Summary
このプロトコルは pentylenetetrazole と化学的キンドリングの方法を記述しててんかんのマウス モデルを提供します。このプロトコルはマウスのてんかん発作後発作誘導と病態への脆弱性を調査するも使用できます。
Abstract
Pentylenetetrazole (PTZ) は、GABA 受容体の拮抗薬です。Subconvulsive 線量の連続注射化学たき、てんかんモデルの開発に使用されているに対し、動物に PTZ の腹腔内投与は高用量で急性、重症発作を誘発します。PTZ の低用量注射なし痙攣発作を誘発します。ただし、PTZ の繰り返し低用量注射はけいれん発作を引き起こす閾値を低下します。最後に、PTZ の連続の低用量投与は重度の強直間代発作を誘発します。このメソッドは、単純なてんかんのけいれん発作を反復を含む慢性疾患として定義される病態の調査に広く適用できます。プロトコルをたきこの化学物質は、動物の反復的な発作を引き起こします。この方法では、ptz カメラを介した発作やてんかん発作の悪化の程度への脆弱性が推定されました。これらの利点は、抗てんかん薬、てんかん関連遺伝子をスクリーニングするためのこのメソッドの使用につながっています。さらに、このメソッドは、てんかん患者の脳の組織学的変化は、化学焚かれ動物の脳にも表示されますので、てんかん発作後神経損傷を調査する使用されています。したがって、このプロトコルは、便利なてんかんモデル動物の作成に便利です。
Introduction
てんかんは、慢性神経疾患再発発作によって特徴付けられる、人々 の約 1% に影響を与えます。てんかん患者におけるてんかんと発作の生成の基になるメカニズムは、臨床試験で完全に明らかにできません。したがって、適切な動物モデルがてんかん1の調査のために必要です。
さまざまなてんかん動物モデルは、てんかんの生理学を調査し、抗てんかん薬2,3を識別するために使用されています。これらのモデルの間では、薬理学的発作誘導、てんかん4の病理学の調査のための動物モデルを生成するために使用する一般的な方法です。このメソッドは、安価で簡単です。電極を介したたきは、一般的に使用される方法が、この手順のコストが高いとメソッド反復発作5を誘導する手術や電気のスキルが必要です。
薬理学的誘導は、タイミングと発作の数をコントロールしやすいためにも便利です。自発的な発作を示す遺伝的マウスモデルもてんかんの研究に使用されます。しかし、これらの遺伝的モデルで発作が発生するタイミングと頻度を予測不可能6可能性があります。監視システムは遺伝子改変マウス6のてんかんの行動を観察する必要があります。
カイニン酸、ピロカルピン、pentylenetetrazole (PTZ) は、発作を誘発する薬7として広く使用されます。カイニン酸はグルタミン酸受容体のアゴニスト、ピロカルピンがコリン作動性受容体を活性化します。PTZ は、γ アミノ酪酸 (GABA) の受容体拮抗薬8。PTZ は、神経活動の増加につながる抑制性シナプスの機能を抑制します。この規制は、動物9の一般化された発作を引き起こします。カイニン酸とピロカルピンの単回投与は、急性発作、特にステータスてんかん重積 (SE)10,11を引き起こすことができるおよび慢性特発性と再発発作12を促進するカイニン酸やピロカルピン-仲介された SE,13。 脳波 (EEG) 録音と行動分析が自発的再発性発作が注射12,13の後の月を観察が示されています。PTZ の痙攣投与量の単回投与は、急性発作を誘導します。ただし、PTZ の単一投与後慢性特発性発作は促進するために困難です。PTZ の慢性投与は、反復発作14を誘導する必要があります。いずれかの方法で繰り返し発作の発生は急性発作の世代よりもより類似している人間のてんかんの病理を誘導することができます。PTZ、場合各注射を呼び起こす、発作と発作の重症度は、各注入と段階的により深刻になります。最後に、低用量の PTZ 注射は重度の強直間代発作を誘発します。このフェーズでは、各注入は重篤な発作を連想させます。さらに、発作の待ち時間と実行時間注射のコースに変更もできます。強直発作に待ち時間はしばしば15をたき付けの後者の段階で短くなります。さらに、発作悪化長期発作期間16と一緒に伴われます。発作の重症度を調節する分子メカニズムを解明、待機時間、および期間は、抗てんかん薬17,18,19をスクリーニングするため便利です。
発作は、PTZ の単一の全身投与によって引き起こされる一般的と回復は非常に速く、30 分4,5以内。したがって、発作の数は PTZ キンドリング モデルでより制御可能です。ただし、脳波モニタリングは PTZ を介した発作20後 12 h まで一般化されたスパイクを見ることができることを示しています。したがって、点火機構のより正確な分析のためのまたはミオクロニー強直発作21後 24 時間観察下動物のまま好ましく。
PTZ 注入の前後に抗てんかん薬のエトスクシミド、バルプロ酸、フェノバルビ タール、vigabatrin、retigabine3など管理が発作重症度3,22の悪化を軽減します。 23。同様に、ノックアウト マウス マトリックス マトリックスメタロプロテアーゼ 924などの発作の増悪に関与して欠如遺伝子が、FGF 2225と neuritin26, を使用することを複数の PTZ 注射後減らされた発作の重症度を展示する示されています。さらに、てんかん発作はこのメソッドの後に病理組織学的変化を観察しています。側頭葉てんかん患者、苔状線維が発芽して27,28, 異常な顆粒ニューロン移行29、アストログリオーシス30, 神経細胞のような頭脳で典型的な所見があります。海馬31,32海馬硬化33年死去。同様の変化は、てんかんモデル動物で観察されます。利用可能なメソッドの中で化学的キンドリングの PTZ を介したはてんかん動物モデルを生成する、再現性のある良いと安価な方法です。ピロカルピンを介した SE モデルで発作のコントロールが難しく、多くのマウスが死ぬか SE34を開発する失敗します。対照的に、死亡率と発作の重症度は、PTZ モデルでより制御されます。また、PTZ、カイニン酸よりも安価、マウス脳外科のスキルは薬剤の投与は必須ではありません。
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Protocol
すべての実験手順は、動物のケアおよび使用委員会の東京都医科学研究所によって承認されました。生後 8 - 16 週齢のマウスはお勧めします。任意の交は、実験のため許容されます。C57bl/6 マウス BALB/c とスイスのアルビノ マウス、ptz カメラより敏感に対し ptz カメラより耐性があります。C57BL/6 は、この研究で使用されました。Ptz カメラの脆弱性は、マウスの年齢によっても異なります。若いマウスと比較して、古いマウスは、PTZ35より耐火物。このメソッドに使用される動物の数が異なることが、少なくとも 6-10 動物が条件ごとに必要です。
1. PTZ の準備
- 2 mg/mL PTZ 滅菌 0.9% (w/v) 塩化ナトリウムを溶解します。当日使用の ptz カメラを準備します。
2. PTZ の注入
- 9:00 と 12:00 (正午) の間のすべての実験を実行します。
- 動物の体重を測定します。
- 慣れのため観察室に動物を配置します。
- (3 分) の馴化期間中 PTZ 動物や、以前に決定された投与の体重に基づく注射剤の量を計算します。
注: たとえば、35 mg/kg ptz カメラを使用すると、PTZ の 0.875 mg は 25 グラムの重量を量るマウスに必要な (35 mg/kg × 0.025 kg = 0.875 mg)。2 mg/mL PTZ ソリューションの 437.5 μ L 注入してしたがって、(0.875 mg/2 mg/mL = 0.4375 mL)。PTZ の注入量は、マウスの遺伝子型とひずみに依存します。野生型 c57bl/6 マウス最初の試験、30-35 mg PTZ/kg 体重の投与量を使用することをお勧めします。Ptz カメラの感度は、マウス使用株報36,37に依存します。注射の投与量は、実験の目的によって異なります。 - 動物の腹部の左または右の象限に 27 g 針に接続されている 1 mL 注射器で PTZ を腹腔内注入します。正中線に注入することは避けてください。
- 同じ位置に繰り返し注射を避けてください。
- PTZ (図 1 a)、投与後 30 分間、動物の行動を観察し、分類スコア異常行動を次のように。可能であれば、特にになったら発作重症度スコア 3 以上は、24 h、または、少なくともさらに 6-10 時間の投与後、観察の下で動物を飼います。
- 任意の軽度の発作または 30 分観察期間を超えて動物の行動の変化に注意してください。これは長期観察期間てんかんの慢性のいわれのない発作の世代で PTZ の subconvulsive 線量の特に重要な影響に対処することです。
- さらに、発作の重症度に関連するメジャーな発作期間の変更として各観測発作の発作期間。また、PTZ 注射後最初の発作に待ち時間は、収集するもう一つの重要な指標です。発作頻度、期間、および待機時間を監視、発作後の分子研究のため重要です。
- PTZ の毎日 (図 1 a) を挿入します。注射の数は、実験の目的によって異なります。代表的な例は次のとおりです。
- 動物はスコア 5 (強直間代発作) の発作を経験したら、完全に燃やし動物を生成するには、追加の 3 政権内注入を終了します。3 つの連続した政権の奪取のスコアが向上しない場合この場合、注射投与量を増加します。それぞれの動物は異なる番号と PTZ 注射の用量を受信できます。
- PTZ、抗てんかん薬の評価、遺伝子改変マウスの表現型の研究などへの脆弱性を評価するすべての条件の数と PTZ 注入量を修正します。すべての動物に PTZ 注入; の同じ数を与える合計 8 に 12 の注射をお勧めします。動物が死亡した場合発作スコアは 6 として示されるべきであります。
- 高発作を維持するために必要な注射の用量を決定するてんかん発作が発生する病理組織学的変化を研究する 10 以上の注射用 (4 または 5) を獲得します。この場合、総噴射数は 25 から 30 の範囲する必要があります。発作スコア 5 に達すると注入量を減らします。発作スコア 3 以下が縮小した場合は、注射投与量を増やします。
3. 発作のスコア
- 動物の行動を観察し、スコアを記録します。
- 分類し、続く38,39 (図 1 b)、てんかんの行動のスコアします。
0: 正常な動作、異常無し。
1: 固定、腹の上に横たわる。
2: 頭うなずいて、顔、前肢または後肢ミオクローヌス。
3: 継続的な全身のミオクローヌス、ミオクロニー ピクピク、尾がかたく開催。
4: 飼育、トニックの奪取、その側に落ちる。
5: 野生急いでとジャンプ、その裏に落ちて、強直間代発作です。
6: 死。
- 分類し、続く38,39 (図 1 b)、てんかんの行動のスコアします。
- ラシーン スコア40、実験の状況に基づく行動基準を変更します。
4. 発作後分析
- 今回の分析
- 灌流固定
- 準備
- 4% (w/v) パラホルムアルデヒド (PFA) を 0.1 M リン酸緩衝液 (7.4) に溶かしてください。約 70 ° C に 1 M 水酸化ナトリウム (50 mL PFA ソリューションの 1 M 水酸化ナトリウム約 1 μ L) のドロップを追加するソリューションを加熱します。
- 準備冷えた 4 %pfa とリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)。
- 針と管の蠕動性ポンプを設定します。残留をクリアするための管を通って約 20 mL の水を実行します。次に、氷冷 PBS で管の開口端を置きます。
- Transcardial 血流と固定の脳の準備
- 深く小さな瓶で 50 %isoflurane/50% エタノールとマウスを麻酔します。
- 仰臥位で、前肢と後肢の先端を固定することでマウスを維持します。
- 腹部の腹側正中線をカットし、横隔膜を公開します。
- 横隔膜を肋骨の縁に沿ってカットします。その後、リブとボディの両方の側面をカットします。ロックの鉗子で剣状突起をつまみ、胸郭を片脚します。針で固定または鉗子でつまんで、剣状突起の位置を維持します。心を公開します。
- 左心室に針を挿入し、はさみを使用して右心房に切れ込み。内部の壁に穴を開けることができると心臓に針をあまりプッシュしないように注意してください。
- (約 15 ~ 20 mL/分) 血液を洗浄するための針を通して氷冷 PBS の着実な流れを開始します。
- 体から血液を選択解除すると、泡の添加せず 4% パラホルムアルデヒド溶液 (約 60 mL) にチューブを移動します。灌流を停止します。
- 背面の首と背骨を切り取って頭の皮膚とはさみを解剖で頭蓋骨の背の部分をはがします。
- 眼窩間属の骨を切り、頭蓋骨の背の部分を完全に削除します。
- 後方から jugal 骨と脳の間のギャップを作成し、脳の下に三叉神経と視交叉をカットします。慎重に脳を削除し、4% を含むバイアルに PFA。12-16 h のための 4 ° C で脳を修正後。
- 準備
- 脳スライス標本
- 脳に対する凍害保護作用を可能にするソリューションに沈むまで 20% スクロース/PBS に固定脳を転送します。
- 必要なスライス方向と脳の必要な部品に基づく固定脳をカットします。
- Cryomicrotome を設定します。位置にブレードをセットし、温度-20 ° C 未満にミクロトーム ステージを維持
- カット済みの脳をステージに配置、20% スクロース/PBS で脳をコートします。スクロース/PBS ソリューションが徐々 にフリーズする、まで脳が完全に冷凍 20% スクロース/PBS で埋め込まれているステージで、脳を覆っています。
- 組織をブレードをスライドさせて、脳 (30 μ m 厚) をスライスします。PBS にスライスを転送し、4 ° C でそれらを保つ
- 蛍光免疫組織化学
- 0.1% で必要なスライスを洗うトリトン X 100/PBS (PBST) 室温 (RT) で 3 回、10 分間。
- 2% ヤギ血清または 5% ウシ血清アルブミン (BSA) に 1-2 時間室温で PBST にそれらをインキュベートし、スライスをブロックします。
- 4 ° C で 1 に 7 overnights 2% ヤギ血清または 5 %bsa を用いた PBST の一次抗体の濃度が適切な抗体溶液内のスライスを孵化させなさい
- 10 分間、室温 3 回 PBST でスライスを洗う
- 光保護 RT で 1-2 時間 PBST で二次抗体の濃度が適切な二次抗体の解決でスライスを孵化させなさい。
- スライド ガラスの上にスライスをマウントし、メディアをマウント、カバーガラスでカバーします。
- 蛍光顕微鏡とスライスを観察します。
- 灌流固定
- 3 商工会議所テスト
- 準備
- 少なくとも 2 2-6 ヶ月歳 129/Sv マウス「見知らぬ人のマウス」にマウスとして同性の準備します。分析の前にケージの中のすべてのマウスを慣らします。各トレーニング セッションの檻の中にマウスを置くし、15 分間マウスを残してください。
- 件名マウスを使って各慣れのフェーズの前に 70% のエタノールで表面を拭くことによって全体の器具や両方のケージをきれい。
- 3 商工会議所装置の 2 つの側面の部屋で空のケージを置き、部屋間のドアを開きます。
- 件名マウスを慣らすしセンター室で件名マウスを置きます、マウスは両方のケージを調査に加えて、ケージを恐れているかもしれない追加 5 分対象動物はありませんまで自由に装置を通して移動するマウスを許可します。20 分のケージを調査し、この分析方法では使用しないでください。そのような動物は、ケージを回避し、ほとんどケージの近くに来る。
- 動物センター室に移動後と 5 分センター室を自由に移動マウスの扉を終了します。この期間中にケージに慣らすにケージで 129/Sv のマウスの 1 つを置きます。
- 社会性解析
- 件名マウス馴化期間の直後にこの分析を実施します。
- 129/Sv マウスを含んでいるかごを置き「見知らぬ人 1 ケージ」、側面の部屋の 1 つのと呼ばれる「オブジェクト ケージ」、他側の商工会議所でと呼ばれる空のケージを配置します。
- ドアを開き、件名のマウスの動作を監視します。
- 10 分間自由に移動し、次の行動のパラメーターを記録する件名マウスを許可します。見知らぬ人 1 ケージを回避し、残りの部屋の 1 つの隅にマウスで示されているように、件名マウスが見知らぬ人 1 ケージ内マウスを恐れて、動物は分析のため使用しないでください。
各商工会議所、見知らぬ人 1 部屋、オブジェクト室内楽、そしてセンター室で) 時間を過ごした。
各ケージ、見知らぬ人 1 ケージおよびオブジェクト ケージの調査にかかった時間 b)。(マウスはマウスをくんくんかいでケージを調べてまたは toughing マウスまたはケージとして分類されます)
c) (省略可能) 各商工会議所に入り口の数
d) 総走行距離旅 (オプション) - マウスのセンター室に移動後、は、ドアを閉じます。
- 目新しさは社会分析
- 社会性解析の直後に、この分析を実施します。
- 両方のケージ 70% エタノールで拭いてください。
- 「見知らぬ人 2 ケージ」と部屋の 1 つの場所見知らぬ人 2 ケージと呼ばれるケージ内の 1 つの別の 129/Sv マウスを置きます。「見知らぬ人 1 ケージ」と呼ばれる、他のケージで見知らぬ人 1 マウスに、他の部屋で見知らぬ人 1 ケージを置きます。
- ドアを開き、件名のマウスの動作を監視します。
- 10 分間自由に移動する被写体マウスを許可し、社会性解析について同じ行動パラメーターを測定します。
注: 1 見知らぬ人と見知らぬ人 2 マウスをランダムに選択する必要があります。見知らぬ人 1 室とオブジェクト商工会議所と同様、見知らぬ人 1 室と見知らぬ人の 2 室は、ランダムに決定する必要があります。
- 準備
- 文脈恐怖差別
- ご利用いただけます
- 各ご利用いただけます公判前に 70% のエタノールで表面を拭くことによって実験装置をクリーニングします。
- マウスが、特定の条件でエアコン装置 (装置の形状、壁の色、床材、臭気、照明、バック グラウンド ノイズの音量が事前確認)。たとえば、ここで使用されるエアコン装置だった明確なプレキシ ガラス壁、金属格子床、エタノール臭、100 ルクスの明るさ 65 dB 背景ホワイト ノイズと正方形の装置です。
- 0.1 mA 2 の電気ショックの擬似ランダムのタイミングでフット ショックによるマウスの状態 s x 3 倍に 5 分のコースも。
- ご利用いただけます後自宅のケージにマウスを返します。
- メモリ評価
- それぞれの評価の前に 70% のエタノールで表面を拭くことによって実験装置をクリーニングします。
- 次の日以下のエアコン、ショック状態と同じ装置の上にマウスを置くし、5 分にわたって凍結時間を測定します。
- 後で同じ日に装置にマウスを置くし、5 分アセスメント中に凍結時間を測定します。白プレキシ ガラス壁、板の床、臭気、30 ルクスの明るさと 70 dB ホワイト ノイズ三角装置をここで使いました。
- 同じ条件と新規の条件の凍結時間を比較します。通常のメモリの能力を持つマウスは、新規の状態でよりも同じ状態でもっと固定されます。凍結は、以上の 2 のための動物の定義された不動 s。
- ご利用いただけます
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Representative Results
PTZ の反復注射は、発作の重症度の増加を誘導します。6 c57bl/6 マウスを施した PTZ と別の 6 マウスは対照群として生理食塩水で扱われました。PTZ 投与量は 35 mg/kg と 10 注射を投与します。発作のスコアは、発作や異常行動を生理食塩水注射 (図 2) でない誘発したに対し、PTZ 注射で徐々 に増加。ボンフェローニ テスト続く分散分析は、PTZ 投与群と生理食塩水投与群間に有意差を示した。
反復発作は異常な軸索分岐形成 (苔状線維芽) と海馬顆粒細胞の異常な移行を促進します。マウスは、(投与量は 24 mg/kg と重度の発作による死亡を引き起こすことがなくマウスで重度の発作を維持するために 35 mg/kg の間調整された) 25 注射用 PTZ と扱われました。マウスの脳は、最後の注射後 3 週間を修正しました。制御脳は、PTZ 注射前に修正されました。脳スライスされた反 synaptoporin (x 500) と苔状線維の発芽 (図 3 a) を観察する抗 ZnT3 (x 500) 抗体および抗 doublecortin 抗体 (の顆粒細胞の異常な移行を観察する (x 200) immunostained3 a を図)。顆粒細胞層の苔状線維は、PTZ 扱われるスライス (図 3 a) で認められた.PTZ 扱われるスライス (図 3 a) 門部内 doublecortin の陽性である新生顆粒細胞に観察されました。顆粒細胞層と肺門部図 3 aに示すように図 3 bに示します。
反復発作も、マウスの正常な動作を損ないます。12 c57bl/6 マウスは PTZ (35 mg/kg, 10 注射) で治療され、別の 12 マウスは対照群として生理食塩水で扱われました。最後の注射後 2 週間 3 チャンバー テスト (図 4 a) および文脈恐怖差別テスト (図 5 a) でマウスを行った。PTZ 投与マウスでは、通常社会性 (図 4 b) を示した。マウスがオブジェクト内の部屋よりも見知らぬ人 1 部屋で時間を過ごした (生理食塩水: p = 0.003、PTZ: p = 0.027) よりも彼らはオブジェクトのケージを調査した見知らぬ人 1 ケージを検討 (生理食塩水: p = 0.009、PTZ: p = 0.004)。しかし、PTZ 投与マウスを示した異常社会ノベルティ (図 4) 障害の社会的記憶を示す。コントロール マウスは見知らぬ人 2 室で見知らぬ人 1 部屋以上の時間を費やして, 室で過ごしたよりもぼうぼうのマウスが時間に有意な差を示さなかったに対し、彼らは見知らぬ人 1 ケージを調査した見知らぬ人 2 ケージまたは時間、ケージを調査 (商工会議所の時刻: 生理食塩水: p = 0.006、PTZ: p = 0.126。時間調査: 生理食塩水: p = 0.002、PTZ: p = 0.426)。PTZ 投与マウスはまた文脈恐怖テスト (図 5 b) の障害メモリを示した。PTZ 投与マウスでは凍結時間に有意な差を示さなかったに対し小説の状態よりもショック状態で凍結時間を示したマウスを制御 (生理食塩水: p < 0.001、PTZ: p = 0.060)。対になっていない t 検定は統計解析を行った。
図 1: プロトコルの概要します。(A) PTZ を介したたきの模式図。(B)それぞれ差押えスコアの代表的な動物の行動のイラスト。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 痙攣性挙動の評価します。平均発作のスコアがグラフで示されます。各条件で 6 マウスを用い、注射の 1 つのシリーズを行った。各注入後発作点数は監視され、得点します。発作の重症度を増加し、大幅 PTZ 注射を生理食塩水注射と比較して、(p < 0.001: 繰り返される措置 ANOVA)。各発作スコアは平均 ± SEM. として表示されますこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 顆粒細胞の苔状線維の PTZ を介した発芽と異常な移行。(A)最大射影門部、粒状の層、およびマウスの海馬スライスの分子層の免疫組織化学的像 (右) たきの前後 (左) たきに。アンチ synaptoporin (上) および抗 ZnT3 抗体 (中央) (苔状線維) 顆粒ニューロンの軸索を視覚化する使用されました。抗 doublecortin 抗体は新生児顆粒ニューロン (下) を視覚化するために使用されました。Ptz カメラを介した反復発作は、苔状線維の発芽 (矢印) と肺門部 (矢印) に顆粒細胞の異常な移動を誘発します。スケール バー、50 μ m。各画像のおおよその位置で示されます(B) です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 異常な社会的行動の PTZ を介した。(A) 3 室テストの模式図。(B)時間の平均量は、各商工会議所で過ごし、社会性テストで各ケージの調査時間の平均金額が表示されます。(C)時間の平均量は、各商工会議所で過ごし、時間の平均量を費やして調査社会目新しさテストで各ケージが表示されます。PTZ および生理食塩液投与群 12 マウスがあった。Ptz カメラを介した発作誘発異常な社会的行動 (* * * p < 0.001、n. s. 重要な = ではない)。すべての回が平均 ± SEM. として表示されますこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: PTZ を介した記憶障害。(A)文脈恐怖差別テストの模式図。(B)各条件で凍結時間の平均の割合が表示されます。PTZ および生理食塩液投与群 12 マウスがあった。グラフは、SEM. の平均の ± を示していますこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、てんかんの薬理学的動物モデルの確立のため広くアクセス プロトコルを提案します。Ptz カメラを介した化学たきは長い歴史を持つ、てんかん41の病理組織学的および細胞の病理学の調査のための一般に受け入れられたモデルです。てんかんの化学的キンドリング モデルは Suzdak とヤンセン、1995年42以前見直されました。薬理学的発作誘導、PTZ、とくに、重症発作を誘発簡単でシンプルな方法です。注入量の変化は、発作の重症度と相関します。したがって、PTZ 用量を変更して、結果の動作を調べることによっていくつかの試験に適切な投与量を識別することは非常に簡単です。
多くの研究者がノックアウトまたはノックイン マウスてんかんモデルとして作成し、自発性発作43,44を示すマウスの生産に成功しているしようとしました。ただし、薬理学的発作誘導はまだてんかんの良いモデルを考慮します。発作誘導遺伝子の改変以外の別の一般的な方法には、動物の脳に電極を埋め込み、電気ショックを介した発作を誘発するが含まれます。このメソッドは、コストがかかり、困難、脳5で正確な軌跡で電極を移植する外科的スキルが必要です。
痙攣の化学的誘導定位と低コスト2,4上映抗てんかん薬の迅速な調査ができます。頻度と自発性発作と SE の重症度は、使用薬剤によって異なります。カイニン酸とピロカルピンは SE とそれに続く慢性特発性または再発発作45,46,47を引き起こすために使用することを主に。PTZ の使用、他の一方で、両方促進するために高用量と化学を開発する SE 動物 subconvulsive 線量48,49で与えられたときに火を付けた。また、誘発てんかんけいれんの薬のメカニズムは、よく知られています。したがって、発作を誘導するために必要な機構をブロックは、抗てんかん薬の識別を助けるかもしれない。一方で遺伝的モデルはてんかん発作50を呼び起こすメカニズムを調査する必要があります。発作を誘発するメカニズムを解明すると後、は、抗てんかん薬のスクリーニングを開始可能性があります。
ここに示した代表的な結果、PTZ 投与後 30 分間、動物の行動が観察されました。ただし、プロトコルのセクションで述べたように、動物現象は、できれば 24 h または少なくとも 6-10 h の PTZ 注射後奪取スコア 3 以上に到達したら特に。動物監視システムは、全体の日のための動物を観察する必要があります、長時間の観察はてんかんの深い理解を得る上で重要。さらに、発作の持続時間と発作遅延は、収集に便利なメジャーです。発作持続時間と遅延の変化を時間と発作の重症度に関してこれらの測定は重要です。
発作後の化学的に燃やし動物病理について調べた、海馬を中心に。反復発作または SE 苔状線維が発芽27,28、新生児顆粒ニューロン25,29の異常な移行、アストログリオーシス海馬30と錐体細胞のアポトーシスを誘導します。31,32。 脳の組織学的変化がてんかん患者の神経機能を混乱させます。たとえば、自閉症スペクトラム障害 (ASD) と知的障害 (ID) てんかん協会はよく認識された51,52,53です。てんかん発作は、ASD を誘導し、ID または ASD と ID は、てんかんの症状を誘発するかどうかはまだ複雑な質問です。最近の研究は、ptz カメラを介した発作が ASD のような社会認知障害54を誘発すること示されている ID のような赤字55,56,57を学習します。てんかんを介した病理を引き出す神経障害と精神疾患ことが示唆されました。
てんかんによって促進される組織学的変化は、発作誘導後を開発する時間を取る。この点では、薬理学的発作誘導は、研究者は、タイミング、数および動物の発作の重症度を制御できるため便利です。化学的キンドリングを含むてんかんモデル動物はてんかん誘発のメカニズムに関連する神経生理学的障害の調査を促進するためにいきます。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この作品は、日本学術振興会科研費助成番号 24700349、24659093、25293239、JP18H02536、17 K 07086、文部科学省科研費助成番号 25110737、23110525、アメッド許可番号 JP18ek0109311、洗心医療研究財団と日本によって支えられた部分的てんかん研究の基礎。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Pentylenetetrazole | Sigma-Aldrich | P6500 | |
Sodium chloride | MANAC | 7647-14-5 | |
Mouse | CLEA Japan | C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male | |
Syringe (1mL) | Terumo | SS-01T | |
Needle(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm) | Terumo | NN-2719S | |
Weighing scale | Mettler | PE2000 | This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&D company. |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Sodium hydroxide | nacalai tesque | 31511-05 | |
Peristatic pump | ATTO | SJ1211 | |
Sucrose | nacalai tesque | 30404-45 | |
Microtome | Yamato | REM-700 | This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710 |
Microtome blade | Feather | S35 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
anti-synaptoporin antibody | Synaptic systems | 102 002 | |
anti-ZnT3 antibody | Synaptic systems | 197 002 | |
anti-doublecortin | Santa Cruz | sc-8066 | This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390). |
Contextual fear discrimination test apparatus | O'hara | ||
Three chamber test apparatus | Muromachi |
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