Summary
Linse-gratis video mikroskopi gør det muligt for os at overvåge cellekulturer direkte inde i rugemaskinen. Her beskriver vi de fulde protokol, der bruges til at erhverve og analysere en 2,7 dagen lang erhvervelse af kulturperler HeLa celler, fører til et datasæt på 2.2 x 106 målinger af individuelle celle morfologi og 10584 cellecyklus spor.
Abstract
Her, vi viser, at linsen-gratis video mikroskopi gør det muligt for os at samtidig indfange kinetik af tusindvis af celler direkte inde i rugemaskinen, og at det er muligt at overvåge og kvantificere enkelt celler langs flere celle cyklusser. Vi beskriver den fulde protokol, der bruges til at overvåge og kvantificere en HeLa cellekultur 2,7 dage. Første celle kultur erhvervelse er udført med en linse-gratis video mikroskop, og derefter dataene analyseres efter en fire-trins proces: multi bølgelængde holografisk genopbygning, celle-inddeling, celle segmentering og celledeling afsløring algoritmer. Som et resultat, viser vi, at det er muligt at samle en datasæt med mere end 10.000 cellecyklus spor og mere end 2 x 106 celle morfologiske målinger.
Introduction
Overvågning kulturperler pattedyrceller hele flere celle cyklusser og måle præcist Cellestørrelse og celle tør masse er en udfordrende opgave. Flere etiket-frie optiske teknikker er i stand til at udføre denne opgave1,2: fase-shifting interferometri3, digitale holografiske mikroskopi (DHM)4,5,6, 7, quadriwave lateral klipning interferometri8,9 og kvantitative fase tomografi10,11. Disse metoder har ført til mange ny indsigt i forståelsen af cellecyklus i pattedyrsceller. Men de er sjældent kombineret med automatisk celle tracking algoritmer og deres gennemløb er stadig begrænset, når måling celle masse baner1 (N < 20 i henholdsvis3,4,5 , 6). derfor en roman optisk metode er nødvendige for at måle celle masse baner med store statistik (N > 1000).
I dette papir vise vi evne til linse-gratis video mikroskopi til samtidigt billede tusindvis af celler direkte inde i rugemaskinen, og derefter kvantificere enkelt celle metrics langs tusindvis af individuelle cellecyklus spor. Linse-gratis mikroskopi er en kvantitativ fase imaging teknik, som giver mulighed for erhvervelse af fase billede af tætpakkede celler over et meget stort synsfelt (typisk flere snese mm2, her 29.4 mm2)12,13 ,14,15. Flere målinger på det enkelte celle niveau bestemmes, fxcelle område, celle tør masse, celle tykkelse, celle største akse længde og celle skærmformat12,15, fra hvert billede. Derefter, ved at anvende en celle-tracking algoritme, disse funktioner kan afbildes for hver enkelt celle som funktion af eksperiment tid14,15. Derudover ved at registrere forekomsten af celledelinger i celle spor, er det muligt at udvinde andre vigtige oplysninger, som den oprindelige celle tør masse (lige efter celledeling), den endelige tør cellemasse (lige før celledeling) og cellen cyklus varighed, dvs., tiden mellem to på hinanden følgende divisioner15. Alle disse målinger kan beregnes med meget god statistik (N > 1000) da den store synsfelt vil typisk give analyse af 200 til 10.000 celler i en enkelt linse-fri erhvervelse.
For at forklare denne metode baseret på linse-gratis video mikroskopi, beskriver vi protokol for at overvåge og kvantificere en HeLa cellekultur 2,7 dage. Dataanalyse er en fire-trins proces baseret på flere bølgelængde holografisk genopbygning, celle-inddeling, celle segmentering og celledeling algoritmer. Her er det vist at den rumlige opløsning og relativt hurtig framerate (en erhvervelse hvert 10 minut) opnået med denne linse-gratis video mikroskopi opsætning er kompatibel med standard algoritmer, celle-tracking. Den fulde analyse af dette datasæt resulterer i måling af 10,584 celle spor over komplet celle cyklusser.
For at opsummere, er linse-gratis video mikroskopi et kraftfuldt værktøj til automatisk overvåge tusindvis af umærkede, ikke-synkroniserede og umodificerede celler pr. eksperiment; hver celle spores over flere celle cyklusser. Vores målinger giver således gennemsnitsværdien af adskillige celle parametre, men endnu vigtigere, den inter celle variation over en stor population af celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. celle kultur overvågning erhvervelse
- Vokse HeLa celler i DMEM + glutamin (fxGlutaMAX) medium suppleret med 10% (v/v) varme-inaktiverede føtal kalv serum og 1% penicillin og streptomycin.
- Pels 6-godt glas bund kultur plader med fibronektin (25 µg/mL) i 1 time. Derefter frø 2 x 104 celler pr. brønd.
- Under købet, ændre mediet hver 3 dage.
- For time-lapse erhvervelse, bruge video linse-fri lup (kommercielt tilgængelige).
Bemærk: Dette er baseret på den linse-gratis beregningsmæssige imaging teknik, som beskrevet af Ozcan et al. 16 , som blev ændret til at udføre løbende overvågning i en inkubator ved en kontrolleret temperatur på 37 ° C12,15. Det har en komplementær metal oxide semiconductor (CMOS) billedsensor med en Pixelafstand på 1,67 µm og et billeddiagnostiske område med 6,4 x 4,6 mm2. Flere bølgelængde belysning er fastsat af en multichip lys emitting diode (led) enhed, som leverer røde, grønne og blå belysning. Bølgelængder er centreret om 636, 521 og 452 nm henholdsvis med en spektral båndbredde på 25, 45 og 25 nm henholdsvis. Rød-grøn-blå (RGB) lysdioder er placeret over en 150 µm pinhole i en afstand af ca. 5 cm fra cellerne. Den målte tæt på LED lys effekt er så lavt som 10 µW på hver bølgelængde og belysning er kun et sekund per erhvervelse. Derfor forventes ingen foto-toksicitet problemer når cellekulturer observeres under linse-gratis video mikroskop. - Sætte celle kultur container sat i kontakt med CMOS-sensor (figur 1). Brug en beholder med et glas coverslip i bunden, hvilket er vigtigt for kvaliteten af linse-fri erhvervelse. Plastbeholdere kan også bruges, men den linse-fri erhvervelse vil blive forringet på grund af den dårlige optiske kvalitet af disse containere.
- Styre video linse-fri lup med erhvervelse software (kommercielt tilgængelige), som udfører både time-lapse erhvervelse og holografiske genopbygningen. De parametre, der skal angives af brugeren i software interfacet er frame rate, varigheden af forsøget, og typen af cellekultur, dvs vedhængende celler eller flydende celler.
- Sæt input parametre af erhvervelse software. Indstil billedfrekvensen indstillet til én erhvervelse hver 10 minutter og sæt kultur celletype til 'tilhænger'.
Bemærk: En rammehastighed på en erhvervelse hver 10 minutter er et godt kompromis, da det sikrer en pålidelig celle sporing mens størrelsen af den resulterende datasæt skal analyseres er stadig rimelig. Den hurtigste frame rate kan opnås med denne linse-gratis mikroskopi setup er en erhvervelse hver 5 minutter. Yderligere stigende frameraten resulterer i overdreven opvarmning af CMOS-sensor, som kan påvirke levedygtigheden for cellerne i kulturen. - Starte time-lapse erhvervelse og holografiske genopbygning algoritme (kommercielt tilgængelige) vil automatisk behandle linse-fri erhvervelse for at opnå den fase billede af cellekultur. Holografisk genopbygning algoritme er baseret på en multi bølgelængde fase hentning algoritme17 og giver et RGB rekonstruerede fase billede i intervallet [-π, + π] for hver enkelt celle over et stort synsfelt 29.4 mm2. Princippet om linse-gratis i-line holografi er at belyse en tynd prøve (på z = 0) med en plan bølge (af amplitude 1 efter normalisering) og til at registrere på en CMOS sensor efterfølgende diffraktion intensitet billedet på en kort afstand z = Z, typisk 1 mm efter den prøven. I vores setup, belysningen er sekventielt skiftede til 3 bølgelængder (λ1= 0.450 µm, λ2= 0.540 µm, λ3= 0.647 µm) til at måle tre diffraktion mønstre af den samme prøve.
2. celle kultur dataanalyse
- For celle-tracking, bruge Trackmate algoritme, en open source Fiji plugin for automatiseret sporing af én partikler18. At indlæse først fuld time-lapse erhvervelse i Fiji (belastning billede sekvensen kommando). På grund af den store størrelse af de datasæt, der indeholder typisk 400 RGB frames 29,7 MB, er det hurtigere at indlæse dem i 8-bit format. Næste guider Trackmate Fiji plugin brugeren gennem flere faser af celle-tracking algoritme, nemlig en celle påvisning stadium, en celle tracker Stadium og flere filtre anvendes til celle opdagelser og de beregnede spor. På hvert stadium, konfigurere algoritmerne og få vist resultaterne straks så, at hvis det er nødvendigt, kan man nemt navigere frem og tilbage for at justere indstillingerne. De forskellige menuer på grænsefladen Trackmate er vist i figur 2 med de faktiske indstillinger anvendes til HeLa celler eksperiment.
- Sæt input parametre af erhvervelse-softwaren som følger (Se figur 2). Angive den anslåede blob diameter 15 pixel, detektor tærsklen til 0,25, den forbindelse maksimale afstand 15 pixel, gap-afsluttende max afstand til 15 pixel og antallet af Steder i spor til 3,5.
Bemærk: Disse indstillinger varierer naturligvis fra et eksperiment til en anden, især det 'anslåede blob diameter' hvilket svarer til i Cellestørrelse (her givet i pixels på 1,67 µm). Den samme bemærkning gælder for 'forbinder max afstand' som tegner sig for den maksimale afstand rejste en celle inden for to på hinanden følgende frames (her givet i pixels på 1,67 µm). Sin optimale værdi ville afhænger af celle motilitet men også celle tæthed. - For enden af celle-tracking proces generere resultaterne i form af tre tekstfiler ('Analyse' knappen, se fig. 2). Den mest nyttige fil, med navnet 'Steder i spor statistik', består af en tabel over alle registrerede celler med deres respektive (x, y) positioner i erhvervelse, deres billednummer og deres nummer. På grundlag af disse data, udføre celle segmentering og opdage celledelinger bruger dedikeret algoritmer (Se supplerende kodefiler). De to andre filer er navngivet 'Links i spor statistik' og 'Spor statistik' og omfatter alle de resultater, der beskæftiger sig med spor, fx spor varighed, antallet af fundne huller, spore indledende ramme, osv.
- Brug celle segmentering algoritme (Se supplerende kodefil) hen til automatisk uddrag flere målinger der beskriver celle morfologi fra rekonstruerede fase billede. Disse måleenheder er celle areal (S), celle største akse længde (L), celle mindre akse længde (l) og celle skærmformat (L/l). Fasen for inddrives fra linse-gratis mikroskopi er proportional med densitet og tykkelse af modellen lag som diskuteret tidligere15.
- Ud over de morfologiske funktioner i cellen, udtrække kvantitative celle tør masse (CDM) målinger fra de rekonstruerede fase13,19,20
EQ. (1)
hvor φ(x,y) er det rekonstruerede fase Skift19, λ bølgelængden og α = 1,8 x 10-4 m3/kg specifikke brydningsindekset, som vedrører variation af brydningsindekset tørre masse1, 19. - Evaluere den celle tykkelse ved hjælp af et skøn over forskellen mellem brydningsindeks celle og kultur medier. Forholdet mellem celle tykkelse h(x,y) og den målte faseskift er givet ved20:
EQ. (2.1)
EQ. (2.2)
med Δn(x,y) = ncelle (x,y) - nmedium (x,y), brydningsindeks forskellen mellem cellen og kultur medier. I følgende går ud fra en konstant værdi på Δn = 0,025, som er beregnet fra brydningsindekset målt i HeLa cellekerner (n = 1.35511), og at fosfatbufferet saltopløsning (PBS) kultur medier (n = 1,33). Selv om tykkelse celleværdi er kun vejledende, da det er baseret på en antagelse, dens relative variationer er meningsfulde og kan udnyttes til at opdage delende celler. - Bruge en dedikeret algoritme (Se supplerende kodefil) til at registrere forekomsten af celledelinger og derefter udtrække celle numre, der er knyttet til de registrerede celledelinger, for at afsløre en celledeling, celler med målte tykkelse større end 8 µm er først identificeret, så tjek om en ny celle vises tæt sammen i rum og tid. På denne måde, er påvisning af celledelinger afhængig af to robuste kriterier. Alternative og mere forfinede metoder til registrering af celledeling kan anvendes til lensfree time-lapse erhvervelse21,22,23.
EQ. (1)
EQ. (2.1)
EQ. (2.2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For den holografiske genopbygningsprocessen, feltet lys er beskrevet ved en skalar felt A (hvor 
er den komplekse værdi af A i flyet på afstand z fra positionen prøve, og laterale 
og på bølgelængde λ). Lys formering er modelleret af Huygens-Fresnel teorien, som giver en spreder kerne 
. Derfor felt amplitude på detektor flyet, enz er relateret til lys amplitude 0 ved den følgende relation:
dvs.
med 
, hvor jeg er det komplekse tal (jeg2=-1)
Intensitet måling er simpelthen modelleret af 
. Formålet med genopbygning algoritmen er at finde en 'god' felt A0, relateret til den observerede prøve, hvor diffraktion ville matche de målte intensitet jegz. Strategien er at overveje amplitude felt fase ved detektor flyet φz som ukendte af problemet og at optimere en multispektrale samlede variation kriterium for objektet. Overvejer mere eksplicit, at felterne
dvs.
for nogen fase felt φz, 
passer perfekt til data siden 
. Så den efterfølgende felt 
er et muligt amplitude felt i prøven fly, på grund af den observerede intensitet image. Dette er grunden til, hvorfor et kriterium på A0 bruges til at angive en entydig løsning blandt alle data-matching muligheder. Kriterium at minimere blev valgt som:
hvor x og y er koordinater for flyet, dvs 
. Ved hjælp af sådant kriterium kan vælge blandt alle mulige områder, et prøve felt vise skarpe kanter på den samme position for alle bølgelængder, som er fysisk meningsfulde. Denne metode reducerer forekomsten af "twin-billeder' i det rekonstruerede feltet et0. 'Twin-billede' er et vigtigt artefakt, der skyldes manglende fase information i løbet af købsprocessen.
Til praktisk beregning af integraler er discretized med en rumlig prøvetagning svarende til detektor opløsning, derivater er erstattet af Sobel givet operatører og vindinger af Huygens-Fresnel spreder 
udføres ved at gå til Fourier rummet hvor 
har et simpelt udtryk: 
. Minimering af (real) kriterium ε med hensyn til de (reelle) sæt variabler 
bekæmpes ved hjælp af den ikke-lineære konjugeret gradient metode, som kræver gradient ε skal beregnes for enhver fase tilknyttet hver detektor pixel for hver bølgelængde.
Celle/genopbygningsfasen udpakning
Figur 3 viser resultaterne af den holografiske rekonstruktion af en ramme af en time-lapse erhvervelse af HeLa celler i kultur. Figur 3a viser fuld synsfeltet af en rå erhvervelse i den blå kanal på en 29.4 mm2 område. Baseret på dette billede og dem, der erhverves i de røde og grønne kanaler, producerer holografisk genopbygningen et RGB-fase billede af celler som vist i tal 3b og 3 c. Det rekonstruerede fase billede udstiller lokalt indpakket fase artefakter svarende til celler, der inducerer en fase Skift overstiger + π. For at udføre en simpel fase udpakning, gennemførte vi en heuristisk betyder, nemlig vi opdage pixels med værdien 
overstiger 0,3 og indstille disse pixels til + π. Denne simple metode er baseret på en ejendom af RGB-rekonstrueret fase billeder. I teorien på hver pixel skal vi måle forholdet 
lig 
. Men for mitotiske celle, når fase indpakning opstår, dette forhold er ikke længere vedligeholdes i RGB rekonstruerede fase billedet (figur 3f). Den ovenfor nævnte heuristisk metode tager fordel af denne egenskab, så at en simpel tærskel kan bruges til at registrere pixels præsentere fase indpakning. Resultaterne af den rekonstruerede fase billede før og efter udpakning er vist i tal 3f og 3 g, henholdsvis. Disse uindpakkede fase billeder er derefter fødes ind i den celle-tracking algoritme. Uden denne udpakning skridt, celle-tracking algoritme ikke opdager celler i division og celler af store tykkelse, som ville svække de endelige resultater. Opløsningen af den rekonstruerede fase billede blev anslået til ca 5 µm15 (fuld linjeafstand rumlige opløsning), som er relativt groft. Det er dog muligt at observere detaljer såsom lamellipodia og cellens cytoplasma (tal 3f og 3 g). Vigtigst, billede fremstillet af linse-gratis mikroskopi viser en stor kontrast og er undtaget af halo artefakter. Dette muliggør automatisk celle registrerings- og celle-tracking.
Celle kultur dataanalyse
For at udtrække cellecyklus musiknumre, dataanalyse er baseret på en række forskellige algoritmer, nemlig cellen sporing udføres med Trackmate Fiji plugin, påvisning af divisioner og i sidste ende udvinding af celle cyklus spor, dvs de sekvens mellem to celledelinger. I det følgende diskutere vi kvaliteten af output af disse algoritmer i forhold til manuel målinger.
Figur 4 viser forskellige skærmbilleder af celle-tracking resultater, resultater af celle opdagelse algoritme og resultaterne af den analyse af celle-tracking. Påvisning af celler i den linse-fri erhvervelse (tal 4a-4 c) er det første trin i celle-tracking algoritme. For at validere celle opdagelse algoritme, kommenterede vi manuelt en lille del af time-lapse linse-fri erhvervelse (214 rammer 663 x 663 µm2). Vi manuelt valgt ialt 5365 celle positioner og sammenlignet resultaterne med dem, der opnås ved Trackmate Fiji plugin. Figur 5 viser resultatet i form af sand detektion, falske positiver og falske negativer. Den resulterende følsomhed er omkring 96% og den positive prædiktive værdi så stor som 99,7%. Disse høje værdier afspejler den gode kvalitet af de rekonstruerede fase billeder fås med opsætningen af linse-gratis video mikroskopi. Efter celle detektering, en celle segmentering algoritme gør det muligt for at måle — for hver enkelt celle – flere forskellige måleparametre, fx området celle skal cellen tør masse og celle tykkelse. Figur 6a skildrer princippet om segmentering algoritme og finde 6f viser segmenterede billeder i en tidssekvens for en region af interesse for 663 x 663 µm2 (den samme som i figur 5). Algoritmen indleder segmenteringen af tærskel fase billede (Se fig. 6b) og derefter det gælder en seeding procedure (Se figur 6 c). Nemlig er pixel i midten af de fundne celler angivet til værdien af den tilsvarende track. X-Y positioner af cellerne og deres tilsvarende nummer leveres af filen 'Steder i spor statistik' fremstillet efter celle tracking. Derefter, en iterativ påfyldning proceduren gennemføres der udvider frø til grænserne for cellen (tal 6 c-e) bestemmes af den første tærskel (fig. 6b). Denne fyldning procedure er baseret på grundlæggende operationer i matematiske morfologi, fx dilatation og erosion. Fra segmentering resultatet, det er derefter muligt at beregne flere målinger på enkelt celle niveau, dvs. morfologiske funktioner såsom celle længde, området celle og celle skærmformat, men også, endnu vigtigere, cellen tør masse ifølge EQ. 1. For at vurdere pålideligheden af linse-gratis mikroskopi måling af cellen tør masse, vi har sammenlignet den linse-gratis rekonstruerede fase billede af faste HeLa celler (figur 6 g) med samme region erhverves ved hjælp af en digital holografisk mikroskopi med en 5 X mål (figur 6 h). Figur 6i viser cellen tør masse målt ved betyde linse-gratis mikroskopi som en funktion af den tørre masse målt med DHM til 302 segmenteret HeLa celler. Der er en god korrelation mellem de to målinger (koefficient af bestemmelse Rasmussen2 er 0,86, hældning = 0,9, offset =-17 pg). Fra figur 6i, kan vi vurdere præcisionen af celle tør masse måling ved hjælp af linse-gratis mikroskopi. Præcision, målt som middelværdi fejl mellem den linse-fri data og lineær fit, er ca. 16 pg.
Når kompilering alle enkelt celle målinger over fuld time-lapse erhvervelse, er det da muligt at skaffe scatterplots af flere målinger som funktion af tiden, som vist i figur 7. Disse scatterplots indeholder oplysninger om kinetik af dyrkede celler over en meget stor befolkningsgruppe. Antallet af celler i synsfeltet stiger fra 2.000 op til 15.000 (figur 7a). Ganget med antallet af tidspunkter, dette fører til et stort datasæt 2.2 x 10 fundet6 celler, hver af dem karakteriseret ved dets koordinater og morfologiske træk, dvs tørre cellemasse (figur 7b), celle område (figur 7 c) , celle gennemsnitlige tykkelse (figur 7 d), major akse længde (figur 7e) og højde/breddeforhold (figur 7f).
Vigtigere, kombinationen af celle sporing og celle segmentering algoritmer gør det muligt at måle kinetics på enkelt celle-niveau. Som et eksempel viser figur 8 analyse af en celle spore varer ca 66 timer og udstiller fire celledelinger på T0 + 4.1 h, T0 + 20,5 h, T0 + 36.7 h og T0 + 53,3 h. figur 8a viser resultaterne af den automatiske celle segmentering algoritme, som giver mulighed for os til at afgrænse effektivt overfladen af denne celle. Brug celle segmentering, det er derefter muligt at beregne flere målinger som funktion af tiden, fx celle areal (fig. 8b), cellen tør masse (fig. 8 c), celle gennemsnitlige tykkelse (figur 8 d) og cellen motilitet (figur 8e). Fra disse grafer, kan man klart måle kinetik af disse cellulære målinger mellem celledelinger. Især kan man iagttage stigningen i cellen område og tør masse under en celle cyklus. Derudover bruger den automatiske registrering af celledelinger, tre forskellige cellecyklus spor kan udvindes fra dette spor og celle cyklus varighed, dvs. perioden mellem to divisioner, kan skønnes. På de enkelt celle track vist i figur 8, vi målte tre cellecyklus varigheder, nemlig 16,4 h, 16,2 h og 16,7 h. kompilere alle cellecyklus spor fra analyse af en 2,7 dage time-lapse erhvervelse resultater i afsløring af 16725 celledelinger og Beskrivelse af 10,584 celle cykelstier. Det er derefter muligt at måle gennemsnitlige og variabiliteten af cellecyklus varighed med lyd statistik. Vi fandt, at fordelingen af cellecyklus varighed er tæt på Gaussisk distribution (figur 9a) med en middelværdi på 16,5 h, og en relativ standardafvigelse på 12,4% (standardafvigelse målt på de Gaussian peak divideret med middelværdi af fordelingen ). Den gennemsnitlige fordobling tid på 16,5 h er i overensstemmelse med celle cyklus længderne målt manuelt på sporet præsenteret på figur 8. Det ligger dog i den nederste række publicerede værdier for HeLa fordobling tid som er normalt mellem 20 og 30 h24,25,26,27. Dog i reference28, er en kort fordobling tid med 16,2 ± 1,7 h også nævnt. For yderligere at validere vores målinger af cellecyklus længder og bekræfte pålideligheden af vores linse-gratis mikroskopi teknik, har vi udført en manuel sporing af 100 cellecyklus spor (10,148 celle positioner). På cellen cyklus spor opnået manuelt (N = 100) målte cellecyklus længde er 16.7±1.9 h (N = 100, figur 9b). Dette er meget tæt på måling af 16.5±2.1 h (N = 10,584) fremstillet med cellen automatisk sporing, påvise gyldigheden af den samlede analyse. Når sammenligne manuel sporing af celle cyklus baner til en fastsættes automatisk, fandt vi at 67% af cellecyklus spor var med held opdaget og at cyklus længder målt automatisk er godt korreleret til dem målt manuelt (figur 9b). Registrering af effektiviteten af cellecyklus baner blev målt i de første 32 timers eksperiment med en tæthed under 150 celler/mm2. Denne opdagelse sats naturligvis aftager med tiden, som cellen tæthed øger op ~ 500 celler/mm2. Antallet af fundne cellecyklus spor når et plateau på T0 + 32 h (figur 9 c) mens antallet celler stadig stiger med en faktor på tre mellem T0 + 32 h og T0 + 72 h (figur 7a). I betragtning af antallet af falsk positive og negative fund, figur 9b præsenterer 5 outliers punkter: 4 af dem er på grund af falsk negativ opdagelse (cyklus længde > 25 h) og 1 med en falsk positiv detektion (cyklus længde < 10 h). For at opnå denne resultater, har vi brugt en høj tærskel på tykkelse (8 µm) i celledeling opdagelse algoritme, for at favorisere et lavt falsk positiv rate. Derudover sporene præsenterer uoverensstemmelse har været filtreret ud, dvs celle cyklus som varighed er under 6 h og spor med en tør masse bane, der ikke øger lineært som funktion af tiden. De er kun 3% af det samlede antal af cellecyklus spor. Som et resultat, er fordelingen af cellecyklus længde opnået automatisk godt tilnærmet af en Gaussisk (figur 9a) med et lavt antal korte spor (celle cyklus længde < 10 h, 5,1% af det samlede antal spor), som vil følge af falsk positive division opdagelser. På samme måde, numre viser en lang celle cyklus, som ville delvist resultater fra falsk negative division opdagelser, er også sjældne (celle cyklus længde > 25 h, 2,4% af det samlede antal spor). Manuel sporing af cellecyklus baner blev også brugt til yderligere vurdere celle sporing udføres med plugin. Vi har målt på 6693 celler en overordnede lokalisering nøjagtighed på 1,6 µm på tilsvarende punkter, som ligger inden for én pixel pitch (1,67 µm).
Andre parametre kan undersøges, som den oprindelige tør cellemasse (lige efter en division), den endelige tør masse (lige før en celledeling), samt den gennemsnitlige vækstrate i løbet af celle cyklus. Figur 9 d afbilder indledende og afsluttende celle tør masserne som funktion af tiden. Det viser, at både indledende og afsluttende celle tør masserne falde med tiden. Medianværdien af den oprindelige celle tør masse falder fra 223 pg ned til 130 pg og den endelige celle tør masse fra 460 pg ned til 220 pg. Forholdet mellem to forbliver stabile ved 1,89 ± 0,12 under hele forsøget (figur 9 d-e). Endelig, figur 9f viser udviklingen af celle tør masse vækstrate som funktion af tiden over 10,584 celle cyklus sporene og vi fandt, at faldet i celle vækst sats er en fælles tendens i hele cellen befolkningen i denne særlige eksperiment.
Figur 1: linse-gratis mikroskopi. (en) skematisk af linse-gratis mikroskopi erhvervelse setup. (b) billede af 6-brønde linse-gratis video mikroskop. Det bruger en CMOS billedsensor med en Pixelafstand på 1,67 µm og en billeddannelse område af 6,4 mm x 4,6 mm = 29.4 mm2. Belysning leveres af en multi-farvede RGB lysdioder med en pinhole placeret i en afstand af ca. 5 cm fra prøven. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Trackmate grænseflade. Hovedmenuer plugin vist med de faktiske indstillinger anvendes til cellen HeLa eksperimentere. Den anslåede blob diameter var indstillet til 15 pixel, detektor tærskel blev sat til 0,25, den forbindelse maksimale afstand var indstillet til 15 pixel, gap-afsluttende max afstand var indstillet til 15 pixel og antallet af Steder i spor var indstillet til 3,5. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: holografisk genopbygningsprocessen. (en) rå erhvervelse af HeLa celler i kultur gennem linsen-fri mikroskopi (fuld af synsfeltet 29.4 mm2). (b) detaljer af (en). (c) detaljer (b). (d) RGB rekonstruerede fase billede (fuld af synsfeltet 29.4 mm2). (e) detaljer af (d). (f) detaljer af (e). (g) fase billede fremstillet efter fase udpakning for at være i forhold til (f), før udpakning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: skærmbilleder af celle-tracking resultaterne udføres ved hjælp af Trackmate Fiji plugin. (en) resultaterne af den celle opdagelse algoritme, der er baseret på en Laplacian af Gaussisk (LoG) detektor. Billedet viser den fulde synsfelt objektiv-fri erhvervelse på T0 + 16h40min, hvor 2,451 celler er påvist. Sidstnævnte er omgivet med en lilla cirkel. (b) resultater af celle-tracking algoritme. Alle celle numre er vist over 50 frames (~ 8 timer) med en farvekode modsvarer median hastigheden. (c, d) Detaljeret billede af (a) og (b) henholdsvis (gul rektangel). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: validering af celle påvisning fase af celle-tracking algoritme. (en) beskåret billede af HeLa celler i kultur (663 x 663 µm2) hvor cellen markeres i hånden er markeret med blå kors og dem registreret med celle-tracking algoritme er markeret med Røde Kors. Dette gør det muligt for bestemmelse af falsk positive påvisning (rød cirkel) og falsk negativ opdagelse (orange cirkel). (b) antallet af sand detektion (grøn linje), falsk positive (rød linje) og falsk negativ (orange) påvisning afbildes som funktion af eksperiment-tiden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: resultater af celle segmentering. (en) Reconstructed fase billede af en region af interesse for time-lapse erhvervelse på T0 + 7 h (663 x 663 µm2). (b) algoritmen, der initierer segmenteringen af tærskel fase billede (c) segmenteringen starter med en seeding procedure, dvs pixels i centrum af de fundne celler er angivet til værdien af den tilsvarende track. (d-e) Næste og iterativt implementeret en påfyldning procedure der udvider den indledende seeding til grænserne for cellen bestemmes af den første tærskel (b). (f) resultatet af segmentering algoritme er vist i en tidssekvens på en 663 x 663 µm2 region (samme som i figur 5). Segmenteringen er vist som en farvet overflade overlejret på toppen af det rekonstruerede fase billede. Bemærk at den linse-gratis signal primært kommer fra det nukleare område, og de segmenterede områder falder tæt på kernen. (g) Reconstructed fase fremstillet af linse-gratis mikroskopi i fast HeLa celler. Dette er en beskåret billede af fuld synsfeltet 29.4 mm2. (h) fase billede af regionen vist i (g) fremstillet ved digitale holografiske mikroskopi med en 5 X mål (NA 0,12) belyst med en laser på 647 nm. (jeg) Plot af cellen tør masse fremstillet ved linse-gratis mikroskopi som en funktion af den tørre masse måles ved hjælp af DHM. Scatterplot kompilerer 302 celler målinger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: dataanalyse af en 2,7-dag linse-gratis time-lapse erhvervelse af HeLa celler. (en) samlet antal celler tælles i fuld synsfeltet 29.4 mm2 som funktion af tiden. (b) Scatterplot af cellen tør masse som funktion af tiden. På hver kasse, svarende til en placering på 6 timer, den røde centrale mark angiver medianen og bunden og toppen kanterne af boksen angiver de 25 og 75 percentiler, henholdsvis. Knurhår udvide til de mest ekstreme datapunkter ikke betragtes som afvigende. (c-f) Scatterplots af cellen segmenteret område (c), celle gennemsnitlige tykkelse (d), celle største akse længde (e) og celle skærmformat (f) som funktion af tiden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: dataanalyse af en 2,7 dag celle bane (10 min frame interval). (en) celle segmentering udføres på time-lapse erhvervelse af en celle spor varig omkring 66 h. Celle af interesse er vist med en blå overlejring. Hver beskårne billede er 53 x 53 µm2. Celledelinger er vist med gule cirkler. (b) Plot af området celle som funktion af tiden. (c) tid udvikling af cellen tør masse beregnede fra integralet af fasen over området segmenterede celle ifølge Eq. (1). (d) Plot af gennemsnittet celle tykkelsen beregnes som funktion af tiden efter Eq. (2). Celle tykkelse udstiller skarpe toppe svarende til celledelinger (gule cirkler i (a) og røde linjer i (b-c-d-e)). (e) Plot af celle motilitet som funktion af tiden. (f) segmentering resultater svarende til det sidste billede i banen på T0 + 66h20min når celle densitet er omkring 475 celler/mm2. Billedet er 200 x 200 µm2 centreret på cellen i interesse. De hvide pletter (røde stjerner) svarer til celle debris, der vises efter en dag i cellekultur. (g) 800 x 800 µm2 beskåret rekonstruerede fase billede af den sidste ramme i denne celle nummer. Celle af interesse er omgivet af en gul cirkel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: cellecyklus analyse. (en) fordeling af cellecyklus varighed for en 2,7-dages observation af kulturperler HeLa celler (N = 10, 584 celle cyklusser). Fordelingen af cellecyklus varighed er tæt på en Gaussisk med en middelværdi på 16,5 timer og en relativ standardafvigelse på 12,3% (standardafvigelse målt på de Gaussian peak divideret med gennemsnittet af fordelingen). (b) sammenligning mellem manuel og automatisk celle sporing til bestemmelse af celle cyklus længde. Den manuelle tracking funktioner 100 cellecyklus baner (10,148 celle positioner). (c) fordeling af start tidspunktet for automatisk detekterede cellecyklus baner. (d) Plot af den målte oprindelige celle tør masse (lige efter celledeling, sorte prikker) og endelige celle tør masse (lige før celledeling, røde prikker) som funktion af tiden. På hver kasse, svarende til en placering af 6 h, den røde centrale mark angiver medianen og bunden og toppen kanterne af boksen angiver de 25 og 75 percentiler, henholdsvis. Knurhår udvide til de mest ekstreme datapunkter ikke betragtes som afvigende. (e) Scatterplot af cellen endelige tør masse som en funktion af den oprindelige tør masse. (f) udviklingen af celle tør masse vækst sats som en funktion af tid, eksperiment. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil 1: kode 'segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m'. Denne Matlab kode bruger 'trackmate' datasæt til at udføre celle segmenteringen af komplet time-lapse erhvervelse som rekonstruerede fase billeder gemmes i mappen 'folder_out'. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: kode 'lineage_Version_Jove.m'. Denne kode bruger array 'trackmate' behandlet med celle segmentering algoritme (segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m), for at udtrække cellecyklus baner og bestemme de forskellige parametre af interesse, f.eks., at celle cyklus varighed, den første celle tør masse og den endelige celle tør masse. Denne kode er i to dele, den første del beskæftiger sig med afsløring af de delende celler, og den anden del med analysen af cellecyklus baner. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette papir viser vi, at linsen-gratis video mikroskopi kan bruges inde i en inkubator til at fange kinetik af tusindvis af celler. For at beskrive den overordnede metode forklarede vi, hvordan en 2,7 dag time-lapse erhvervelse af HeLa celler i kultur kan analyseres med standard algoritmer, celle-tracking. Resultatet er et datasæt byder 2.2 x 106 celle målinger og 10,584 celle cykelstier. Opkøb blev udført på en kultur af Hela celler med en relativt stor afstand, celle-til-celle (celle tæthed < 500 celler/mm2) og morfologi, der kan tilnærmes med en disk. Disse to funktioner lette anvendelsen af en automatisk sporing af celle analyse, som gør det muligt at indsamle sådanne et stort datasæt. Andre cellelinjer med mindre celle til celle afstand eller med mere komplekse morfologier ville være vanskeligere at spore og efterfølgende datasæt ville være mindre.
Vi mener, at denne fremgangsmåde er interessant for mange undersøgelser, for eksempel celleproliferation og celle størrelse undersøgelser. Sidstnævnte er et vigtigt område for forskning i grundlæggende biologi og mange spørgsmål er fortsat ubesvarede så pænt drøftet i en gennemgang af Ginzberg et al. 29. den protokol, der er foreslået i dette arbejde giver således mulighed for at måle vigtige målinger kræves for celle spredning undersøgelser, dvs celle cyklus varighed, celle tør masse, celle tør masse forholdet mellem slutningen og begyndelsen af cyklussen og cellen tør masse vækstrate. Udover undersøgelse af celleproliferation, vil denne metode være af interesse for studiet af celle migration, da det kan producere et stort antal spor, hver enkelt varede flere timer. Denne protokol går ud over topmoderne14,30 ved at demonstrere for første gang erhvervelse af tusindvis af celle spor i mere end 10 h.
Afslutningsvis har vi udviklet en let-at-bruge linse-gratis teknik, der gør det muligt for at spore samtidig tusindvis af label-gratis celler over flere dage af kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne har intet at anerkende.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytonote lens-free video microscope | Iprasense | ||
| Horus acquisition software | Iprasense | ||
| 6-well glass bottom culture plates | MatTek corporation | Part No: P06G-0-14-F | |
| DMEM + GlutaMAX medium | Gibco | ||
| heat-inactivated fetal calf serum | Eurobio | ||
| penicillin and streptomycin | Gibco | ||
| Fibronectin | Sigma Aldrich | ||
| Matlab, image processing toolbox | Mathworks |
References
- Zangle, T. A., Teitell, M. A. Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics. Nat Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).
- Popescu, G., Park, K., Mir, M., Bashir, R. New technologies for measuring single cell mass. Lab Chip. 14 (4), 646-652 (2014).
- Reed, J., et al. Rapid, massively parallel single-cell drug response measurements via live cell interferometry. Biophys J. 101 (5), 1025-1031 (2011).
- Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci. USA. 108 (32), 13124-13129 (2011).
- Girshovitz, P., Shaked, N. T. Generalized cell morphological parameters based on interferometric phase microscopy and their application to cell life cycle characterization. Biomed Opt Express. 3 (8), 1757-1773 (2012).
- Kemper, B., Bauwens, A., Vollmer, A., Ketelhut, S., Langehanenberg, P. Label-free quantitative cell division monitoring of endothelial cells by digital holographic microscopy. J Biomed Opt. 15 (3), (2010).
- Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PLoS One. 9 (2), 1-8 (2014).
- Bon, P., Savatier, J., Merlin, M., Wattellier, B., Monneret, S. Optical detection and measurement of living cell morphometric features with single-shot quantitative phase microscopy. J Biomed Opt. 17 (7), (2012).
- Aknoun, S., et al. Living cell dry mass measurement usinq quantitative phase imaging with quadriwave lateral shearing interferometry: an accuracy and sensitivity discussion. J Biomed Opt. 20 (1), 1-4 (2015).
- Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
- Choi, W., et al. Tomographic phase microscopy. Nat Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
- Kesavan, S. V., et al. High-throughput monitoring of major cell functions by means of lensfree video microscopy. Sci Rep. 4, 1-11 (2014).
- Zheng, G., Lee, S. A., Antebi, Y., Elowitz, M. B., Yang, C. The ePetri dish, an on-chip cell imaging platform based on subpixel perspective sweeping microscopy (SPSM). Proc Natl Acad Sci USA. 108 (41), 16889-16894 (2011).
- Pushkarsky, I., et al. Automated single-cell motility analysis on a chip using lensfree microscopy. Sci Rep. 4, 4717 (2014).
- Allier, C., et al. Imaging of dense cell cultures by multiwavelength lens-free video microscopy. Cytom Part A. 91 (5), 1-10 (2017).
- Su, T. -W., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. High-throughput lensfree imaging and characterization of a heterogeneous cell solution on a chip. Biotechnol Bioeng. 102 (3), 856-868 (2009).
- Delacroix, R., et al. Cerebrospinal fluid lens-free microscopy: a new tool for the laboratory diagnosis of meningitis. Sci Rep. 7, 39893 (2017).
- Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2016).
- Popescu, G. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).
- Liu, P. Y., et al. Cell refractive index for cell biology and disease diagnosis: past, present and future. Lab Chip. 16, 634-644 (2016).
- Rapoport, D. H., Becker, T., Mamlouk, A. M., Schicktanz, S., Kruse, C. A novel validation algorithm allows for automated cell tracking and the extraction of biologically meaningful parameters. PLoS One. 6 (11), e27315 (2011).
- Al-Kofahi, O., et al. Automated cell lineage construction: A rapid method to analyze clonal development established with murine neural progenitor cells. Cell Cycle. 5 (3), 327-335 (2006).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. Tracking in cell and developmental biology. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 894-902 (2009).
- Posakony, J. W., England, J. M., Attardi, G. Mitochondrial growth and division during the cell cycle in HeLa cells. J Cell Biol. 74 (2), 468-491 (1977).
- Zocchi, E., et al. Expression of CD38 Increases Intracellular Calcium Concentration and Reduces Doubling Time in HeLa and 3T3 Cells. J Biol Chem. 273 (14), 8017-8024 (1979).
- Reitzer, L. J., Wice, B. M., Kennell, D. Evidence that glutamine, not sugar, is the major energy source for cultured HeLa cells. J Biol Chem. 254 (8), 2669-2676 (1979).
- Benedetti, A. D. E., Joshi-barve, S., Rinker-Schaeffer, C., Rhoads, R. E. Expression of Antisense RNA against Initiation Factor eIF-4E mRNA in HeLa Cells Results in Lengthened Cell Division Times, Diminished Translation Rates, and Reduced Levels of Both eIF-4E and the p220 Component of eIF-4F. Mol Cell Biol. 11 (11), 5435-5445 (1991).
- Kumei, Y., Nakajima, T., Sato, A., Kamata, N., Enomoto, S. Reduction of G1 phase duration and enhancement of c-myc gene expression in HeLa cells at hypergravity. J Cell Sci. 93 (2), 221-226 (1989).
- Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. On being the right (cell) size. Science. 348 (6236), 1245075 (2015).
- Mathieu, E., et al. Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments. Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).
