨片の顕微鏡写真。スケール バー = 250 μ m (C)、(D)、100 μ m、100 μ m (E)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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Protocol

1 です。 アセンブリと配置

  1. 選択が剛性が目的の実験に適した片持ち。LP をカンチレバー #4-40 ソケット ヘッド キャップ ネジ (SHCSs) を ( 図 3 を参照) に接続します。LP をアタッチ中片持梁腕をない塑性変形に注意してください
    2. 。

Figure 3
図 3: カンチレバーを組み立てる手順を強制的にセンサーと測定その剛性。(A) 負荷ポイント (LP) は負荷ポイント チップ (LPT) 上向きに指される片持梁 (C) に接続されています。(B) カンチレバー LP サブアセンブリが CP として示される片持ちプレートに接続されているとします。片持ちプレートの凹部のポケットは、片持梁腕の下に表示されます。(C) 片持板がフレームの下側に接続されている、(B) に示すように板の側面に直面している、Equation 6 方向。ツキガイ (D) ワイヤー フックとして FODS マイクロメータを示し、LPT の穴からぶら下がっているプロトコルの 手順 2 で使用される校正重みが表示されます。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

。
  1. けば無料綿棒に 2-プロパノールを数滴を適用し、LP ミラーの表面を拭きます。傷のミラーを検査し、破損がある場合にミラーを交換します
    2. 。
  2. は、片持ちプレートのプレートから LPT 指すと凹部のポケットを有する板の側面にある #6-32 SHCSs を使用するカンチレバーを緩めに取り付けます ( 図 3 B を参照)。1/8 を挿入 " カンチレバーとプレートを位置合わせピン、ネジを締めます、位置合わせピンを削除します
    3. 。
  3. は、FODS マイクロメータ反時計回り (参照してください 図 3 C) を回すことによってできるだけ多くの対象を撤回します。緩めの LPT 指している #6-32 SHCSs を使用してフレームに片持ちプレートに取り付けます、Equation 4 方向 ( 図 1 を参照)。1/8 を挿入 " フレームと片持ちプレートの位置合わせピン、ネジを締めます、( 図 3 C を参照) の位置合わせピンを削除します
    4. 。
  4. 電源を調整ノブを使用して定電圧モードで 12.00 V に電圧を設定します。電圧出力をオンにし、電源装置の電流が表示されていることを確認 ' s 液晶画面は約 60-70 mA です。電流電圧測定の不確かさを減らすために定常状態に到達するために少なくとも 1 時間を待機します
    5. 。
  5. を開き、実行、Basic_Data プログラム (サプルメンタリ コード ファイルを参照してください)。LP に向かって FODS ミラー ユーザー インターフェイスのグラフに表示される出力電圧最大値に達するまで移動する (参照してください 図 3 C と 図 4 A) FODS マイクロメータを回り。
    1. 、電圧出力、FODS を撤回する反時計回りに FODS マイクロメータ (動) 5.0 は、対象住宅の側にネジをセットを回して FODS のゲイン調整します
      2. 。
  6. 顕微鏡照明オンし顕微鏡の位置を調整して、LPT はビューのフィールドの中央に配置されるので、2 つのマニュアルの翻訳段階を使用して集中。クリックして Basic_Data プログラムを停止、' 停止 ' ボタン
    7. 。
  7. は、モーター コント ローラー ユーザー インターフェイス ソフトウェアを開きます。ポテンショメータ スライダーを使用して、 Equation 5 -軸モータコント ローラーの最大許容移動にステージを移動する、 < img alt =「方程式 6」src ="/ファイル/ftp_upload/56571/56571eq6.jpg"/> 方向とセットをクリックしてホーム ポジション、' ホーム ' ユーザー インターフェイスのボタン。
    1. 使用ポテンショメータのスライダー、Equation 7-軸の最大許容移動にステージを移動するモーター コント ローラー、Equation 8 方向とセット ホーム ポジション。ユーザー インターフェイス ソフトウェアを閉じます
      2. 。
  8. 平準化のマイクロメータ ヘッドの先端プレート ステージ ベース プレート芝生で休憩できるようにステージ ベース プレート ( 図 4 A を参照) 上のステージの座席します。アイソレーション テーブル上にバブルのレベルを置き、各テーブル内の圧力を調整する ' バルブを回して s 足親指のネジの腕、表面レベル。
    1. はプレートを平準化ステージの上にバブルのレベルを移動し、それはまたレベル、マイクロメータを調整します。マイクロメータの位置をメモしてステージ ベース プレートからステージを外します。注: プロトコルがここで一時停止にすることができます
      2. 。

Figure 4
図 4: 機械のテスト装置で組み立て、手順 1.9 とプロトコルの 3.7。(A) 試料ステージ (SS)、翻訳段階 (TS) にアタッチされ、平準化がステージ ベース プレート (SBP) に装着されているプレート (SLP) は、ステージ上、マイクロメータを使用して、平準化します。ステージのベース プレートは、アイソレーション テーブル上の光学ブレッド ボードに接続されます。片持ち梁 (C);片持ちプレート (CP);光ファイバー変位センサー (FODS) 力センサ システムを構成します。カンチレバーに負荷 (B) ポイント (LP) を接続し、試料ステージ、スピキュール上負荷ポイント チップ (LPT) が置かれました。曲げ試験の中には、対象を使用して LP の変位を測定します。FODS と LP ミラー間距離の初期値は、(A) に示すように FODS マイクロメータ (FM) によって制御されます。(C) A トレンチで、LPT の下、サンプル段階での敷設スピキュールの顕微鏡写真。スケール バー = 250 μ m (C)。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

。

2 片持梁剛性測定

  1. Basic_Data プログラムと出力電圧まで右回りに FODS マイクロメータは停止 (動) 約 4 ターンにをクリックして、プログラムを実行、' 停止 ' ボタン。
    2. 。
  2. 分析用天秤を使用してワイヤー フックと校正の重みの質量を測定します
    3. 。
  3. は、Cantilever_Calibration プログラムを開く (サプルメンタリ コード ファイル を参照してください) 力のため目的のファイル名を入力し、カリユーザー インターフェイスのテキスト ボックスに出力ファイルを bration
    4. 。 Cantilever_Calibration プログラムを実行し、
  4. ' OK ' 最初の校正用分銅の質量を入力するメッセージが表示されたら。発振は停止し、緑をクリックしてユーザー インターフェイス グラフに表示出力電圧を待つ ' 電圧安定化 ' 電圧測定を実行します
    5. 。
  5. 架線使用ピンセットは、LPT の穴からフック、フックは対物レンズ (D の 図 3 を参照) から離れて直面しています。フックの添加物による片持ばりの振動を減衰させるため、ピンセットを使用します。
    1. ダイアログ ボックスでグラムにフックの質量を入力し、クリックして ' [ok] '。前の手順のようにクリックする前に発振は停止への出力電圧を待つ、' 電圧安定化 ' ボタン
      2. 。
  6. ワイヤ上最初のウェイトを掛ける使用ピンセット フックし、前の手順で説明するように電圧測定を行うプロセスを繰り返します。校正重みのすべてのハングされているか、出力電圧は 1.8 V 未満までは、この手順を繰り返します。この時点で、クリックして ' キャンセル ' Cantilever_Calibration プログラムを終了ダイアログ ボックス
    7. 。
  7. 半時計回り FODS マイクロメータを FODS を撤回します。LPT からフックと重みを慎重に削除します
    。 注: 力校正出力ファイルは校正大衆、100 FODS 出力電圧の測定値の平均値とこれらの測定値の標準偏差によって適用されるフォースのタブ区切りリストです。代表の結果 では、カンチレバーの剛性を測定するこのデータ ファイルを処理する方法について説明します
    8. 。

3。試料作製

  1. 摩耗ニトリル手袋 E. aspergillum を処理するときのスケルトンをスポンジし、処理されないとき、密閉容器にスケルトンを格納します
    。 注意: spicules は、主にシリカで構成されます、ので壊れたスピキュール フラグメントの鋭い、炎症につながる皮膚に埋め込まれたことができます
    2. 。
  2. ピンセットのペアを使用して、その遠位端とスケルトンから取り外します 1 つのアンカー スピキュールを把握する ( 図 2 A 参照)。きれいな顕微鏡スライドの上、骨片を配置します
    3. 。
  3. は、#00000 赤クロテン ブラシを使用してその長さに沿って中間点付近のスライドに対して、スピキュールを保持します。カット、≈ 4 mm のセクションのスライドに垂直ブラシの両側に、スピキュールに対してかみそりの刃を押すことによって骨片の表面 ( 図 2 B を参照)。大型遠位および近位骨片のセクションを破棄し、≈ 4 mm セクション
    4. 。
  4. 検査 10 倍の倍率の偏光顕微鏡を使用して 4 mm スピキュール セクション ( 図 2 C を参照してください-E)。スピキュール セクションを破棄し、( 図 2 E 参照) シリカ層の大規模な領域がない場合は 3.2 の手順 に戻ります。専らそのシリカ層に新たな損傷を防止するため赤 #00000 クロテン ブラシを使用して検査スピキュール セクションを処理します
    5. 。
  5. きれいにスピキュール フラグメントまたはブラシや圧縮空気で試料ステージの面から他の粒子。糸くず無料綿棒に 2-プロパノールを数滴を適用し、試料ステージを拭いてください。非反射性塗料をコーティングしたステージの部分との接触を避けてください。注: ペイントを使って曲げテスト中に撮影した画像に鏡面反射の数を減らす
  6. は、サンプル ステージにスピキュール セクションを転送します。曲げ試験のため必要な範囲と海溝の間でスピキュール セクションを置き、慎重にそれをプッシュ、Equation 10 トレンチ リッジに対して方向。スピキュールが ( 図 2 C 参照) トレンチ端部に垂直であることを確認します
    7. 。 マイクロメータ スピンドルの先端ステージ ベース プレート芝生の残りの部分は、
  7. ステージ ベース プレート上のステージを座席します。必要に応じて、プロトコルの 1.9 の手順 でメモした値にプレートを平準化ステージ上、マイクロメータを調整します
    8. 。

4。電圧変位補間ファイル

  1. 開く Bending_Test プログラム (サプルメンタリ コード ファイルを参照してください)。設定、' ステップ サイズ ' 2 μ m の ' 最大変位 ' 0.5 mm ' 低電圧停止 ' 1.5 V と ' 高電圧停止 ' 4.6 V のユーザー インターフェイスに表示されるテキスト ボックスを使用する。 テキストを使用して
    1. 選択任意の画像とデータ ディレクトリと出力ファイル名は、ユーザー インターフェイスのボックスします。設定、' 画像を保存 ' ユーザー インターフェイスの下の位置に切り替えます、言葉の下の緑色の長方形ボタンをクリックして ' 電圧差 '、それが点灯になります
      2. 。
  2. Bending_Test プログラムを実行し、初期化するモーター コント ローラーとカメラ インターフェイスを待つ
    3. 。 照明器具をオンに
  3. 、lpt ポートが表示されるので、明るさを調整します。時計回りに回して FODS マイクロメータ ユーザー インターフェイス グラフに表示出力電圧が対 ~1.7
    1. 使用ポテンショメータのスライダー、Equation 5-ステージを移動する軸モーター コント ローラー、Equation 1 までの方向これは、lpt ポートとセットの下 ~ 1 cm、Equation 5-軸をクリックしてホーム ポジション、" ホーム " ボタン
      2. 。
  4. のポテンショメータのスライダーを使用して、Equation 7-、Equation 11-、lpt ポートの位置に軸モーター コント ローラーサンプル ステージ上にある薄い鋼板の中央に、Equation 12、トレンチからの方向。ポテンショメータのスライダーを使用して、Equation 5-ステージを移動する軸モーター コント ローラー、Equation 1 ステージまで方向顕微鏡内にある ' s 視野
    5. 。
  5. はポテンショメータのスライダーを使用して、Equation 5-ステージを移動する軸モーター コント ローラー、Equation 1 しながら方向ユーザー インターフェイスの出力電圧のグラフを見てください。Lpt ポートがステージを連絡するおおよその位置を決定する ' の電圧の変化を捜すことによって s の表面さらに、ステージの動き。ステージ約 10 μ m を撤回します
    6. 。
  6. というラベルの付いたボタンをクリックして " を開始テスト "。プロンプトが表示されたら、入力値 0.003 V と 0.001 mm の ' タッチ感度 ' と ' ステップ サイズをタッチ '、それぞれ。テストが完了するまで待機します
    。 注: これ以降、ステージから取り外さないでステージ ベース プレート曲げ試験が正確な変位測定を確保するために完了するまで。電圧変位補間出力ファイルが 100 FODS 出力電圧の測定値の平均値と一緒にこれらの測定値の標準偏差のタブ区切りリスト、Equation 5-軸ステージのすべての段階の変位増分位置。代表結果 では、このデータ ファイルを使用して LP 変位を測定対象の出力電圧に変換する方法について説明します
    7. 。

5。曲げ試験

  1. 開くと実行 Basic_Data プログラムし、ユーザー インターフェイスのグラフに表示される出力電圧はポテンショメータのスライダーを使用して対 3 約まで FODS マイクロメータを反時計回りに回し、 < imgalt ="方程式 7" src="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56571/56571eq7.jpg"/> -スピキュール (参照 図 4 C) 上記トレンチ端部間 LPT の位置に軸モータコント ローラー。
    1. 使用ポテンショメータのスライダー、Equation 5-ステージを移動する軸モーター コント ローラー、Equation 1 までの方向トレンチ リッジの上面の下、LPT は ( 図 5 を参照)。最後に、ポテンショメータのスライダーを使用して、Equation 11-LP の完全な幅の端の間は、フォーカスにトレンチ リッジの前部表面をもたらす軸モーター コント ローラー、トレンチ リッジ。クリックして Basic_Data プログラムを停止、' 停止 ' ボタン
      2. 。
  2. 開くと Center_LoadPoint プログラムを実行 (サプルメンタリ コード ファイル を参照してください)。使用、Equation 7-軸モータコント ローラー、LPT がほぼ正しいトレンチ端部と接触するまで、ステージを移動します。クリックして、" を見つけるエッジ " ボタン
    3. 。 プロンプトが表示されたら、
  3. を使用して、Equation 7-軸モータコント ローラー、LPT がほぼ左トレンチ端部と接触するまで、ステージを移動します。クリックして、" を見つけるエッジ " ボタン。トレンチのスパンに LPT 途中の位置にプログラムを待ちます ( 図 5 B 参照).
    注: これ以降後それは調整することが重要、Equation 7-このように軸モータコント ローラー、LPT のミスアラインメントになります
    4. 。
  4. Bending_Test プログラムを開きます。2 μ m、0.5 mm、1.5 V 低電圧停止高電圧 4.5 V のユーザー インターフェイスでテキスト ボックスを使用して停止し、最大変位するステップ サイズを設定します。 テキストを使用して
    1. 選択任意の画像とデータ ディレクトリと出力ファイル名は、ユーザー インターフェイスのボックスします。設定、' 画像を保存 ' 上の位置にユーザー インターフェイスに切り替えるし、言葉の下緑の長方形ボタンをクリックして ' 電圧差 ' が点灯しないように
      2. 。
  5. Bending_Test プログラムを実行し、初期化するモーター コント ローラーとカメラ インターフェイスを待つ
    6. 。
  6. ステージを移動、 Equation 1 モータコント ローラーのポテンショメータのスライダーを使用して、スピキュールが顕微鏡内まで方向 ' s の視野。ポテンショメータのスライダーを使用して、 Equation 11 -軸モータコント ローラー、スピキュールは、LPT の下までステージを移動します。
    1. が顕微鏡焦点のノブを調整、スピキュールは、ユーザーのフォーカス インターフェイス ( 図 4 C を参照してください)。出力電圧が約 1.8 v. まで FODS マイクロメータを反時計方向に回して
  7. ステージを移動する z 軸モータコント ローラーのポテンショメータのスライダーを使用して、Equation 1 ユーザー インターフェイスの出力電圧のグラフを見ながら方向。Lpt ポートがさらにステージの動きと電圧の変化を探して、スピキュールを連絡するおおよその位置を決定します。ステージ約 50 μ m を撤回します
    8. 。
  8. クリック " テスト開始 " 曲げ試験が完了し、ステージに戻りますまで待つと、Equation 5-軸ホーム位置
    。 注意: ステージが移動 2 μ m 刻み (ステップ 5.4 議定書に規定する)、Equation 1、スピキュールを曲げ方向 (を参照してください 図 5 C) いくつかの停止条件のいずれかが満たされるまで。停止条件:) 0.5 mm の最大のステージ移動に達する;b) スピキュール改とプログラム FODS 出力電圧; の大きなドロップを検出します。または c) 4.5 V の高電圧制限に達した。(A) 条件を停止するため、彼らはテストを終了、または前の値を上書きしたい場合、ユーザーが求められます。ときに ' をオーバーライドして ' は選択すると、ユーザーは段階の変位制限をインクリメントまたは、スピキュールが読み込まれて、データの収集を続行するためにステージの変位のステップの方向を反転する機会を有する。変位増分ト書きは] をクリックして変更することも、" ロードを逆 " ボタンのテスト中に任意の時点で。曲げテスト出力ファイルは、プロトコルの 4.6 のステップ で生成された電圧変位の補間出力ファイルの同じ構造です。つまり、それは 100 FODS 出力電圧の測定値の平均値と一緒にこれらの測定値の標準偏差のタブ区切りリスト、Equation 5-すべての段階で軸ステージ位置変位増分値です。代表の結果 では、曲げ試験におけるカンチレバーの変位とステージの変位を計算するための電圧変位の補間ファイルと共にこのデータ ファイルを使用する方法を説明します。片持梁剛性が、スピキュールの LPT によって適用されるフォースを計算する使用後、.
    9. テストが完了したら、
  9. FODS マイクロメータを反時計回りに回し、FODS が LPT ミラーから少なくとも 5 mm まで。その後、慎重にステージ ベース プレートからステージを削除します
    10. 。

Figure 5
図 5: トレンチ LPT を整列させるための手順 ' スパン半ば s と曲げ試験を行う(A)、LPT はプロトコルの 手順 5.1 の終わりにトレンチ リッジの上面の下にあるが、半ば範囲にまだ配置されていません。手順 5.2 と 5.3 プロトコルのでセンタリング後 LPT の位置 (B) の手順を完了しています。(C) A 曲げテスト中に撮影した骨片の顕微鏡写真。LPT、下にスピキュール断面の変位 Equation 14、図式的にマークされています。スケール バー = 250 μ m (A ・ C)。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

。

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Representative Results

機械的テストの最も基本的な出力は、試料と、力が適用される場所で変位に加わる力の大きさです。3 点曲げ試験の場合目的は、LPT によって適用されるフォースのマグニチュードを取得、Equation 13との lpt ポートの下に試験片の断面の変位、 Equation 4 方向、 Equation 14 。ただし、ここで説明したテストの機械装置、後処理手順をいくつか実行する必要がある手順 2、4 および 5 プロトコルの望まれたこれにから得られる出力データを変換するEquation 13-Equation 14データ。3 点曲げ試験から得られたデータ ファイル: 1) 電圧変位の補間ファイル;2) 力の校正ファイル;・ 3) 曲げテスト ファイル。測定および派生の量の概要は、表 1の通りです。

シンボル 定義
Nh ファイルを出力の電圧変位の補間の電圧値の数
Vh プロトコルの手順 4 で測定した電圧値
ΣVh Vhの標準偏差
zsh プロトコルの手順 4 でステージ位置を測定
Nc 力の測定力校正出力ファイルの数
Fc プロトコルの手順 2 で校正重みによって適用されるフォース
Vc プロトコルの手順 2 で測定した電圧値
ΣVc Vcの標準偏差
zlc VhとVcを使用して計算されるプロトコルの手順 2 で、LP の位置
wlc Zlcからプロトコルの手順 2 で LP の変位を計算
Nt 曲げテスト出力ファイルに力と変位の測定値の数
zセント プロトコルの手順 5 でステージの位置
wセント プロトコルの手順 5 の段階の変位
Vt プロトコルの手順 5 で測定された電圧値
ΣVt Vtの標準偏差
zlt VhとVtを使用して計算プロトコルの手順 5 で、LP の位置
wlt Zltからプロトコルの手順 5 で LP の変位を計算
F Zltからプロトコルの手順 5 で LP によって適用されるフォースを計算
w0 プロトコルの手順 5 で LP の下で骨片の断面の変位

表 1: 手順 2、4 および 5 プロトコルの単位そして代表結果セクションで計算量に使用されるシンボルの概要。

電圧変位の補間ファイルの目的は、LPT 変位を測定対象の出力電圧を関連付けることです。移動するステージとしてですので剛翻訳段階に、lpt ポートを結合することによってこれは、 Equation 1 の変化、方向、 Equation 5 -軸ステージ位置 LPT 変位 (プロトコルの手順 4 ) と同じです。電圧変位の補間ファイルには点のセットが含まれていますEquation 15、 Equation 16 FODS 平均出力電圧 1000 Hz のサンプリング レートでの測定を 100 以上の撮影は、 Equation 17 100 電圧の関連付けられている標準偏差は、測定、Equation 18は、 Equation 5 -軸ステージ位置とEquation 19はステージ数変位手順 (図 6 (B) 参照)。

力校正ファイルには、LP 変位で LP によって適用されるフォースのマグニチュードを計算するため使用することができます測定するカンチレバーの剛性ことができます。力校正ファイルには、点のセットが含まれていますEquation 20、 Equation 21 FODS 平均出力電圧 1000 Hz のサンプリング レートでの測定を 100 以上の撮影は、 Equation 22 100 の関連付けられている標準偏差は、電圧測定、 Equation 23、LPT の重みによって加えられた力をおよびEquation 24使用される校正重みの数です。校正ウェイトは、最初のポイントはゼロの測定よりも 2 つのポイントがあることを確認の適用力と力の 2 点目だけでワイヤー フック。

最後に、曲げテスト ファイルを使用して、計算するEquation 14、 Equation 13 。ポイントのセットが含まれていますEquation 25、 Equation 26 FODS 平均出力電圧 1000 Hz のサンプリング レートでの測定を 100 以上の撮影は、 Equation 27 100 電圧測定の標準偏差を関連付けられているEquation 28は、 Equation 5-軸ステージ位置とEquation 29の番号は、r 曲げ試験における変位手順を実行段階。

最初、Equation 5力校正中に LPT の位置のコンポーネントEquation 30、セットを使用してあるEquation 31マップにEquation 21に値Equation 32線形補間を用いた値。Equation 5 LPT 変位のコンポーネントによって与えられるEquation 33、 Equation 34 。片持梁、関係の長さと比較して LPT 変位が小さいのでEquation 23とEquation 35線形が表示されます。したがって、カンチレバーの剛性は適合する線で計算できる、Equation 36データと、斜面をコンピューティングEquation 37。代表的な一連の点Equation 36とその対応する近似直線図 6A。曲げ実験で使用される片持梁の剛性は 90.6 ± 0.3 N/m。

Figure 6
図 6: 三点曲げ試験の代表の結果(A) 力と変位データ (グレー) カンチレバーの剛性の推定に使用される線形フィット (ブルー) と共にプロトコルの手順 2で取得しました。(B) 電圧変位の補間出力ファイルに含まれるデータの代表例です。測定対象の出力電圧、 Equation 51 、ステージの位置Equation 52、線形補間を介して取得することができます。これはカンチレバーの変位を測定するために使用されますEquation 50、曲げテストします。(C) 代表的な力-変位応答 3 異なる大腸菌 aspergillumの成功 3 点曲げ試験から骨片を固定します。失敗の 3 点曲げ試験から (D) の力-変位応答。曲線の非線形性かことを示します、スピキュールだった正しくサンプル ステージの上に座ってと下落した後の最初の接触は、LPT、向きを変えます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

次、Equation 5曲げテスト中に LPT の位置のコンポーネントEquation 38、セットを使用してあるEquation 31マップにEquation 26に値Equation 39線形補間を用いた値。Equation 5曲げ試験における LPT 変位のコンポーネントによって与えられるEquation 40、 Equation 41 。Equation 5によって与えられる曲げ試験における段階変形成分Equation 42。

Lpt ポートと、スピキュール曲げ試験、骨片変位の全体中に接触しているのでEquation 43によって与えられる

Equation 44(1)

LPT、によって適用されるフォースとEquation 45、

Equation 46(2)

セットから注意することが重要ですEquation 31の両方を取得するために使用Equation 32とEquation 39の値、値の補間による、Equation 47とEquation 26の範囲内である必要がありますEquation 16。これは、手順 2、 4 5プロトコルの開始電圧の適切な値と高電圧ストップ値を設定することにより実現します。

図 6Cは、3 つの代表的な骨片の力-変位曲線を示しています。細長い、線形弾性構造物 3 点曲げ、Equation 13と直線的に増加する予定ですEquation 14の値が小さいEquation 14 30。非線形性、 Equation 13 -Equation 14小さな曲線Equation 14(例えば図 6D参照) 通常、スピキュール可能性がありますいないが正しく装着されている試料ステージ上を示唆しています。この場合、テストを停止する必要があり、スピキュールがサンプル ステージ (プロトコルの手順 3.6 ) に移動しました。

十分な精度を確保するために、Equation 13とEquation 14測定、曲げ試験のコース上の総電圧変更Equation 48、少なくとも 1 V にする必要があります。多くの準拠のカンチレバーが se をする必要があります合計電圧変動が 1 V 未満の場合報道。

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Discussion

プロトコルのいくつかの手順は、力と変位を正確に測定を確保するため特に重要です。いくつかの重要な手順はすべて 3 点曲げ試験に普遍的なこの機械のテスト装置に固有のものです。

LP ミラーがきれい、傷の検査プロトコルの手順 1.2とステップ 1.6プロトコルの「FODS ゲインを設定します。ゲインの手順 2、 4、および5プロトコルのために一定する LP ミラー反射率が重要です。この理由から、2 つの校正手順 (ステップ 2と4のプロトコル) は曲げ試験 (プロトコルの手順 5 ) の直前に実行してください。

1.9 の手順とプロトコルの3.7のステージは、アイソレーション テーブル上の表面に対して平準化します。これらの手順は、Equation 2骨片の長手方向軸線に垂直な力のコンポーネントは。機械試験装置のフレームは、片持ち梁、LP ミラー、および、対象の表面がすべて免震テーブルの表面に平行を製造されています。これは、力センサー、力と変位の分離のテーブルの表面に垂直のコンポーネントを測定することを意味します。ステージの上は角度でずれているかどうかEquation 53アイソレーション テーブル上の表面に対して、LPT の測定された変位になりますEquation 55、Equation 54に垂直な方向の実際の変位は、骨片の長手方向軸線 (図 7参照)。以来、 Equation 56 、この結果で応用力の予測と方程式(1) と (2) あたりの骨片変位の予測の下で。

Figure 7
図 7: 変位計測結果に平準化の段階の効果。(A)、ステージが斜めに傾いているEquation 53、アイソレーション テーブル上の面とカンチレバーの下。(B) 垂直方向の LP の変位Equation 50(図 1 (D) を参照) が、対象によって測定されます。スピキュールの軸に垂直な方向の LP 変位のコンポーネントは、 Equation 54 。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

手順 5.1-、lpt ポートはプロトコルの5.3では、海溝のスパンにわたって途中が配置されます。半ば範囲に関して LPT のずれは、実際には31,32よりも硬めに表示される標本になります。つまり、骨片の変位が同じ力が中間スパンに適用された場合に測定するだろうよりも小さくなります。ずれのこのタイプはないステージ ベース プレートからステージを削除するか、 xを調整することによって避けることができる-軸ステージ位置中心の手順が完了 (手順 5.1- プロトコルの5.3 )。

このメソッドの制限の 1 つは力と変位測定の相対測定不確かさを減らすためにカンチレバーの剛性が選択されること FODS 出力電圧曲げ中 4.5 に 1.8 V の全範囲にまたがって、テストします。しかし、この電圧範囲で、ほぼ骨片変位と同じ (図 6 (C) 参照) に失敗するまでちょうど約 ≈250 μ m の片持ち梁の変位に対応します。これは、カンチレバーと、スピキュールに似たような剛性があることを意味します。これは弾性応答と、骨の強度を測定する問題ではない、それはスピキュールの靱性特性の正確な測定を妨げるもの。これは、靭性特性の正確な測定を確保するために、スピキュールの亀裂は33の制御された方法で反映する必要があるためにです。通常、これはテスト デバイスが標本33より硬い場合のみ可能です。試験装置の剛性を高めるためより高感度変位センサー、FODS の代わりにされる可能性があります。

E. aspergillumスピキュールに曲げテスト プロトコル実験を行った、機械的試験装置その他の LBBSs と同様の合成材料の 3 点曲げ試験を実行する使用できます。この機械のテスト装置は 0.01 から 1 mm 微細溝断面直径範囲は、範囲 1 から 10 mm までの標本に最適です。大きい直径サンプル ステージは、試料ステージ上ロールことはできませんので、再設計する必要があります。これは段階の表面の粗さ試験片の圧延を防ぐために十分であるので、骨片のようなより小さい繊維のための問題ではありません。トレンチ端部および LPT の半径も大きい標本のサポートされている31,32点でローカルの損傷を防止するため作られたする必要があります。さらに、プレートを平準化ステージはステージ ベース プレートに固定する必要があります (図 4Aを参照してください) ステージ傾斜力が ≈1 を超える場合を防ぐために、プロトコルの3.7 のステップの後 ¼"-20 ソケット ヘッド キャップ ネジを使用して (名)

高精度な力と変位の測定は、カンチレバーの剛性がフレームの剛性 (≈107 N/m) よりもはるかに小さい、常に。この制限によって、≈ 25 n このデバイスによって適用することができます最大の力その結果、標本はこのデバイスを使用して、テストを実行することができる場合は、曲げテストを実行する前に耐えることができます最大の力を推定することが重要です。

この作業は、プロトコル、技術的な図面を提供します (を参照してください補足ファイル 1)およびソフトウェア (サプルメンタリ コード ファイルを参照してください)、再生して、私たちの機械式試験装置を使用して。これはうまくいけば多くの異なる LBBSs の曲げ性状を正確に測定するためのプラットフォームを提供します。これらの測定 LBBS のアーキテクチャとその機械的性質の関係のより深い理解を開発するための前提条件であります。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この作業は [材料力学と構造プログラム、付与数 1562656]; 国立科学財団によって支えられました。機械エンジニア [Haythornthwaite 若手研究者賞] のアメリカの社会。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TMC 36" x 48" isolation table with 4" CleanTop breadboard TMC 63-563 Isolation Table
Diffeential Screw Adjuster Thorlabs DAS110 For stage leveling plate
1" Travel Micrometer Head with 0.001" Graduations Thorlabs 150-801ME For stage leveling plate
Right-Angle Bracket for PT Series Translation Stages, 1/4"-20 Mounting Holes Thorlabs PT102 For microscope mount
1" Dovetail Translation Stage, 1/4"-20 Taps Thorlabs DT25 For microscope mount
1" Translation Stage with 1/4"-170 Adjustment Screw, 1/4"-20 Taps Thorlabs PT1B For microscope mount
12" Length, Dovetail Optical Rail Edmund Optics 54-401 For microscope mount
2.5" Width, Dovetail Carrier Edmund Optics 54-404 For microscope mount
0.5" Width, Dovetail Carrier Edmund Optics 54-403 For microscope mount
InfiniTube Mounting C-Clamp with ¼-20 Edmund Optics 57-788 Microscope component
Standard (with no In-Line Attachment), InfiniTube Edmund Optics 56-125 Microscope component
Standard In-Line Attachment (Optimized at 2X-10X), InfiniTube Edmund Optics 56-126 Microscope component
Mitutoyo/Achrovid Objective Adapter (M26 to M27) Edmund Optics 53-787 Microscope component
5X Infinity Achrovid Microscope Objective Edmund Optics 55-790 Microscope component
0.316" ID, Fiber Optic Adapter SX-6 Edmund Optics 38-944 Microscope component
¼" x 36", Flexible Fiber Optic Light Guide Edmund Optics 42-347 Microscope component
115V, MI-150 Fiber Optic Illuminator w/IR Filter and Holder Edmund Optics 55-718 Microscope component
Allied Vision Manta G-223 2/3" Color CMOS Camera Edmund Optics 88-452 Microscope component
Power Supply for Manta/ Guppy Pro/ Stingray/ Pike Edmund Optics 68-586 Microscope component
1/4" Travel Single Axis Translation Stage Thorlabs MS1S FODS micrometer
Analog Reflectance Dependent Fiber Optic Displacement Sensor Philtec D20 FODS
30V, 3A DC Power Supply Agilent U8001A Power supply for DAQ and FODS
14-Bit, 48 kS/s Low-Cost Multifunction DAQ National Instruments USB-6009 DAQ for FODS
Three Axis Motorized Translation Stage Thorlabs Thorlabs T25 XYZ-E/M Translation stage
T-Cube DC Servo Motor Controller Thorlabs TDC001 Motor controller for stage
T-Cube Power Supply Thorlabs TPS001 Power supply for motor controller
National Instruments LabVIEW (2013 SP1) National Instruments Used for running software
National Instruments LabVIEW Vision Acquisition Software (2016) National Instruments Used for running software
Nikon Eclipse Ci-POL Main Body MVI MDA96000 Polarized light microscope
Nikon Pi Intermediate Tube with Analyzer Slider MVI MDB45305 Polarized light microscope
Nikon Dia-Polarizer MVI MDN11920 Polarized light microscope
Power Cord - 7'6" MVI 79035 Polarized light microscope
Nikon P-Amh Mechanical Stage MVI MDC45000 Polarized light microscope
Nikon Lwd Achromat Condenser MVI MBL16100 Polarized light microscope
Nikon LV-NBD5BD-CH Manual Quint Nosepiece ESD MVI MBP60125 Polarized light microscope
Nikon C-TF Trinocular Tube F MVI MBB93100 Polarized light microscope
Nikon CFI 10X Eyepiece FN 22mm NC MVI MAK10110 Polarized light microscope
Nikon TU Plan Flour BD 10x Objective MVI MUE42100 Polarized light microscope
Venus Flower Basket Sponge Denis Brand N/A Sponge skeleton
3.5X Headband Flip-Up Magnifier McMaster Carr 1490T5 Used for spicule sectioning
Ø1" Silicon Wafer, Type P / <100> Ted Pella 16011 Used for load point mirror
Low Lint Tapered Tip Cotton Swab McMaster Carr 71035T31 Used for cleaning LP mirror
Rubber grip precision knife McMaster Carr 35575A68 Used for sectioning spicules
Microscope Slides, frosted end, 75 x 25 x 1mm Ted Pella 260409 Used for sectioning spicules
Sable Brushes, #00000, 0.08mm W x 4.0mm L Ted Pella 11806 Used for handling spicules
PELCO Pro High Precision Tweezers, extra fine tips, superior finish Ted Pella 5367-5NM Used for handling spicules
Dual Axis Linear Scale Micrometer Edmund Optics 58-608 Used for calibrating the microscopes
FLEX-A-TOP FT-38 CAS ESD Plastic Containers FT-38-CAS Used for storing spicules
Plastic Vial Bullseye Level McMaster Carr 2147A11 Used for leveling the stage
Analytical Balance Mettler Toledo MS105DU Used to mass calibration weights

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