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Neuroscience

Pentylenetetrazole-प्रेरित जलना माउस मॉडल

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/56573
Automatic Translation
1, 1
1Synaptic Plasticity Project, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science

Summary

इस प्रोटोकॉल pentylenetetrazole के साथ रासायनिक जलना की एक विधि का वर्णन है और मिर्गी का एक माउस मॉडल प्रदान करता है । इस प्रोटोकॉल भी चूहों में मिरगी बरामदगी के बाद जब्ती प्रेरण और रोगजनन के लिए भेद्यता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

Pentylenetetrazole (PTZ) एक गाबा-एक रिसेप्टर प्रतिपक्षी है । एक पशु में PTZ के एक intraperitoneal इंजेक्शन एक उच्च खुराक पर एक तीव्र, गंभीर बरामदगी लाती है, जबकि एक subconvulsive खुराक के अनुक्रमिक इंजेक्शन रासायनिक जलना, एक मिर्गी मॉडल के विकास के लिए इस्तेमाल किया गया है । एक एकल कम खुराक के इंजेक्शन PTZ आक्षेप के बिना एक हल्के जब्ती लाती है । तथापि, दोहराव कम खुराक इंजेक्शन PTZ के एक ऐंठन जब्ती पैदा करने के लिए दहलीज कमी । अंत में, PTZ के सतत कम खुराक प्रशासन एक गंभीर टॉनिक-क्लोनल जब्ती लाती है । यह विधि सरल और व्यापक रूप से मिर्गी के pathophysiology की जांच करने के लिए लागू है, जो एक पुरानी बीमारी है कि दोहराव बरामदगी शामिल है के रूप में परिभाषित किया गया है । यह रासायनिक जलना प्रोटोकॉल जानवरों में दोहराव बरामदगी का कारण बनता है । इस विधि के साथ, PTZ के लिए जोखिम-मध्यस्थता बरामदगी या मिरगी बरामदगी की उत्तेजना की डिग्री का अनुमान था । ये फायदे एंटी-मिरगी दवाओं और मिर्गी से संबंधित जीन को परखने के लिए इस विधि के इस्तेमाल के लिए प्रेरित करते हैं । इसके अलावा, इस विधि मिरगी बरामदगी के बाद न्यूरॉन क्षति की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है क्योंकि मिरगी रोगियों के दिमाग में मनाया ऊतकवैज्ञानिक परिवर्तन भी रासायनिक जलाने वाले जानवरों के दिमाग में दिखाई देते हैं । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल को सुविधाजनक ढंग से मिर्गी के पशु मॉडलों के उत्पादन के लिए उपयोगी है ।

Introduction

मिर्गी एक पुरानी स्नायविक विकार है कि आवर्तक बरामदगी की विशेषता है और लगभग 1% लोगों को प्रभावित करता है । मिर्गी के रोगियों में epileptogenesis और जब्ती सृजन के अंतर्निहित तंत्र को नैदानिक अध्ययनों में पूर्णतः स्पष्ट नहीं किया जा सकता. इसलिए, मिर्गी के अध्ययन के लिए एक उपयुक्त पशु मॉडल की आवश्यकता है1.

मिर्गी की फिजियोलॉजी की जांच और एंटी मिरगी ड्रग्स की पहचान करने के लिए मिर्गी के एक किस्म के पशु मॉडलों का इस्तेमाल किया गया है2,3. इन मॉडलों के अलावा, औषधीय जब्ती प्रेरण4मिर्गी की विकृति की जांच के लिए एक पशु मॉडल उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल एक आम विधि है । यह विधि सस्ती और सरल है । इलेक्ट्रोड मध्यस्थता जलना भी एक सामान्य रूप से इस्तेमाल किया विधि है, लेकिन इस प्रक्रिया की लागत अधिक कर रहे हैं, और विधि के लिए दोहराव बरामदगी5प्रेरित करने के लिए शल्य चिकित्सा और बिजली के कौशल की आवश्यकता है ।

औषधीय प्रेरण भी लाभप्रद है क्योंकि समय और बरामदगी की संख्या आसानी से नियंत्रित कर रहे हैं । सहज बरामदगी का प्रदर्शन करने वाले जेनेटिक माउस मॉडलों का इस्तेमाल मिर्गी के अध्ययन में भी किया जाता है. हालांकि, भविष्यवाणी कब और कितनी बार इन आनुवंशिक मॉडल में पैदा हो असंभव हो सकता है6। एक निगरानी प्रणाली के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों6के मिरगी व्यवहार का पालन करने की आवश्यकता है ।

Kainic एसिड, pilocarpine और pentylenetetrazole (PTZ) व्यापक रूप से जब्त-उत्प्रेरण ड्रग्स7के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं । Kainic एसिड ग्लूटामेट रिसेप्टर्स के लिए एक एगोनिस्ट है, और pilocarpine कोलीनर्जिक रिसेप्टर्स सक्रिय करता है । PTZ एक गामा aminobutyric एसिड (गाबा) है-एक रिसेप्टर प्रतिपक्षी8. PTZ निरोधात्मक synapses के समारोह को रोकता है, वृद्धि हुई ंयूरॉंस गतिविधि के लिए अग्रणी । यह विनियमन9पशुओं में सामान्यीकृत बरामदगी का कारण बनता है । kainic एसिड और pilocarpine का एक इंजेक्शन तीव्र बरामदगी पैदा कर सकता है, विशेष रूप से स्थिति एपिलेप्टिकस (एसई)10,11 और kainic एसिड-या pilocarpine-मध्यस्थता एसई पुरानी सहज और आवर्तक बरामदगी12 को बढ़ावा , 13. Electroencephalographic (ईईजी) रिकॉर्डिंग और व्यवहार विश्लेषण संकेत दिया है कि सहज आवर्तक बरामदगी एक महीने के बाद एक इंजेक्शन12,13मनाया जाता है । PTZ की एक ऐंठन खुराक का एक इंजेक्शन भी तीव्र बरामदगी लाती है । हालांकि, PTZ के एक इंजेक्शन के बाद पुरानी सहज बरामदगी को बढ़ावा देने के लिए मुश्किल हैं । PTZ के जीर्ण प्रशासन दोहराव बरामदगी14प्रेरित करने के लिए आवश्यक है । या तो विधि में, दोहराव बरामदगी की पीढ़ी तीव्र बरामदगी की पीढ़ी की तुलना में मानव मिर्गी के लिए एक विकृति है कि अधिक प्रेरित करने में सक्षम है । PTZ के मामले में, प्रत्येक इंजेक्शन एक जब्ती उदाहरण भी देते हैं, और जब्ती गंभीरता प्रत्येक इंजेक्शन के साथ एक stepwise तरीके से अधिक गंभीर हो जाता है । अंत में, एक एकल कम खुराक PTZ इंजेक्शन एक गंभीर टॉनिक-क्लोनल जब्ती लाती है । इस चरण में, प्रत्येक इंजेक्शन गंभीर बरामदगी उदाहरण देते हैं । इसके अलावा, जब्ती विलंबता और अवधि भी इंजेक्शन के पाठ्यक्रम पर बदल जाते हैं । बरामदगी टॉनिक के लिए विलंबता अक्सर15घूरने के बाद के चरण में कम हो जाता है । इसके अलावा, जब्ती उत्तेजना एक लंबे समय तक जब्ती अवधि16के साथ है । आणविक जब्ती गंभीरता, विलंबता विनियमन तंत्र की जांच, और अवधि विरोधी मिरगी दवाओं17,18,19स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी है ।

बरामदगी आमतौर पर PTZ के एक प्रणालीगत प्रशासन द्वारा प्रेरित कर रहे हैं, और वसूली बहुत तेजी से 30 मिनट4,5के भीतर है । इस प्रकार, बरामदगी की संख्या PTZ-जलना मॉडल में अधिक नियंत्रणीय है । हालांकि, ईईजी मॉनिटरिंग ने संकेत दिया है कि सामान्यीकृत spikes के PTZ के बाद 12 घंटे के लिए देखा जा सकता है-मध्यस्थता बरामदगी20. इसलिए, जानवरों अधिमानतः myoclonic या टॉनिक बरामदगी21 के बाद 24 घंटे के लिए निरीक्षण के तहत जलना तंत्र के अधिक सटीक विश्लेषण के लिए रहना चाहिए ।

विरोधी के प्रशासन मिरगी दवाओं, जैसे ethosuximide, valproate, phenobarbital, vigabatrin, और retigabine3, से पहले या बाद PTZ इंजेक्शन जब्ती गंभीरता3,22की उत्तेजना को कम, 23. इसी तरह, नॉकआउट चूहों कि कमी बरामदगी गहरा में शामिल जीन, जैसे मैट्रिक्स metalloproteinase के रूप में-924, FGF-2225 और neuritin26, कई PTZ इंजेक्शन के बाद कम जब्ती गंभीरता प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है । इसके अलावा, मिरगी बरामदगी के बाद histopathological परिवर्तन देख इस विधि के साथ संभव है । अस्थायी पालि मिर्गी के साथ रोगियों में, मस्तिष्क में ठेठ ऊतकवैज्ञानिक परिवर्तन कर रहे हैं, इस तरह के रूप में काई फाइबर अंकुरण27,28, असामान्य दाना ंयूरॉन प्रवास29, astrogliosis30, न्यूरॉन्स सेल हिप्पोकैम्पस में मृत्यु31,३२, और हिप्पोकैम्पस स्केलेरोसिस३३। इसी तरह के परिवर्तन मिरगी मॉडल जानवरों में मनाया जाता है । उपलब्ध तरीकों के अलावा, PTZ मध्यस्थता रासायनिक जलना एक अच्छा, reproducible और सस्ती विधि मिर्गी के एक पशु मॉडल का उत्पादन करने के लिए है । एक pilocarpine में मध्यस्थता एसई मॉडल, जब्ती नियंत्रण मुश्किल है और कई चूहों मरने या एसई३४विकसित करने में विफल । इसके विपरीत, मृत्यु दर और जब्ती गंभीरता PTZ मॉडल में अधिक नियंत्रित कर रहे हैं । इसके अतिरिक्त, PTZ kainic एसिड से कम महंगा है, और माउस मस्तिष्क सर्जरी में कौशल दवा प्रशासन के लिए आवश्यक नहीं हैं ।

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Protocol

सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं टोक्यो मेट्रोपोलिटन चिकित्सा विज्ञान संस्थान की पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया । जन्मोत्तर 8-16-सप्ताह पुराने चूहों की सिफारिश कर रहे हैं । किसी भी नस्ल तनाव प्रयोग के लिए स्वीकार्य है । C57BL/6 चूहों और अधिक ptz के लिए प्रतिरोधी रहे हैं, जबकि बालब/सी और स्विस albino चूहों ptz के लिए और अधिक संवेदनशील हैं । C57BL/6 इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया । PTZ के लिए भेद्यता भी माउस की उंर पर निर्भर करता है । छोटे चूहों की तुलना में, पुराने चूहों३५PTZ करने के लिए और अधिक दुर्दम्य हैं । इस विधि के लिए इस्तेमाल जानवरों की संख्या भिन्न हो सकते हैं, लेकिन प्रत्येक शर्त के लिए कम से 6-10 पशुओं की आवश्यकता है ।

1. PTZ की तैयारी

  1. विघटन 2 मिलीग्राम/एमएल PTZ में ०.९% (डब्ल्यू/NaCl । उपयोग के दिन पर PTZ तैयार करते हैं ।

2. PTZ के इंजेक्शन

  1. 9:00 a.m. और 12:00 p.m. (दोपहर) के बीच सभी प्रयोगों को निष्पादित करें.
  2. पशु के शरीर के वजन को मापने ।
  3. आदी होना के लिए एक प्रेक्षण कक्ष में पशु प्लेस ।
  4. आदी होना अवधि के दौरान (3 मिनट), पशु और पहले से निर्धारित इंजेक्शन खुराक के शरीर के वजन के आधार पर इंजेक्शन के लिए PTZ समाधान की मात्रा की गणना ।
    नोट: उदाहरण के लिए, जब ३५ मिलीग्राम/kg ptz उपयोग किया जाता है, ०.८७५ मिलीग्राम ptz एक माउस के लिए आवश्यक है 25 जी (३५ मिलीग्राम/किग्रा x ०.०२५ kg = ०.८७५ मिलीग्राम) । इसलिए, ४३७.५ μL एक 2 मिलीग्राम/एमएल PTZ समाधान इंजेक्ट किया जाना चाहिए (०.८७५ mg/2 मिलीग्राम/एमएल = ०.४३७५ एमएल) । PTZ इंजेक्शन की खुराक माउस जीनोटाइप और तनाव पर निर्भर करता है । जंगली-प्रकार C57BL/6 चूहों के लिए, 30-35 मिलीग्राम PTZ/kg शरीर के वजन की एक खुराक पहले परीक्षण के लिए सिफारिश की है । PTZ संवेदनशीलता के लिए माउस३६,३७इस्तेमाल किया तनाव पर निर्भर करता है । इंजेक्शन खुराक प्रयोग के उद्देश्य के अनुसार भिन्न होती है ।
  5. एक 1-एमएल के साथ PTZ intraperitoneally इंजेक्षन एक 27 गेज सुई पशु के पेट के बाईं या सही वृत्त का चक्र से जुड़ी सिरिंज । midline पर इंजेक्शन लगाने से बचें ।
    1. एक ही स्थिति में दोहराया इंजेक्शन से बचें ।
  6. PTZ प्रशासन के बाद 30 मिनट के लिए पशु व्यवहार का पालन करें (आंकड़ा 1a), और वर्गीकृत और नीचे दिखाए गए के रूप में असामांय व्यवहार स्कोर । यदि संभव हो, 24 घंटे के लिए निरीक्षण के तहत जानवरों को रखने, या कम से कम एक अतिरिक्त 6-10 एच पोस्ट इंजेक्शन, विशेष रूप से एक बार जब्ती गंभीरता स्कोर 3 या इसके बाद के संस्करण तक पहुंचता है ।
    1. 30-ंयूनतम अवलोकन अवधि से परे जानवरों में किसी भी हल्के दौरे या व्यवहार में परिवर्तन पर ध्यान दें । यह लंबे समय तक अवलोकन अवधि मिर्गी में जीर्ण अकारण बरामदगी की पीढ़ी में PTZ की एक subconvulsive खुराक की एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण और पूर्ण प्रभाव को संबोधित कर सकते हैं ।
    2. इसके अलावा, जब्ती की अवधि में परिवर्तन जब्ती गंभीरता से संबंधित के रूप में एक मनाया जब्ती की जब्ती की अवधि को मापने । इसके अलावा, पहले बरामदगी के लिए विलंबता PTZ इंजेक्शन के बाद एक और महत्वपूर्ण उपाय है इकट्ठा करने के लिए । जब्ती आवृत्ति, अवधि की निगरानी, और विलंबता किसी भी पद जब्ती आणविक अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है ।
  7. हर दूसरे दिन PTZ इंजेक्षन (आंकड़ा 1a) । इंजेक्शन की संख्या प्रयोग के उद्देश्य पर निर्भर करता है । प्रतिनिधि उदाहरण इस प्रकार हैं ।
    1. करने के लिए पूरी तरह से प्रज्वलित पशुओं उत्पंन, एक बार एक जानवर 5 के एक स्कोर के साथ एक बरामदगी का अनुभव (टॉनिक-क्लोनल जब्ती), अतिरिक्त तीन प्रशासन के भीतर इंजेक्शन खत्म । इस मामले में, इंजेक्शन खुराक में वृद्धि अगर जब्ती स्कोर लगातार तीन प्रशासन के लिए वृद्धि नहीं करता है । प्रत्येक जानवर एक अलग संख्या और PTZ इंजेक्शन की खुराक प्राप्त कर सकते हैं ।
    2. संख्या और हर हालत में ptz इंजेक्शन की खुराक फिक्स ptz विरोधी मिर्गी दवाओं के आकलन में शामिल है और आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के phenotype के अध्ययन सहित । सभी जानवरों PTZ इंजेक्शन के एक ही नंबर दे; कुल 8 से 12 इंजेक्शन की सिफारिश की है । यदि एक जानवर मर जाता है, जब्ती स्कोर 6 के रूप में चिह्नित होना चाहिए ।
    3. इंजेक्शन खुराक एक उच्च जब्ती स्कोर (4 या 5) 10 या अधिक इंजेक्शन के लिए histopathological परिवर्तन है कि मिरगी बरामदगी होने का अध्ययन करने के लिए बनाए रखने के लिए आवश्यक निर्धारित करें । इस मामले में, कुल इंजेक्शन संख्या 25 से 30 तक की सीमा होनी चाहिए । अगर जब्ती स्कोर 5 तक पहुंच जाता है इंजेक्शन खुराक घटाएं । जब्ती स्कोर 3 या उससे कम करने के लिए कम हो जाती है, तो इंजेक्शन खुराक में वृद्धि.

3. जब्ती स्कोर

  1. पशु व्यवहार का पालन करें और स्कोर रिकॉर्ड ।
    1. वर्गीकृत और स्कोर मिरगी व्यवहार निम्नानुसार३८,३९ (चित्र 1b):
      0: सामांय व्यवहार, कोई विषमता ।
      1: स्थिरीकरण, पेट पर झूठ बोल रही है ।
      2: सिर हिलाना, चेहरे, forelimb, या hindlimb पेशी अवमोटन ।
      3: सतत पूरे शरीर पेशी अवमोटन, myoclonic बेवकूफ, पूंछ अब्बू आयोजित किया ।
      4: पालन, टॉनिक जब्ती, अपनी ओर से नीचे गिरने ।
      5: टॉनिक-क्लोनल जब्ती, अपनी पीठ पर नीचे गिरने, जंगली भागने और कूद ।
      6: मौत ।
  2. प्रायोगिक शर्तों के आधार पर रेसिन स्कोर४०के आधार पर व्यवहारिक मानदंड बदलें ।

4. पोस्ट-जब्ती विश्लेषण

  1. Immunohistopathological विश्लेषण
    1. छिड़काव निर्धारण
      1. तैयारी
        1. ०.१ M फास्फेट बफर (पीएच ७.४) में 4% (डब्ल्यू/वी) paraformaldehyde (पीएफए) भंग. 1 मीटर NaOH की एक बूंद के अलावा के साथ लगभग ७० ° c करने के लिए समाधान हीट (लगभग 1 µ l के 1 m NaOH के लिए ५० मिलीलीटर पीएफए समाधान).
        2. आइस-कोल्ड 4% पीएफए और फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पंजाब) तैयार करें ।
        3. एक ट्यूब और सुई के साथ, एक सिकुड़नेवाला पंप की स्थापना की । बाहर अवशेष साफ करने के लिए ट्यूब के माध्यम से पानी की लगभग 20 मिलीलीटर भागो । फिर, ट्यूब के खुले छोर को आइस-कोल्ड पंजाबियों में लगाएं ।
      2. Transcardial छिड़काव और सुलझी ब्रेन की तैयारी
        1. गहरा एक छोटे से जार में ५०% isoflurane/50% इथेनॉल के साथ माउस anesthetize ।
        2. अपने forelimbs और hindlimbs के सुझावों को पिन करके माउस को एक लापरवाह पोजीशन में रखें ।
        3. पेट के ventral midline को काटें और डायाफ्राम को बेनकाब करें ।
        4. लागत मार्जिन के साथ डायाफ्राम कट । फिर, पसलियों और शरीर के दोनों पार्श्व पक्षों में कटौती । असिरूप प्रक्रिया को लॉक संदंश द्वारा पिंच करें और रिब केज को एवर्ट । यह एक सुई के साथ लगाए या संदंश के साथ चुटकी द्वारा असिरूप प्रक्रिया की स्थिति को बनाए रखने. दिल बेनकाब ।
        5. बाईं निलय में सुई डालें और कैंची का उपयोग कर सही atrium में कटौती करते हैं । यह एक आंतरिक दीवार पियर्स कर सकते हैं के रूप में बहुत दूर दिल में सुई धक्का नहीं करने के लिए जागरूक हो ।
        6. सुई के माध्यम से बर्फ ठंडा पंजाबियों के एक सतत प्रवाह शुरू रक्त (लगभग 15-20 मिलीलीटर/
        7. जब रक्त शरीर से साफ हो गया है, एक 4% paraformaldehyde समाधान (लगभग ६० एमएल) बुलबुले के अलावा बिना ट्यूब ले जाएँ । उसके बाद, छिड़काव रोकें ।
        8. पीछे गर्दन और रीढ़ की हड्डी में कटौती और सिर की त्वचा और खोपड़ी के पृष्ठीय भाग के छिलके के साथ विदारक कैंची ।
        9. आंख की कक्षाओं के बीच premaxillary हड्डी में कटौती और पूरी तरह से खोपड़ी के पृष्ठीय भाग को हटा दें ।
        10. पीछे की ओर से मस्तिष्क और जुगल हड्डी के बीच एक अंतर पैदा करते हैं और मस्तिष्क के नीचे एक और नीचे के लिए और ऑप्टिक नसों chiasm में कटौती । ध्यान से मस्तिष्क को हटाने और इसे 4% पीएफए युक्त एक शीशी में जगह है । 12-16 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मस्तिष्क के बाद ठीक ।
    2. मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी
      1. समाधान में मस्तिष्क डूब जब तक 20% सुक्रोज/पंजाब के लिए फिक्स्ड ब्रेन स्थानांतरण cryoprotection के लिए अनुमति देने के लिए ।
      2. आवश्यक स्लाइस अभिविन्यास और मस्तिष्क के आवश्यक भाग के आधार पर फिक्स्ड मस्तिष्क में कटौती.
      3. cryomicrotome सेट करें । स्थिति में ब्लेड सेट और-20 डिग्री सेल्सियस के तहत एक तापमान पर microtome चरण बनाए रखने ।
      4. मंच पर पूर्व कट मस्तिष्क प्लेस और कोट 20% सुक्रोज के साथ मस्तिष्क/ सुक्रोज/पंजाबियों समाधान धीरे-धीरे स्थिर होगा, मंच पर मस्तिष्क को कवर, जब तक मस्तिष्क पूरी तरह से जमे हुए में एंबेडेड है 20% सुक्रोज/
      5. मस्तिष्क (30 µm मोटाई) ऊतक के माध्यम से ब्लेड फिसलने से स्लाइस । पंजाब में स्लाइस ट्रांसफर करें और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें ।
    3. फ्लोरोसेंट immunohistochemistry
      1. ०.१% ट्राइटन X-100/पंजाब (PBST) 10 मिनट, कमरे के तापमान (आरटी) में 3 बार के लिए आवश्यक स्लाइसें धो लें ।
      2. PBST में उंहें 2% बकरी सीरम या 5% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के लिए आर टी पर 1-2 एच के साथ मशीन द्वारा स्लाइस ब्लॉक ।
      3. 2% बकरी सीरम या 5% BSA के साथ PBST में प्राथमिक एंटीबॉडी के उपयुक्त एकाग्रता के साथ एक एंटीबॉडी समाधान में स्लाइसें 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 से 7 रात के लिए मशीन ।
      4. 10 मिनट, आरटी में 3 बार के लिए PBST में स्लाइस धो लें ।
      5. आरटी, प्रकाश की रक्षा में 1-2 एच के लिए PBST में माध्यमिक एंटीबॉडी के उपयुक्त एकाग्रता के साथ एक माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में स्लाइसें की मशीन ।
      6. कांच स्लाइड पर स्लाइस माउंट और बढ़ते मध्यम और कवर ग्लास के साथ कवर ।
      7. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ स्लाइस का निरीक्षण ।
  2. तीन चेंबर की परीक्षा
    1. तैयारी
      1. सबसे कम २ २-6 महीने पुराने 129/एसवी चूहों के रूप में एक ही लिंग के विषय चूहों के लिए "अजनबी माउस." विश्लेषण से पहले सभी चूहों को पिंजरे में Habituate । प्रत्येक प्रशिक्षण सत्र के लिए, पिंजरे में माउस प्लेस और 15 मिनट के लिए माउस छोड़ दें ।
      2. विषय माउस के साथ प्रत्येक आदी होना चरण से पहले, ७०% इथेनॉल के साथ सतह पोंछते हुए पूरे तंत्र और दोनों पिंजरों साफ ।
      3. 3 चैंबर उपकरण के दो पक्ष कक्षों में खाली पिंजरों प्लेस और चैंबरों के बीच दरवाजे खोलो ।
      4. विषय माउस habituate करने के लिए, केंद्र कक्ष में एक विषय माउस जगह और माउस को स्वतंत्र रूप से उपकरण भर में स्थानांतरित करने के लिए जब तक माउस दोनों पिंजरों की जांच की है, प्लस एक अतिरिक्त 5 मिनट । विषय जानवरों है कि पिंजरे के डर से हो सकता है नहीं 20 मिनट के लिए पिंजरे की जांच और इस विश्लेषण के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए । ऐसे जानवर पिंजरे से बचते हैं और शायद ही कभी पिंजरे के करीब आते हैं ।
      5. केंद्र कक्ष में पशु चाल के बाद, दरवाजे बंद करो और माउस को स्वतंत्र रूप से 5 मिनट के लिए केंद्र कक्ष में ले जाने के लिए । इस अवधि के दौरान, एक पिंजरे में 129/Sv चूहों में से एक डाल पिंजरे में habituate करने के लिए ।
    2. सामाजिकता विश्लेषण
      1. विषय माउस की आदी होना अवधि के तुरंत बाद इस विश्लेषण को पूरा करना ।
      2. एक 129/एसवी माउस वाले पिंजरे प्लेस, "अजनबी 1 पिंजरा", पक्ष कक्षों में से एक में और खाली पिंजरे जगह है, "वस्तु पिंजरे", दूसरे पक्ष के चैंबर में शब्द ।
      3. दरवाजा खोलो और विषय माउस के व्यवहार की निगरानी ।
      4. 10 मिनट के लिए स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने के लिए विषय माउस की अनुमति दें और निम्न व्यवहार पैरामीटर रिकॉर्ड. यदि विषय माउस अजनबी 1 पिंजरे में माउस का डर है, के रूप में अजनबी 1 पिंजरे से परहेज और कक्षों में से एक के कोने में शेष से संकेत के रूप में, पशु विश्लेषण के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए ।
        एक) प्रत्येक चैंबर में बिताया समय, अजनबी 1 चैंबर, वस्तु चैंबर, और केंद्र चैंबर.
        ख) समय प्रत्येक पिंजरे की जांच खर्च, अजनबी 1 पिंजरे और वस्तु पिंजरे । (माउस पिंजरे की जांच के रूप में वर्गीकृत अगर माउस सूंघने या माउस या पिंजरे कठिन है)
        ग) प्रत्येक कक्ष में प्रवेश द्वार की संख्या (वैकल्पिक)
        घ) कुल दूरी यात्र (वैकल्पिक)
      5. के बाद माउस केंद्र कक्ष में ले जाता है, दरवाजे बंद करो ।
    3. सामाजिक नवीनता विश्लेषण
      1. सामाजिकता विश्लेषण के तुरंत बाद इस विश्लेषण को जारी रखें ।
      2. ७०% इथेनॉल के साथ दोनों पिंजरों पोंछ ।
      3. पिंजरों में से एक में एक और 129/एसवी माउस प्लेस, "अजनबी 2 पिंजरे" और जगह अजनबी कक्षों में से एक में 2 पिंजरे । दूसरे पिंजरे में अजनबी 1 माउस प्लेस, "अजनबी 1 पिंजरे" करार, और अजनबी दूसरे कक्ष में 1 पिंजरे जगह है ।
      4. दरवाजा खोलो और विषय माउस के व्यवहार की निगरानी ।
      5. 10 मिनट के लिए स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने के लिए विषय माउस की अनुमति दें, और सामाजिकता विश्लेषण के लिए वर्णित एक ही व्यवहार मापदंडों को मापने.
        नोट: अजनबी 1 और अजनबी 2 माउस बेतरतीब ढंग से चुना जाना चाहिए । अजनबी 1 चैंबर और वस्तु चैंबर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अजनबी 1 चैंबर और अजनबी 2 चैंबर बेतरतीब ढंग से निर्धारित किया जाना चाहिए ।
  3. प्रासंगिक भय भेदभाव
    1. कंडीशनिंग
      1. प्रत्येक कंडीशनिंग परीक्षण से पहले, ७०% इथेनॉल के साथ सतह पोंछते द्वारा प्रायोगिक तंत्र को साफ ।
      2. विशिष्ट स्थितियों के साथ एक कंडीशनिंग तंत्र में एक माउस प्लेस (उपकरण आकार, दीवार रंग, फर्श सामग्री, गंध, प्रकाश, और पृष्ठभूमि शोर मात्रा पूर्व निर्धारित किया जाना चाहिए) । उदाहरण के लिए, यहां इस्तेमाल कंडीशनिंग उपकरण स्पष्ट सामिल दीवारों, एक धातु ग्रिड फर्श, एक इथेनॉल गंध, १०० लक्स चमक, और ६५-dB पृष्ठभूमि सफेद शोर के साथ एक वर्ग उपकरण था ।
      3. स्तर के साथ सदमे से माउस शर्त ०.१-mA बिजली के झटके के छद्म यादृच्छिक समय के साथ 2 एस एक्स 5 मिनट के पाठ्यक्रम पर 3 बार ।
      4. घर के पिंजरे में चूहे को कंडीशनिंग के बाद लौटाएं ।
    2. स्मृति आकलन
      1. प्रत्येक आकलन से पहले, ७०% इथेनॉल के साथ सतह पोंछते द्वारा प्रायोगिक तंत्र को साफ ।
      2. कंडीशनिंग के बाद अगले दिन, सदमे हालत के रूप में एक ही उपकरण में माउस जगह और 5 मिनट के पाठ्यक्रम पर ठंड समय को मापने ।
      3. बाद में उसी दिन, एक उपंयास तंत्र में माउस प्लेस और एक 5 मिनट के आकलन के दौरान ठंड समय उपाय । सफेद सामिल दीवारों, प्लेट फ्लोर, कोई गंध, 30 लक्स चमक, और ७०-dB सफेद शोर के साथ एक त्रिकोणीय उपकरण यहां इस्तेमाल किया गया था ।
      4. एक ही शर्त और उपंयास हालत के बीच ठंड समय की तुलना करें । एक सामांय स्मृति क्षमता के साथ चूहों उपंयास हालत में से एक ही हालत में और अधिक स्थिर होगा । ठंड से अधिक 2 एस के लिए पशु की गतिशीलता परिभाषित किया गया है ।

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Representative Results

के दोहराव इंजेक्शन PTZ बरामदगी गंभीरता में वृद्धि लाती है । छह C57BL/6 चूहों PTZ साथ इलाज किया गया, और एक और 6 चूहों एक नियंत्रण समूह के रूप में खारा के साथ इलाज किया गया । PTZ खुराक था ३५ मिलीग्राम/kg, और 10 इंजेक्शन प्रशासित थे । जब्ती स्कोर-धीरे PTZ इंजेक्शन के साथ वृद्धि हुई है, जबकि कोई बरामदगी या असामांय व्यवहार खारा इंजेक्शन (चित्रा 2) द्वारा पैदा किए गए थे । Bonferroni परीक्षण के बाद ANOVA PTZ इलाज समूह और खारा-इलाज समूह के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर दिखाया ।

दोहराव जब्ती ंयायपालिका axonal शाखा गठन (काई फाइबर अंकुरण) और हिप्पोकैम्पस में granules कोशिकाओं के असामान्य प्रवास को बढ़ावा देता है । चूहों 25 इंजेक्शन के लिए PTZ के साथ इलाज किया गया (खुराक के बीच समायोजित किया गया था 24 मिलीग्राम/किग्रा और ३५ मिलीग्राम/एक गंभीर जब्ती की वजह से मौत उत्प्रेरण के बिना चूहों में गंभीर बरामदगी बनाए रखने के लिए). माउस दिमाग अंतिम इंजेक्शन के 3 सप्ताह बाद तय किया गया । नियंत्रण दिमाग PTZ इंजेक्शन से पहले तय कर रहे थे । मस्तिष्क स्लाइस विरोधी synaptoporin (एक्स ५००) और विरोधी ZnT3 (एक्स ५००) एंटीबॉडी के साथ immunostained थे काई फाइबर अंकुरण (आंकड़ा 3ए) और विरोधी doublecortin एंटीबॉडी (एक्स २००) के साथ का पालन करने के लिए granules कोशिकाओं के असामान्य प्रवास का पालन ( चित्र 3ए) । एक दाना सेल परत में अंकुरण काई फाइबर PTZ-इलाज स्लाइस (3ए) में मनाया गया । नवजात दाना कोशिकाओं, जो doublecortin के लिए immunoreactive रहे हैं, PTZ इलाज स्लाइस (3ए) में hilus के भीतर मनाया गया । दाना कोशिका परत और hilus 3 ए चित्रा में दिखाया गया है चित्र बीमें सचित्र है ।

दोहराव बरामदगी भी चूहों के सामांय व्यवहार ख़राब । बारह C57BL/6 चूहों PTZ के साथ इलाज किया गया (३५ मिलीग्राम/किग्रा, 10 इंजेक्शन), और एक और 12 चूहों खारा के साथ एक नियंत्रण समूह के रूप में इलाज किया गया । दो सप्ताह के अंतिम इंजेक्शन के बाद, चूहों में विश्लेषण किया गया एक 3-चैंबर परीक्षण (चित्रा 4a) और प्रासंगिक डर भेदभाव परीक्षण (चित्र 5 ए). PTZ इलाज चूहों सामांय सामाजिकता दिखाया (चित्रा 4B) । चूहों अजनबी 1 कक्ष में वस्तु चैंबर (खारा: p = ०.००३, ptz: p = ०.०२७) में अधिक समय बिताया और अजनबी 1 पिंजरे की जांच से अधिक वे वस्तु पिंजरे (खारा: p = ०.००९, ptz: p = ०.००४) की जांच की । हालांकि, PTZ इलाज चूहों असामांय सामाजिक नवीनता (आंकड़ा 4c) बिगड़ा सामाजिक स्मृति का संकेत दिखाया । नियंत्रण चूहों अजनबी 1 कक्ष की तुलना में अजनबी 2 चैंबर में अधिक समय बिताया है और अजनबी 2 पिंजरे से अधिक की जांच की तुलना में वे अजनबी 1 पिंजरे की जांच की, जबकि जलाने चूहों समय में किसी भी महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखा था कक्षों में बिताए या समय पिंजरों की जांच खर्च (चैंबर में समय: खारा: पी = ०.००६, PTZ: p = ०.१२६ । समय की जांच: खारा: p = ०.००२, PTZ: p = ०.४२६) । PTZ इलाज चूहों भी प्रासंगिक डर परीक्षण (चित्रा 5B) में बिगड़ा स्मृति दिखाया । नियंत्रण चूहों उपंयास हालत में की तुलना में सदमे की हालत में एक लंबी ठंड समय दिखाया, जबकि ptz इलाज चूहों ठंड समय में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखा (खारा: p < ०.००१, PTZ: p = ०.०६०) । सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए ख़राब टी-टेस्ट किए गए ।

Figure 1
चित्र 1: प्रोटोकॉल का संक्षिप्त विवरण । (A) PTZ-मध्यस्थता जलना की योजनाबद्ध चित्रण । (ख) संबंधित जब्ती स्कोर के लिए प्रतिनिधि पशु व्यवहार के चित्र । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: ऐंठन व्यवहार का आकलन । मतलब जब्ती स्कोर ग्राफ में संकेत कर रहे हैं । प्रत्येक हालत में छह चूहों का इस्तेमाल किया गया था, और इंजेक्शन की एक श्रृंखला बाहर ले जाया गया था । प्रत्येक इंजेक्शन के बाद, जब्ती स्कोर पर नजर रखी और रन बनाए । खारा इंजेक्शन की तुलना में, PTZ इंजेक्शन काफी जब्ती गंभीरता (पी < ०.००१: दोहराया-उपाय ANOVA) वृद्धि हुई है । प्रत्येक जब्ती स्कोर मतलब ± SEM के रूप में दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: PTZ मध्यस्थता काई फाइबर अंकुरण और granules कोशिकाओं के असामान्य प्रवास । (क) जलना (बाएँ) से पहले और जलना (दाएँ) के बाद चूहों के हिप्पोकैम्पस स्लाइस की hilus, दानेदार परत, और आणविक परत की अधिकतम अनुमानित immunohistochemical छवियाँ. एंटी-synaptoporin (टॉप) और एंटी-ZnT3 एंटीबॉडी (मिडिल) का इस्तेमाल axons को दाना न्यूरॉन्स (मॉस फाइबर) की कल्पना के लिए किया जाता था । एंटी doublecortin एंटीबॉडी नवजात दाना न्यूरॉन्स (नीचे) कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. PTZ-मध्यस्थता दोहराव बरामदगी काई फाइबर अंकुरण प्रेरित (तीर) और hilus (ऐरोहेड) में granules कोशिकाओं के असामान्य प्रवास । स्केल बार, ५० माइक्रोन । प्रत्येक छवि की अनुमानित स्थिति में (B) दर्शाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: PTZ मध्यस्थता असामांय सामाजिक व्यवहार । (A) 3-चैंबर परीक्षण के योजनाबद्ध चित्रण । (ख) प्रत्येक कक्ष में बिताए गए समय का अर्थ राशि और सामाजिकता परीक्षण में प्रत्येक पिंजरे की जांच करने में लगने वाले समय का अर्थ राशि दर्शाया गया है. (ग) प्रत्येक कक्ष में बिताए गए समय का अर्थ राशि और सामाजिक नवीनता परीक्षण में प्रत्येक पिंजरे की जांच करने में लगने वाले समय का अर्थ राशि दर्शाया गया है. दोनों PTZ-और खारा व्यवहार समूहों में बारह चूहे थे । PTZ मध्यस्थता बरामदगी प्रेरित असामांय सामाजिक व्यवहार (* * * p < ०.००१, एन एस = महत्वपूर्ण नहीं) । हर समय मतलब ± SEM के रूप में दिखाए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: PTZ-मध्यस्थता स्मृति हानि । (A) प्रासंगिक भय भेदभाव परीक्षण के योजनाबद्ध चित्रण । (ख) प्रत्येक दशा में जमने वाले समय का अर्थ प्रतिशत दर्शाया गया है. दोनों PTZ-और खारा व्यवहार समूहों में बारह चूहे थे । ग्राफ से पता चलता है ± SEM. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां, हम मिर्गी के एक औषधीय पशु मॉडल की स्थापना के लिए एक व्यापक रूप से सुलभ प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । PTZ मध्यस्थता रासायनिक जलना एक लंबा इतिहास है और histopathology और मिर्गी४१के सेलुलर विकृति विज्ञान के अध्ययन के लिए एक सामांय रूप से स्वीकार किए जाते है मॉडल है । मिर्गी का रासायनिक जलना मॉडल Suzdak और Jansen, १९९५४२द्वारा पहले की समीक्षा की गई है । विशेष रूप से PTZ के साथ औषधीय जब्ती प्रेरण, गंभीर बरामदगी पैदा करने के लिए एक आसान और सरल तरीका है । इंजेक्शन खुराक में परिवर्तन बरामदगी गंभीरता के साथ सहसंबंधी बनाना । इस प्रकार, PTZ खुराक बदलकर कई परीक्षणों पर उचित खुराक की पहचान और परिणामी व्यवहार की जांच बहुत आसान है ।

कई शोधकर्ताओं ने मिर्गी के मॉडल के रूप में चूहों में नॉकआउट या दस्तक बनाने का प्रयास किया है और चूहों का उत्पादन करने में सफल रहा है कि प्रदर्शन सहज बरामदगी४३,४४. हालांकि, औषधीय जब्ती प्रेरण अभी भी मिर्गी के लिए एक अच्छा मॉडल माना जाता है । जब्ती के लिए एक अंय आम विधि जीन संशोधन के अलावा अंय एक जानवर के मस्तिष्क में इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपन और electroshock मध्यस्थता बरामदगी उत्प्रेरण शामिल है । इस विधि महंगा है, मुश्किल है, और मस्तिष्क5में सटीक लोकस पर इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपण करने के लिए शल्य चिकित्सा कौशल की आवश्यकता है ।

आक्षेपों की रासायनिक प्रेरण कम लागत2,4पर epileptogenesis और एंटी-मिरगी दवा स्क्रीनिंग की तेजी से जांच में सक्षम बनाता है । आवृत्ति और सहज बरामदगी की गंभीरता और एसई इस्तेमाल दवा के आधार पर बदलती हैं । Kainic एसिड और pilocarpine मुख्य रूप से एसई और बाद में पुरानी सहज या आवर्तक बरामदगी४५,४६,४७भड़काने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । दूसरी ओर, PTZ दोनों को बढ़ावा देने के एसई जब एक उच्च खुराक में दिया और रासायनिक जब एक subconvulsive खुराक४८,४९में दी पशुओं को जलाने के विकास के लिए प्रयोग किया जाता है । इसके अलावा, ऐंठन दवाओं के तंत्र है कि बरामदगी प्रेरित अच्छी तरह से जाना जाता है । इस प्रकार, जब्ती पैदा करने के लिए आवश्यक तंत्र को अवरुद्ध विरोधी मिरगी दवाओं की पहचान करने में मदद कर सकते हैं । दूसरी ओर, आनुवंशिक मॉडल तंत्र है कि मिरगी बरामदगी५०आह्वान की जांच करने के लिए आवश्यक हैं । के बाद तंत्र द्वारा जो बरामदगी प्रेरित कर रहे है आविर्भाव, विरोधी मिरगी दवाओं की स्क्रीनिंग शुरू किया जा सकता है ।

प्रतिनिधि यहां दिखाए गए परिणामों में, पशु व्यवहार PTZ प्रशासन के बाद 30 मिनट के लिए मनाया गया । हालांकि, के रूप में प्रोटोकॉल अनुभाग में उल्लेख किया है, पशु व्यवहार अधिमानतः 24 घंटे के लिए मनाया जाता है या कम 6-10 h PTZ इंजेक्शन के बाद, विशेष रूप से एक बार जब्ती स्कोर 3 या उच्चतर तक पहुंचता है । हालांकि एक पशु निगरानी प्रणाली पूरे दिन के लिए पशु का निरीक्षण करने के लिए आवश्यक हो सकता है, एक लंबे समय तक अवलोकन मिर्गी की गहरी समझ प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, जब्ती की अवधि और जब्ती विलंबता जमा करने के लिए उपयोगी उपाय कर रहे हैं । ये माप महत्वपूर्ण है जब जब्ती की अवधि और समय और बरामदगी गंभीरता को विलंबता में परिवर्तन से संबंधित ।

रसायनिक रूप से जलाने वाले पशुओं की बरामदगी उपरांत histopathology की जांच की गई है, खासकर हिप्पोकैम्पस में । दोहराव बरामदगी या एसई काई फाइबर प्रेरित27,28, नवजात दाना न्यूरॉन्स के असामान्य प्रवास25,29, हिप्पोकैम्पस30में astrogliosis, और पिरामिडीय न्यूरॉन्स की apoptosis अंकुरित 31 , ३२. मस्तिष्क में ये ऊतकवैज्ञानिक परिवर्तन मिरगी रोगियों में स्नायविक कार्यों को बाधित करते हैं. उदाहरण के लिए, autism स्पेक्ट्रम विकारों (एएसडी) और बौद्धिक विकलांगता (आईडी) के साथ मिर्गी के संघ अच्छी तरह से मांयता प्राप्त है५१,५२,५३। चाहे मिरगी बरामदगी प्रेरित एएसडी और आईडी या एएसडी और आईडी प्रेरित मिरगी लक्षण अभी भी एक जटिल सवाल है । हाल के अध्ययनों से पता चला है कि PTZ मध्यस्थता बरामदगी एएसडी की तरह सामाजिक-संज्ञानात्मक विकलांगता५४ और पहचान घाटे ५५,५६,५७सीखने की तरह प्रेरित । इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि मिर्गी की मध्यस्थता histopathology में न्यूरॉनिक शिथिलता और मनोरोग विकारों को बाहर निकालना.

मिर्गी से पदोन्नत ऊतकवैज्ञानिक परिवर्तन जब्ती प्रेरण के बाद विकसित करने के लिए समय ले लो । इस संबंध में, औषधीय जब्ती प्रेरण लाभप्रद है क्योंकि शोधकर्ताओं समय, संख्या और पशुओं में बरामदगी की गंभीरता को नियंत्रित कर सकते हैं । जिनमें रासायनिक जलना, epileptogenesis के पशु मॉडल्स मिर्गी प्रेरणीय और संबंधित neurophysiological विकारों के दोनों तंत्र की जाँच को बढ़ावा देना जारी रखेगा.

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव की घोषणा ।

Acknowledgments

यह काम आंशिक रूप से JSPS KAKENHI अनुदान संख्या २४७००३४९, २४६५९०९३, २५२९३२३९, JP18H02536, और 17K07086, MEXT KAKENHI अनुदान संख्या २५११०७३७ और २३११०५२५, एमएड अनुदान संख्या JP18ek0109311, और SENSHIN मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन और जापान द्वारा समर्थित किया गया मिर्गी रिसर्च फाउंडेशन ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pentylenetetrazole Sigma-Aldrich P6500
Sodium chloride MANAC 7647-14-5
Mouse CLEA Japan C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male
Syringe (1mL) Terumo SS-01T
Needle(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm) Terumo NN-2719S
Weighing scale Mettler PE2000 This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&D company.
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Sodium hydroxide nacalai tesque 31511-05
Peristatic pump ATTO SJ1211
Sucrose nacalai tesque 30404-45
Microtome Yamato REM-700 This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710
Microtome blade Feather S35
Triton X-100 Sigma-Aldrich X-100
anti-synaptoporin antibody Synaptic systems 102 002
anti-ZnT3 antibody Synaptic systems 197 002
anti-doublecortin Santa Cruz sc-8066 This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).
Contextual fear discrimination test apparatus O'hara
Three chamber test apparatus Muromachi

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Pentylenetetrazole-प्रेरित जलना माउस मॉडल
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Shimada, T., Yamagata, K.… More

Shimada, T., Yamagata, K. Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model. J. Vis. Exp. (136), e56573, doi:10.3791/56573 (2018).

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