Summary
Lens-vrije videomicroscopie ons in staat stelt om te controleren van celculturen direct in de incubator. Hier beschrijven we het volledige protocol gebruikt voor het verwerven en analyseren van een 2.7 dag lang verwerving van gekweekte HeLa cellen, wat leidt tot een dataset van 2.2 x 106 metingen van individuele cel morfologie en 10584 celcyclus tracks.
Abstract
Hier, wij tonen die lens-gratis video microscopie laat ons tegelijkertijd vastleggen de kinetiek van duizenden cellen rechtstreeks binnen de incubator en dat het mogelijk is om te controleren en te kwantificeren van afzonderlijke cellen langs verschillende cel cycli. We beschrijven de volledige protocol dat wordt gebruikt om te controleren en te kwantificeren van een celkweek van HeLa 2.7 dagenlang. Eerst, cel cultuur overname is uitgevoerd met een lens-gratis video Microscoop, en vervolgens de gegevens wordt geanalyseerd na een proces van vier stappen: multi golflengte holografische wederopbouw, cel-tracking, mobiele segmentatie en celdeling detectie algoritmen. Dientengevolge, laten we zien dat het mogelijk is te verzamelen een dataset met meer dan 10.000 celcyclus tracks en meer dan 2 x 106 cel morfologische metingen.
Introduction
Monitoring van gekweekte zoogdiercellen in heel verschillende cel cycli en nauwkeurig meten cel grootte en cel drooggewicht is een uitdagende taak. Verschillende label-vrije optische technieken kunnen uitvoeren van deze taak1,2: fase-verschuiving interferometrie3, digitale holografische microscopie (DHM)4,5,6, 7, quadriwave laterale schuintrekken interferometrie8,9 en kwantitatieve fase tomografie10,11. Deze methoden hebben geleid tot veel nieuwe inzichten in het begrijpen van de celcyclus van zoogdiercellen. Maar zij worden zelden in combinatie met automatische cel bijhouden van algoritmen en hun doorvoer beperkt blijft bij het meten van massa trajecten1 cel (N < 20 in respectievelijk3,4,5 , 6). Vandaar een nieuwe optische methode voor het meten van de massa trajecten cel met grote statistieken nodig is (N > 1000).
In dit document tonen wij de mogelijkheden van de lens-vrije videomicroscopie voor gelijktijdig beeld duizenden cellen rechtstreeks binnen de incubator, en vervolgens het kwantificeren van eencellige statistieken langs duizenden individuele cel fietspaden. Lens-vrije microscopie is een kwantitatieve fase imaging techniek waarmee de overname van fase beeld van dichtbevolkte verpakte cellen over een zeer groot gezichtsveld (meestal enkele tientallen mm2, hier 29,4 mm2)12,13 ,14,15. Diverse maatstelsels op het niveau van één cel worden bepaald, bijvoorbeeldcel gebied, cel drooggewicht, cel dikte, lengte van de hoofdas cellen en cel hoogte-/ breedteverhouding12,15, van elke afbeelding. Vervolgens, door toepassing van een algoritme cel-tracking, deze functies kunnen worden uitgezet voor iedere enkele cel als functie van het experiment tijd14,15. Bovendien, door het detecteren van de aanwezigheid van celdelingen in de cel nummers, het is mogelijk om uit te pakken van andere belangrijke informatie, zoals de eerste cel droge massa (net na de celdeling), de laatste cel drooggewicht (net voor de afdeling van de cel) en de cel cyclus duur, dat wil zeggen, de tijd tussen twee opeenvolgende divisies15. Alle deze metingen kunnen worden berekend met zeer goede statistieken (N > 1000) Aangezien het groot gezichtsveld zou meestal de analyse van 200 naar 10000 cellen in een enkele lens-gratis overname.
Om uit te leggen deze methode gebaseerd op de lens-vrije videomicroscopie, beschrijven we het protocol om te controleren en te kwantificeren van een celkweek van HeLa 2.7 dagenlang. Data-analyse is een vier-stappen-proces op basis van multi golflengte holografische wederopbouw, cel-tracking, mobiele segmentatie en celdeling algoritmen. Hier wordt aangetoond dat de ruimtelijke resolutie en de relatief snelle framerate (een acquisitie om de 10 minuten) verkregen met deze lens-vrije videomicroscopie setup compatibel met standaard cel-tracking algoritmen. De volledige analyse van deze dataset resulteert in de meting van 10,584 cel nummers over volledige cel cycli.
Om samen te vatten, is lens-vrije videomicroscopie een krachtig hulpmiddel voor het automatisch controleren van duizenden labelloze, niet-gesynchroniseerde en ongewijzigde cellen per experiment; elke cel wordt bijgehouden over meerdere cel cycli. Onze metingen bieden dus de gemiddelde waarde van verschillende parameters van de cel, maar nog belangrijker, de variabiliteit van Inter cel over een grote bevolking van cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. de controle op verwerving van celkweek
- HeLa cellen in DMEM + glutamine (bvGlutaMAX) groeien medium aangevuld met 10% (v/v) warmte-geïnactiveerd foetale kalf serum en 1% penicilline en streptomycine.
- Jas 6-goed bodem cultuur glasplaten met fibronectine (25 µg/mL) gedurende 1 uur. Vervolgens zaad 2 x 104 cellen per putje.
- Tijdens de overname, veranderen het medium om de 3 dagen.
- Voor de time-lapse overname, gebruikt u de video lens-vrije Microscoop (Los verkrijgbaar).
Opmerking: Dit is gebaseerd op de lens-vrije computationele beeldvormende techniek zoals beschreven door Ozcan et al. 16 die is bewerkt voor het uitvoeren van continue monitoring in een incubator bij een gecontroleerde temperatuur van 37 ° C12,15. Het beschikt over een aanvullend metalen zuurstofverbinding semiconductor (CMOS) spiegelbeeld voeler met een pixelgrootte van 1.67 µm en een opnamegebied van 6.4 x 4,6 mm2. Meerdere golflengte verlichting wordt geleverd door een multichip licht emitterende diode (LED's) apparaat levert van rode, groene en blauwe verlichting. De golflengten zijn gecentreerd, op 636, 521 en 452 nm met een spectrale bandbreedte van 25, 45 en 25 respectievelijk nm respectievelijk. De rood-groen-blauw (RGB) LEDs bevinden zich boven een 150 µm gaatje op een afstand van ongeveer 5 cm uit de cellen. Het licht gemeten dichtbij de LED vermogen is zo laag als 10 μW bij elke golflengte en de tijd van de verlichting is slechts één seconde per acquisitie. Dus, geen foto-toxiciteit problemen worden verwacht wanneer celculturen worden waargenomen onder de lens-gratis video Microscoop. - Zet de cel cultuur container bracht in contact met de CMOS-sensor (Figuur 1). Gebruik een container met een dekglaasje glas aan aan de onderkant, die belangrijk is voor de kwaliteit van de lens-gratis overname. Plastic verpakkingen kunnen ook worden gebruikt, maar de lens-gratis overname zal worden afgebroken als gevolg van de slechte optische kwaliteit van deze containers.
- Controle van de video lens-vrije Microscoop met de acquisitie software (Los verkrijgbaar), die zowel de time-lapse acquisitie en de holografische wederopbouw voert. De parameters die moeten worden opgenomen door de gebruiker in de interface van de software zijn de framesnelheid, de duur van het experiment, en het type van de cultuur van de cel, d.w.z. Adherente cellen of zwevende cellen.
- Stel de invoerparameters van de acquisitie software. Stel de framesnelheid ingesteld op één verwerving elke 10 minuten en het celtype cultuur te 'aanhanger'.
Opmerking: Een framesnelheid van een acquisitie om de 10 minuten is een goed compromis, aangezien hierdoor een betrouwbare cel bijhouden terwijl de grootte van de resulterende dataset te analyseren nog redelijk is. De snelste framesnelheid haalbaar met deze lens-vrije microscopie opstelling is een overname elke 5 minuten. Verdere verhoging van de framesnelheid resulteert in buitensporige verwarming van de CMOS sensor die kan invloed hebben op de levensvatbaarheid van de cellen in de cultuur. - Start de time-lapse verwerving en de holografische wederopbouw algoritme (Los verkrijgbaar) verwerkt automatisch de lens-gratis overname met het oog op het imago van de fase van de cultuur van de cel. De holografische wederopbouw-algoritme is gebaseerd op een multi golflengte fase ophalen algoritme17 en biedt een RGB-afbeelding van de gereconstrueerde fase in het bereik van [-π, + π] voor iedere enkele cel over een groot gezichtsveld van 29,4 mm2. Het principe van lens-vrije in-lijn holografie is voor het verlichten van een dunne monster (op z = 0) met een vliegtuig Golf (amplitude 1 na normalisatie) en te detecteren op een CMOS-sensor van de latere diffractie intensiteit afbeelding op een korte afstand z = Z, meestal 1 mm na de monster. In onze opstelling, de verlichting is sequentieel overgeschakeld naar 3 golflengten (λ1= 0.450 µm, λ2= 0.540 µm, λ3= 0.647 µm) voor het meten van drie diffractie patronen van hetzelfde monster.
2. cel cultuur Data-analyse
- Voor cel-tracking, gebruikt u de Trackmate-algoritme, een opensource Fiji plugin voor het geautomatiseerde volgen van enkele deeltjes18. At eerst, laad de volledige time-lapse overname in Fiji (de opdracht van de volgorde van de afbeelding van de belasting). Vanwege de grote omvang van de datasets, die meestal 400 RGB frames van 29,7 Mb kenmerkt, is het sneller om ze te laden in 8-bits indeling. Naast begeleidt de plugin van Trackmate Fiji de gebruiker door verschillende stadia van het algoritme van de cel-tracking, namelijk een cel detectie stadium, een cel tracker fase en meerdere filters toegepast op de cel detecties en de berekende nummers. In iedere fase, de algoritmen configureren en weergeven van de resultaten onmiddellijk zodat, indien nodig, een gemakkelijk heen en weer navigeren kunt om te passen de instellingen. De verschillende menu's van de Trackmate-interface worden weergegeven in Figuur 2 met de werkelijke instellingen die worden gebruikt voor de HeLa cellen experiment.
- Stel de invoerparameters van de overname-software als volgt (Zie Figuur 2). Stel de geschatte blob-diameter 15 pixels, de drempel van de detector op 0,25, de koppeling maximumafstand 15 pixels, de kloof-sluiting max afstand tot 15 pixels en het aantal plekken in de nummers 3.5.
Opmerking: Deze instellingen zal uiteraard verschillen van één experiment naar de andere, met name de 'geschatte blob diameter' die overeenkomt met de grootte van de cel (hier gegeven in pixels 1.67 µm). Dezelfde opmerking geldt voor het ' koppelen max' die goed zijn voor de maximumafstand afgelegde afstand door een cel binnen twee opeenvolgende frames (hier gegeven in pixels 1.67 µm). De optimale waarde zou afhangt van de beweeglijkheid van de cel maar ook van de celdichtheid. - Aan het einde van de cel-tracking proces, de resultaten te genereren in de vorm van drie tekstbestanden ('Analyse' knop, Zie Figuur 2). Het nuttigste bestand, genaamd 'Spots in tracks statistieken', bestaat uit een tabel met alle gedetecteerde cellen met hun respectieve (x, y) posities in de verwerving, hun framenummer en hun nummer. Op basis van deze gegevens, uitvoeren van cel segmentatie en celdelingen met speciale algoritmen (Zie aanvullende codebestanden) detecteren. De twee andere bestanden heten 'Links in de statistieken van de tracks' en 'Track statistieken' en omvatten alle resultaten die zich bezighouden met de tracks, zoals de duur van de track, aantal gedetecteerde lacunes, nummer van eerste frame, enz.
- Gebruik de cel segmentatie algoritme (Zie aanvullende codebestand) automatisch uitpakken van diverse maatstelsels beschrijven de morfologie van de cel van de gereconstrueerde fase afbeelding. Deze statistieken zijn de cel-oppervlakte (S), de cel hoofdas lengte (L), de cel secundaire as lengte (l) en de hoogte-breedteverhouding van de cel (L/l). De fase die lens-vrije microscopie verhaald is evenredig met de dichtheid en de dikte van de laag van het model zoals eerder besproken15.
- Naast de morfologische eigenschappen van de cel, uittreksel kwantitatieve cel droge massa (CDM) metingen van de gereconstrueerde fase13,19,20
EQ. (1)
waar φ(x,y) is de gereconstrueerde fase verschuiving19, λ de golflengte en α = 1,8 x 10-4 m3/kg de specifieke brekingsindex, namelijk de variatie van de brekingsindex te drogen massa1, 19. - De dikte van de cel met behulp van een schatting van het verschil tussen de brekingsindex van de cel en die van de voedingsbodems evalueren. De relatie tussen de cel dikte h(x,y) en de gemeten faseverschuiving wordt gegeven door20:
EQ. (2.1)
EQ. (2.2)
met Δn(x,y) = ncel (x,y) - nmedium (x,y), het verschil van de brekingsindex tussen de cel en de cultuur-media. In het volgende veronderstellen een constante waarde van Δn = 0,025, die naar verwachting van de brekingsindex gemeten in HeLa celkernen (n = 1.35511) en dat van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voedingsbodems (n = 1.33). Hoewel de dikte van de celwaarde uitsluitend indicatief is aangezien het is gebaseerd op een veronderstelling, haar relatieve variaties zijn zinvol en kunnen worden benut om de scheidslijn cellen te detecteren. - Gebruik de toegewijde algoritme (Zie aanvullende codebestand) op te sporen het vóórkomen van celdelingen en pak vervolgens cel tracks die gekoppeld aan de gedetecteerde celdelingen, zijn om op te sporen van een afdeling van de cel, cellen met een gemeten dikte groter dan 8 µm zijn voor het eerst geïdentificeerd, dan controleren of een nieuwe cel voorkomt nauw in ruimte en tijd. Op deze manier is het opsporen van celdelingen afhankelijk van twee robuuste criteria. Alternatief en uitgebreidere methoden voor de detectie van de celdeling kunnen worden toegepast op de lensfree time-lapse overname21,22,23.
EQ. (1)
EQ. (2.1)
EQ. (2.2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor de holografische wederopbouwproces, het lichte gebied wordt beschreven door een scalair veld een (waar 
is de complexe waarde van A op het vliegtuig op afstand z van de monster- en laterale positie 
en op de golflengte λ). Lichte vermeerdering is gemodelleerd door de Huygens-Fresnel-theorie waarin een propagator kernel 
. Daarom de amplitude van het veld op het vlak van de detector, eenz is gerelateerd aan de lichte amplitude een0 door de volgende relatie:
dat wil zeggen
met 
, waarbij ik het complexe getal (ik2=-1)
De meting van de intensiteit is gewoon gemodelleerd door 
. Het doel van het wederopbouw-algoritme is het vinden van een 'goed' veld A0, aan het waargenomen monster, waarin diffractie zou overeenkomen met de gemeten intensiteit gerelateerde ikz. De strategie is om te overwegen de amplitude veld fase bij de detector vliegtuig φz als onbekende van het probleem en het optimaliseren van het criterium van een multispectrale totale variatie van het object. Explicieter, gelet op de velden
dat wil zeggen
voor elke fase veld φz, 
perfect overeenkomt met de gegevens sinds 
. Zodat het volgende veld 
is een mogelijke amplitude-veld in het vlak van de steekproef, gegeven de waargenomen intensiteit afbeelding. Dit is de reden waarom een criterium op A0 wordt gebruikt om op te geven van een unieke oplossing onder alle gegevens-matching mogelijkheden. Het criterium om te minimaliseren werd gekozen als:
waarbij x en y zijn de coördinaten van het vliegtuig, dat wil zeggen 
. Met behulp van een dergelijk criterium kunt selecteren, onder alle mogelijke terreinen, een monster veld weergeven van scherpe randen op dezelfde plaats voor alle golflengten, die fysiek zinvol is. Deze methode vermindert het voorkomen van 'twin-beelden' in het gereconstrueerde veld een0. Het 'twin-beeld' is een belangrijk artefact die uit een gebrek aan fase informatie tijdens het aankoopproces voortvloeit.
Voor de praktische berekening, de integralen zijn discretized met een ruimtelijke steekproef die overeenkomt met de resolutie van de detector, de derivaten zijn vervangen door Sobel exploitanten en kronkels van de Huygens-Fresnel propagator 
worden uitgevoerd door te gaan aan de Fourier-ruimte waar 
heeft een eenvoudige uitdrukking: 
. Minimalisering van de (echte) criterium ε met betrekking tot de (echte) ingestelde variabelen 
wordt aangepakt met behulp van de niet-lineaire geconjugeerde-gradiëntenmethode, waarvoor de gradiënt van ε moeten worden berekend voor elke fase gekoppeld aan elke detector pixels voor elk golflengte.
Mobiele fase van wederopbouw/uitpakken
Figuur 3 toont de resultaten van de holografische wederopbouw van één frame van een time-lapse verwerving van HeLa cellen in cultuur. Figuur 3a toont het volledige gezichtsveld van een ruwe verwerving in het blauwe kanaal op een 29,4 mm2 -gebied. Gebaseerd op deze afbeelding en degene die zijn verworven in de rode en groene kanalen, produceert de holografische wederopbouw een RGB-afbeelding van de fase van de cellen zoals in cijfers 3b en 3 c. De gereconstrueerde fase afbeelding vertoont lokaal verpakt fase artefacten overeenkomt met cellen die een fase verschuiving van meer dan induceren + π. Om uit te voeren een eenvoudige fase uitpakken, wij een heuristische betekenen, namelijk detecteren wij de pixels met de waarde 
meer dan 0,3 en stel deze pixels + π. Deze eenvoudige methode is gebaseerd op een eigenschap van de RGB-gereconstrueerd fase afbeeldingen. In theorie aan elke pixel meten we een verhouding 
gelijk aan 
. Maar in het geval van mitotische cel, wanneer fase inwikkeling optreedt, deze relatie wordt niet langer onderhouden in de RGB-gereconstrueerde fase afbeelding (figuur 3f). De hierboven genoemde heuristische methode maakt gebruik van deze eigenschap, zodat een eenvoudige drempelmethode kan worden gebruikt voor het detecteren van de pixels presenteren fase verpakking. De resultaten van het beeld van de gereconstrueerde fase vóór en na het uitpakken wordt weergegeven in cijfers 3f en 3 g, respectievelijk. Deze onverpakt fase beelden worden vervolgens ingevoerd in de cel-tracking-algoritme. Zonder deze uitpakken stap, zou de cel-tracking-algoritme niet detecteren van cellen in de divisie en cellen van grote dikte, waardoor de uiteindelijke resultaten in gevaar zou komen. De resolutie van de afbeelding van de gereconstrueerde fase werd geschat op ongeveer 5 µm15 (volledige breedte ruimtelijke resolutie), die is relatief grof. Toch is het mogelijk om te observeren details zoals lamellipodia en cel cytoplasma (3f cijfers en 3 g). Bovenal is het beeld verkregen door lens-vrije microscopie toont een groot contrast en is vrijgesteld van halo artefacten. Dit vergemakkelijkt de opsporing van de automatische cel en cel-tracking.
Cel cultuur data-analyse
Uitpakken van de celcyclus worden bijgehouden, de data-analyse is gebaseerd op een reeks van verschillende algoritmen, namelijk de cel bijhouden uitgevoerd met de plugin van Trackmate Fiji, de detectie van divisies en uiteindelijk de winning van cel cyclus tracks, dat wil zeggen de volgorde tussen twee celdelingen. In de volgende bespreken we de kwaliteit van de resultaten van deze algoritmen in vergelijking met handmatige metingen.
Figuur 4 toont verschillende schermopnamen van de cel-tracking-resultaten, de resultaten van de cel detectie algoritme en de resultaten van de analyse van de cel-tracking. Het opsporen van cellen in de lens-vrije verwerving (cijfers 4a-4 c) is de eerste stap van de cel-tracking-algoritme. Om te kunnen valideren de cel detectie algoritme, geannoteerde we handmatig een klein gedeelte van de time-lapse lens-vrije verwerving (214 frames van 663 x 663 µm2). Wij handmatig geselecteerd van een totaal van 5365 cel posities en deze resultaten vergeleken met die welke verkregen door de plugin van Trackmate Fiji. Figuur 5 toont de resultaten in termen van echte detectie, valse positieven en valse negatieven. De resulterende gevoeligheid is ongeveer 96% en de positief voorspellende waarde zo groot als 99,7%. Deze hoge waarden weerspiegelt de goede kwaliteit van de gereconstrueerde fase beelden verkregen met de lens-vrije videomicroscopie setup. Na de detectie van de cel, een cel segmentatie algoritme maakt het mogelijk om meten — voor elke cel — diverse verschillende maatstelsels, bijvoorbeeld het gebied van de cel, de cel droge massa en de dikte van de cel. Figuur 6a toont het principe van het algoritme van de segmentatie en 6f figuur toont de gesegmenteerde beelden in een tijdreeks voor een gebied van belang van 663 x 663 µm2 (hetzelfde als in Figuur 5). Het algoritme initieert de segmentatie door drempelmethode de fase-afbeelding (Zie Figuur 6b) en wordt vervolgens een seeding procedure toegepast (Zie Figuur 6 c). Namelijk zijn de pixels van het centrum van de gedetecteerde cellen ingesteld op de waarde van de bijbehorende track. De X-Y-posities van de cellen en hun overeenkomstige tracknummer worden geleverd door de 'Spots in tracks statistieken' bestand verkregen na het volgen van de cel. Vervolgens wordt een iteratieve vullen procedure geïmplementeerd die zich uitstrekt van het zaad tot de grenzen van de cel (figuren 6 c-e) bepaald door de eerste drempelmethode (Figuur 6b). Deze procedure invullen, is afhankelijk van basisbewerkingen in de mathematische morfologie, bijvoorbeeld dilatatie en erosie. Uit het resultaat van de segmentatie, het is dan mogelijk om te berekenen van diverse maatstelsels op de eencellige niveau, d.w.z. morfologische kenmerken zoals de lengte van de cellen, het gebied van de cel en de hoogte-breedteverhouding van de cel, maar ook, wat nog belangrijker is, de cel droge massa volgens EQ. 1. Teneinde de betrouwbaarheid van de microscopie lens-gratis meting van de cel droge massa, wij hebben het imago van de lens-vrije gereconstrueerde fase van vaste HeLa cellen (Figuur 6 g) vergeleken met dezelfde regio verworven door middel van een digitale holografische microscopie met een 5 X doelstelling (Figuur 6 h). Figuur 6i toont de cel droge massa gemeten door gemiddelde van lens-vrije microscopie als een functie van het drooggewicht gemeten met DHM voor 302 gesegmenteerd HeLa cellen. Er is een goede correlatie tussen de twee metingen (prestatiecoëfficiënt bepaling R2 is 0.86, helling = 0.9, offset =-17 pg). Uit Figuur 6 decies, kunnen we de precisie van de cel droge massameting verkregen met behulp van microscopie lens-gratis schatten. De precisie, gemeten als de gemiddelde square fout tussen de lens-gegevens en de lineaire pasvorm, is ongeveer 16 pg.
Bij het opstellen van alle eencellige metingen over de volledige time-lapse verwerving, is het vervolgens mogelijk te krijgen scatterplots van diverse maatstelsels als functie van de tijd, zoals weergegeven in Figuur 7. Deze scatterplots bevatten informatie over de kinetiek van de gekweekte cellen over een zeer grote populatie. Het aantal cellen in het gezichtsveld stijgt vanaf 2.000 tot 15.000 (figuur 7a). Vermenigvuldigd met het aantal tijdstippen, dit leidt tot een grote dataset van 2.2 x 106 gedetecteerd cellen, elk van hen wordt gekenmerkt door zijn coördinaten en morfologische kenmerken, d.w.z. cel drooggewicht (figuur 7b), cel gebied (Figuur 7 c) , cel gemiddelde dikte (Figuur 7 d), hoofdas lengte (figuur 7e), en hoogte-breedteverhouding (afbeelding 7f).
Nog belangrijker is, de combinatie van cel bijhouden en cel segmentatie algoritmen stelt ons in staat om te meten de kinetiek op het niveau van één cel. Als voorbeeld toont Figuur 8 de analyse van een cel bijhouden ongeveer 66 uur durende en tentoonstellen van vier celdelingen op T0 4.1 h, T0 + 20,5 h, T0 + 36,7 h en T0 + 53,3 h. figuur 8a tonen de resultaten van de automatische cel segmentatie algoritme waarmee ons af te bakenen efficiënt het oppervlak van deze cel. Met behulp van de segmentatie van de cel, het is dan mogelijk om verschillende statistieken te berekenen als functie van de tijd, bijvoorbeeld de cel-oppervlakte (Figuur 8), de cel droge massa (Figuur 8 c), de gemiddelde dikte van de cel (Figuur 8 d) en de cel motiliteit (figuur 8e). Uit deze grafieken, kan men duidelijk de kinetiek van deze cellulaire statistieken tussen celdelingen meten. Men kan in het bijzonder de toename van de mobiele ruimte en het drooggewicht observeren tijdens een celcyclus. Bovendien, met behulp van de automatische detectie van celdelingen, drie verschillende cel fietspaden kunnen worden geëxtraheerd uit dit nummer en de duur van de celcyclus, dat wil zeggen de periode tussen twee divisies, kan worden geschat. Op het spoor van eencellige weergegeven in Figuur 8, we gemeten drie celcyclus duur, namelijk 16.4 h, 16.2 h en 16.7 h. samenstellen van alle de celcyclus tracks uit de analyse van een 2,7 dagen time-lapse overname resulteert in de opsporing van 16725 celdelingen en de beschrijving van 10,584 tracks van de celcyclus. Het is dan mogelijk om het gemiddelde en de variabiliteit van de duur van de celcyclus met goede statistieken te meten. We vonden dat de verdeling van de celcyclus duur dicht bij Gaussiaanse distributie (figuur 9a) met een gemiddelde van 16,5 h, en een relatieve standaardafwijking van 12,4% (standaarddeviatie gemeten op de Gaussiaanse peak gedeeld door het gemiddelde van de verdeling is ). De gemiddelde tijd van 16.5 h verdubbeling komt overeen met de lengte van de celcyclus gemeten handmatig op het spoor op Figuur 8gepresenteerd. Het ligt echter in het lagere bereik van gepubliceerde waarden voor HeLa verdubbeling tijd die meestal tussen 20 en 30 h24,25,26,27. In verwijzing28, is echter ook een korte verdubbeling tijd van 16,2 ± 1,7 h genoemd. Om verdere valideren van onze metingen van de lengte van de celcyclus en bevestigen van de betrouwbaarheid van onze microscopie lens-vrije techniek, die wij hebben uitgevoerd een handmatige tracking van 100 celcyclus tracks (10,148 cel posities). Cyclus van de cel nummers handmatig verkregen (N = 100) de lengte gemeten celcyclus is 16.7±1.9 h (N = 100, figuur 9b). Dit is zeer dicht bij de meting van 16.5±2.1 h (N = 10,584) verkregen met de automatische cel tracking, demonstreren de geldigheid van de algemene analyse. Wanneer het vergelijken van het handmatig bijhouden van de celcyclus trajecten aan bepaald automatisch, vonden we dat 67% van de celcyclus tracks met succes zijn aangetroffen en dat de cyclus lengte automatisch gemeten zijn goed gecorreleerd aan degene die zijn gemeten handmatig (figuur 9b). De efficiëntie van de detectie van de celcyclus trajecten werd gemeten in de eerste 32 uren van het experiment, op een bevolkingsdichtheid onder 150 cellen/mm2. Deze opsporingstarief duidelijk vermindert met de tijd, als de cel dichtheid verhoogt ~ 500 cellen/mm2. Het aantal gedetecteerde celcyclus nummers bereikt een plateau op T0 + 32 h (Figuur 9 c) terwijl het aantal cellen nog steeds stijgt met een factor drie tussen T0 + 32 h en T0 + 72 h (figuur 7a). Gezien de omvang van de valse positieve en negatieve detecties, figuur 9b presenteert 5 uitschieters punten: 4 van hen zijn te wijten aan onjuiste negatieve detectie (lengte cyclus > 25 h) en 1 tot en met een onjuiste positieve detectie (cyclus lengte < 10u). Dit om resultaten te verkrijgen, hebben we een hoge drempel over de dikte (8 µm) in de celdeling detectie algoritme, gebruikt om het voordeel van een lage valse positieve tarieven. Bovendien, de presentatie van inconsistentie tracks zijn gefilterd uit, dat wil zeggen de celcyclus welke duur minder dan 6 h en tracks met een droge massa traject dat niet lineair als functie van de tijd toeneemt. Ze zijn slechts 3% van het totale aantal nummers van de celcyclus. Dientengevolge, is de verdeling van de lengte van de celcyclus automatisch verkregen goed benaderd door een Gaussiaan (figuur 9a) met een laag aantal korte tracks (lengte van de celcyclus < 10u, 5,1% van het totale aantal tracks), die uit onwaar voortvloeien zou positieve divisie detecties. Ook tracks weer te geven van een lange cyclus van de cel, die zou gedeeltelijk resultaten van valse negatief divisie detecties, zijn ook zeldzame (lengte van de celcyclus > 25 h, 2,4% van het totale aantal tracks). Handmatige tracking van de celcyclus trajecten werd ook gebruikt voor de verdere beoordeling van het volgen van de cel uitgevoerd met de plugin. Wij hebben gemeten op 6693 cellen een algehele nauwkeurigheid van de lokalisatie van 1.6 µm op overeenkomende punten, die binnen één Pixelpitch (1.67 µm).
Andere parameters kunnen worden onderzocht, zoals de cel eerste droge massa (net na een divisie), de laatste droge massa (net voor een celdeling), evenals het gemiddelde groeipercentage tijdens de celcyclus. Figuur 9 d percelen droge massa's van de eerste en laatste cel als functie van de tijd. Het laat zien dat beide eerste en laatste cel droge massa met de tijd verminderen. De gemiddelde waarde van de eerste cel droge massa neemt af tot 223 pg tot 130 pg en de laatste cel droge massa van 460 pg tot 220 pg. De verhouding tussen de twee blijft stabiel op 1.89 ± 0.12 tijdens het hele experiment (Figuur 9 d-e). Ten slotte, Figuur 9 septies toont de evolutie van de cel droge massa groei als een functie van de tijd over de 10,584 sporen van de celcyclus en we vonden dat de afname van de groei van de cel een gemeenschappelijke trend voor de bevolking van de gehele cel in dit bijzonder experiment is.
Figuur 1: Lens-vrije microscopie. (een) Schematische voorstelling van de lens-vrije microscopie overname setup. (b) foto van de 6-putten lens-gratis video Microscoop. Het maakt gebruik van een CMOS-beeldsensor met een pixelgrootte van 1.67 µm en een opnamegebied van 6.4 mm x 4,6 mm = 29,4 mm2. Verlichting wordt geleverd door een multi-gekleurde RGB LED's samen met een gaatje geplaatst op een afstand van ongeveer 5 cm uit het monster. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: de interface Trackmate. Hoofdmenu's van de plugin getoond met de werkelijke instellingen die worden gebruikt voor de cel HeLa experimenteren. De diameter van de geschatte blob is ingesteld op 15 pixels, de detector drempel was ingesteld op 0,25, de koppeling maximumafstand werd ingesteld op 15 pixels, de kloof-sluiting max afstand werd ingesteld op 15 pixels en het aantal plekken in de nummers 3.5 was ingesteld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: holografische wederopbouwproces. (een) Raw verwerving van HeLa cellen in cultuur door middel van lens-vrije microscopie (volledige gezichtsveld van 29,4 mm2). (b) Detail van (a). (c) Detail van (b). (d) RGB gereconstrueerde fase afbeelding (volledige gezichtsveld van 29,4 mm2). Detail van de (e) van (d). (f) Detail van (e). (g) fase beeld verkregen na fase uitpakken om te worden vergeleken met (f), voordat het uitpakken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Screen captures van de cel-tracking-resultaten uitgevoerd met behulp van de plugin van Trackmate Fiji. (een) resultaten van de cel detectie algoritme dat is gebaseerd op een Laplaciaan van Gauss (LoG) detector. De foto toont het volledige gezichtsveld van de lens-gratis overname T0 + 16h40min in die 2,451 cellen worden gedetecteerd. De laatste zijn omgeven met een paarse cirkel. (b) resultaten van de cel-tracking-algoritme. Alle mobiele nummers staan meer dan 50 frames (~ 8 uur) met een kleurcode die overeenkomt met de gemiddelde snelheid. (c, d) Gedetailleerde foto van (a) en (b) respectievelijk (gele rechthoek). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: validatie van de cel detectie etappe van de cel-tracking algoritme. (een) Cropped beeld van HeLa cellen in cultuur (663 x 663 µm2) waar de cel geselecteerd met de hand worden gemarkeerd met blauwe kruisen en die met de cel-tracking algoritme ontdekt zijn gemarkeerd met de rode kruisen. Hierdoor is de bepaling van de onjuiste positieve detectie (rode cirkel) en valse negatieve detecties (oranje cirkel). (b) het aantal echte detectie (groene lijn), valse positieve (rode lijn) en detectie van valse negatief (oranje) worden uitgezet als functie van de tijd van het experiment. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: resultaten van de cel segmentatie. (een) Reconstructed fase beeld van een regio van belang voor de time-lapse overname T0 + 7 h (663 x 663 µm2). (b) het algoritme initieert de segmentatie door drempelmethode die de fase afbeelding (c) de segmentatie begint met een seeding procedure, dat wil zeggen de pixels van het centrum van de gedetecteerde cellen zijn ingesteld op de waarde van de bijbehorende track. (d-e) Vervolgens en iteratief is de procedure van een vulling geïmplementeerd die breidt het oorspronkelijke zaaien tot de grenzen van de cel bepaald door de eerste drempelmethode (b). (f) het resultaat van het algoritme van de segmentatie is getoond voor een tijdreeks op een 663 x 663 µm2 regio (hetzelfde als in Figuur 5). De segmentatie wordt weergegeven als een gekleurde oppervlak bedekt boven op de afbeelding van de gereconstrueerde fase. Merk op dat de lens-gratis signaal is voornamelijk afkomstig van de nucleaire regio, en de gesegmenteerde gebieden dicht bij de kern vallen. (g) Reconstructed fase verkregen door lens-vrije microscopie in vaste HeLa cellen. Dit is een bijgesneden afbeelding van het volledige gezichtsveld van 29,4 mm2. (h) fase beeld van de regio weergegeven in (g) verkregen door digitale holografische microscopie met een 5 X doelstelling (NB 0.12) verlicht met een laser op 647 nm. (ik) Plot van de cel droge massa verkregen door middel van lens-vrije microscopie als een functie van het drooggewicht gemeten door middel van DHM. De scatterplot compileert 302 cellen metingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: Data-analyse van een 2.7-dag lens-vrije tijd-tijdspanne verwerving van HeLa cellen. (een) totaal aantal cellen in de volledige gezichtsveld van 29,4 mm2 geteld als een functie van de tijd. (b) Scatterplot van de cel droge massa als een functie van de tijd. Op elke doos, overeenkomt met een opslaglocatie van 6 uur, de rode centrale is ingeschakeld, de mediaan en de randen van het onder- en bovenkant van het vak aangeven de 25e en 75e percentiel, respectievelijk. De snorharen worden uitgebreid tot de meest extreme gegevenspunten niet beschouwd als uitschieters. (c-f) Scatterplots van de cel gesegmenteerd gebied (c), de gemiddelde dikte van de cel (d), de cel hoofdas lengte (e) en de hoogte-breedteverhouding van de cel (f) als een functie van de tijd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8: Data-analyse van een 2.7 dag cel traject (10 min frame interval). (een) cel segmentatie uitgevoerd op de time-lapse verwerving van een cel track duurzame ongeveer 66 h. De cel van belang wordt weergegeven met een blauwe overlay. Elke bijgesneden afbeelding is 53 x 53 µm2. De celdelingen worden weergegeven met gele cirkels. (b) Plot van het gebied van de cel als functie van de tijd. (c) de tijdsevolutie van de cel droge massa berekend op basis van de integraal van de fase over het gebied van de gesegmenteerde cel volgens Eq. (1). (d) Plot van het gemiddelde cel dikte berekend als een functie van de tijd volgens Eq. (2). De dikte van de cel vertoont scherpe pieken overeenkomt met celdelingen (gele cirkels in (a) en rode lijnen in (b-c-d-e)). (e) Plot van de beweeglijkheid van de cel als functie van de tijd. (f) segmentatie resultaten overeenkomend met het laatste frame van het spoor en op T0 + 66h20min wanneer de celdichtheid ongeveer 475 cellen/mm2 is. Het beeld is 200 x 200 µm2 gecentreerd op de cel van belang. De witte vlekken (rode sterretjes) komen overeen met de cel puin dat na een dag van cultuur van de cel weergegeven. (g) 800 x 800 µm2 bijgesneden gereconstrueerde fase afbeelding van het laatste frame van dit nummer van de cel. De cel van belang is omgeven door een gele cirkel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9: analyse van de celcyclus. (een) distributie van de celcyclus duur voor een 2.7-dag observatie van gekweekte HeLa cellen (N = 10, 584 cel cycli). De verdeling van de celcyclus duur ligt dicht bij een Gaussiaan met een gemiddelde van 16,5 uur en een relatieve standaardafwijking van 12,3% (gemeten op de Gaussiaanse peak gedeeld door het gemiddelde van de verdeling standaarddeviatie). (b) vergelijking tussen de handmatige en automatische cel bijhouden voor de bepaling van de lengte van de celcyclus. De handmatige tracking beschikt over 100 celcyclus trajecten (10,148 cel posities). (c) verdeling van de begin tijd van de automatisch gedetecteerde celcyclus trajecten. (d) Plot van de gemeten oorspronkelijke cel droge massa (net na de celdeling, zwarte stippen) en de laatste cel drooggewicht (net voor celdeling, rode puntjes) als een functie van de tijd. Op elke doos, overeenkomt met een opslaglocatie van 6 h, de rode centrale is ingeschakeld, de mediaan en de randen van het onder- en bovenkant van het vak aangeven de 25e en 75e percentiel, respectievelijk. De snorharen worden uitgebreid tot de meest extreme gegevenspunten niet beschouwd als uitschieters. (e) Scatterplot van de laatste cel droge massa als een functie van de aanvankelijke droge massa. (f) de evolutie van de cel droge massa groei als een functie van de tijd van het experiment. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende bestand 1: Code 'segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m'. Deze Matlab-code gebruikt de dataset 'trackmate' voor het uitvoeren van de segmentatie van de cel van de volledige time-lapse overname waarvan de gereconstrueerde fase afbeeldingen worden opgeslagen in de map 'folder_out'. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende File 2: Code 'lineage_Version_Jove.m'. Deze code gebruikt de array 'trackmate' verwerkt met de cel segmentatie algoritme (segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m), uitpakken de celcyclus trajecten en de verschillende parameters van belang, bijvoorbeeldbepalen., de cel de duur van de cyclus, de eerste cel droge massa en de laatste cel droge massa. Deze code bestaat uit twee delen, het eerste deel behandelt van de opsporing van de scheidingslijn cellen, en het tweede deel met de analyse van de celcyclus trajecten. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze paper, laten we zien dat lens-vrije videomicroscopie binnen een incubator te vangen de kinetiek van duizenden cellen kan worden gebruikt. Om de algemene methodologie beschrijven we uitgelegd hoe een time-lapse verwerving van 2.7 dag van HeLa cellen in cultuur kan worden geanalyseerd met standaard cel-tracking algoritmen. Het resultaat is een dataset met 2.2 x 106 cel metingen en 10,584 tracks van de celcyclus. De acquisities werden uitgevoerd op een cultuur van Hela cellen met een relatief grote afstand van de cel-naar-cel (celdichtheid < 500 cellen/mm2) en cel morfologie die kan worden benaderd met een schijf. Deze twee functies vergemakkelijking van de toepassing van een automatische analyse van cel-tracking, die het mogelijk maakt te verzamelen van dergelijke een grote dataset. Andere cellijnen met kleinere afstand van cel naar cel of met meer complexe morphologies zou moeilijker om bij te houden en latere datasets zou kleiner.
Wij zijn van mening dat deze aanpak interessant voor tal van studies, bijvoorbeeld voor celproliferatie en cel grootte studies is. De laatste zijn een belangrijk gebied van onderzoek in de fundamentele biologie en nog veel vragen onbeantwoord zo mooi besproken in een recensie door Ginzberg et al. 29. het protocol voorgesteld in dit werk biedt dus een middel om te meten belangrijke statistieken die nodig zijn voor cel proliferatie studies, d.w.z. de duur van de celcyclus het drooggewicht cel, de cel droge massa verhouding tussen het einde en het begin van de cyclus en de cel droge massa groeitempo op jaarbasis. Naast de studie van celproliferatie, zal deze methode zijn van belang voor de studie van cel migratie, aangezien het een groot aantal van de nummers, elkaar gedurende enkele uren kan opleveren. Dit protocol gaat verder dan de stand van de techniek14,30 door aan te tonen voor het eerst de overname van duizenden tracks van de cel gedurende meer dan 10 uur.
Tot slot hebben we een easy-to-use lens-vrije techniek die toelaat om bij te houden gelijktijdig duizenden label-vrije cellen over meerdere dagen van cultuur ontwikkeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs hebben niets te erkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytonote lens-free video microscope | Iprasense | ||
| Horus acquisition software | Iprasense | ||
| 6-well glass bottom culture plates | MatTek corporation | Part No: P06G-0-14-F | |
| DMEM + GlutaMAX medium | Gibco | ||
| heat-inactivated fetal calf serum | Eurobio | ||
| penicillin and streptomycin | Gibco | ||
| Fibronectin | Sigma Aldrich | ||
| Matlab, image processing toolbox | Mathworks |
References
- Zangle, T. A., Teitell, M. A. Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics. Nat Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).
- Popescu, G., Park, K., Mir, M., Bashir, R. New technologies for measuring single cell mass. Lab Chip. 14 (4), 646-652 (2014).
- Reed, J., et al. Rapid, massively parallel single-cell drug response measurements via live cell interferometry. Biophys J. 101 (5), 1025-1031 (2011).
- Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci. USA. 108 (32), 13124-13129 (2011).
- Girshovitz, P., Shaked, N. T. Generalized cell morphological parameters based on interferometric phase microscopy and their application to cell life cycle characterization. Biomed Opt Express. 3 (8), 1757-1773 (2012).
- Kemper, B., Bauwens, A., Vollmer, A., Ketelhut, S., Langehanenberg, P. Label-free quantitative cell division monitoring of endothelial cells by digital holographic microscopy. J Biomed Opt. 15 (3), (2010).
- Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PLoS One. 9 (2), 1-8 (2014).
- Bon, P., Savatier, J., Merlin, M., Wattellier, B., Monneret, S. Optical detection and measurement of living cell morphometric features with single-shot quantitative phase microscopy. J Biomed Opt. 17 (7), (2012).
- Aknoun, S., et al. Living cell dry mass measurement usinq quantitative phase imaging with quadriwave lateral shearing interferometry: an accuracy and sensitivity discussion. J Biomed Opt. 20 (1), 1-4 (2015).
- Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
- Choi, W., et al. Tomographic phase microscopy. Nat Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
- Kesavan, S. V., et al. High-throughput monitoring of major cell functions by means of lensfree video microscopy. Sci Rep. 4, 1-11 (2014).
- Zheng, G., Lee, S. A., Antebi, Y., Elowitz, M. B., Yang, C. The ePetri dish, an on-chip cell imaging platform based on subpixel perspective sweeping microscopy (SPSM). Proc Natl Acad Sci USA. 108 (41), 16889-16894 (2011).
- Pushkarsky, I., et al. Automated single-cell motility analysis on a chip using lensfree microscopy. Sci Rep. 4, 4717 (2014).
- Allier, C., et al. Imaging of dense cell cultures by multiwavelength lens-free video microscopy. Cytom Part A. 91 (5), 1-10 (2017).
- Su, T. -W., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. High-throughput lensfree imaging and characterization of a heterogeneous cell solution on a chip. Biotechnol Bioeng. 102 (3), 856-868 (2009).
- Delacroix, R., et al. Cerebrospinal fluid lens-free microscopy: a new tool for the laboratory diagnosis of meningitis. Sci Rep. 7, 39893 (2017).
- Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2016).
- Popescu, G. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).
- Liu, P. Y., et al. Cell refractive index for cell biology and disease diagnosis: past, present and future. Lab Chip. 16, 634-644 (2016).
- Rapoport, D. H., Becker, T., Mamlouk, A. M., Schicktanz, S., Kruse, C. A novel validation algorithm allows for automated cell tracking and the extraction of biologically meaningful parameters. PLoS One. 6 (11), e27315 (2011).
- Al-Kofahi, O., et al. Automated cell lineage construction: A rapid method to analyze clonal development established with murine neural progenitor cells. Cell Cycle. 5 (3), 327-335 (2006).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. Tracking in cell and developmental biology. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 894-902 (2009).
- Posakony, J. W., England, J. M., Attardi, G. Mitochondrial growth and division during the cell cycle in HeLa cells. J Cell Biol. 74 (2), 468-491 (1977).
- Zocchi, E., et al. Expression of CD38 Increases Intracellular Calcium Concentration and Reduces Doubling Time in HeLa and 3T3 Cells. J Biol Chem. 273 (14), 8017-8024 (1979).
- Reitzer, L. J., Wice, B. M., Kennell, D. Evidence that glutamine, not sugar, is the major energy source for cultured HeLa cells. J Biol Chem. 254 (8), 2669-2676 (1979).
- Benedetti, A. D. E., Joshi-barve, S., Rinker-Schaeffer, C., Rhoads, R. E. Expression of Antisense RNA against Initiation Factor eIF-4E mRNA in HeLa Cells Results in Lengthened Cell Division Times, Diminished Translation Rates, and Reduced Levels of Both eIF-4E and the p220 Component of eIF-4F. Mol Cell Biol. 11 (11), 5435-5445 (1991).
- Kumei, Y., Nakajima, T., Sato, A., Kamata, N., Enomoto, S. Reduction of G1 phase duration and enhancement of c-myc gene expression in HeLa cells at hypergravity. J Cell Sci. 93 (2), 221-226 (1989).
- Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. On being the right (cell) size. Science. 348 (6236), 1245075 (2015).
- Mathieu, E., et al. Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments. Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).
