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Neuroscience

Modèle de souris de bois d’allumage induite par le pentylènetétrazole

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/56573
Automatic Translation
1, 1
1Synaptic Plasticity Project, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science

Summary

Ce protocole décrit une méthode de bois d’allumage chimique avec pentylènetétrazole et fournit un modèle de souris de l’épilepsie. Ce protocole permet également d’enquêter sur la vulnérabilité à l’induction de la saisie et la pathogenèse après les crises d’épilepsie chez les souris.

Abstract

Pentylènetétrazole (PTZ) est un antagoniste des récepteurs GABA-A. Une injection intrapéritonéale de PTZ dans un animal induit une crise aiguë, sévère à une dose élevée, alors que les injections séquentielles d’une dose de sous-convulsive ont été utilisées pour le développement de produit chimique kindling, un modèle de l’épilepsie. Une seule injection de faibles doses de PTZ induit une crise d’épilepsie bénigne sans convulsion. Toutefois, des injections de faibles doses répétitives de PTZ diminuent le seuil pour évoquer une crise convulsive. Enfin, administration de faible dose continue de PTZ provoque une grave crise tonico-clonique. Cette méthode est simple et largement applicable pour étudier la physiopathologie de l’épilepsie, qui est définie comme une maladie chronique nécessitant des crises répétitives. Ce produit chimique kindling protocole provoque des crises répétitives chez les animaux. Avec cette méthode, on estimait la vulnérabilité aux crises induite par le PTZ ou le degré d’aggravation des crises d’épilepsie. Ces avantages ont conduit à l’utilisation de ce procédé de criblage de médicaments contre l’épilepsie et les gènes liés à l’épilepsie. En outre, cette méthode a servi à enquêter sur les dommages neuronaux après des crises d’épilepsie car les modifications histologiques observées dans le cerveau des patients épileptiques apparaissent également dans le cerveau des animaux chimique-allumé. Ainsi, le présent protocole est utile pour produire facilement des modèles animaux d’épilepsie.

Introduction

L’épilepsie est une affection neurologique chronique qui se caractérise par des crises récurrentes et touche environ 1 % des personnes. Les mécanismes sous-jacents de génération épileptogenèse et saisies chez les patients épileptiques ne peuvent pas être totalement clarifiés dans les études cliniques. Par conséquent, un modèle animal approprié est requis pour l’étude de l’épilepsie1.

Une variété de modèles animaux d’épilepsie ont été utilisés pour étudier la physiologie de l’épilepsie et d’identifier les médicaments anti-épileptiques2,3. Parmi ces modèles, l’induction pharmacologique de saisie est une méthode couramment utilisée pour générer un modèle animal pour l’étude de la pathologie de l’épilepsie4. Cette méthode est simple et peu coûteux. Induite par l’électrode allumage est également une méthode couramment utilisée, mais les frais de cette procédure sont plus élevés, et la méthode exige des compétences chirurgicales et électriques pour induire des crises répétitives5.

Induction pharmacologique est également avantageuse parce que le calendrier et le nombre de saisies sont facilement contrôlés. Des modèles de souris génétiques qui présentent des crises spontanées sont également utilisés dans l’étude de l’épilepsie. Toutefois, le fait de prédire quand et à quelle fréquence les crises surviennent dans ces modèles génétiques peut être impossible6. Un système de surveillance est nécessaire pour observer le comportement épileptique de souris génétiquement modifiées6.

Acide kaïnique, pilocarpine et pentylènetétrazole (PTZ) sont largement utilisés comme induisant la saisie de drogues7. Acide kaïnique est un agoniste des récepteurs du glutamate, et pilocarpine active les récepteurs cholinergiques. PTZ est un acide gamma aminobutyrique (GABA)-un antagoniste de récepteur8. PTZ supprime la fonction des synapses inhibitrices, conduisant à une augmentation de l’activité neuronale. Le présent règlement provoque des crises généralisées dans animaux9. Une seule injection de l’acide kaïnique et pilocarpine peut provoquer des crises aiguës, surtout état de mal épileptique (SE)10,11 et kaïnique acide ou pilocarpine-médiation SE favorise le chronique convulsions récurrentes et spontané12 , 13. enregistrements électroencéphalographiques (EEG) et l’analyse du comportement ont indiqué que les convulsions récurrentes spontanées sont observées un mois après une seule injection12,13. Une seule injection d’une dose convulsive de PTZ induit également la crise aiguë. Toutefois, des saisies spontanées chroniques après une seule injection de PTZ sont difficiles à promouvoir. L’administration chronique de PTZ est nécessaire pour induire des crises répétitives14. Dans les deux méthodes, la génération de crises répétitives est capable d’induire une pathologie plus semblable à celui de l’épilepsie humaine que la génération des crises aiguës. Dans le cas de PTZ, chaque injection évoque une crise d’épilepsie, et gravité de la saisie devient plus sévère selon des étapes avec chaque injection. Enfin, une seule injection de faibles doses PTZ provoque une grave crise tonico-clonique. Dans cette phase, chaque injection évoque des crises graves. En outre, la latence de la saisie et la durée aussi changent au cours des injections. La latence à la saisie tonique devient souvent plus courte dans la dernière phase d’allumage15. En outre, aggravation de la crise s’accompagne d’une saisie prolongée durée16. Étudie les mécanismes moléculaires régissant la sévérité de la saisie, latence et la durée est utile pour le dépistage des antiépileptiques17,18,19.

Saisies sont souvent induits par une seule administration systémique de PTZ, et la récupération est très rapide, moins de 30 min4,5. Ainsi, le nombre de saisies est plus contrôlable dans le modèle de PTZ-bois d’allumage. Surveillance EEG a cependant indiqué que les pointes généralisées peuvent être vu jusqu'à 12 h après saisie PTZ-mediated20. Donc, les animaux devrait préférence rester sous observation pendant 24 h après la crise myoclonique ou toniques21 pour une analyse plus précise des mécanismes de bois d’allumage.

L’administration de médicaments contre l’épilepsie comme éthosuximide, valproate, phénobarbital, vigabatrine et RÉTIGABINE3, avant ou après l’injection de PTZ atténue l’aggravation de la crise gravité3,22, 23. De même, chez des souris knockout que manque gènes impliqués dans l’exacerbation de saisie, tels que matrix metalloproteinase-924, FGF-2225 et neuritin26, ont démontré à exposer gravité réduite saisie après injections multiples de PTZ. En outre, observer des modifications histopathologiques après des crises d’épilepsie est possible avec cette méthode. Chez les patients atteints d’épilepsie du lobe temporal, il y a des modifications histologiques typiques dans le cerveau, comme les fibres moussues germination anormale granule neuron migration29,27,28, neuronale, astrogliosis30 mort à l’hippocampe31,32et33de la sclérose hippocampique. Des changements similaires sont observées chez les animaux de modèle épileptique. Parmi les méthodes disponibles, bois d’allumage chimique induite par le PTZ est une méthode bien, reproductible et peu coûteuse à produire un modèle animal de l’épilepsie. Dans un modèle SE induite par la pilocarpine, contrôle de saisie est difficile et beaucoup de souris meurent ou ne parviennent pas à développer SE34. En revanche, la mortalité et la gravité de la crise sont plus contrôlables dans le modèle PTZ. En outre, PTZ est moins cher que l’acide kaïnique et compétences en chirurgie de cerveau de souris ne sont pas requis pour l’administration de médicaments.

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Protocol

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité de l’utilisation de la Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science et animalier. Postnatal 8 - 16 semaines souris sont recommandés. Toute souche consanguine est acceptable pour l’expérience. Les souris C57BL/6 sont plus résistants aux PTZ, tandis que BALB/c et suisses des souris albinos sont plus sensibles au PTZ. C57BL/6 ont été utilisées dans cette étude. Vulnérabilité aux PTZ dépend aussi de l’âge de la souris. Par rapport aux plus jeunes souris, souris âgées sont plus réfractaires aux PTZ35. Le nombre d’animaux utilisés pour cette méthode peut varier, mais au moins 6 à 10 animaux sont requis pour chaque condition.

1. préparation du PTZ

  1. Dissoudre 2 mg/mL PTZ stérile 0,9 % (p/v) NaCl. Préparer PTZ sur le jour d’utilisation.

2. injection de PTZ

  1. Effectuer toutes les expériences entre 09:00 et 12:00 (midi).
  2. Mesurer le poids corporel de l’animal.
  3. Placer l’animal dans une chambre d’observation pour l’accoutumance.
  4. Au cours de la période d’accoutumance (3 min), calculer le volume de solution PTZ pour l’injection basée sur le poids corporel de l’animal et la dose d’injection préalablement déterminée.
    NOTE : par exemple, lorsque 35 mg/kg PTZ est utilisé, 0,875 mg de PTZ est requise pour une souris pesant 25 g (35 mg / kg x 0,025 kg = 0,875 mg). Par conséquent, 437,5 μL de solution PTZ 2 mg/mL doit être injecté (0,875 mg/2 mg / mL = 0,4375 mL). La dose d’injection du PTZ dépend du génotype de la souris et la souche. Pour les souris C57BL/6 de type sauvage, une dose de 30-35 mg PTZ/kg de poids corporel est recommandée pour le premier essai. Sensibilité au PTZ dépend de la souche utilisée de la souris36,37. La dose d’injection varie en fonction de l’objectif de l’expérience.
  5. Injecter par voie intrapéritonéale PTZ avec une seringue de 1 mL attachée à une aiguille de calibre 27 dans le quadrant gauche ou à droit de l’abdomen de l’animal. Éviter l’injection à la ligne médiane.
    1. Éviter des injections répétées au même endroit.
  6. Observer les comportements animaux pendant 30 min après l’administration de PTZ (Figure 1 a) et classer et marquer le comportement anormal comme indiqué ci-dessous. Si possible, garder les animaux en observation pour 24 heures, ou au moins des 6-10 h après l’injection, surtout une fois que le score de gravité de saisie atteint 3 ou supérieure.
    1. Notez tout douces saisies ou des changements de comportement chez les animaux au-delà de la période d’observation de 30 min. Cela prolonge observation période peut-être adresser un effet particulièrement important et complète d’une dose sous-convulsive de PTZ dans la génération des chroniques saisies sans provocation contre l’epilepsie.
    2. En outre, mesure la durée de la saisie de chaque saisie observée comme changements dans durée de saisie se rapportent à la gravité de la crise. En outre, la latence de la première saisie après l’injection de PTZ est une autre importante mesure de percevoir. Surveillance de la fréquence des crises, la durée et le temps de latence est essentiel pour toute saisies après des études moléculaires.
  7. Injecter le PTZ tous les deux jours (Figure 1 a). Le nombre d’injections dépend de l’objectif de l’expérience. Voici des exemples représentatifs.
    1. Pour générer des animaux complètement allumé, une fois qu’un animal subit une saisie avec un score de 5 (crise tonico-clonique), finir l’injection au sein des administrations de trois supplémentaires. Dans ce cas, augmenter la dose d’injection si le score de saisie n’augmente pas pour trois administrations consécutives. Chaque animal peut recevoir un numéro différent et la dose d’injections de PTZ.
    2. Fixer le nombre et la dose d’injection PTZ dans toutes les conditions pour évaluer la vulnérabilité de PTZ, y compris dans les évaluations des antiépileptiques et études du phénotype des souris génétiquement modifiées. Donner à tous les animaux le même nombre d’injections de PTZ ; un total de 8 à 12 injections est recommandé. Si un animal meurt, le score de saisie devrait être désigné en tant que 6.
    3. Déterminer la dose d’injection nécessaire pour maintenir une saisie haute score (4 ou 5) pour 10 ou plusieurs injections pour étudier les changements histopathologiques qui se produisent des crises d’épilepsie. Dans ce cas, le nombre total d’injection doit varier de 25 à 30. Diminuer la dose d’injection si le score de saisie atteint 5. Si le score de saisie diminue égale ou inférieure à 3, augmenter la dose d’injection.

3. saisie Score

  1. Observez les comportements animaux et les scores.
    1. Classer et marquer les comportements épileptiques comme suit38,39 (Figure 1 b) :
      0 : comportement normal, aucune anomalie.
      1 : immobilisation, couché sur le ventre.
      2 : tête myoclonie hochant la tête, du visage, membre antérieur ou postérieur.
      3 : continue confiné myoclonie, myoclonique secousses, queue qui s’est tenue vers le haut avec raideur.
      4 : saisie d’élevage, tonique, tombant sur le côté.
      5 : crise tonico-clonique, tombant sur son dos, sauvage se précipiter et le saut.
      6 : la mort.
  2. Changer les critères comportements basés sur la Racine Note40, selon les conditions expérimentales.

4. la saisie après analyse

  1. Analyse Immunohistopathological
    1. Fixation de perfusion
      1. Préparation
        1. Dissoudre 4 % (p/v) de paraformaldéhyde (PFA) dans un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4). Chauffer la solution à environ 70 ° C avec l’ajout d’une goutte de 1 NaOH M (environ 1 µL de 1 NaOH M pour 50 mL de solution de PFA).
        2. Préparer 4 glacee % PFA et une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
        3. Mettre en place une pompe péristaltique, avec un tube et l’aiguille. Faire passer environ 20 mL d’eau par le tube pour effacer les résidus. Ensuite, placez l’extrémité ouverte du tube dans PBS glacée.
      2. Perfusion de Transcardial et préparation du cerveau fixe
        1. Profondément anesthésier la souris avec de l’éthanol de isoflurane/50% de 50 % dans un petit pot.
        2. Maintenir la souris en position couchée en épinglant les pointes de leurs membres antérieurs et postérieurs.
        3. Couper la ligne de médiane ventrale de l’abdomen et exposer le diaphragme.
        4. Découper la membrane le long du rebord costal. Ensuite, couper les deux côtés latérale des côtes et corps. Pincez le processus xiphoïde par la pince de verrouillage et evert la cage thoracique. Maintenir la position du processus xiphoïde par l’épinglage avec une aiguille ou il pincer avec une pince. Exposer le cœur.
        5. Introduire l’aiguille dans le ventricule gauche et faites une coupe dans l’oreillette droite à l’aide de ciseaux. Sachez ne pas à pousser l’aiguille trop loin dans le cœur, car il peut percer un mur intérieur.
        6. Commencer un flux constant de PBS glacée par l’aiguille de laver le sang (environ 15 à 20 mL/min).
        7. Quand le sang a été éliminé de l’organisme, passer le tube à une solution de paraformaldéhyde de 4 % (environ 60 mL) sans ajout de bulles. Puis, arrêter la perfusion.
        8. Couper le cou arrière et la colonne vertébrale et Décollez la peau de la tête et la partie dorsale du crâne avec ciseaux de dissection.
        9. Couper l’OS prémaxillaire entre les orbites oculaires et supprimer complètement la partie dorsale du crâne.
        10. Créer un espace entre le cerveau et les os jugal du côté postérieur et couper les nerfs trijumeau et le chiasma sous le cerveau. Soigneusement retirer le cerveau et le placer dans un flacon contenant 4 % PFA. Fixer le cerveau à 4 ° C pendant 12 à 16 h.
    2. Préparation de tranches de cerveau
      1. Transférer le cerveau fixe à 20 % de sucrose/PBS jusqu'à ce que le cerveau s’enfonce dans la solution permettant de cryoprotection.
      2. Couper le cerveau fixe basé sur l’orientation de la tranche requis et la partie requise du cerveau.
      3. Définir la cryomicrotome. Placer la lame en position et maintenir la scène microtome à une température inférieure à-20 ° C.
      4. Placez le cerveau prédécoupé sur la scène et enduire le cerveau avec 20 % de sucrose/PBS. La solution de saccharose/PBS gèlera progressivement, couvrant le cerveau sur la scène, jusqu'à ce que le cerveau est entièrement noyé dans la gelée 20 % saccharose/PBS.
      5. Tranchez le cerveau (30 µm d’épaisseur) en faisant glisser la lame à travers le tissu. Transférer les tranches dans PBS et les conserver à 4 ° C.
    3. Immunohistochemistry fluorescent
      1. Laver les tranches nécessaires à 0,1 % Triton X-100/PBS (PBST) pendant 10 min, 3 fois à température ambiante (RT).
      2. Bloquer les tranches en les incubant en PBST avec 2 % chèvre 5 % ou sérum albumine sérique bovine (BSA) pendant 1-2 h à température ambiante.
      3. Incuber les tranches dans une solution d’anticorps avec la concentration appropriée d’anticorps primaire dans le PBST avec 2 % chèvre BSA de sérum ou de 5 % pour 1 à 7 nuitées à 4 ° C.
      4. Laver les tranches dans du PBST pendant 10 min, 3 fois à température ambiante.
      5. Incuber les tranches dans une solution d’anticorps secondaire avec la concentration appropriée d’anticorps secondaire dans le PBST pendant 1-2 h à RT, protégés par la lumière.
      6. Monter les tranches sur lames de verre et recouvrir avec le milieu de montage et de la lamelle couvre-objet.
      7. Observer les tranches avec la microscopie de fluorescence.
  2. Test de trois chambres
    1. Préparation
      1. Préparer au moins 2 2 - souris 129/Sv 6 mois du même sexe que les souris sujet à être la « souris par un étranger ». S’habituer à toutes les souris dans la cage avant l’analyse. Pour chaque session de formation, placez votre souris dans la cage et laisser la souris pendant 15 min.
      2. Avant chaque phase d’accoutumance avec la souris de sujet, nettoyer l’ensemble de l’appareil et les deux cages en frottant la surface avec de l’éthanol à 70 %.
      3. Placer les cages vides dans les chambres des deux côté de l’appareil de 3 chambres et ouvrir les portes entre les chambres.
      4. Pour s’habituer à la souris de l’objet, de placer une souris du sujet dans l’hémicycle du centre et de permettre la souris se déplacer librement dans l’ensemble de l’appareil jusqu'à ce que la souris a enquêté sur les deux cages, ainsi qu’un animal sujet supplémentaire de 5 min. qui peut avoir peur de la cage ne sont pas enquêter sur la cage pendant 20 min et ne doit pas être utilisé pour cette analyse. Ces animaux, éviter la cage et viennent rarement à proximité de la cage.
      5. Après que l’animal se déplace dans la chambre de centre, fermez les portes et laisser la souris se déplacer librement dans la salle du centre pendant 5 min. Pendant cette période, une des souris 129/Sv mis dans une cage à s’habituer à la cage.
    2. Analyse de la socialité
      1. Procéder à cette analyse immédiatement après la période d’accoutumance de la souris de l’objet.
      2. Placer la cage contenant une souris 129/Sv, appelé la « cage de Stranger 1 », dans l’une des chambres à côté et la cage vide, appelée la cage « objet », dans l’autre chambre de côté.
      3. Ouvrez la porte et surveiller le comportement de la souris de l’objet.
      4. Laissez la souris sujet à se déplacer librement pendant 10 min et on enregistre les paramètres comportements suivants. Si la souris sujet a peur de la souris dans la cage 1 étranger, comme en témoigne la souris en évitant la cage 1 étranger et restant dans le coin de l’une des chambres, l’animal ne doit pas servir à l’analyse.
        un) temps passé dans chaque chambre, la chambre 1 de l’étranger, la chambre objet et Centre Chambre.
        b) temps passé à étudier chaque cage, la cage 1 étranger et la cage de l’objet. (La souris est classée étudie la cage si la souris est renifler ou toughing la souris ou la cage)
        c) le nombre d’entrées dans chaque chambre (optionnel)
        d) total distance parcourue (en option)
      5. Après que la souris se déplace dans la chambre de centre, fermer les portes.
    3. Analyse sociale nouveauté
      1. Procéder à cette analyse immédiatement après l’analyse de la socialité.
      2. Essuyez les deux cages avec l’éthanol à 70 %.
      3. Placer une autre souris 129/Sv dans une des cages, appelés la « Cage de Stranger 2 » et place l’étranger 2 cage dans une des chambres. Placer la souris 1 inconnu dans l’autre cage, appelée la « cage de Stranger 1 » et la cage 1 inconnu dans l’autre chambre.
      4. Ouvrez la porte et surveiller le comportement de la souris de l’objet.
      5. Laissez la souris de l’objet à déplacer librement pendant 10 min et mesurer les mêmes paramètres comportements décrits pour l’analyse de la socialité.
        Remarque : La souris étranger 1 et 2 de l’étranger doivent être choisie au hasard. L’étranger 1 chambre et chambre objet ainsi que l’étranger 1 chambre et étranger 2 chambre devraient être déterminées au hasard.
  3. Discrimination de peur contextuelle
    1. Climatisation
      1. Avant chaque essai de conditionnement, nettoyez l’appareil expérimental en frottant la surface avec de l’éthanol à 70 %.
      2. Placez une souris dans un appareil de climatisation avec des conditions particulières (forme de l’appareil, couleur des murs, matériau du sol, odeurs, éclairage et volume de bruit de fond devraient être prédéterminés). Par exemple, l’appareil de conditionnement utilisé ici est un appareil carré avec plexiglass clair murs, un plancher de grille métallique, une odeur d’éthanol, luminosité 100 lux et 65 dB bruit blanc.
      3. Conditionner la souris de choc avec un timing Pseudo-aléatoire des chocs électriques 0,1-mA pour 2 s x 3 fois au cours de 5 min.
      4. Retourner la souris à la cage après conditionnement.
    2. Évaluation de la mémoire
      1. Avant chaque évaluation, nettoyer l’appareil expérimental en frottant la surface avec de l’éthanol à 70 %.
      2. Le lendemain suivant conditionnement, placez la souris dans le même appareil en état de choc et mesurer le temps de congélation au cours de 5 min.
      3. Plus tard, le même jour, placez la souris dans un appareil nouveau et mesurer le temps de congélation pendant une évaluation de 5 min. Un engin triangulaire avec plexiglas blanc murs, plancher plat, aucune odeur, luminosité 30 lux et bruit blanc 70-dB a été utilisé ici.
      4. Comparer le temps de congélation entre la même condition et l’état nouveau. Les souris avec une capacité de mémoire normale vont geler plus dans le même État que dans la nouvelle condition. La congélation est défini l’immobilité de l’animal pendant plus de 2 s.

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Representative Results

Injection répétitive du PTZ induit une augmentation dans la sévérité de la saisie. Six souris C57BL/6 ont été traités avec le PTZ, et un autre 6 souris ont été traitées avec une solution saline comme un groupe de contrôle. La dose PTZ était de 35 mg/kg et 10 injections ont été réalisées. Le score de saisie a augmenté graduellement avec des injections de PTZ, tandis que pas saisies ou comportements anormaux ont été évoqués par des injections salines (Figure 2). ANOVA suivie de Bonferroni test a montré une différence significative entre le groupe traité PTZ et le groupe imprégnées d’une solution saline.

Saisie répétitive favorise la formation aberrante branche axonale (fibres moussues de germination) et migration anormale des cellules étoilées dans l’hippocampe. Souris ont été traitées avec PTZ pour 25 injections (dose a été ajusté entre 24 mg/kg et 35 mg/kg pour maintenir la saisie sévère chez les souris sans provoquer de décès causé par une grave crise d’épilepsie). Le cerveau de souris ont été fixé à 3 semaines après la dernière injection. Cerveaux de contrôle ont été fixés avant les injections de PTZ. Tranches de cerveau ont été immunomarquées avec anti-synaptoporin (x 500) et les anticorps anti-ZnT3 (x 500) d’observer la germination de fibres moussues (Figure 3 a) et avec l’anticorps anti-doublecortin (x 200) d’observer la migration anormale des cellules étoilées ( Figure 3 a). Des fibres moussues, inhibiteurs de germination dans la couche de cellules de granules a été observée chez les tranches imprégnées de PTZ (Figure 3 a). Les microglies nouveau-né, qui sont immunoréactifs pour doublecortin, ont été observés dans le hile dans les tranches imprégnées de PTZ (Figure 3 a). La couche de cellules de granule et hile illustré à la Figure 3 a est illustrée dans la Figure 3 b.

Crises répétitives également altérer un comportement normal de souris. Douze souris C57BL/6 ont été traitées avec PTZ (35 mg/kg, 10 injections), et un autre 12 souris ont été traitées avec une solution saline comme un groupe de contrôle. Deux semaines après la dernière injection, les souris ont été analysés dans un essai en chambre 3 (Figure 4 a) et le test de discrimination de peur contextuelle (Figure 5 a). Chez les souris traitées PTZ a montré la socialité normale (Figure 4 b). Souris a passé plus de temps dans la chambre 1 étranger que dans l’objet de chambre (saline : p = 0,003, PTZ : p = 0,027) et étudié la cage 1 étranger plus qu’ils ont étudié la cage de l’objet (saline : p = 0,009, PTZ : p = 0,004). Cependant, chez les souris traitées PTZ ont montré nouveauté sociale anormale (Figure 4) indiquant des troubles de la mémoire sociale. Contrôle souris a passé plus de temps dans la salle 2 de l’étranger qu’à l’étranger 1 chambre et a étudié à l’étranger 2 cage plus qu’ils ont étudié la cage 1 étranger, alors que les souris embrasées n’ont pas montré de différence significative dans le temps passé dans les chambres ou temps passé à étudier les cages (temps en chambre : saline : p = 0,006, PTZ : p = 0,126. Enquête sur le temps : saline : p = 0,002, PTZ : p = 0.426). Chez les souris traitées PTZ a également montrent des troubles de la mémoire lors de l’essai de peur contextuelle (Figure 5 b). Contrôler la souris ont montré une congélation plus longtemps dans l’état de choc que dans la nouvelle condition, alors que chez les souris traitées PTZ n’a montré aucune différence significative dans le temps de congélation (saline : p < 0,001, PTZ : p = 0,060). Non-appariés t-tests ont été effectués pour des analyses statistiques.

Figure 1
Figure 1 : brève description du protocole. (A) illustration schématique de bois d’allumage induite par le PTZ. (B) Illustrations des comportements animaux représentatifs pour les scores respectifs de saisie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : évaluation du comportement convulsif. Les scores moyens de saisie sont indiqués dans le graphique. Six souris ont été utilisés dans chaque État, et une série d’injections a été réalisée. Après chaque injection, les scores de saisie ont été surveillés et a marqué. Par rapport aux injections salines, injections de PTZ augmentèrent de sévérité de la saisie (p < 0,001 : ANOVA de mesures répétées). Chaque score de saisie s’affiche comme la moyenne ± SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : migration de germination et anormaux PTZ véhiculée par les fibres moussues des cellules étoilées. (A) Maximum prévu images immunohistochemical des hile, couche granuleuse et la couche moléculaire de tranches d’hippocampe des souris avant l’allumage (à gauche) et après allumage (à droite). Anti-synaptoporin (en haut) et les anticorps anti-ZnT3 (au milieu) ont été utilisées pour visualiser les axones des neurones granulaires (fibres moussues). L’anticorps anti-doublecortin a été utilisé pour visualiser les neurones granule nouveau-né (en bas). PTZ-mediated des crises répétitives induisent des fibres moussues germination (flèches) et migration anormale des cellules étoilées dans le hile (pointes de flèche). Echelle, 50 μm. La position approximative de chaque image est indiquée en (B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : comportement social anormal induite par le PTZ. (A) illustration schématique de l’essai de 3 chambres. (B) la quantité moyenne de temps passé dans chaque chambre et la quantité moyenne de temps passé à étudier chaque cage lors de l’essai de la socialité sont indiqués. (C) la quantité moyenne de temps passé dans chaque chambre et la quantité moyenne de temps passé enquêter sur chaque cage dans le critère de nouveauté sociale apparaissent. Il y avait douze souris dans les deux groupes traités PTZ et une solution saline. PTZ-mediated saisies induites par un comportement social anormal (*** p < 0,001, n.s. = non significatif). Toutes les heures sont indiquées comme la moyenne ± SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : troubles de la mémoire induite par le PTZ. (A) une illustration schématique de l’essai de mobilité contextuelle de peur. (B) le pourcentage moyen de congélation fois dans chacune des conditions sont indiquées. Il y avait douze souris dans les deux groupes traités PTZ et une solution saline. Graphique montre la moyenne ± SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Nous présentons ici un protocole largement accessible pour la mise en place d’un modèle animal pharmacologique de l’épilepsie. Bois d’allumage chimique induite par le PTZ a une longue histoire et est un modèle couramment accepté pour l’étude de la pathologie histopathologie et cellulaires de l’épilepsie,41. Le modèle chimique embrasement de l’épilepsie a été examiné précédemment par Suzdak et Jansen, 1995,42. Induction pharmacologique de saisie, en particulier avec le PTZ, est une méthode simple et facile pour évoquer des crises graves. Changements dans la dose d’injection sont en corrélation avec la sévérité de la saisie. Ainsi, il est très facile d’identifier la dose appropriée au cours de plusieurs essais en modifiant la dose PTZ et en examinant le comportement qui en résulte.

De nombreux chercheurs ont tenté de créer le masquage ou souris knock-in comme modèles d’épilepsie et ont réussi à produire des souris qui présentent des crises spontanées43,44. Cependant, induction pharmacologique de saisie est toujours considéré comme un bon modèle pour l’épilepsie. Une autre méthode commune pour l’induction de saisie autre que de la modification génétique consiste à implanter des électrodes dans le cerveau de l’animal et induire des saisies médiée par les électrochocs. Cette méthode est coûteuse, difficile et nécessite une dextérité chirurgicale à implanter l’électrode au locus précis dans le cerveau5.

Induction chimique des convulsions permet l’enquête rapide d’épileptogenèse et médicament antiépileptique projeté à faible coût2,4. La fréquence et la gravité des crises spontanées et SE varient selon la drogue utilisée. Pilocarpine et acide kaïnique servent surtout à provoquer SE et ultérieures saisies spontanée ou récidivante chronique45,46,47. D’autre part, le PTZ est utilisé tant pour promouvoir SE lorsqu’il est administré en une dose élevée et de développer chimiquement allumée animaux lorsqu’il est administré en une dose sous-convulsive48,49. En outre, les mécanismes de médicaments convulsifs qui induisent des saisies sont bien connus. Ainsi, bloquant le mécanisme nécessaire pour induire la saisie peut aider à identifier les médicaments contre l’épilepsie. En revanche, modèles génétiques sont nécessaires pour étudier les mécanismes qui évoquent des crises d’épilepsie,50. Après que les mécanismes par lesquels saisies sont induites sont élucidés, on peut commencer le dépistage de médicaments contre l’épilepsie.

Dans les résultats représentatifs ci-contre, comportement animal a été observée pendant 30 min après l’administration de PTZ. Toutefois, comme mentionné dans la section protocole, comportement animal est préférence observé pour 24h ou au moins 6 à 10 h après l’injection de PTZ, surtout une fois la saisie score atteint 3 ou supérieur. Bien qu’un animal, système de surveillance peut-être devoir observer l’animal pendant toute la journée, une observation prolongée est essentielle pour obtenir une compréhension profonde de l’épilepsie. En outre, la durée de la saisie et la latence de saisie sont des mesures utiles à recueillir. Ces mesures sont importantes lorsque touchant les changements en durée de saisie et de la latence à temps et la saisie de la sévérité.

L’histopathologie après saisie d’animaux chimiquement allumé a été étudiée, en particulier dans l’hippocampe. Crises répétitives ou SE provoquer des fibres moussues,27,28, migration anormale du nouveau-né granule neurones25,29, astrogliosis dans l’hippocampe30et l’apoptose des neurones pyramidaux de la germination 31 , 32. ces modifications histologiques dans le cerveau perturbent les fonctions neurologiques chez des patients épileptiques. Par exemple, l’association de l’épilepsie avec troubles du spectre autistique (TSA) et de la déficience intellectuelle (ID) est bien reconnue51,52,53. Si induisent des crises d’épilepsie ASD et ID ou ASD et ID d’induisent des symptômes épileptiques est toujours une question compliquée. Des études récentes ont montré que les convulsions induite par le PTZ induisent ASD-comme sociaux-cognitifs54 et ID-comme apprentissage des déficits 55,56,,57. Ces résultats indiquent que l’histopathologie induite par l’épilepsie provoque la dysfonction neuronale et les troubles psychiatriques.

Modifications histologiques promues par l’épilepsie tardent à se développer après l’induction de la saisie. À cet égard, l’induction pharmacologique de saisie est avantageuse, car les chercheurs peuvent contrôler la synchronisation, le nombre et la gravité des crises chez les animaux. Y compris chimiques d’embrasement, modèles animaux d’épileptogenèse continuera de promouvoir l’enquête sur les deux le mécanisme d’induction de l’épilepsie et des troubles neurophysiologiques.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

Acknowledgments

Ce travail a été partiellement soutenu par un nombre de subventions JSPS KAKENHI 24700349, 24659093, 25293239, JP18H02536 et 17 K 07086, numéros de bourse MEXT KAKENHI 25110737 et 23110525, AMED Grant nombre JP18ek0109311 et le SENSHIN Medical Research Foundation et le Japon Epilepsy Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pentylenetetrazole Sigma-Aldrich P6500
Sodium chloride MANAC 7647-14-5
Mouse CLEA Japan C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male
Syringe (1mL) Terumo SS-01T
Needle(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm) Terumo NN-2719S
Weighing scale Mettler PE2000 This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&D company.
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Sodium hydroxide nacalai tesque 31511-05
Peristatic pump ATTO SJ1211
Sucrose nacalai tesque 30404-45
Microtome Yamato REM-700 This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710
Microtome blade Feather S35
Triton X-100 Sigma-Aldrich X-100
anti-synaptoporin antibody Synaptic systems 102 002
anti-ZnT3 antibody Synaptic systems 197 002
anti-doublecortin Santa Cruz sc-8066 This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).
Contextual fear discrimination test apparatus O'hara
Three chamber test apparatus Muromachi

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