Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Pentylenetetrazole-induceret Kindling musemodel

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/56573
Automatic Translation
1, 1
1Synaptic Plasticity Project, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science

Summary

Denne protokol beskriver en metode til kemisk kindling med pentylenetetrazole og giver en musemodel af epilepsi. Denne protokol kan også bruges til at undersøge sårbarhed over for beslaglæggelse induktion og patogenese efter epileptiske anfald hos mus.

Abstract

Pentylenetetrazole (PTZ) er en GABA-A receptor antagonist. En intraperitoneal injektion af PTZ i dyrets inducerer et akut, alvorlig anfald på en høj dosis, mens sekventiel injektioner af en subconvulsive dosis har været brugt til udvikling af kemiske pindebrænde, en epilepsi model. En enkelt lavdosis injektion af PTZ inducerer en mild beslaglæggelse uden Krampetrækning. Dog sænke gentagne lavdosis injektioner af PTZ tærsklen for at fremkalde en krampagtig beslaglæggelse. Endelig, kontinuerlig lavdosis administration af PTZ inducerer en svær tonisk-kloniske anfald. Denne metode er simpel og bredt anvendelig at undersøge Patofysiologi af epilepsi, der defineres som en kronisk sygdom, der involverer gentagne anfald. Dette kemikalie kindling protokol forårsager gentagne anfald hos dyr. Med denne metode, blev det anslået sikkerhedsrisiko til PTZ-medieret anfald eller graden af forværring af epileptiske anfald. Disse fordele har ført til brugen af denne metode til screening af anti-epileptisk medicin og epilepsi-relaterede gener. Desuden, har denne metode været brugt til at undersøge neuronal skade efter epileptiske anfald, fordi de observerede i hjernen hos epileptiske patienter histologiske ændringer vises også i hjerne kemikalie-optændt dyr. Denne protokol er således nyttigt for bekvemt producerer animalske modeller af epilepsi.

Introduction

Epilepsi er en kronisk neurologisk lidelse, der er karakteriseret ved tilbagevendende anfald og påvirker ca 1% af befolkningen. De underliggende mekanismer for epileptogenesis og beslaglæggelse generation i epilepsi patienter kan ikke fuldt afklaret i kliniske undersøgelser. En passende dyremodel er derfor påkrævet for studiet af epilepsi1.

En række dyremodeller for epilepsi har været brugt til at undersøge fysiologi af epilepsi og identificere anti-epileptisk medicin2,3. Blandt disse modeller er farmakologiske beslaglæggelse induktion en fælles metode til at generere en dyremodel for undersøgelse af patologi af epilepsi4. Denne metode er billig og simpel. Elektrode-medieret kindling er også et almindeligt anvendte metode, men omkostningerne ved denne procedure er højere, og metoden kræver kirurgisk og elektriske færdigheder til at fremkalde gentagne anfald5.

Farmakologiske induktion er også en fordel fordi timingen og antallet af beslaglæggelser styres nemt. Genetiske musemodeller, der udviser spontane anfald er også brugt i studiet af epilepsi. Forudsige, hvornår og hvor ofte anfald opstår i disse genetiske modeller kan dog være umuligt6. Et overvågningssystem er forpligtet til at overholde de epileptiske opførsel af genmodificerede mus6.

Kainic syre, pilocarpin og pentylenetetrazole (PTZ) er almindeligt anvendt som beslaglæggelse-inducerende lægemidler7. Kainic syre er en agonist for glutamat receptorer, og pilocarpin aktiverer kolinerge receptorer. PTZ er en gamma aminosmørsyre (GABA)-en receptor antagonist8. PTZ undertrykker funktionen i hæmmende synapser, hvilket fører til øget neuronal aktivitet. Denne forordning medfører generaliserede anfald i dyr9. En enkelt injektion af kainic syre og pilocarpin kan fremkalde akut anfald, især status epilepticus (SE)10,11 og kainic syre - eller pilocarpin-medieret SE fremmer kronisk spontan og tilbagevendende anfald12 , 13. electroencephalographic (EEG) optagelser og opførsel analyse har indikeret, at spontan tilbagevendende anfald er observeret en måned efter en enkelt injektion12,13. En enkelt injektion af en krampagtig dosis af PTZ inducerer også akut anfald. Kronisk spontane anfald efter en enkelt injektion af PTZ er imidlertid vanskeligt at fremme. Kronisk indgift af PTZ er forpligtet til at fremkalde gentagne anfald14. I enten metode er generation af gentagne anfald stand til at fremkalde en patologi mere svarer til menneskelige epilepsi end generation af akut anfald. I tilfælde af PTZ, hver injektion fremkalder en beslaglæggelse og beslaglæggelse sværhedsgraden bliver mere alvorlig i en trinvis måde med hver injektion. Endelig, en enkelt lavdosis PTZ injektion inducerer en svær tonisk-kloniske anfald. I denne fase fremkalder hver injektion svære anfald. Hertil kommer, ændrede beslaglæggelse ventetid og varighed også løbet af injektionerne. Ventetid til tonic beslaglæggelse bliver ofte kortere i den sidste fase af pindebrænde15. Derudover er beslaglæggelse forværring ledsaget af en langvarig beslaglæggelse varighed16. Undersøger den molekylære mekanisme regulering beslaglæggelse sværhedsgraden, er ventetid og varighed nyttig for screening anti-epileptisk medicin17,18,19.

Anfald er almindeligt fremkaldt af en enkelt systemisk administration af PTZ, og opsvinget er meget hurtig, inden for 30 min.4,5. Således er er antallet af beslaglæggelser mere kontrollerbar i PTZ-kindling model. Dog har EEG overvågning tilkendegivet at generaliseret pigge kan ses op til 12 h efter PTZ-medieret beslaglæggelse20. Dyr bør derfor helst forblive under observation i 24 timer efter myoklon eller tonic beslaglæggelse21 for nærmere analyse af kindling mekanismer.

Administration af anti-epileptisk medicin, såsom ethosuximid, valproat, phenobarbital, vigabatrin og retigabine3, før eller efter PTZ injektion afbøder forværring af beslaglæggelse sværhedsgrad3,22, 23. Ligeledes har knockout mus, manglende gener involveret i beslaglæggelse forværring, såsom matrix metalloproteinase-924, FGF-2225 og neuritin26, vist sig at udstille reduceret beslaglæggelse sværhedsgraden efter flere PTZ injektioner. Desuden observere histopatologiske forandringer efter epileptiske anfald er muligt med denne metode. Hos patienter med FLE er der typiske histologiske forandringer i hjernen, såsom mossy fiber spiring27,28, unormal granulet neuron migration29, astrogliosis30, neuronal celle død i hippocampus31,32, og hippocampus sklerose33. Lignende ændringer er observeret i epileptiske model dyr. Blandt de tilgængelige metoder er PTZ-medieret kemiske kindling en god, reproducerbare og billig metode til at producere en dyremodel af epilepsi. I en pilocarpin-medieret SE model, beslaglæggelse kontrol er vanskelig og mange mus dør eller undlader at udvikle SE34. Derimod er dødelighed og beslaglæggelse sværhedsgraden mere kontrollerbar i modellen PTZ. Derudover PTZ er billigere end kainic syre, og færdigheder i mus hjerneoperation er ikke påkrævet for drug administration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af Animal Care og brug Udvalget af de Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science. Postnatal 8 - 16 uger gamle mus er anbefalet. Enhver indavlet stamme er acceptabelt for eksperimentet. C57BL/6 mus er mere modstandsdygtige over for PTZ, der henviser til, at BALB/c og schweiziske albino mus er mere følsomme over for PTZ. C57BL/6 blev brugt i denne undersøgelse. Sårbarhed over for PTZ afhænger også af alder af musen. Sammenlignet med yngre mus, er ældre mus mere refraktære over for PTZ35. Antallet af dyr, der anvendes for denne metode kan variere, men mindst 6-10 dyr er påkrævet for hver betingelse.

1. forberedelse af PTZ

  1. Opløs 2 mg/mL PTZ i steril 0,9% (w/v) NaCl. Forberede PTZ dag af brug.

2. indsprøjtning af PTZ

  1. Udføre alle eksperimenter mellem 9:00 am og 12:00 p.m. (middag).
  2. Mål dyrets legeme last.
  3. Placere dyret i en observation kammer for tilvænning.
  4. Perioden tilvænning (3 min), beregne mængden af PTZ injektionsvæske på kropsvægt af dyret og tidligere beregnede injektion dosis.
    Bemærk: For eksempel, når 35 mg/kg PTZ bruges, 0,875 mg af PTZ er nødvendig for en mus vejer 25 g (35 mg / kg x 0,025 kg = 0,875 mg). Derfor 437.5 μL af 2 mg/mL PTZ opløsning skal injiceres (0,875 mg/2 mg / mL = 0.4375 mL). Injektion dosis af PTZ afhænger af musen genotype og stamme. Wild-type C57BL/6 mus anbefales en dosis på 30-35 mg PTZ/kg kropsvægt for den første retssag. Følsomhed over for PTZ afhænger mus stamme bruges36,37. Injektion dosis varierer afhængigt af formålet med forsøget.
  5. Injicere PTZ intraperitoneal med en 1-mL sprøjte knyttet til en 27-gauge kanyle ind i den venstre eller højre kvadrant af maven af dyret. Undgå indsprøjtning på midterlinjen.
    1. Undgå gentagne injektioner på samme position.
  6. Observere animalsk opførsel for 30 min efter PTZ administration (figur 1A), og klassificere og score den unormale adfærd som vist nedenfor. Hvis det er muligt, holde dyr under observation for 24 h eller i det mindste en yderligere 6-10 h efter injektion, især når beslaglæggelse sværhedsgraden score når 3 eller derover.
    1. Bemærk nogen milde anfald eller adfærdsmæssige ændringer i dyr ud over 30-min observationsperioden. Dette langvarig observation periode kan omhandle et særdeles vigtigt og komplet effekt af en subconvulsive dosis af PTZ i generation af kronisk uprovokerede epileptiske anfald.
    2. Derudover foranstaltning beslaglæggelse varighed hver observerede beslaglæggelse som ændringer i beslaglæggelse varighed relaterer til beslaglæggelse sværhedsgraden. Derudover er ventetid til den første anfald efter PTZ-injektion en anden vigtig foranstaltning til at indsamle. Overvågning af beslaglæggelse frekvens, varighed og ventetid er afgørende for enhver post beslaglæggelse molekylære undersøgelser.
  7. Injicere PTZ hver anden dag (figur 1A). Antallet af injektioner afhænger af formålet med forsøget. Repræsentative eksempler er som følger.
    1. For at generere fuldstændig optændt dyr, når et dyr, der oplever en beslaglæggelse med en score på 5 (tonisk-kloniske anfald), færdig injektion i yderligere tre administrationer. I dette tilfælde øge injektion dosis hvis beslaglæggelse score ikke øger for tre på hinanden følgende administrationer. Hvert dyr kan modtage et andet antal og dosis af PTZ injektioner.
    2. Lave antal og dosis af PTZ injektion i hver stand til at vurdere sårbarheden til PTZ, herunder i vurderinger af anti-epilepsi narkotika og undersøgelser af Fænotypen af genmodificerede mus. Give alle dyr det samme antal PTZ injektioner; ialt 8 til 12 injektioner anbefales. Hvis et dyr dør, burde beslaglæggelse score være betegnet som 6.
    3. Bestemme injektion dosis nødvendig for at opretholde en høj beslaglæggelse score (4 eller 5) for 10 eller flere injektioner at studere de histopatologiske forandringer, der sker epileptiske anfald. I dette tilfælde bør samlede injektion antallet spænder fra 25 til 30. Formindske injektion dosis, hvis beslaglæggelse score når 5. Hvis beslaglæggelse score falder til 3 eller lavere, øge injektion dosis.

3. beslaglæggelse Score

  1. Observere den animalske opførsel og registrere scores.
    1. Klassificere og score de epileptiske adfærd som følger38,39 (figur 1B):
      0: normal opførsel, ingen abnormitet.
      1: immobilisering, liggende på maven.
      2: hovedet nikkende, facial, forelimb eller hindlimb myoklonus.
      3: løbende hele kroppen myoklonus, myoklon jerks, hale holdt op stift.
      4: opdræt, tonic beslaglæggelse, falder ned på sin side.
      5: tonisk-kloniske anfald, falder ned på ryggen, vilde farende og hoppe.
      6: døden.
  2. Ændre de adfærdsmæssige kriterier baseret på Racine score40, alt efter de eksperimentelle betingelser.

4. efter beslaglæggelse analyse

  1. Immunohistopathological analyse
    1. Perfusion fiksation
      1. Forberedelse
        1. Opløses 4% (w/v) PARAFORMALDEHYD (PFA) i 0,1 M fosfat-buffer (pH 7,4). Varme løsning på ca. 70 ° C med tilsætning af en dråbe af 1 M NaOH (ca 1 µL 1 M NaOH til 50 mL PFA løsning).
        2. Forberede iskold 4% PFA og fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
        3. Oprette en peristaltisk pumpe med en tube og nål. Køre ca. 20 mL vand gennem røret at rydde rester. Anbring den åbne ende af røret i iskold PBS.
      2. Transcardial perfusion og forberedelse af faste hjernen
        1. Dybt bedøver mus med 50% isoflurane/50% ethanol i en lille krukke.
        2. Hold musen i en liggende stilling ved fastgørelse tips af deres forbens og hindlimbs.
        3. Skær den ventrale midterlinjen af maven og udsætte mellemgulvet.
        4. Skær mellemgulvet langs de kystnære margen. Derefter skæres begge laterale sider af ribben og krop. Knivspids formet som et sværd proces af låsning pincet og evert brystkassen. Opretholde placeringen af formet som et sværd proces ved at fastgøre det med en nål eller klemme det med pincet. Udsætte hjertet.
        5. Indsætte nålen ind i venstre hjertekammer og gøre et snit i højre atrium ved hjælp af saks. Vær opmærksom på ikke at skubbe nålen for langt ind i hjertet, som det kan gennembore en indervæg.
        6. Begynde en lind strøm af iskold PBS gennem nål til at vaske ud blod (ca 15-20 mL/min).
        7. Når blodet er blevet fjernet fra kroppen, flytte røret til en 4% PARAFORMALDEHYD løsning (ca. 60 mL) uden tilsætning af bobler. Så, stop perfusion.
        8. Skære bag nakken og rygsøjlen og skrælle hoved huden og den dorsale del af kraniet med dissekere saks.
        9. Skær den premaxillary knogle mellem øjet baner og helt fjerne den dorsale del af kraniet.
        10. Oprette en kløft mellem hjernen og jugal knoglen fra den bageste side og skære trigeminus nerver og optiske chiasm nedenunder hjernen. Forsigtigt fjerne hjernen og placere den i et hætteglas indeholdende 4% PFA. Post løse hjerne ved 4 ° C i 12-16 h.
    2. Hjernen skive forberedelse
      1. Overfør faste hjernen til 20% saccharose/PBS indtil hjernen synker i løsning at give mulighed for cryoprotection.
      2. Skær fast hjernen baseret på den krævede Skive orientering og nødvendig del af hjernen.
      3. Angiv cryomicrotome. Sæt klingen i position og fastholde mikrotomen fase ved en temperatur under-20 ° C.
      4. Placer pre-cut hjernen på scenen og pels hjernen med 20% saccharose/PBS. Saccharose/PBS løsning vil gradvist fryse, der dækker hjernen på scenen, før hjernen er helt integreret i frosne 20% saccharose/PBS.
      5. Skær hjernen (30 µm tykkelse) ved at skubbe klingen gennem væv. Overføre skiver til PBS og holde dem ved 4 ° C.
    3. Fluorescerende Immunohistokemi
      1. Vaske de nødvendige skiver i 0,1% Triton X-100/PBS (PBST) i 10 min, 3 gange ved stuetemperatur (RT).
      2. Blokere skiver af inkubere dem i PBST med 2% ged serum eller 5% bovint serumalbumin (BSA) i 1-2 timer ved RT.
      3. Inkuber udsnittene i et antistof løsning med den passende koncentration af primære antistof i PBST med 2% ged serum eller 5% BSA til 1-7 overnatninger på 4 ° C.
      4. Vask skiver i PBST i 10 minutter, 3 gange på RT.
      5. Inkuber skiver i en sekundær antistof løsning med den passende koncentration af sekundær antistof i PBST for 1-2 h i RT, lys-beskyttet.
      6. Montere skiver på glas dias og dække med montering medium og dækslet glas.
      7. Observere skiver med Fluorescens mikroskopi.
  2. Tre-kammer test
    1. Forberedelse
      1. Forbered mindst 2 2-6-måned-forhenværende 129/Sv mus af samme køn som emne mus til at være "fremmed musen." Habituate alle mus i bur inden analysen. For hvert træningspas, placere musen i buret og lade musen i 15 min.
      2. Før hver tilvænning fase med emnet mus, rense hele apparatet og begge bure ved at tørre overfladen med 70% ethanol.
      3. Placer de tomme bure i to side kamrene af apparatet 3-kammer og åbne døre mellem afdelingerne.
      4. Habituate emne mus, placere et emne mus i midten kammer og tillade mus frit flytte hele apparatet, indtil musen har undersøgt både bure, plus en yderligere 5 min. emne dyr, der kan være bange for buret ikke undersøge bur i 20 min. og bør ikke bruges til denne analyse. Sådanne dyr undgå buret og sjældent komme tæt på buret.
      5. Når dyret bevæger sig ind i center kammeret, lukke dørene og lade musen flytte frit i midten kammer i 5 min. I denne periode, skal du sætte en af 129/Sv mus i et bur til habituate til buret.
    2. Socialitet analyse
      1. Foretage denne analyse umiddelbart efter perioden tilvænning af emnet musen.
      2. Placer buret indeholdende en 129/Sv mus, kaldet "fremmed 1 buret", i en af side kamrene og placerer den tomme bur, betegnes "objekt buret", i anden side kammeret.
      3. Åbne døren og overvåge opførslen af emnet musen.
      4. Tillad emne musen til at flytte frit i 10 min og registrere følgende adfærdsmæssige parametre. Hvis emnet musen er bange for musen i fremmed 1 bur, som angivet af mus undgå fremmede 1 bur og resterende i hjørnet af en af afdelingerne, bør dyret ikke anvendes til analyse.
        a) tid tilbragt i hver afdeling, fremmed 1 kammer, objekt kammer og center afdeling.
        b) tid brugt undersøger hvert bur, fremmed 1 bur og objekt bur. (Musen er klassificeret som undersøger buret, hvis musen snuse eller toughing den mus eller bur)
        c) antallet indgange i hvert kammer (valgfri)
        d) samlet distance tilbagelagt (valgfri)
      5. Når musen flyttes ind i midten kammer, lukke dørene.
    3. Sociale nyhed analyse
      1. Foretage denne analyse umiddelbart efter socialitet analyse.
      2. Tør både bure med 70% ethanol.
      3. Placer en anden 129/Sv mus i et af de bure, kaldet "Fremmed 2 buret" og sted fremmed 2 bur i en af afdelingerne. Placere fremmed 1 musen i andre buret, kaldet "fremmed 1 buret", og placere fremmed 1 bur i andet kammeret.
      4. Åbne døren og overvåge opførslen af emnet musen.
      5. Tillad emne musen til at flytte frit i 10 min, og måle samme adfærdsmæssige parametre for socialitet analyse.
        Bemærk: Stranger 1 og fremmed 2 mus bør valgt tilfældigt. Fremmed 1 kammer og objekt salen samt fremmed 1 kammer og fremmed 2 kammer bør fastsættes tilfældigt.
  3. Kontekstuelle frygt forskelsbehandling
    1. Aircondition
      1. Før hver conditioning retssag, rense den eksperimentelle apparater ved at tørre overfladen med 70% ethanol.
      2. Placere en mus i en conditioning apparater med specifikke betingelser (apparater form, vægfarve, gulvet materiale, lugt, belysning og baggrund støj volumen skal være forudbestemt). For eksempel var den conditioning apparater, der anvendes her en firkantet apparater med klare plexiglas vægge, et metal gitter gulv, ethanol lugt, 100 lux lysstyrke og hvid 65-dB baggrundsstøj.
      3. Betingelse musen ved mund-chok med pseudo-tilfældige timing af 0,1-mA elektriske stød for 2 s x 3 gange i løbet af 5 min.
      4. Returnere musen til hjem buret efter konditionering.
    2. Hukommelsesvurderingen
      1. Før hver vurdering, rense den eksperimentelle apparater ved at tørre overfladen med 70% ethanol.
      2. Den næste dag følgende conditioning, placere musen i den samme apparatur som chok tilstand og måle den frysning tid i løbet af 5 min.
      3. Senere samme dag, placere musen i en roman apparater og måle den frysning tid under en 5-min vurdering. En trekantet apparater med hvid plexiglas vægge, plate sal, ingen lugt, 30 lux lysstyrke og 70-dB hvid støj blev brugt her.
      4. Sammenligne det frysning tid mellem samme betingelse og roman tilstand. Mus med en normal hukommelse evne vil fryse flere i den samme tilstand end i den nye tilstand. Nedfrysning er defineret immobilitet af dyr for mere end 2 s.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gentagen injektion af PTZ inducerer en stigning i beslaglæggelse sværhedsgrad. Seks C57BL/6 mus blev behandlet med PTZ, og en anden 6 mus blev behandlet med saltvand som en kontrolgruppe. PTZ dosis var 35 mg/kg, og 10 indsprøjtninger blev administreret. Beslaglæggelse score gradvist steget med PTZ injektioner, mens ingen anfald eller unormal adfærd var fremkaldt af saltvand indsprøjtninger (figur 2). ANOVA efterfulgt af Bonferroni test viste en betydelig forskel mellem den PTZ-behandlede gruppe og gruppen saltvand-behandlet.

Gentagne anfald fremmer afvigende cytoskeletale gren dannelse (mossy fiber spiring) og unormale migration af granulet cellerne i hippocampus. Mus blev behandlet med PTZ for 25 injektioner (dosis blev justeret mellem 24 mg/kg og 35 mg/kg til at opretholde alvorlige beslaglæggelse i mus uden inducerende dødsfald forårsaget af en alvorlig anfald). Musen hjerner var fast 3 uger efter den sidste injektion. Kontrol hjerner blev fastsat før PTZ injektioner. Hjernen skiver var immunostained med anti-synaptoporin (x 500) og anti-ZnT3 (x 500) antistoffer til at observere mossy fiber spiring (figur 3A) og anti-doublecortin antistoffer (x 200) at observere den unormale migration af granula celler ( Figur 3A). Mossy fiber spiring i granulet cellelag blev observeret i PTZ-behandlede skiver (figur 3A). Nyfødte granula celler, som er immunoreaktive for doublecortin, blev observeret i hilus i PTZ-behandlede skiver (figur 3A). Granulet cellelag og hilus vist i figur 3A er illustreret i figur 3B.

Gentagne anfald også forringe normal opførsel af mus. Tolv C57BL/6 mus blev behandlet med PTZ (35 mg/kg, 10 indsprøjtninger), og en anden 12 mus blev behandlet med saltvand som en kontrolgruppe. To uger efter den sidste injektion, blev musene analyseret i en 3-kammer test (figur 4A) og kontekstuelle frygt forskelsbehandling test (figur 5A). PTZ-behandlede mus viste normale socialitet (figur 4B). Musene brugt mere tid i fremmed 1 salen end i objektet kammer (saltvand: p = 0,003, PTZ: p = 0,027) og undersøgt fremmed 1 buret mere end de undersøgte objekt bur (saltvand: p = 0,009, PTZ: p = 0,004). Men PTZ-behandlede mus viste unormal social nyhed (figur 4 c) vejledende svækket sociale hukommelse. Control mus tilbragte mere tid i fremmed 2 kammeret end i fremmed 1 kammer og undersøgt fremmed 2 buret mere end de undersøgt fremmed 1 bur, mens de kindled mus ikke viste nogen signifikant forskel i tid tilbragt i afdelingerne eller tid brugt undersøge bure (tid i salen: saltvand: p = 0,006, PTZ: p = 0.126. Tid undersøge: saltvand: p = 0,002, PTZ: p = 0,426). PTZ-behandlede mus viste også nedsat hukommelse i den kontekstuelle frygt test (figur 5B). Styre mus viste en længere frysning tid i chok tilstand end i den nye tilstand, mens PTZ-behandlede mus ikke viste nogen signifikant forskel i frysning tid (saltvand: p < 0,001, PTZ: p = 0.060). Uparret t-test blev gennemført til statistiske analyser.

Figure 1
Figur 1: kort beskrivelse af protokollen. (A) skematisk illustration af PTZ-medieret kindling. (B) illustrationer af repræsentative animalsk opførsel for respektive beslaglæggelse scores. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: vurdering af krampagtig opførsel. Betyde beslaglæggelse scores er angivet i grafen. Seks mus blev brugt i hver tilstand, og en række indsprøjtninger blev udført. Efter hver injektion, blev beslaglæggelse scores overvåget og scorede. Sammenlignet med saltvand indsprøjtninger, PTZ injektioner betydeligt øget beslaglæggelse sværhedsgraden (p < 0,001: gentaget foranstaltninger ANOVA). Hver beslaglæggelse score er vist som gennemsnit ± SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: PTZ-medieret mossy fiber spirende og unormal migration af granula celler. (A) maksimale forventede immunhistokemiske billeder af hilus, granulerende lag og molekylære lag af hippocampus skiver af mus før kindling (venstre) og efter kindling (til højre). Anti-synaptoporin (øverst) og anti-ZnT3 antistoffer (midten) blev brugt til at visualisere axoner af granulet neuroner (mossy fibre). Anti-doublecortin antistof blev brugt til at visualisere nyfødte granulet neuroner (nederst). PTZ-medieret gentagne anfald fremkalde mossy fiber spiring (pile) og unormale migration af granula celler til hilus (pilespidser). Skalalinjen, 50 μm. Den omtrentlige placering af hvert billede er angivet i (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: PTZ-medieret unormal social adfærd. (A) skematisk illustration af den 3-kammer test. (B) det gennemsnitlige beløb af tid tilbragt i hver afdeling og den gennemsnitlige mængde tid brugt undersøger hvert bur i socialitet test er vist. (C) den gennemsnitlige mængde af tid tilbragt i hver afdeling og det gennemsnitlige antal timer brugt undersøger hvert bur i sociale nyhed test er vist. Der var tolv mus i begge PTZ - og saline-behandlede grupper. PTZ-medieret krampeanfald induceret unormal social adfærd (*** p < 0,001, n.s. = ikke signifikant). Alle gange er vist som gennemsnit ± SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: PTZ-medieret hukommelse værdiforringelse. (A) skematisk illustration af kontekstuelle frygt forskelsbehandling test. (B) den gennemsnitlige procentdel af indefrysning gange i hver tilstand er vist. Der var tolv mus i begge PTZ - og saline-behandlede grupper. Grafen viser den gennemsnitlige ± SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her præsenterer vi et bredt tilgængelige protokol om oprettelse af et farmakologisk dyremodel af epilepsi. PTZ-medieret kemiske kindling har en lang historie og er et almindeligt accepterede model for studiet af epilepsi41histopatologi og cellulære patologi. Den kemiske kindling model af epilepsi er blevet gennemgået tidligere ved Suzdak og Jansen, 199542. Farmakologiske beslaglæggelse induktion, især med PTZ, er en let og enkel metode til at fremkalde alvorlige anfald. Ændringer i injektion dosis korrelerer med beslaglæggelse sværhedsgraden. Således, identificere den passende dosis over flere forsøg ved at ændre PTZ dosis og undersøge den resulterende adfærd er meget let.

Mange forskere har forsøgt at oprette knockout eller knock-i mus som epilepsi modeller og har formået at producere mus, der udviser spontane anfald43,44. Farmakologiske beslaglæggelse induktion anses dog stadig en god model for epilepsi. En anden fælles metode for beslaglæggelse induktion end gen ændring indebærer implantere elektroder ind i en dyrets hjerne og fremkalde elektrochok-medieret anfald. Denne metode er dyrt, svært, og kræver kirurgisk dygtighed til implantatet elektrode på den præcise locus i hjernen5.

Kemiske induktion af kramper muliggør hurtig undersøgelse af epileptogenesis og anti-epileptisk stof screening på lave omkostninger2,4. Hyppigheden og sværhedsgraden af spontane anfald og SE varierer afhængigt af det stof anvendes. Kainic syre og pilocarpin bruges primært til at provokere SE og efterfølgende kroniske spontan eller tilbagevendende anfald45,46,47. På den anden side PTZ bruges både til at fremme SE når det gives i en høj-dosis og at udvikle kemisk optændt dyr når det gives i en subconvulsive dosis48,49. Derudover er mekanismer af krampagtig narkotika, der inducerer anfald velkendte. Således, blokerer den mekanisme, der er nødvendig for at fremkalde anfald kan bidrage til at identificere anti-epileptisk medicin. På den anden side er genetiske modeller forpligtet til at efterforske de mekanismer, der fremkalder epileptiske anfald50. Efter de mekanismer, hvorved beslaglæggelser er induceret er belyst, kan screening af anti-epileptisk medicin startes.

I de repræsentative resultater vist her, blev dyrs adfærd observeret for 30 min efter PTZ administration. Dog som nævnt i afsnittet protokol, observeres dyreadfærd helst for 24 h eller i det mindste 6-10 h efter PTZ injektion, især når beslaglæggelse score når 3 eller højere. Selv om dyrets overvågningssystem kan være nødvendigt at observere dyret for hele dagen, er en langvarig observation kritisk for at opnå en dyb forståelse af epilepsi. Hertil kommer, er beslaglæggelse varighed og beslaglæggelse latency nyttige foranstaltninger til at indsamle. Disse målinger er vigtige, når vedrørende ændringer i beslaglæggelse varighed og ventetid tid og beslaglæggelse sværhedsgraden.

Efter beslaglæggelse histopatologi af kemisk optændt dyr er blevet undersøgt, især i hippocampus. Gentagne anfald eller SE fremkalde mossy fiber spiring27,28, unormal migration af nyfødte granulet neuroner25,29, astrogliosis i hippocampus30og apoptose af pyramide neuroner 31 , 32. disse histologiske forandringer i hjernen forstyrre neurologiske funktioner i epileptiske patienter. For eksempel, er sammenslutningen af epilepsi med autisme spektrum forstyrrelser (ASF) og intellektuelle handicap (ID) godt anerkendt51,52,53. Om epileptiske anfald fremkalde ASD og ID eller ASD og ID fremkalde epileptiske symptomer er stadig en kompliceret spørgsmål. Nylige undersøgelser har vist, at PTZ-medieret anfald fremkalde ASD-lignende social-kognitive funktionsnedsættelser54 og ID-lignende læring underskud 55,56,57. Disse resultater viser, at epilepsi-medieret histopatologi fremkalder neuronal dysfunktion og psykiatriske lidelser.

Histologiske ændringer fremmes af epilepsi tage tid til at udvikle efter beslaglæggelse induktion. I denne henseende er farmakologiske beslaglæggelse induktion fordelagtig, fordi forskere kan kontrollere timing, antallet og sværhedsgraden af anfald hos dyr. Herunder kemiske kindling, dyremodeller for epileptogenesis vil fortsætte med at fremme undersøgelsen af både mekanismen af epilepsi induktion og relaterede neurofysiologiske forstyrrelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev delvist støttet af JSPS KAKENHI grant numre 24700349, 24659093, 25293239, JP18H02536, og 17 K 07086, MEXT KAKENHI grant numre 25110737 og 23110525, AMED Grant nummer JP18ek0109311, og SENSHIN Medical Research Foundation og Japan Epilepsi Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pentylenetetrazole Sigma-Aldrich P6500
Sodium chloride MANAC 7647-14-5
Mouse CLEA Japan C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male
Syringe (1mL) Terumo SS-01T
Needle(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm) Terumo NN-2719S
Weighing scale Mettler PE2000 This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&D company.
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Sodium hydroxide nacalai tesque 31511-05
Peristatic pump ATTO SJ1211
Sucrose nacalai tesque 30404-45
Microtome Yamato REM-700 This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710
Microtome blade Feather S35
Triton X-100 Sigma-Aldrich X-100
anti-synaptoporin antibody Synaptic systems 102 002
anti-ZnT3 antibody Synaptic systems 197 002
anti-doublecortin Santa Cruz sc-8066 This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).
Contextual fear discrimination test apparatus O'hara
Three chamber test apparatus Muromachi

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Löscher, W., Brandt, C. Prevention or Modification of Epileptogenesis after Brain Insults: Experimental Approaches and Translational Research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
  2. Loscher, W. Animal Models of Seizures and Epilepsy: Past, Present, and Future Role for the Discovery of Antiseizure Drugs. Neurochem Res. , (2017).
  3. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
  4. Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
  5. Pitkänen, A., Schwartzkroin, P. A., Moshé, S. L. Models of Seizures and Epilepsy. , Academic Press. xvii (2006).
  6. Yang, Y., Frankel, W. N. Genetic approaches to studying mouse models of human seizure disorders. Adv Exp Med Biol. 548, 1-11 (2004).
  7. Leite, J. P., Garcia-Cairasco, N., Cavalheiro, E. A. New insights from the use of pilocarpine and kainate models. Epilepsy Res. 50 (1-2), 93-103 (2002).
  8. Squires, R. F., Saederup, E., Crawley, J. N., Skolnick, P., Paul, S. M. Convulsant potencies of tetrazoles are highly correlated with actions on GABA/benzodiazepine/picrotoxin receptor complexes in brain. Life Sci. 35 (14), 1439-1444 (1984).
  9. Tourov, A., et al. Spike morphology in PTZ-induced generalized and cobalt-induced partial experimental epilepsy. Funct Neurol. 11 (5), 237-245 (1996).
  10. Furtado Mde, A., Braga, G. K., Oliveira, J. A., Del Vecchio, F., Garcia-Cairasco, N. Behavioral, morphologic, and electroencephalographic evaluation of seizures induced by intrahippocampal microinjection of pilocarpine. Epilepsia. 43, Suppl 5. 37-39 (2002).
  11. Hosford, D. A. Animal models of nonconvulsive status epilepticus. J Clin Neurophysiol. 16 (4), discussion 353 306-313 (1999).
  12. Medina-Ceja, L., Pardo-Pena, K., Ventura-Mejia, C. Evaluation of behavioral parameters and mortality in a model of temporal lobe epilepsy induced by intracerebroventricular pilocarpine administration. Neuroreport. , (2014).
  13. Bragin, A., Azizyan, A., Almajano, J., Wilson, C. L., Engel, J. Jr Analysis of chronic seizure onsets after intrahippocampal kainic acid injection in freely moving rats. Epilepsia. 46 (10), 1592-1598 (2005).
  14. Schmidt, J. Changes in seizure susceptibility in rats following chronic administration of pentylenetetrazol. Biomed Biochim Acta. 46 (4), 267-270 (1987).
  15. Angelatou, F., Pagonopoulou, O., Kostopoulos, G. Changes in seizure latency correlate with alterations in A1 adenosine receptor binding during daily repeated pentylentetrazol-induced convulsions in different mouse brain areas. Neuroscience Letters. 132 (2), 203-206 (1991).
  16. Löscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research. 50 (1), 105-123 (2002).
  17. Ilhan, A., Iraz, M., Kamisli, S., Yigitoglu, R. Pentylenetetrazol-induced kindling seizure attenuated by Ginkgo biloba extract (EGb 761) in mice. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 30 (8), 1504-1510 (2006).
  18. Emami, S., Kebriaeezadeh, A., Ahangar, N., Khorasani, R. Imidazolylchromanone oxime ethers as potential anticonvulsant agents: Anticonvulsive evaluation in PTZ-kindling model of epilepsy and SAR study. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 21 (2), 655-659 (2011).
  19. Klitgaard, H. Levetiracetam: The Preclinical Profile of a New Class of Antiepileptic Drugs? Epilepsia. 42, 13-18 (2001).
  20. Kellinghaus, C., et al. Dissociation between in vitro and in vivo epileptogenicity in a rat model of cortical dysplasia. Epileptic Disord. 9 (1), 11-19 (2007).
  21. Koutroumanidou, E., et al. Increased seizure latency and decreased severity of pentylenetetrazol-induced seizures in mice after essential oil administration. Epilepsy Res Treat. 2013, 532657 (2013).
  22. Krall, R. L., Penry, J. K., White, B. G., Kupferberg, H. J., Swinyard, E. A. Antiepileptic drug development: II. Anticonvulsant drug screening. Epilepsia. 19 (4), 409-428 (1978).
  23. White, H. S. Preclinical development of antiepileptic drugs: past, present, and future directions. Epilepsia. 44, Suppl 7. 2-8 (2003).
  24. Mizoguchi, H., et al. Matrix metalloproteinase-9 contributes to kindled seizure development in pentylenetetrazole-treated mice by converting pro-BDNF to mature BDNF in the hippocampus. J Neurosci. 31 (36), 12963-12971 (2011).
  25. Lee, C. H., Umemori, H. Suppression of epileptogenesis-associated changes in response to seizures in FGF22-deficient mice. Front Cell Neurosci. 7, 43 (2013).
  26. Shimada, T., Yoshida, T., Yamagata, K. Neuritin Mediates Activity-Dependent Axonal Branch Formation in Part via FGF Signaling. J Neurosci. 36 (16), 4534-4548 (2016).
  27. Parent, J. M., et al. Dentate granule cell neurogenesis is increased by seizures and contributes to aberrant network reorganization in the adult rat hippocampus. J Neurosci. 17 (10), 3727-3738 (1997).
  28. Sutula, T., He, X. X., Cavazos, J., Scott, G. Synaptic reorganization in the hippocampus induced by abnormal functional activity. Science. 239 (4844), 1147-1150 (1988).
  29. Parent, J. M., Elliott, R. C., Pleasure, S. J., Barbaro, N. M., Lowenstein, D. H. Aberrant seizure-induced neurogenesis in experimental temporal lobe epilepsy. Ann Neurol. 59 (1), 81-91 (2006).
  30. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
  31. Arzimanoglou, A., et al. Epilepsy and neuroprotection: an illustrated review. Epileptic Disord. 4 (3), 173-182 (2002).
  32. Represa, A., Niquet, J., Pollard, H., Ben-Ari, Y. Cell death, gliosis, and synaptic remodeling in the hippocampus of epileptic rats. Journal of Neurobiology. 26 (3), 413-425 (1995).
  33. Blumcke, I. Neuropathology of focal epilepsies: a critical review. Epilepsy Behav. 15 (1), 34-39 (2009).
  34. Buckmaster, P. S., Haney, M. M. Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 102 (3), 153-159 (2012).
  35. Nokubo, M., et al. Age-dependent increase in the threshold for pentylenetetrazole induced maximal seizure in mice. Life Sci. 38 (22), 1999-2007 (1986).
  36. Ferraro, T. N., et al. Mapping Loci for Pentylenetetrazol-Induced Seizure Susceptibility in Mice. The Journal of Neuroscience. 19 (16), 6733-6739 (1999).
  37. Kosobud, A. E., Cross, S. J., Crabbe, J. C. Neural sensitivity to pentylenetetrazol convulsions in inbred and selectively bred mice. Brain Res. 592 (1-2), 122-128 (1992).
  38. Shimada, T., Takemiya, T., Sugiura, H., Yamagata, K. Role of Inflammatory Mediators in the Pathogenesis of Epilepsy. Mediators of Inflammation. 2014, 1-8 (2014).
  39. Itoh, K., et al. Magnetic resonance and biochemical studies during pentylenetetrazole-kindling development: the relationship between nitric oxide, neuronal nitric oxide synthase and seizures. Neuroscience. 129 (3), 757-766 (2004).
  40. Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 32 (3), 281-294 (1972).
  41. Bialer, M., White, H. S. Key factors in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Nat Rev Drug Discov. 9 (1), 68-82 (2010).
  42. Suzdak, P. D., Jansen, J. A. A review of the preclinical pharmacology of tiagabine: a potent and selective anticonvulsant GABA uptake inhibitor. Epilepsia. 36 (6), 612-626 (1995).
  43. Seyfried, T. N., Glaser, G. H. A review of mouse mutants as genetic models of epilepsy. Epilepsia. 26 (2), 143-150 (1985).
  44. Upton, N., Stratton, S. Recent developments from genetic mouse models of seizures. Current Opinion in Pharmacology. 3 (1), 19-26 (2003).
  45. Rao, M. S., Hattiangady, B., Reddy, D. S., Shetty, A. K. Hippocampal neurodegeneration, spontaneous seizures, and mossy fiber sprouting in the F344 rat model of temporal lobe epilepsy. J Neurosci Res. 83 (6), 1088-1105 (2006).
  46. Hellier, J. L., Patrylo, P. R., Buckmaster, P. S., Dudek, F. E. Recurrent spontaneous motor seizures after repeated low-dose systemic treatment with kainate: assessment of a rat model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 31 (1), 73-84 (1998).
  47. Turski, L., et al. Seizures produced by pilocarpine: neuropathological sequelae and activity of glutamate decarboxylase in the rat forebrain. Brain Res. 398 (1), 37-48 (1986).
  48. Itoh, K., Watanabe, M. Paradoxical facilitation of pentylenetetrazole-induced convulsion susceptibility in mice lacking neuronal nitric oxide synthase. Neuroscience. 159 (2), 735-743 (2009).
  49. Deng, Y., Wang, M., Wang, W., Ma, C., He, N. Comparison and Effects of Acute Lamotrigine Treatment on Extracellular Excitatory Amino Acids in the Hippocampus of PTZ-Kindled Epileptic and PTZ-Induced Status Epilepticus Rats. Neurochemical Research. 38 (3), 504-511 (2013).
  50. Kupferberg, H. Animal models used in the screening of antiepileptic drugs. Epilepsia. 42, Suppl 4. 7-12 (2001).
  51. Berg, A. T., Plioplys, S. Epilepsy and autism: is there a special relationship? Epilepsy Behav. 23 (3), 193-198 (2012).
  52. Robinson, S. J. Childhood epilepsy and autism spectrum disorders: psychiatric problems, phenotypic expression, and anticonvulsants. Neuropsychol Rev. 22 (3), 271-279 (2012).
  53. Tuchman, R. Autism and Cognition Within Epilepsy: Social Matters. Epilepsy Curr. 15 (4), 202-205 (2015).
  54. Takechi, K., Suemaru, K., Kiyoi, T., Tanaka, A., Araki, H. The alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptor modulates autism-like behavioral and motor abnormalities in pentylenetetrazol-kindled mice. Eur J Pharmacol. 775, 57-66 (2016).
  55. Abdel-Zaher, A. O., Farghaly, H. S. M., Farrag, M. M. Y., Abdel-Rahman, M. S., Abdel-Wahab, B. A. A potential mechanism for the ameliorative effect of thymoquinone on pentylenetetrazole-induced kindling and cognitive impairments in mice. Biomed Pharmacother. 88, 553-561 (2017).
  56. Jia, F., et al. Effects of histamine H(3) antagonists and donepezil on learning and mnemonic deficits induced by pentylenetetrazol kindling in weanling mice. Neuropharmacology. 50 (3), 404-411 (2006).
  57. Pahuja, M., Mehla, J., Reeta, K. H., Tripathi, M., Gupta, Y. K. Effect of Anacyclus pyrethrum on pentylenetetrazole-induced kindling, spatial memory, oxidative stress and rho-kinase II expression in mice. Neurochem Res. 38 (3), 547-556 (2013).

Tags

Neurovidenskab sag 136 kemiske pindebrænde beslaglæggelse epilepsi neural plasticitet dyreadfærd histopatologi
Pentylenetetrazole-induceret Kindling musemodel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shimada, T., Yamagata, K.… More

Shimada, T., Yamagata, K. Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model. J. Vis. Exp. (136), e56573, doi:10.3791/56573 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter