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Neuroscience

Pentylenetetrazole-induzierten anzünden-Maus-Modell

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/56573
Automatic Translation
1, 1
1Synaptic Plasticity Project, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode des chemischen anzünden mit Pentylenetetrazole und bietet einem Mausmodell der Epilepsie. Dieses Protokoll kann auch zur Anfälligkeit für Beschlagnahme Induktion und Pathogenese nach epileptischen Anfällen bei Mäusen zu untersuchen.

Abstract

Pentylenetetrazole (PTZ) ist ein GABA-A-Rezeptor-Antagonist. Eine intraperitoneale Injektion von PTZ in ein Tier induziert einen akuten, schweren Anfall bei einer hohen Dosis während sequenzielle Injektionen einer subconvulsive Dosis für die Entwicklung von chemischen kindling, eine Epilepsie-Modell verwendet wurden. Eine niedrig dosierte Injektion des PTZ induziert einen leichten Anfall ohne Krampf. Jedoch verringern sich wiederholende niedrig dosierte Injektionen von PTZ die Schwelle um einen krampfartigen Anfall hervorrufen. Kontinuierliche niedrig dosierte Verabreichung von PTZ induziert schließlich einen schweren Tonikum-klonischen Anfall. Diese Methode ist einfach und vielseitig einsetzbar, die Pathophysiologie der Epilepsie, die ist definiert als eine chronische Erkrankung, die sich wiederholende Anfälle beinhaltet zu untersuchen. Diese Chemikalie Anfeuerholz Protokoll verursacht wiederkehrende Anfälle bei Tieren. Mit dieser Methode schätzte Anfälligkeit für PTZ-vermittelten Anfälle oder der Grad der Erschwerung von epileptischen Anfällen. Diese Vorteile führten zu die Verwendung dieser Methode für das screening von Antiepileptika Medikamente und Epilepsie-Genen. Darüber hinaus wurde diese Methode zur neuronalen Schaden nach epileptischen Anfällen zu untersuchen, weil die histologischen Veränderungen in den Gehirnen von epileptischen Patienten auch in den Gehirnen der Chemikalie angezündet Tiere erscheinen. Somit eignet sich dieses Protokoll für die Herstellung von bequem Tiermodellen der Epilepsie.

Introduction

Epilepsie ist eine chronische neurologische Erkrankung, die zeichnet sich durch wiederkehrende Anfälle und betrifft etwa 1 % der Menschen. Die zugrunde liegenden Mechanismen der Epileptogenesis und Beschlagnahme Generation bei Epilepsiepatienten können nicht vollständig in den klinischen Studien geklärt werden. Daher ist einem geeigneten Tiermodell zur Erforschung der Epilepsie1erforderlich.

Eine Vielzahl von Tiermodellen der Epilepsie haben verwendet worden, zu untersuchen, die Physiologie der Epilepsie und Antiepileptika Medikamente2,3zu identifizieren. Unter diesen Modellen ist die pharmakologische Beschlagnahme Induktion eine gängige Methode zur Erzeugung von einem Tiermodell zur Untersuchung von der Pathologie des Epilepsie-4. Diese Methode ist kostengünstig und einfach. Elektrode-vermittelten anzünden ist auch eine häufig verwendete Methode, aber die Kosten dieses Verfahrens sind höher, und die Methode erfordert chirurgische und elektrische Fähigkeiten, sich wiederholende Anfälle5zu induzieren.

Pharmakologische Induktion ist auch vorteilhaft, da das Timing und die Zahl der Sicherstellungen von leicht gesteuert werden. Genetischer Mausmodelle, die spontanen Anfälle aufweisen sind auch in der Studie von Epilepsie verwendet. Vorhersagen, wann und wie oft die Anfälle in diesen genetischen Modellen auftreten kann jedoch unmöglich6sein. Ein monitoring-System ist erforderlich, um das epileptische Verhalten von genetisch veränderten Mäusen6zu beobachten.

Kainic Säure, Pilocarpin und Pentylenetetrazole (PTZ) sind als Beschlagnahme-induzierende Medikamente7verbreitet. Kainic Säure ist ein Agonist für Glutamat-Rezeptoren und Pilocarpin cholinerge Rezeptoren aktiviert. PTZ ist ein Gamma-Aminobuttersäure (GABA)-ein Rezeptor-Antagonist-8. PTZ unterdrückt die hemmenden Synapsen-Funktion führt zu erhöhter neuronaler Aktivität. Dieser Verordnung verursacht Generalisierte Anfälle in Tiere9. Eine einmalige Injektion von Kainic Säure und Pilocarpin induzieren kann akute Anfälle, vor allem Status Epilepticus (SE)10,11 und Kainic Säure - oder Pilocarpin-vermittelten SE fördert chronische spontane und wiederkehrende Anfälle12 , 13. EEG (EEG) Aufnahmen und Verhaltensanalyse haben gezeigt, dass spontane wiederkehrende Anfälle pro Monat nach einer einzigen Injektion12,13eingehalten werden. Eine einmalige Injektion einer konvulsiven Dosis von PTZ induziert auch akuten Anfall. Chronische spontane Anfälle nach einer einzelnen Injektion des PTZ sind jedoch schwer zu fördern. Chronische Verabreichung von PTZ ist erforderlich, um sich wiederholende Anfälle14zu induzieren. Bei beiden Methoden ist die Generation der sich wiederholende Anfälle in der Lage, eine Pathologie der menschlichen Epilepsie ähnlicher als die Generation der akute Anfälle auslösen. Bei PTZ jeder Injektion erinnert an einen Anfall, und Beschlagnahme Schweregrad wird in gewissem Sinne schrittweise bei jeder Injektion schwerer. Zu guter Letzt induziert eine niedrig dosierte PTZ Injektion einen schweren Tonikum-klonischen Anfall. In dieser Phase ruft jeder Injektion schwere Anfälle. Darüber hinaus ändern die Beschlagnahme Latenz und Dauer auch im Laufe der Injektionen. Die Latenz zu tonischen Anfall wird oft in der Spätphase der kindling15verkürzt. Darüber hinaus ist eine verlängerte Beschlagnahme Dauer16Beschlagnahme Verschlimmerung begleitet. Untersuchen die molekulare Mechanismen zur Regulierung der Beschlagnahme schwere, ist Latenz und Dauer nützlich für das screening von Antiepileptika Medikamente17,18,19.

Anfälle sind häufig durch eine einzelne systemische Verabreichung von PTZ induziert, und die Erholung ist sehr schnell, innerhalb von 30 min4,5. So ist die Zahl der Sicherstellungen im PTZ-anzünden-Modell besser kontrollierbar. Allerdings hat das EEG Überwachung angedeutet, dass generalisierte Spikes bis zu 12 h nach PTZ-vermittelten Beschlagnahme20gesehen werden können. Tiere sollten daher vorzugsweise unter Beobachtung für 24 h nach der Tonika oder myoklonische Anfall21 für eine genauere Analyse der Mechanismen, Kleinholz bleiben.

Die Verabreichung von Medikamenten Antiepileptika, z. B. Ethosuximide, Valproat, Phenobarbital, Vigabatrin und retigabin3, vor oder nach der Injektion PTZ mildert die Verschlimmerung der Beschlagnahme Schweregrad3,22, 23. Ebenso zeigten Knockout-Mäusen, dass Beschlagnahme Exazerbation, wie Matrix-Metalloproteinase-9-24, FGF-2225 und Neuritin26, fehlende Gene beteiligt zu reduzierten Beschlagnahme Schweregrad nach PTZ Mehrfacheinspritzungen aufweisen. Darüber hinaus beobachten histopathologische Veränderungen nach epileptische Anfällen ist mit dieser Methode möglich. Bei Patienten mit Temporallappen-Epilepsie gibt es typische histologische Veränderungen im Gehirn, wie moosige Faser sprießen,27,28, abnorme Granulat Neuron Migration29, Astrogliosis30, neuronale Zelle Tod im Hippocampus31,32und hippocampale Sklerose33. Ähnliche Veränderungen sind bei epileptischen Modell Tieren beobachtet. Unter den verfügbaren Methoden ist PTZ-vermittelten chemischen anzünden eine gute, reproduzierbare und kostengünstige Methode, einem Tiermodell der Epilepsie zu produzieren. In einem Pilocarpin-vermittelten SE Modell Anfallskontrolle ist schwierig und viele Mäuse sterben oder nicht SE34weiterentwickeln. Im Gegensatz dazu sind Sterblichkeit und schwere Anfall besser kontrollierbar im PTZ Modell. Darüber hinaus PTZ ist weniger teuer als Kainic Säure und Maus Gehirnchirurgie sind nicht für die Medikamentengabe erforderlich.

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Protocol

Animal Care und Use Committee des Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science stimmten alle experimentelle Verfahren. Postnatale 8 - 16 Wochen alten Mäusen empfohlen. Jede Inzucht Belastung ist akzeptabel für das Experiment. C57BL/6 Mäusen sind widerstandsfähiger gegen PTZ, während BALB/c und Swiss Albino-Mäuse für PTZ empfindlicher sind. C57BL/6 wurden in dieser Studie verwendet. Anfälligkeit für PTZ hängt auch vom Alter der Maus. Im Vergleich zu jüngeren Mäusen, sind ältere Mäuse mehr refraktär gegenüber PTZ-35. Die Zahl der Versuchstiere für diese Methode kann variieren, aber mindestens 6-10 Tiere sind für jede Bedingung erforderlich.

1. Vorbereitung des PTZ

  1. 2 mg/mL PTZ in steriler 0,9 % (w/V) NaCl auflösen. Bereiten Sie PTZ am Tag der Nutzung.

2. Injektion von PTZ

  1. Alle Experimente zwischen 09:00 und 12:00 (Mittag) durchführen.
  2. Körpergewicht des Tieres zu messen.
  3. Legen Sie das Tier in eine Beobachtung Kammer für Gewöhnung.
  4. Berechnen Sie das Volumen der PTZ-Lösung basierend auf das Körpergewicht des Tieres und die zuvor ermittelte Injektion Dosis Injektionslösung, zur Zeit der Gewöhnung (3 min).
    Hinweis: zum Beispiel bei 35 mg/kg PTZ wird 0,875 mg des PTZ ist erforderlich für eine Maus mit einem Gewicht von 25 g (35 mg / kg x 0,025 kg = 0,875 mg). Daher sollte 437.5 μL einer PTZ-Lösung 2 mg/mL injiziert werden (0,875 mg/2 mg / mL = 0,4375 mL). Die Injektion Dosis von PTZ hängt von der Maus Genotyp und Belastung. Für Wildtyp C57BL/6 Mäusen empfiehlt sich eine Dosis von 30-35 mg PTZ/kg Körpergewicht für den ersten Versuch. Sensibilität für PTZ hängt die Maus verwendete Stamm36,37. Die Injektion Dosis variiert je nach dem Zweck des Experiments.
  5. Injizieren Sie PTZ intraperitoneal mit einer 1-mL-Spritze, ein 27-Gauge-Nadel in den linken oder rechten Quadranten des Abdomens des Tieres befestigt. Vermeiden Sie die Injektion an der Mittellinie.
    1. Vermeiden Sie wiederholte Injektionen an der gleichen Stelle.
  6. Tierische Verhaltensweisen für 30 min nach PTZ Verabreichung (Abbildung 1A), zu beobachten und klassifizieren und abnormale Verhalten der Gäste, wie unten gezeigt. Halten Sie die Tiere unter Beobachtung für 24 h oder mindestens eine zusätzliche 6-10 h nach der Injektion, wenn möglich, vor allem, wenn die Beschlagnahme schwere Partitur 3 erreicht oder höher.
    1. Hinweis: jede milde Anfälle oder Verhaltensänderungen bei den Tieren über den Beobachtungszeitraum von 30 Minuten. Dies verlängert die Beobachtung, dass Zeit eine besonders wichtige und vollständige Wirkung einer subconvulsive Dosis von PTZ in der Generation der chronischen unprovozierten Anfälle bei Epilepsie wenden kann.
    2. Darüber hinaus messen die Beschlagnahme Dauer jeder beobachteten Anfall als Änderungen in der Dauer der Beschlagnahme beziehen sich auf die Beschlagnahme schwere. Darüber hinaus ist die Latenz, der erste Anfall nach der PTZ-Injektion eine weitere wichtige Maßnahme zu sammeln. Überwachung der Beschlagnahme Häufigkeit, Dauer und Latenz ist entscheidend für jede Post-Beschlagnahme Molekulare Studien.
  7. Injizieren Sie PTZ jeden zweiten Tag (Abbildung 1A). Die Anzahl der Injektionen richtet sich nach dem Ziel des Experiments. Repräsentative Beispiele sind wie folgt.
    1. Um vollständig angeheizte Tiere erzeugen, sobald ein Tier einen Anfall mit einer Punktzahl von 5 (Tonika-klonischen Anfall) Erfahrungen, beenden Sie die Injektion innerhalb von weiteren drei Verwaltungen. In diesem Fall erhöhen Sie die Injektion-Dosis, wenn die Beschlagnahme Punktzahl nicht für drei aufeinander folgende Verwaltungen steigt. Jedes Tier kann eine unterschiedliche Anzahl und Dosis der PTZ-Injektionen erhalten.
    2. Befestigen Sie die Anzahl und Dosis der PTZ-Injektion in jeder Bedingung, die Anfälligkeit für PTZ, einschließlich Bewertungen der Anti-Epilepsie-Medikamente und Untersuchungen des Phänotyps von genetisch veränderten Mäusen zu bewerten. Alle Tiere die gleiche Anzahl von PTZ-Injektionen zu geben; insgesamt 8 bis 12 Injektionen wird empfohlen. Wenn ein Tier stirbt, sollte die Beschlagnahme Partitur als 6 bezeichnet werden.
    3. Bestimmen Sie die Injektion Dosis notwendig, einen hohen Anfall pflegen score (4 oder 5) für 10 oder mehr Injektionen, die histopathologischen Veränderungen zu studieren, die epileptische Anfälle auftreten. In diesem Fall sollte die Anzahl der gesamten Injektion von 25 bis 30 reichen. Die Injektion-Dosis zu verringern, wenn die Beschlagnahme Punktzahl 5 erreicht. Wenn die Beschlagnahme Partitur auf 3 oder niedriger sinkt, die Injektion-Dosis zu erhöhen.

(3) Beschlagnahme Score

  1. Beobachten Sie die tierische Verhaltensweisen zu und zeichnen Sie der Ergebnisse auf.
    1. Klassifizieren und schieße die epileptischen Verhaltensweisen wie folgt38,39 (Abbildung 1 b):
      0: normales Verhalten, keine Anomalie.
      1: Immobilisierung, am Bauch liegen.
      2: Kopf nicken, Gesichtsbehandlung, vordergliedmaße oder Megalosauridae Myoklonien.
      3: kontinuierliche Ganzkörper-Myoklonus, myoklonische wichst, Rute steif gehalten.
      4: Kindererziehung, tonische Beschlagnahme, auf seiner Seite nach unten fallen.
      5: Tonika-klonischen Anfall, Herunterfallen auf den Rücken, wild hetzen und springen.
      6: Tod.
  2. Ändern Sie die verhaltensbezogenen Kriterien anhand der Racine Partitur40, abhängig von den experimentellen Bedingungen.

4. nach dem Anfall Analyse

  1. Immunohistopathological Analyse
    1. Perfusion Fixierung
      1. Vorbereitung
        1. 4 % (w/V) Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) auflösen. Erhitzen Sie die Lösung auf etwa 70 ° C mit dem Zusatz von einem Tropfen 1 M NaOH (ca. 1 M NaOH für 50 mL-PFA-Lösung 1 µL).
        2. Bereiten Sie eiskalte 4 % PFA und Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
        3. Richten Sie eine Peristaltische Pumpe mit Schlauch und Nadel. Laufen Sie etwa 20 mL Wasser durch das Rohr um Rückstände zu löschen. Dann setzen Sie das offene Ende des Röhrchens in eiskaltem PBS.
      2. Transcardial Perfusion und Vorbereitung von festen Gehirn
        1. Die Maus mit 50 % isoflurane/50% Ethanol in ein kleines Glas tief zu betäuben.
        2. Halten Sie die Maustaste in Rückenlage durch die Spitzen ihrer Vorderbeine und Hinterbeine festhalten.
        3. Schneiden der ventralen Mittellinie des Bauches und setzen das Zwerchfell.
        4. Schneiden Sie die Membran entlang der Küsten. Dann schneiden Sie beide Seiten der Rippen und des Körpers. Xiphoid Prozeß durch die Verriegelung Zange zusammendrücken und evert den Brustkorb. Pflegen Sie die Position des Xiphoid Prozeß durch fixieren es mit einer Nadel oder mit der Pinzette kneifen. Setzen Sie das Herz aus.
        5. Stechen Sie die Nadel in die linke Herzkammer und machen Sie einen Schnitt in den rechten Vorhof mit einer Schere. Achten Sie darauf, nicht die Nadel ins Herz, zu weit zu treiben, da es eine Innenwand durchbohren kann.
        6. Beginnen Sie einen stetigen Strom von eiskaltem PBS durch die Nadel das Blut (ca. 15-20 mL/min) zu waschen.
        7. Wenn das Blut aus dem Körper abgebaut ist, bewegen Sie das Rohr zu einer 4 % Paraformaldehyd Lösung (ca. 60 mL) ohne Zusatz von Luftblasen. Halten Sie dann die Durchblutung.
        8. Schneiden Sie die hinteren Nacken und Wirbelsäule und die Kopfhaut und die dorsalen Teil des Schädels mit präparierscheren abziehen.
        9. Schneiden des Zwischenkieferbeins Knochens zwischen den Augen Bahnen und der dorsalen Teil des Schädels vollständig zu entfernen.
        10. Erstellen Sie eine Lücke zwischen dem Gehirn und jugal Knochen von der hinteren Seite und schneiden Sie die Trigeminal Nerven und Optik Chiasmus unterhalb des Gehirns. Nehmen Sie das Gehirn vorsichtig und legen Sie sie in ein Fläschchen mit 4 % PFA. Nach dem Beheben des Gehirns bei 4 ° C für 12-16 Uhr.
    2. Gehirn-Scheibe-Vorbereitung
      1. Übertragen Sie die feste Gehirn auf 20 % Saccharose/PBS, bis das Gehirn die Lösung versinkt, um Cryoprotection zu ermöglichen.
      2. Schneiden Sie die feste Gehirn anhand der benötigten Scheibe Orientierung und erforderliche Teil des Gehirns.
      3. Legen Sie die Cryomicrotome. Setzen Sie das Messer in Position und halten Sie die Mikrotom-Bühne bei einer Temperatur unter-20 ° C.
      4. Platzieren Sie die vorgeschnittene Gehirn auf der Bühne und das Gehirn mit 20 % Saccharose/PBS Mantel. Die Saccharose/PBS-Lösung wird nach und nach Einfrieren, die das Gehirn auf der Bühne, bis das Gehirn vollständig in gefrorenen 20 % Saccharose/PBS eingebettet ist.
      5. Schneiden Sie das Gehirn (30 µm Dicke) durch Verschieben der Klinge durch das Gewebe. Übertragen Sie die Scheiben in PBS und halten sie bei 4 ° C.
    3. Fluoreszierende immunohistochemistry
      1. Waschen Sie die notwendigen Scheiben in 0,1 % Triton X-100/PBS (PBST) für 10 min, 3 Mal bei Raumtemperatur (RT).
      2. Die Scheiben zu blockieren, indem Brüten sie in PBST mit 2 % Ziege Serum oder 5 % Rinderserumalbumin (BSA) für 1-2 h bei RT
      3. Inkubieren Sie die Scheiben in einer Antikörperlösung mit der geeigneten Konzentration der Primärantikörper in PBST mit 2 % Ziege Serum oder 5 % BSA für 1 bis 7 Übernachtungen bei 4 ° c
      4. Waschen Sie die Scheiben in PBST für 10 min, 3 Mal bei RT
      5. Inkubieren Sie die Scheiben in eine sekundäre Antikörper-Lösung mit der geeigneten Konzentration der Sekundärantikörper in PBST 1-2 h bei RT, lichtgeschützt.
      6. Montieren Sie die Scheiben auf Objektträger und mit Eindeckmittel und Deckglas abdecken.
      7. Beobachten Sie die Scheiben mit Fluoreszenz-Mikroskopie.
  2. Drei-Kammer-test
    1. Vorbereitung
      1. Bereiten Sie mindestens 2 2-6-Monate-alten 129/Sv Mäuse des gleichen Geschlechts wie das Thema Mäuse, die "fremde Maus." Alle Mäuse in den Käfig vor der Analyse zu gewöhnen. Platzieren Sie für jede Trainingseinheit den Mauszeiger in den Käfig und lassen Sie die Maus für 15 Minuten.
      2. Reinigen Sie vor jeder Gewöhnung Phase mit dem Thema Maus den gesamten Apparat und beide Käfige durch Abwischen der Oberfläche mit 70 % Ethanol.
      3. Legen Sie die leere Käfige in den beiden seitlichen Kammern der 3-Kammer-Vorrichtung und öffnen Sie die Türen zwischen den Kammern.
      4. Um das Thema Maus gewöhnen, legen Sie eine Thema Maus in der Mitte der Kammer und lassen Sie die Maus, um frei zu bewegen, während das Gerät, bis die Maus die beiden Käfige untersuchte, plus eine zusätzliche 5 min. Thema Tiere, die ängstlich des Käfigs möglicherweise nicht untersuchen Sie den Käfig für 20 min und sollte nicht für diese Analyse verwendet werden. Solche Tiere vermeiden Sie den Käfig und kommen nur selten in der Nähe des Käfigs.
      5. Nachdem das Tier bewegt sich in die Mitte der Kammer, schließen Sie die Türen und lassen Sie die Maus in die Mitte-Kammer für 5 min frei bewegen. Während dieser Zeit legte eine der 129/Sv Mäuse in einem Käfig, in den Käfig zu gewöhnen.
    2. Sozialität Analyse
      1. Diese Analyse unmittelbar nach der Gewöhnung Periode der Thema Maus durchführen.
      2. Legen Sie den Käfig mit einem 129/Sv-Maus, bezeichnet die "fremden 1 Käfig", in einem der Nebenräume und legen Sie die leeren Käfig, genannt den "Objekt-Käfig", in die andere Seite-Kammer.
      3. Öffnen Sie die Tür und überwachen Sie das Verhalten der Maus Thema zu.
      4. Erlauben Sie die Thema Maus frei für 10 min bewegen und zeichnen die folgenden verhaltensbezogene Parameter. Wenn die Thema Maus die Maus in der fremde 1 Käfig fürchtet wie angegeben mit der Maus den fremden 1 Käfig zu vermeiden und in der Ecke einer der Kammern bleiben, sollte das Tier nicht für die Analyse verwendet werden.
        (a) Zeit in jeder Kammer, der fremde 1 Kammer, Objekt Kammer und Zentrum Kammer.
        (b) Zeit jeder Käfig, den fremden 1 Käfig und der Objekt-Käfig zu untersuchen. (Die Maus gilt als den Käfig zu untersuchen, wenn die Maus schnüffeln ist oder Toughing Maus oder Käfig)
        (c) die Anzahl der Eingänge in jeder Kammer (optional)
        (d) insgesamt zurückgelegte Strecke (optional)
      5. Nachdem die Maus in die Mitte der Kammer bewegt, schließen Sie die Türen.
    3. Analyse der sozialen Neuheit
      1. Diese Analyse unmittelbar nach der Sozialität Analyse durchführen.
      2. Wischen Sie beide Käfige mit 70 % Ethanol.
      3. Setzen Sie eine andere 129/Sv-Maus in einem der Käfige, bezeichnet den "Fremden 2 Käfig" und Ort der fremden 2 Käfig in einer der Kammern. Platzieren Sie die fremden 1 Maus in den anderen Käfig, genannt den "fremden 1 Käfig", und legen Sie den fremden 1 Käfig in die andere Kammer.
      4. Öffnen Sie die Tür und überwachen Sie das Verhalten der Maus Thema zu.
      5. Ermöglichen Sie die Thema Maus frei für 10 min bewegen und Messen Sie die gleichen Verhaltensstörungen Parameter für die Sozialität Analyse beschrieben.
        Hinweis: Die fremde 1 und 2 fremden Maus sollte nach dem Zufallsprinzip gewählt werden. Der fremde 1 Kammer und Objekt Kammer sowie der fremden 1 Kammer und fremder 2 Kammer sollte nach dem Zufallsprinzip bestimmt werden.
  3. Kontextbezogene Angst vor Diskriminierung
    1. Klimaanlage
      1. Vor jeder Prüfung Klimaanlage Reinigen der experimentellen Apparat durch Abwischen der Oberfläche mit 70 % Ethanol.
      2. Legen Sie eine Maus in einer Klimaanlage-Apparatur mit besonderen Bedingungen (Apparat Form, Wandfarbe, Bodenmaterial, Geruch, Beleuchtung und Lautstärke Hintergrund vorab festgelegt werden). Zum Beispiel war die Klimaanlage Vorrichtung verwendet hier einen quadratischen Apparat mit klare Plexiglas Wände, ein Metallgitter-Boden, ein Ethanol Geruch 100 Lux Helligkeit und 65 dB Hintergrund weißes Rauschen.
      3. Zustand die Maus durch Fuß-Schock mit pseudo-zufällige Timing von 0,1 mA Elektroschocks für 2 s X 3 Mal im Laufe von 5 Minuten.
      4. Die Maus nach Klimaanlage nach Hause Käfig zurück.
    2. Speicher-Bewertung
      1. Reinigen Sie vor jeder Bewertung den experimentellen Apparat durch Abwischen der Oberfläche mit 70 % Ethanol.
      2. Am nächsten Tag folgende Klimaanlage, platzieren Sie den Mauszeiger in der gleichen Apparatur als Schock-Zustand und die Gefrierzeit im Laufe von 5 min zu messen.
      3. Später platzieren Sie am selben Tag, den Mauszeiger in einem neuartigen Apparat und Messen Sie die Gefrierzeit während einer 5-min-Bewertung. Hier wurde eine dreieckige Apparat mit weißem Plexiglas Wände, Platte Boden, kein Geruch, 30 Lux Helligkeit und 70 dB weißes Rauschen verwendet.
      4. Die Gefrierzeit zwischen den gleichen Zustand und neuartige Zustand zu vergleichen. Die Mäuse mit einer normalen Speicher-Fähigkeit werden mehr in dem gleichen Zustand als im Roman Zustand einfrieren. Das Einfrieren ist definierten Unbeweglichkeit des Tieres für mehr als 2 s.

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Representative Results

Wiederholte Injektion von PTZ induziert eine Steigerung im Anfall Schweregrad. Sechs C57BL/6 Mäusen mit PTZ behandelt wurden, und ein weiteres 6 Mäuse mit Kochsalzlösung als Kontrollgruppe behandelt wurden. Die PTZ-Dosis betrug 35 mg/kg und 10 Injektionen verabreicht wurden. Die Beschlagnahme Punktzahl stieg allmählich mit PTZ-Injektionen, während keine Anfälle oder abnormen Verhaltensweisen durch Kochsalzlösung Injektionen (Abbildung 2) hervorgerufen wurden. ANOVA, gefolgt von Bonferroni-Test zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen der PTZ-behandelten Gruppe und der Saline-behandelten Gruppe.

Sich wiederholende Beschlagnahme fördert aberranten axonalen Zweig Bildung (moosigen Faser sprießen) und anormale Migration von Granulat Zellen im Hippocampus. Mäuse wurden mit PTZ für 25 Injektionen behandelt (Dosis wurde von 24 mg/kg bis 35 mg/kg schweren Anfall bei Mäusen zu behalten, ohne Induktion Tod durch einen schweren Anfall angepasst). Die mäusegehirnen wurden 3 Wochen nach der letzten Injektion fixiert. Kontrolle Gehirne wurden vor der PTZ-Injektionen behoben. Gehirnscheiben wurden Immunostained mit Anti-Synaptoporin (x 500) und Anti-ZnT3 (x 500) Antikörper gegen das moosige Faser sprießen (Abbildung 3A) zu beobachten und mit dem Anti-Doublecortin Antikörper (x 200) zu beobachten, die anormale Migration von Granulat Zellen ( Abbildung 3A). Moosigen Faser in das Granulat Zellschicht sprießen verzeichneten PTZ-behandelten Scheiben (Abb. 3A). Neugeborenen Granulat Zellen, die für Doublecortin immunreaktiven, wurden innerhalb der Hilus in die PTZ-behandelten Scheiben (Abbildung 3A) beobachtet. Das Granulat Zellschicht und Hilus, dargestellt in Abbildung 3A ist in Abbildung 3 bdargestellt.

Sich wiederholende Anfälle beeinträchtigen auch normales Verhalten von Mäusen. Zwölf C57BL/6 Mäusen mit PTZ (35 mg/kg, 10 Injektionen) behandelt wurden, und eine weitere 12 Mäusen mit Kochsalzlösung als Kontrollgruppe behandelt wurden. Zwei Wochen nach der letzten Injektion wurden die Mäuse in einem 3-Kammer-Test (Abb. 4A) und kontextuellen Angst vor Diskriminierung Test (Abb. 5A) analysiert. PTZ-behandelten Mäusen zeigten normale Sozialität (Abbildung 4 b). Mäuse verbrachte mehr Zeit in der fremde 1 Kammer als Kammer im Objekt (Kochsalzlösung: p = 0,003, PTZ: p = 0,027) und untersucht den fremden 1 Käfig mehr, als sie den Objekt-Käfig untersucht (Kochsalzlösung: p = 0.009, PTZ: p = 0,004). PTZ-behandelten Mäusen zeigten jedoch bezeichnend für soziale Gedächtnisstörungen abnorme soziale Neuheit (Abbildung 4). Kontroll-Mäusen verbrachte mehr Zeit in der fremde 2 Kammer als in der fremde 1 Kammer und untersucht den fremden 2 Käfig mehr, als sie den fremden 1 Käfig untersucht, während die angeheizte Mäuse nicht zeigen keinen signifikanten Unterschied in der Zeit in den Kammern verbrachte oder verbrachte Zeit untersucht die Käfige (Zeit in Kammer: Kochsalzlösung: p = 0,006, PTZ: p = 0.126. Zeit zu untersuchen: Kochsalzlösung: p = 0,002, PTZ: p = 0.426). PTZ-behandelten Mäusen zeigte auch Gedächtnisstörungen in der kontextuellen Angst-Test (Abb. 5 b). Mäuse zeigten eine längere Gefrierzeit in den Schock Zustand als in den neuen Zustand zu kontrollieren, während PTZ-behandelten Mäusen nicht keinen signifikanten Unterschied zeigen in der eisigen Zeit (Kochsalzlösung: p < 0,001, PTZ: p = 0.060). Ungepaarten t-Tests wurden für statistische Analysen durchgeführt.

Figure 1
Abbildung 1: kurze Beschreibung des Protokolls. (A) schematische Darstellung der PTZ-vermittelten anzünden. (B) Illustrationen von repräsentativen tierische Verhaltensweisen für die jeweiligen Beschlagnahme Partituren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Beurteilung der konvulsiven Verhalten. Die mittlere Beschlagnahme Noten werden im Diagramm angezeigt. Sechs Mäuse wurden in jede Bedingung verwendet, und eine Reihe von Injektionen durchgeführt wurde. Nach jeder Injektion waren die Beschlagnahme Partituren überwacht und erzielte. Im Vergleich zu Kochsalzlösung Injektionen, PTZ-Injektionen deutlich erhöht Beschlagnahme Schweregrad (p < 0,001: wiederholt Maßnahmen ANOVA). Jede Beschlagnahme Partitur zeigt sich als Mittelwert ± SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: PTZ-vermittelten moosigen Faser Keimen und anormale Migration Granulat Zellen. (A) Maximum projiziert immunhistochemische Bilder der Hilus, Körnerschicht und molekulare Schicht des Hippokampus Scheiben der Mäuse vor dem Anzünden (links) und nach (rechts) anzünden. Anti-Synaptoporin (oben) und Anti-ZnT3 Antikörper (Mitte) wurden verwendet, um die Axone der Neuronen Granulat (moosigen Fasern) zu visualisieren. Der Anti-Doublecortin-Antikörper wurde verwendet, um Neugeborene Granulat Neuronen (unten) zu visualisieren. PTZ-vermittelten sich wiederholende Anfälle auslösen moosigen Faser sprießen (Pfeile) und anormale Migration von Granulat Zellen in den Hilus (Pfeilspitzen). Maßstabsleiste, 50 μm. Die ungefähre Position der einzelnen Bilder wird (B). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: PTZ-vermittelten sozialen Verhaltensauffälligkeiten. (A) schematische Darstellung der 3-Kammer-Test. (B) der durchschnittliche Zeitaufwand in jeder Kammer und der durchschnittliche Zeitaufwand jeder Käfig in der Sozialität-Test untersucht werden angezeigt. (C) der durchschnittliche Zeitaufwand in jeder Kammer und der durchschnittliche Zeitaufwand Untersuchung jeder Käfig in der sozialen Neuheitstest gezeigt. Es gab zwölf Mäuse in beiden PTZ und Saline-behandelten Gruppen. PTZ-vermittelten Anfälle induziert abnormen Sozialverhalten (*** p < 0,001, n.s. = nicht signifikante). Alle Zeiten werden angezeigt als Mittelwert ± SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: PTZ-vermittelten Gedächtnisstörungen. (A) schematische Darstellung der kontextuellen Angst vor Diskriminierung Test. (B) der durchschnittliche Anteil der einfrierzeiten in jedem Zustand werden angezeigt. Es gab zwölf Mäuse in beiden PTZ und Saline-behandelten Gruppen. Diagramm zeigt den Mittelwert ± SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Hier präsentieren wir Ihnen eine allgemein zugängliche Protokoll für die Errichtung einer pharmakologischen Tiermodell der Epilepsie. PTZ-vermittelten chemischen anzünden hat eine lange Geschichte und ist ein allgemein anerkanntes Modell für die Untersuchung der Histopathologie und Cellular Pathologie von Epilepsie41. Das chemische anzünden-Modell der Epilepsie wurde zuvor von Suzdak und Jansen, 199542geprüft. Pharmakologische Beschlagnahme Induktion, vor allem mit PTZ, ist eine einfache und einfache Methode für schwere Anfälle hervorrufen. Änderungen in der Injektion Dosis korrelieren mit Beschlagnahme Schweregrad. Daher ist es sehr einfach, die passende Dosis über mehrere Studien zu identifizieren, indem Sie ändern die PTZ-Dosis und das daraus resultierende Verhalten.

Viele Forscher haben versucht, Ko oder Knock-in Mäusen wie Epilepsie Modelle erstellen und haben es geschafft in der Herstellung von Mäusen, die spontanen Anfälle43,44aufweisen. Pharmakologische Beschlagnahme Induktion gilt jedoch nach wie vor ein gutes Modell für Epilepsie. Eine weitere gängige Methode zur Beschlagnahme Induktion als gentechnische Veränderung beinhaltet ein Tier Gehirn Elektroden implantiert und induzieren Elektroschock-vermittelten Anfälle. Diese Methode ist teuer, schwierig und erfordert chirurgische Fähigkeiten, die Elektrode an der genaue Ort im Gehirn5zu implantieren.

Chemische Induktion von Krämpfen ermöglicht die schnelle Untersuchung von Epileptogenesis und antiepileptische Drogen-screening bei low-cost2,4. Die Häufigkeit und Schwere der spontane Anfälle und SE variieren je nach der Droge verwendet. Kainic Säure und Pilocarpin werden hauptsächlich verwendet, um SE und spätere chronische spontane oder wiederkehrende Anfälle45,46,47zu provozieren. Auf der anderen Seite PTZ dient sowohl zur Förderung SE, wenn Sie in einer hoch dosierten und chemisch entwickeln entzündet Tiere, wenn Sie in einer subconvulsive Dosis48,49gegeben. Darüber hinaus sind die Mechanismen der konvulsiven Drogen, die Anfälle auslösen bekannt. So kann blockieren den Mechanismus für Beschlagnahme unabdingbar helfen, um Antiepileptika Medikamente zu identifizieren. Auf der anderen Seite sind genetische Modelle erforderlich, um die Mechanismen zu untersuchen, die epileptische Anfälle50hervorrufen. Nachdem die Mechanismen Anfälle verursacht geklärt sind, kann das Screening von Antiepileptika Medikamente gestartet werden.

In die repräsentativen Ergebnisse hier gezeigt wurde das Verhalten der Tiere für 30 min nach PTZ Verwaltung beobachtet. Allerdings ist wie im Abschnitt Protokoll erwähnt, Tierverhalten vorzugsweise beobachtet für 24 h oder mindestens 6-10 h nach Injektion PTZ, vor allem, wenn die Beschlagnahme Punkten erreicht 3 oder höher. Obwohl ein Tier Überwachungssystem erforderlich ist, um das Tier für den ganzen Tag beobachten, ist eine längere Beobachtung entscheidend für den Erhalt eines tiefen Verständnis der Epilepsie. Darüber hinaus sind die Dauer der Beschlagnahme und Beschlagnahme Latenz nützliche Maßnahmen zu sammeln. Diese Messungen sind wichtig, wenn Änderungen in der Dauer der Beschlagnahme und Latenz in Bezug auf Zeit und Beschlagnahme Schweregrad.

Die Post-Beschlagnahme Histopathologie chemisch angeheizte Tiere untersucht worden ist, vor allem im Hippocampus. Sich wiederholende Anfälle oder SE induzieren moosigen Faser sprießen,27,28, anormale Migration von Neugeborenen Granulat Neuronen25,29, Astrogliosis in den Hippocampus30und Apoptose der pyramidale Neuronen 31 , 32. diese histologischen Veränderungen im Gehirn neurologische Funktionen bei epileptischen Patienten zu stören. Beispielsweise ist die Vereinigung von Epilepsie mit Autismus-Spektrum-Störungen (ASD) und geistige Behinderung (ID) anerkannten51,52,53. Ob epileptische Anfälle ASD auslösen und oder ASD und ID epileptische Symptome induzieren ist noch eine komplizierte Frage. Jüngste Studien haben gezeigt, dass PTZ-vermittelten Anfälle ASD-wie sozial-kognitiver Beeinträchtigungen54 induzieren und ID-wie lernen Defizite 55,56,57. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Epilepsie-vermittelten Histopathologie neuronale Dysfunktion und psychiatrischen Störungen hervorruft.

Histologische Veränderungen gefördert durch Epilepsie nehmen Sie sich Zeit, nach Beschlagnahme Induktion zu entwickeln. Pharmakologische Beschlagnahme Induktion ist in dieser Hinsicht vorteilhaft, weil Forscher Zeitpunkt, Anzahl und Schwere der Anfälle bei Tieren steuern können. Einschließlich chemische anzünden, Tiermodellen der Epileptogenesis Untersuchung des Mechanismus von Epilepsie Induktion und verwandte neurophysiologischen Störungen fördert weiterhin.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde teilweise von JSPS KAKENHI Grant-Nummern 24700349, 24659093, 25293239, JP18H02536, und 17 K 07086, MEXT KAKENHI Grant-Nummern 25110737 und 23110525, AMED Grant Nummer JP18ek0109311, und der SENSHIN Medical Research Foundation und der Japan unterstützt. Epilepsie-Forschungsgemeinschaft.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pentylenetetrazole Sigma-Aldrich P6500
Sodium chloride MANAC 7647-14-5
Mouse CLEA Japan C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male
Syringe (1mL) Terumo SS-01T
Needle(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm) Terumo NN-2719S
Weighing scale Mettler PE2000 This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&D company.
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Sodium hydroxide nacalai tesque 31511-05
Peristatic pump ATTO SJ1211
Sucrose nacalai tesque 30404-45
Microtome Yamato REM-700 This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710
Microtome blade Feather S35
Triton X-100 Sigma-Aldrich X-100
anti-synaptoporin antibody Synaptic systems 102 002
anti-ZnT3 antibody Synaptic systems 197 002
anti-doublecortin Santa Cruz sc-8066 This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).
Contextual fear discrimination test apparatus O'hara
Three chamber test apparatus Muromachi

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Shimada, T., Yamagata, K. Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model. J. Vis. Exp. (136), e56573, doi:10.3791/56573 (2018).

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