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Biology

लेंस-अनुयाई सेल संस्कृति के गतिशील और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए नि: शुल्क वीडियो माइक्रोस्कोपी

Published: February 23, 2018 doi: 10.3791/56580
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 3,4, 3, 1, 1, 1, 5, 5, 4,6, 1
1CEA, LETI, DTBS, LISA, Université Grenoble Alpes, 2CEA, LETI, DTBS, LBAM, Université Grenoble Alpes, 3CEA, INSERM, BIG, Université Grenoble Alpes, 4CNRS, FR CNRS 3425, 5CNRS, UMR 144, Molecular Mechanisms of Intracellular Transport, PSL Research University, Institut Curie, 6TIMC-IMAG

Summary

लेंस मुक्त वीडियो माइक्रोस्कोपी हमें सीधे मशीन के अंदर सेल संस्कृतियों पर नजर रखने के लिए सक्षम बनाता है । यहाँ हम पूर्ण प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए प्राप्त करते हैं और एक २.७ दिन लंबे समय के अधिग्रहण का विश्लेषण करने के लिए प्रसंस्कृत हेला कोशिकाओं, एक डेटासेट के लिए अग्रणी २.२ x 106 माप के व्यक्तिगत कक्ष आकृति विज्ञान और १०५८४ सेल चक्र पटरियों.

Abstract

यहां, हम प्रदर्शन है कि लेंस मुक्त वीडियो माइक्रोस्कोपी हमें सक्षम बनाता है एक साथ सीधे मशीन के अंदर की कोशिकाओं के हजारों के कैनेटीक्स पर कब्जा करने और यह है कि निगरानी और कई कोशिका चक्र के साथ एक कोशिकाओं को यों तो संभव है । हम पूरी निगरानी और २.७ दिनों के लिए एक हेला सेल संस्कृति यों तो इस्तेमाल प्रोटोकॉल का वर्णन । पहले, सेल संस्कृति अधिग्रहण एक लेंस मुक्त वीडियो माइक्रोस्कोप के साथ प्रदर्शन किया है, और फिर डेटा एक चार कदम प्रक्रिया के बाद विश्लेषण है: बहु तरंग दैर्ध्य होलोग्राम पुनर्निर्माण, सेल ट्रैकिंग, सेल विभाजन और सेल डिवीजन का पता लगाने एल्गोरिदम. परिणामस्वरूप, हम बताते है कि यह एक १०,००० से अधिक सेल साइकिल पटरियों और अधिक से अधिक 2 x 106 सेल रूपात्मक माप की विशेषता डेटासेट इकट्ठा करने के लिए संभव है ।

Introduction

कई सेल चक्र भर में प्रसंस्कृत स्तनधारी कोशिकाओं की निगरानी और सही सेल आकार और कोशिका सूखी द्रव्यमान को मापने के लिए एक चुनौतीपूर्ण काम है । कई लेबल मुक्त ऑप्टिकल तकनीक इस कार्य को करने में सक्षम है1,2: चरण-स्थानांतरण interferometry3, डिजिटल होलोग्राम माइक्रोस्कोप (DHM)4,5,6, 7, quadriwave पार्श्व कतरनी interferometry8,9 और मात्रात्मक चरण टोमोग्राफी10,11. इन पद्धतियों स्तनधारी कोशिकाओं के सेल चक्र की समझ में कई नए अंतर्दृष्टि के लिए नेतृत्व किया है । हालांकि वे शायद ही कभी स्वचालित सेल ट्रैकिंग एल्गोरिदम के साथ युग्मित होते है और उनका प्रवाह सीमित रहता है जब सेल जन पथ1 (N < 20 में क्रमशः3,4,5 को मापने , 6). इसलिए एक उपंयास ऑप्टिकल विधि के लिए बड़े आंकड़े (एन > 1000) के साथ सेल जन पथ उपाय की जरूरत है ।

इस पत्र में, हम लेंस की क्षमता का प्रदर्शन मुक्त वीडियो माइक्रोस्कोपी करने के लिए एक साथ सीधे कोशिकाओं की छवि हजारों मशीन के अंदर, और फिर व्यक्तिगत सेल चक्र पटरियों के हजारों के साथ एक सेल मीट्रिक यों तो । लेंस से मुक्त माइक्रोस्कोपी एक मात्रात्मक चरण इमेजिंग तकनीक है जो देखने का एक बहुत बड़ा क्षेत्र पर घनी पैक कोशिकाओं के चरण छवि के अधिग्रहण (आमतौर पर मिमी2के कई दसियों, यहां २९.४ mm2)12,13 ,14,15. एकल कक्ष स्तर पर कई मीट्रिक निर्धारित होते हैं, उदा, कक्ष क्षेत्र, सेल ड्राई मास, सेल मोटाई, सेल प्रमुख अक्ष लंबाई और सेल पहलू अनुपात12,15, प्रत्येक छवि से । फिर, एक सेल ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म लागू करके, इन सुविधाओं के प्रयोग के एक समारोह के रूप में हर एक सेल के लिए प्लॉट किया जा सकता है समय14,15। इसके अलावा, सेल पटरियों में सेल डिवीजनों की घटना का पता लगाने के द्वारा, यह ऐसे प्रारंभिक कोशिका शुष्क द्रव्यमान के रूप में अन्य महत्वपूर्ण जानकारी निकालने के लिए संभव है (बस के बाद सेल विभाजन), अंतिम सेल ड्राई मास (बस सेल विभाजन से पहले) और सेल चक्र अवधि, यानी, दो लगातार डिवीजनों के बीच समय15। इन सभी माप बहुत अच्छे आंकड़ों के साथ गणना की जा सकती है (एन > 1000) के बाद से देखने के बड़े क्षेत्र में आम तौर पर एक एकल लेंस मुक्त अधिग्रहण में २०० १०,००० कोशिकाओं के विश्लेषण की अनुमति होगी ।

आदेश में इस पद्धति को समझाने के लेंस के आधार पर मुक्त वीडियो माइक्रोस्कोपी, हम प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए निगरानी और २.७ दिनों के लिए एक हेला सेल संस्कृति यों तो । डेटा विश्लेषण बहु-तरंग होलोग्राम पुनर्निर्माण, सेल ट्रैकिंग, सेल विभाजन और सेल डिवीजन एल्गोरिदम के आधार पर एक चार कदम प्रक्रिया है । यहाँ यह दिखाया गया है कि स्थानिक संकल्प और अपेक्षाकृत तेजी से फ्रेम दर (एक अधिग्रहण हर 10 मिनट) इस लेंस के साथ प्राप्त मुक्त वीडियो माइक्रोस्कोपी सेटअप मानक सेल ट्रैकिंग एल्गोरिदम के साथ संगत है. इस डेटासेट का पूरा विश्लेषण पूरे सेल चक्र पर १०,५८४ सेल ट्रैक के माप में परिणाम है ।

संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए, लेंस मुक्त वीडियो माइक्रोस्कोपी एक शक्तिशाली उपकरण के लिए स्वचालित रूप से unलेबल्ड, unसिंक्रनाइज़्ड, और unसंशोधित कोशिकाओं के प्रति प्रयोग के हजारों की निगरानी है; प्रत्येक कोशिका कई सेल चक्र पर नज़र रखी जा रही है । हमारे माप इस प्रकार कई सेल मापदंडों का मतलब मूल्य प्रदान करते हैं, लेकिन अधिक महत्वपूर्ण बात, कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी पर अंतर सेल परिवर्तनशीलता.

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Protocol

1. सेल संस्कृति निगरानी अधिग्रहण

  1. DMEM + glutamine में हेला कोशिकाओं को उगाना (उदा., GlutaMAX) मध्यम से पूरक 10% (v/v) हीट-निष्क्रिय भ्रूण बछड़ा सीरम और 1% पेनिसिलिन और streptomycin.
  2. कोट 6-अच्छी तरह से ग्लास नीचे कल्चर प्लेट्स विथ fibronectin (25 µ g/एमएल) विथ 1 एच. फिर बीज 2 x 104 प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं ।
  3. अधिग्रहण के दौरान, मध्यम हर 3 दिन बदल जाते हैं ।
  4. समय चूक अधिग्रहण के लिए, वीडियो लेंस का उपयोग करें-मुक्त माइक्रोस्कोप (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध) ।
    नोट: यह लेंस मुक्त अभिकलनी इमेजिंग तकनीक के रूप में Ozcan एट अल द्वारा वर्णित पर आधारित है । 16 जो ३७ डिग्री सेल्सियस12,15के एक नियंत्रित तापमान पर एक मशीन में सतत निगरानी करने के लिए संशोधित किया गया था । यह १.६७ µm की एक पिक्सेल पिच और ६.४ x ४.६ mm2के एक इमेजिंग क्षेत्र के साथ एक पूरक धातु ऑक्साइड अर्धचालक (CMOS) छवि संवेदक सुविधाएं । एकाधिक तरंग दैर्ध्य रोशनी एक multichip प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एल ई डी) डिवाइस है, जो लाल, हरे और नीले रोशनी उद्धार द्वारा प्रदान की जाती है । तरंग दैर्ध्य क्रमशः 25, ४५, और 25 एनएम के एक वर्णक्रमीय बैंडविड्थ के साथ क्रमशः ६३६, ५२१, और ४५२ एनएम पर केंद्रित कर रहे हैं । लाल-हरे-नीले (आरजीबी) एल ई डी कोशिकाओं से लगभग 5 सेमी की दूरी पर एक १५० µm pinhole के ऊपर स्थित हैं । एलईडी के करीब मापा प्रकाश शक्ति के रूप में प्रत्येक तरंग दैर्ध्य में 10 µW के रूप में कम है और रोशनी समय अधिग्रहण के प्रति केवल एक ही दूसरा है । इसलिए, कोई फोटो विषाक्तता समस्याओं की उंमीद कर रहे है जब सेल संस्कृतियों लेंस के तहत मनाया जाता है मुक्त वीडियो माइक्रोस्कोप ।
  5. सेल संस्कृति कंटेनर CMOS संवेदक के साथ संपर्क में डाल दिया (चित्रा 1) । तल पर एक गिलास coverslip के साथ एक कंटेनर का प्रयोग करें, जो लेंस मुक्त अधिग्रहण की गुणवत्ता के लिए महत्वपूर्ण है । प्लास्टिक कंटेनर भी इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन लेंस मुक्त अधिग्रहण इन कंटेनरों के गरीब ऑप्टिकल गुणवत्ता के कारण नीचा हो जाएगा ।
  6. नियंत्रण वीडियो लेंस-अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है), जो दोनों समय चूक अधिग्रहण और होलोग्राम पुनर्निर्माण प्रदर्शन के साथ मुक्त माइक्रोस्कोप । सॉफ्टवेयर इंटरफेस में उपयोगकर्ता द्वारा दर्ज किए जाने की जरूरत है कि मापदंडों फ्रेम दर, प्रयोग की अवधि, और सेल संस्कृति के प्रकार, यानी अनुयाई कोशिकाओं या अस्थायी कोशिकाओं रहे हैं.
  7. अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर के इनपुट पैरामीटर्स सेट करें । प्रत्येक 10 मिनट में एक प्राप्ति के लिए सेट फ़्रेम दर सेट करें और ' अनुयाई ' करने के लिए कक्ष culture प्रकार सेट करें ।
    नोट: एक अधिग्रहण की एक फ्रेम दर हर 10 मिनट एक अच्छा समझौता है क्योंकि यह एक विश्वसनीय सेल ट्रैकिंग सुनिश्चित करता है, जबकि परिणामी डेटासेट के आकार का विश्लेषण किया जा करने के लिए अभी भी उचित है । इस लेंस से मुक्त माइक्रोस्कोपी सेटअप के साथ सबसे तेजी से फ्रेम दर प्राप्त एक अधिग्रहण हर 5 मिनट है । इसके अलावा CMOS संवेदक जो संस्कृति में कोशिकाओं की व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकते है की अत्यधिक हीटिंग में framerate परिणाम बढ़ रही है ।
  8. समय चूक अधिग्रहण शुरू, और होलोग्राम पुनर्निर्माण एल्गोरिथ्म (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध) स्वचालित रूप से लेंस मुक्त अधिग्रहण के लिए सेल संस्कृति के चरण छवि प्राप्त करने की प्रक्रिया होगी । होलोग्राम पुनर्निर्माण एल्गोरिथ्म एक बहु-तरंग दैर्ध्य चरण पुनर्प्राप्ति एल्गोरिथ्म17 पर आधारित है और प्रदान करता है [-π, + π] की श्रेणी में एक आरजीबी खंगाला चरण छवि २९.४ mm2की दृष्टि से एक बड़े क्षेत्र पर प्रत्येक एकल सेल के लिए । लेंस के सिद्धांत मुक्त में लाइन होलोग्रफ़ी है (z = 0 पर) एक विमान की लहर (सामांय होने के बाद 1 आयाम) के साथ एक पतली नमूना रोशन करने के लिए और एक CMOS संवेदक पर पता लगाने के बाद एक छोटी दूरी पर विवर्तन तीव्रता छवि z = z, आम तौर पर 1 मिमी के बाद नमूना. हमारे सेटअप में, प्रदीप्ति क्रमिक रूप से 3 तरंग दैर्ध्य के लिए बंद है (λ1= ०.४५० µm, λ2= ०.५४० µm, λ3= ०.६४७ µm) एक ही नमूना के तीन विवर्तन पैटर्न को मापने के लिए ।

2. सेल संस्कृति डेटा विश्लेषण

  1. सेल ट्रैकिंग के लिए, Trackmate एल्गोरिथ्म, एकल कणों की स्वचालित ट्रैकिंग18के लिए एक खुला स्रोत फिजी प्लगइन का उपयोग करें । सबसे पहले, फिजी (लोड छवि अनुक्रम कमान) में पूर्ण समय चूक अधिग्रहण लोड । डेटासेट के बड़े आकार के कारण, जो आम तौर पर ४०० आरजीबी फ्रेम की २९.७ एमबी की सुविधाएँ, यह उन्हें 8 बिट प्रारूप में लोड करने के लिए तेजी से है. अगले Trackmate फिजी प्लगइन सेल के कई चरणों के माध्यम से उपयोगकर्ता गाइड-एल्गोरिथ्म ट्रैकिंग, अर्थात् एक सेल का पता लगाने के चरण, एक सेल ट्रैकर मंच और कई सेल पता लगाने और गणना पटरियों पर लागू फिल्टर । हर स्तर पर, एल्गोरिदम विन्यस्त और परिणाम तुरंत प्रदर्शित इतना है कि, यदि आवश्यक हो, एक आसानी से आगे और पीछे सेटिंग्स को फिर से समायोजित करने के लिए नेविगेट कर सकते हैं. Trackmate इंटरफेस के विभिंन मेनू वास्तविक सेटिंग्स हेला कोशिकाओं के प्रयोग के लिए इस्तेमाल के साथ चित्रा 2 में दिखाए जाते हैं ।
  2. निंनलिखित के रूप में अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के इनपुट पैरामीटर सेट करें ( चित्र 2देखें) । अनुमानित बूँद व्यास को 15 पिक्सल, डिटेक्टर थ्रेसहोल्ड के लिए सेट करने के लिए ०.२५, 15 पिक्सल के लिए अधिकतम दूरी को जोड़ने, अंतर-15 पिक्सल के लिए अधिकतम दूरी को बंद करने, और ३.५ करने के लिए पटरियों में स्थानों की संख्या ।
    नोट: ये सेटिंग्स स्पष्ट रूप से एक प्रयोग से दूसरे के लिए अलग होगा, विशेष रूप से ' अनुमानित बूँद व्यास ' जो कोशिका के आकार से मेल खाती है (यहाँ १.६७ µm के पिक्सल में दिया). एक ही टिप्पणी के लिए लागू होता है ' अधिकतम दूरी को जोड़ने ' जो अधिकतम दूरी के लिए खाते में दो लगातार फ्रेम के भीतर एक सेल द्वारा यात्रा (यहां १.६७ µm के पिक्सल में दी) । इसकी इष्टतम मूल्य सेल गतिशीलता पर भी सेल घनत्व पर निर्भर करेगा ।
  3. कक्ष-ट्रैकिंग प्रक्रिया के अंत में, तीन पाठ फ़ाइलों के रूप में परिणाम जेनरेट करें (' विश्लेषण ' बटन, चित्र 2देखें) । सबसे उपयोगी फ़ाइल, ' पटरियों सांख्यिकी में स्पॉट ' नाम, एक मेज के अधिग्रहण में उनके संबंधित (एक्स, वाई) पदों, उनके फ्रेम नंबर और उनके ट्रैक नंबर के साथ सभी का पता लगाया कोशिकाओं लिस्टिंग के होते हैं । इस डेटा के आधार पर, सेल विभाजन प्रदर्शन और समर्पित एल्गोरिदम का उपयोग कर सेल डिवीजनों का पता लगाने (अनुपूरक कोड फ़ाइलें देखें). दो अन्य फ़ाइलों पटरियों आँकड़े में ' लिंक ' और ' ट्रैक आँकड़े ' नाम दिया जाता है और पटरियों के साथ काम करने के सभी परिणाम शामिल हैं, उदा ट्रैक अवधि, पता लगाया अंतराल की संख्या, ट्रैक प्रारंभिक फ्रेम, आदि.
  4. पुनर्निर्मित चरण छवि से कक्ष आकृति विज्ञान का वर्णन करने वाले कई मीट्रिक को स्वचालित रूप से निकालने के लिए कक्ष विभाजन एल्गोरिथ्म (अनुपूरक कोड फ़ाइल देखें) का उपयोग करें. ये मेट्रिक्स कक्ष सरफ़ेस क्षेत्र (S), कक्ष प्रमुख अक्ष लंबाई (l), सेल माइनर अक्ष लंबाई (l) और कक्ष पहलू अनुपात (l/ चरण लेंस से बरामद मुक्त माइक्रोस्कोपी के रूप में पहले से ही चर्चा की घनत्व और नमूना परत की मोटाई के लिए आनुपातिक है15।
  5. कक्ष की रूपात्मक सुविधाओं के अलावा, मात्रात्मक सेल ड्राई मास (सीडीएम) माप को खंगाला गया चरण से निकालें13,19,20
    Equation 1Eq. (1)
    जहां φ (x, y) को खंगाला गया चरण shift 19, λ तरंग दैर्ध्य और α = १.८ x 10-4 m3/विशिष्ट अपवर्तन सूचकांक जो अपवर्तन सूचकांक की भिन्नता को शुष्क द्रव्यमान1से संबंधित है, 19.
  6. कोशिका अपवर्तन सूचकांक और संस्कृति मीडिया के बीच के अंतर के आकलन का उपयोग करके कोशिका मोटाई का मूल्यांकन करें. सेल मोटाई एच(एक्स,वाई) और मापा चरण बदलाव के बीच संबंध20द्वारा दिया जाता है:
    Equation 2Eq. (२.१)
    Equation 3Eq. (२.२)
    साथ Δn(x,y) = nसेल (x,y)- nमध्यम (x,y), अपवर्तन सूचकांक सेल और संस्कृति मीडिया के बीच अंतर । निंन में, Δn = ०.०२५का स्थिर मान मान लें, जो हेला कक्ष नाभिक (n = १.३५५11) में मापी गई अपवर्तन सूचकांक से अनुमानित है और वह फास्फेट-बफ़र्ड खारा (पंजाब) संस्कृति मीडिया (n = 1.33) का है । हालांकि सेल मोटाई मूल्य केवल संकेत के रूप में यह एक धारणा पर आधारित है, अपने रिश्तेदार विविधताओं सार्थक कर रहे है और कोशिकाओं विभाजन का पता लगाने के लिए शोषण किया जा सकता है ।
  7. कक्ष विभाजन की पुनरावृत्ति का पता लगाने के लिए समर्पित एल्गोरिथ्म (अनुपूरक कोड फ़ाइल देखें) का उपयोग करें और फिर कक्ष ट्रैक्स जो पता लगाए गए कक्ष विभाजनों से संबंधित हैं, के लिए एक कक्ष विभाजन का पता लगाने के लिए, 8 µm से बड़ी मापी गई मोटाई वाले कक्षों को निकालें पहले पहचाने जाते हैं, फिर जांचें कि क्या कोई नया कक्ष स्थान और समय में बारीकी से दिखाई देता है । इस तरह, सेल डिवीजनों का पता लगाने के दो मजबूत मानदंडों पर निर्भर करता है । कक्ष विभाजन का पता लगाने के लिए वैकल्पिक और अधिक विस्तृत तरीकों lensfree समय चूक अधिग्रहण21,22,23के लिए लागू किया जा सकता है ।

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Representative Results

होलोग्राम पुनर्निर्माण की प्रक्रिया के लिए, प्रकाश क्षेत्र एक अदिश क्षेत्र द्वारा वर्णित है ए ( Equation 4 Equation 5 जहां नमूना से दूरी z पर एक हवाई जहाज़ के परिसर मूल्य है, और पार्श्व की स्थिति और तरंग दैर्ध्य λ पर) । प्रकाश प्रसार Huygens-Fresnel सिद्धांत है जो एक प्रचारक कर्नेल प्रदान करता है द्वारा मॉडलिंग की है । Equation 6 इसलिए, डिटेक्टर विमान में क्षेत्र आयाम, एकजेड निम्नलिखित संबंध द्वारा प्रकाश आयाम एक0 से संबंधित है:
Equation 7यानी.Equation 8
के साथ, जहां Equation 9 मैं संमिश्र संख्या है (i2=-1)

तीव्रता माप बस द्वारा मॉडलिंग की है. Equation 10 पुनर्निर्माण एल्गोरिथ्म के प्रयोजन के लिए एक ' अच्छा ' क्षेत्र मिल रहा है एक0, मनाया नमूना है, जो विवर्तन मापा तीव्रता मैंजेडमैच होगा से संबंधित । रणनीति डिटेक्तार विमान φz पर आयाम क्षेत्र चरण पर विचार करने के लिए समस्या के अज्ञात के रूप में है और एक multispectral वस्तु के कुल भिंनता मापदंड का अनुकूलन है । अधिक स्पष्ट रूप से, खेतों पर विचार
Equation 11

Equation 12यानी.Equation 13
किसी भी चरण फ़ील्ड φzके लिए, के बाद से डेटा से पूरी तरह मेल खाता है । Equation 14 Equation 15 ताकि बाद के क्षेत्र नमूना विमान में एक संभावित आयाम क्षेत्र है, मनाया तीव्रता छवि दिया । Equation 16 यही कारण है कि 0 पर कोई मापदंड सभी डेटा-मिलान संभावनाओं के बीच एक अनंय समाधान निर्दिष्ट करने के लिए उपयोग किया जाता है । कम करने के लिए कसौटी के रूप में चुना गया था:
Equation 17
जहां x और y विमान के लिए निर्देशांक हैं, यानी । Equation 18 इस तरह के एक कसौटी का उपयोग करने में सक्षम बनाता है, सभी संभव क्षेत्रों के बीच, एक नमूना सभी तरंग दैर्ध्य, जो शारीरिक रूप से सार्थक है के लिए एक ही स्थिति में तेज किनारों प्रदर्शित फ़ील्ड । इस विधि में ' जुड़वां छवियां ' की घटना को कम कर देता है खंगाला हुआ क्षेत्र 0। ' जुड़वां ' छवि एक महत्वपूर्ण मूर्ति है कि अधिग्रहण की प्रक्रिया के दौरान चरण जानकारी की कमी से परिणाम है ।

व्यावहारिक गणना के लिए, एक स्थानिक डिटेक्टर संकल्प के अनुरूप नमूना के साथ discretized रहे हैं, डेरिवेटिव Sobel ऑपरेटरों द्वारा प्रतिस्थापित कर रहे हैं और convolutions द्वारा Huygens-Fresnel प्रचारक जा रहा द्वारा प्रदर्शन कर रहे हैं Equation 19 रूपान्तर स्थान के लिए जहां एक सरल अभिव्यक्ति है: । Equation 20 Equation 21 (real) सेट चर के संबंध में (वास्तविक) मापदंड ε का छोटा होना गैर-रेखीय संयुग्मित ग्रेडिएंट विधि का उपयोग करके सुलझाया जाता है, जो ε के ग्रेडिएंट की आवश्यकता होती है जो प्रत्येक के लिए प्रत्येक डिटेक्टर पिक्सेल से संबद्ध चरण के लिए परिकलित की जाती है Equation 22 वेवलेंथ.

कक्ष पुनर्निर्माण/
चित्रा 3 संस्कृति में हेला कोशिकाओं की एक समय चूक अधिग्रहण की एक फ्रेम के होलोग्राम पुनर्निर्माण के परिणाम से पता चलता है । चित्रा 3 ए एक २९.४ mm2 क्षेत्र पर नीले चैनल में एक कच्चे अधिग्रहण के दृश्य का पूरा क्षेत्र से पता चलता है । इस छवि और लाल और हरे रंग के चैनलों में अधिग्रहीत लोगों के आधार पर, होलोग्राम पुनर्निर्माण कोशिकाओं के एक आरजीबी चरण छवि का उत्पादन के रूप में 3 बी अंक में दिखाया गया है और सी सी । खंगाला चरण छवि दर्शाती स्थानीय स्तर पर कोशिकाओं है कि एक चरण + π से अधिक परिवर्तन प्रेरित करने के लिए इसी चरण कलाकृतियों लपेटा । एक सरल चरण unwrapping प्रदर्शन करने के लिए, हम एक अनुमानी मतलब लागू है, अर्थात् हम ०.३ से अधिक मूल्य के साथ पिक्सल का पता लगाने और इन पिक्सल सेट + π । Equation 23 इस सरल विधि आरजीबी की एक संपत्ति के आधार पर चरण छवियों को खंगाला है । प्रत्येक पिक्सेल पर सिद्धांत रूप में हम के बराबर अनुपात को मापने चाहिए । Equation 24 Equation 25 लेकिन mitotic सेल के मामले में, जब चरण रैपिंग होता है, यह रिश्ता अब आरजीबी खंगाला चरण छवि (चित्रा 3f) में नहीं रखा गया है । उपर्युक्त अनुमानी विधि इस संपत्ति का लाभ लेता है, इतना है कि एक सरल सीमा के लिए चरण लपेटकर पेश पिक्सल का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । पहले और बाद में unwrapped चरण छवि के परिणाम आंकड़े 3f और 3 जी, क्रमशः में दिखाया गया है । ये unwrapped चरण छवियों तो सेल ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म में खिलाया जाता है । इस unwrapping कदम के बिना, सेल-ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म विभाजन और बड़ी मोटाई है, जो अंतिम परिणाम समझौता होगा की कोशिकाओं में कोशिकाओं का पता लगाने के लिए असफल हो जाएगा । पुनर्निर्माण चरण छवि का संकल्प लगभग 5 µm15 (पूर्ण पिच स्थानिक संकल्प) है, जो अपेक्षाकृत मोटे होने का अनुमान था । इसके बावजूद यह lamellipodia और सेल कोशिका द्रव्य (आंकड़े 3f और 3जी) के रूप में विवरण का निरीक्षण संभव है । सबसे महत्वपूर्ण बात, छवि लेंस से प्राप्त मुक्त माइक्रोस्कोपी एक बड़े विपरीत प्रदर्शित करता है और हेलो कलाकृतियों से मुक्त है । यह स्वचालित सेल पता लगाने और सेल ट्रैकिंग की सुविधा ।

सेल कल्चर डेटा विश्लेषण
सेल चक्र पटरियों को निकालने के लिए, डेटा विश्लेषण विभिन्न एल्गोरिदम की एक श्रृंखला पर निर्भर करता है, अर्थात् सेल ट्रैकिंग Trackmate फिजी प्लगइन के साथ प्रदर्शन किया, विभाजन का पता लगाने और अंततः सेल चक्र पटरियों के निष्कर्षण, यानी दो कक्ष विभाजनों के बीच अनुक्रम । में निंनलिखित हम इन एल्गोरिदम के outputs की गुणवत्ता पर चर्चा जब मैनुअल माप की तुलना में ।

आरेख 4 कक्ष-ट्रैकिंग परिणामों के विभिंन स्क्रीन कैप्चर, सेल डिटेक्शन एल्गोरिथ्म के परिणाम और कक्ष-ट्रैकिंग विश्लेषण के परिणाम दिखाता है । लेंस में कोशिकाओं का पता लगाने-मुक्त अधिग्रहण (आंकड़े 4a-4c) सेल ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म का पहला कदम है । आदेश में सेल का पता लगाने एल्गोरिथ्म को मांय करने के लिए, हम मैंयुअल रूप से समय चूक लेंस के एक छोटे हिस्से की व्याख्या-मुक्त अधिग्रहण (६६३ x ६६३ µm2के २१४ फ्रेम्स) । हम मैंयुअल रूप से ५३६५ सेल पदों की कुल का चयन किया और Trackmate फिजी प्लगइन द्वारा प्राप्त उन लोगों के साथ इन परिणामों की तुलना में । चित्रा 5 सही पता लगाने, झूठी सकारात्मक और झूठी नकारात्मक के संदर्भ में परिणाम से पता चलता है. जिसके परिणामस्वरूप संवेदनशीलता के बारे में ९६% और सकारात्मक पूर्वानुमान मूल्य के रूप में बड़े रूप में ९९.७% है । इन उच्च मूल्यों को खंगाला चरण छवियों लेंस मुक्त वीडियो माइक्रोस्कोपी सेटअप के साथ प्राप्त की अच्छी गुणवत्ता को प्रतिबिंबित । कक्ष का पता लगाने के बाद, एक कक्ष विभाजन एल्गोरिथ्म को मापने की अनुमति देता है — प्रत्येक कक्ष के लिए — कई विभिंन मीट्रिक्स, उदा. कक्ष क्षेत्र, कक्ष शुष्क मास और कक्ष मोटाई । चित्रा 6a विभाजन एल्गोरिथ्म के सिद्धांत को दर्शाया गया है और चित्रा 6f ६६३ x ६६३ µm2 के हित के एक क्षेत्र के लिए एक समय अनुक्रम में विभाजित छवियों को दर्शाता है ( चित्रा 5के रूप में ही). एल्गोरिथम चरण छवि को थ्रेशोल्ड करके विभाजन प्रारंभ करता है ( चित्र घमण्डदेखें) और फिर यह एक सीडिंग प्रक्रिया लागू करता है ( चित्र 6cदेखें) । अर्थात् पता लगाया कोशिकाओं के केंद्र के पिक्सल इसी ट्रैक के मूल्य के लिए सेट कर रहे हैं । कोशिकाओं और उनके इसी ट्रैक नंबर के एक्स-Y पदों सेल ट्रैकिंग के बाद प्राप्त पटरियों सांख्यिकी में ' स्पॉट द्वारा प्रदान की जाती हैं. फिर, एक चलने भरने की प्रक्रिया लागू की गई है जो बीज को कोशिका की सीमाओं (आंकड़े 6c-e) द्वारा निर्धारित प्रारंभिक थ्रेसहोल्ड (फिगर घमण्ड) तक विस्तारित करता है । इस भरने की प्रक्रिया गणितीय आकृति विज्ञान, जैसे, फैलाव और कटाव में बुनियादी आपरेशनों पर निर्भर करता है । फॉल्ट के परिणाम से, यह तो एकल कोशिका स्तर पर कई मीट्रिक की गणना करने के लिए संभव है, यानी सेल लंबाई, सेल क्षेत्र और सेल पहलू अनुपात की तरह रूपात्मक सुविधाएँ, लेकिन यह भी, अधिक महत्वपूर्ण बात, सेल शुष्क मास के अनुसार Eq .1. आदेश में लेंस की विश्वसनीयता का आकलन करने के लिए सेल ड्राई मास के नि: शुल्क माइक्रोस्कोपी माप, हम लेंस की तुलना में मुक्त निश्चित हेला कोशिकाओं का पुनर्निर्माण चरण छवि (चित्रा 6g) एक ही क्षेत्र के साथ एक डिजिटल होलोग्राम के माध्यम से अधिग्रहीत एक 5x उद्देश्य के साथ माइक्रोस्कोपी (चित्रा 6h). चित्रा 6i DHM के साथ मापा हेला कोशिकाओं के लिए सूखी द्रव्यमान का एक समारोह के रूप में लेंस मुक्त माइक्रोस्कोपी के माध्य से मापा कोशिका सूखी द्रव्यमान से पता चलता है. दो माप के बीच एक अच्छा संबंध है (निर्धारण के गुणांक आर2 ०.८६ है, ढलान = ०.९, ऑफसेट =-17 स्नातकोत्तर) । चित्रा 6iसे, हम सेल शुष्क मास लेंस के माध्यम से प्राप्त माप मुक्त माइक्रोस्कोपी की परिशुद्धता अनुमान कर सकते हैं । परिशुद्धता, लेंस मुक्त डेटा और रैखिक फ़िट के बीच मतलब वर्ग त्रुटि के रूप में मापा, के बारे में 16 स्नातकोत्तर है ।

जब पूरा समय चूक अधिग्रहण पर सभी एकल कोशिका माप संकलन, यह तो समय का एक समारोह के रूप में कई मीट्रिक के scatterplots प्राप्त करने के लिए संभव है चित्रा 7में दिखाया गया है । ये scatterplots एक बहुत बड़ी आबादी से अधिक प्रसंस्कृत कोशिकाओं के कैनेटीक्स के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं । दृश्य के क्षेत्र में कक्षों की संख्या २,००० से १५,००० तक बढ़ जाती है (चित्र 7a) । समय बिंदुओं की संख्या से गुणा, यह २.२ x 106 पता लगाए गए कक्षों का एक बड़ा dataset करने के लिए लीड, उनमें से प्रत्येक इसके निर्देशांक और रूपात्मक सुविधाओं, यानी सेल ड्राई मास (चित्रा 7b), सेल क्षेत्र (चित्रा 7c) की विशेषता , सेल औसत मोटाई (आंकड़ा 7d), प्रमुख अक्ष लंबाई (चित्रा 7e), और पहलू अनुपात (चित्रा 7f) ।

महत्वपूर्ण रूप से, सेल ट्रैकिंग और सेल फॉल्ट एल्गोरिदम का संयोजन हमें एकल कोशिका स्तर पर कैनेटीक्स को मापने में सक्षम बनाता है. एक उदाहरण के रूप में, चित्रा 8 के बारे में ६६ घंटे तक चलने वाले एक सेल ट्रैक के विश्लेषण से पता चलता है और टी0 + 4.1 एच में चार सेल डिवीजनों का प्रदर्शन, टी0 + 20.5 h, टी0 + 36.7 h र टी0 + 53.3 h. चित्रा 8a की अनुमति देता है जो स्वचालित सेल फॉल्ट एल्गोरिथ्म के परिणाम दिखाएँ हम कुशलतापूर्वक इस कोशिका की सतह को चित्रित. कक्ष विभाजन का उपयोग करना, यह तो समय के एक समारोह के रूप में कई मीट्रिक की गणना करने के लिए संभव है, उदाहरण के लिए सेल सतह क्षेत्र (चित्रा 8b), सेल ड्राई मास (चित्रा 8c), सेल औसत मोटाई (चित्रा 8d) और सेल गतिशीलता (चित्रा 8e). इन रेखांकनों से, एक स्पष्ट रूप से सेल डिवीजनों के बीच इन सेलुलर मैट्रिक्स के कैनेटीक्स उपाय कर सकते हैं । विशेष रूप से एक कोशिका चक्र के दौरान सेल क्षेत्र और शुष्क द्रव्यमान की वृद्धि का निरीक्षण कर सकते हैं । इसके अलावा, सेल डिवीजनों के स्वत: पता लगाने का उपयोग कर, तीन अलग सेल चक्र पटरियों इस ट्रैक से निकाला जा सकता है और सेल चक्र अवधि, यानी दो डिवीजनों के बीच में अवधि, अनुमान लगाया जा सकता है । एकल कक्ष ट्रैक पर चित्रा 8में दिखाया गया है, हम तीन सेल चक्र अवधियों मापा, अर्थात् १६.४ एच, १६.२ एच और १६.७ एच. १६७२५ सेल डिवीजनों का पता लगाने में २.७ दिन समय चूक अधिग्रहण परिणामों के विश्लेषण से सभी सेल चक्र पटरियों संकलन और १०,५८४ सेल चक्र पटरियों का विवरण । यह तो मतलब है और ध्वनि आंकड़ों के साथ सेल चक्र अवधि की परिवर्तनशीलता को मापने के लिए संभव है । हमने पाया है कि सेल चक्र अवधि के वितरण १६.५ एच के एक मतलब के साथ गाऊसी वितरण (चित्रा 9a) के करीब है, और १२.४% के एक रिश्तेदार मानक विचलन (वितरण के माध्य से विभाजित गाऊसी चोटी पर मानक विचलन मापा ). १६.५ h का औसत दोहरीकरण समय चित्रा 8पर प्रस्तुत ट्रैक पर मैन्युअल रूप से मापा सेल चक्र लंबाई के साथ संगत है । यह हेला दोहरीकरण समय जो आम तौर पर 20 और 30 एच के बीच24,25,26,27के लिए कर रहे है के लिए प्रकाशित मूल्यों की निचली श्रेणी में है । हालांकि, संदर्भ में28, १६.२ ± १.७ एच का एक छोटा दोहरीकरण समय भी उल्लेख किया है । आगे सेल चक्र लंबाई के हमारे माप को मान्य करने के लिए और हमारे लेंस मुक्त माइक्रोस्कोपी तकनीक की विश्वसनीयता की पुष्टि करने के लिए, हम १०० सेल साइकिल पटरियों (१०,१४८ सेल स्थिति) के एक मैनुअल ट्रैकिंग प्रदर्शन किया है. सेल चक्र पटरियों पर मैन्युअल रूप से प्राप्त (n = १००) मापा सेल चक्र की लंबाई 16.7 ± 1.9 एच (n = १००, चित्रा 9b) है । यह स्वत: सेल ट्रैकिंग के साथ प्राप्त की 16.5 ± 2.1 एच (N = १०,५८४) की माप के बहुत करीब है, समग्र विश्लेषण की वैधता का प्रदर्शन । जब एक स्वचालित रूप से निर्धारित करने के लिए सेल चक्र पथ के मैनुअल ट्रैकिंग की तुलना, हमने पाया है कि सेल चक्र पटरियों का ६७% सफलतापूर्वक पता लगाया गया है और यह है कि चक्र लंबाई स्वचालित रूप से मापा लोगों को अच्छी तरह से संबंधित हैं मापा मैंयुअल रूप से (चित्र 9b) । सेल चक्र पथ का पता लगाने दक्षता प्रयोग के पहले ३२ घंटे में मापा गया था, १५० कोशिकाओं के नीचे एक घनत्व पर/ इस खोज दर जाहिर समय के साथ कम हो जाती है, के रूप में सेल घनत्व बढ़ ~ ५०० कोशिकाओं/2। पता लगाया सेल चक्र पटरियों की संख्या टी0 + 32 एच (चित्रा 9c) पर एक पठार तक पहुंचता है, जबकि अभी भी कोशिकाओं की संख्या टी0 + 32 एच और टी0 + 72 एच (चित्रा 7a) के बीच तीन के एक पहलू से बढ़ जाती है । झूठी सकारात्मक और नकारात्मक पहचान की दर को देखते हुए, चित्रा 9b प्रस्तुत 5 outliers अंक: उनमें से 4 झूठी नकारात्मक पता लगाने के लिए (चक्र लंबाई > 25 एच) और एक झूठी सकारात्मक पता लगाने के लिए 1 (चक्र लंबाई < 10 एच) के कारण कर रहे हैं । इस परिणाम को प्राप्त करने के लिए, हम एक कम झूठी सकारात्मक दर एहसान करने के क्रम में, सेल डिवीजन डिटेक्शन एल्गोरिथ्म में मोटाई (8 µm) पर एक उच्च सीमा का उपयोग किया है । इसके अलावा, विसंगति पेश पटरियों बाहर फ़िल्टर किया गया है, यानी सेल चक्र जो अवधि 6 घंटे से नीचे है और एक शुष्क जन पथ है कि समय के एक समारोह के रूप में रेखीय वृद्धि नहीं करता है के साथ पटरियों । वे सेल साइकिल पटरियों की कुल संख्या का केवल 3% कर रहे हैं । एक परिणाम के रूप में, स्वचालित रूप से प्राप्त सेल चक्र की लंबाई का वितरण कम पटरियों की एक कम संख्या (सेल चक्र की लंबाई < 10 एच, पटरियों की कुल संख्या का ५.१%) के साथ एक गाऊसी (चित्रा 9a) द्वारा अच्छी तरह से अनुमानित है जो गलत से परिणाम होगा सकारात्मक विभाजन का पता लगाने । इसी तरह, एक लंबे सेल चक्र प्रदर्शित पटरियों, जो आंशिक रूप से झूठी नकारात्मक विभाजन का पता लगाने से परिणाम होता है, यह भी दुर्लभ (सेल चक्र लंबाई > 25 एच, पटरियों की कुल संख्या का २.४%) कर रहे हैं । सेल साइकिल पथ के मैनुअल ट्रैकिंग भी आगे सेल प्लगइन के साथ प्रदर्शन पर नज़र रखने का आकलन किया गया था । हम एक पिक्सेल पिच (१.६७ µm) के भीतर है जो मिलान अंक पर १.६ µm की एक समग्र स्थानीयकरण सटीकता ६६९३ कोशिकाओं पर मापा है.

अन्य मापदंडों की जांच की जा सकती है, जैसे सेल प्रारंभिक शुष्क द्रव्यमान (बस एक विभाजन के बाद), अंतिम शुष्क द्रव्यमान (सिर्फ एक कोशिका विभाजन से पहले), साथ ही सेल चक्र के दौरान औसत वृद्धि दर. चित्रा 9d समय के एक समारोह के रूप में प्रारंभिक और अंतिम सेल शुष्क जनता भूखंडों । यह पता चलता है कि दोनों प्रारंभिक और अंतिम सेल शुष्क जनता समय के साथ कमी । प्रारंभिक सेल शुष्क द्रव्यमान का माध्य मूल्य २२३ स्नातकोत्तर से नीचे १३० स्नातकोत्तर तक और अंतिम सेल शुष्क मास ४६० स्नातकोत्तर से २२० स्नातकोत्तर तक कम हो जाती है । दोनों के बीच का अनुपात १.८९ ± ०.१२ पर पूरे प्रयोग के दौरान स्थिर रहता है (figure 9d-e) । अंत में, चित्रा 9f १०,५८४ सेल साइकिल पटरियों पर समय के एक समारोह के रूप में सेल शुष्क जन विकास दर के विकास से पता चलता है और हमने पाया है कि सेल विकास दर में कमी इस विशेष प्रयोग में पूरे सेल जनसंख्या के लिए एक आम प्रवृत्ति है ।

Figure 1
चित्रा 1: लेंस मुक्त माइक्रोस्कोपी. (a) लेंस मुक्त माइक्रोस्कोपी अधिग्रहण सेटअप की योजनाबद्ध । (ख) 6 वेल्स लेंस मुक्त वीडियो माइक्रोस्कोप की तस्वीर । यह १.६७ µm की एक पिक्सेल पिच और ६.४ mm x ४.६ mm = २९.४ mm2के एक इमेजिंग क्षेत्र के साथ एक CMOS छवि संवेदक का उपयोग करता है । रोशनी नमूना से लगभग 5 सेमी की दूरी पर रखा एक pinhole के साथ एक बहु रंग का आरजीबी एल ई डी द्वारा प्रदान की जाती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: Trackmate इंटरफ़ेस. प्लगइन के मुख्य मेनू वास्तविक हेला सेल प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया सेटिंग्स के साथ दिखाया गया है । अनुमानित ब्लॉब व्यास 15 पिक्सल के लिए सेट किया गया था, डिटेक्टर दहलीज ०.२५ करने के लिए सेट किया गया था, जोड़ने की अधिकतम दूरी 15 पिक्सल के लिए सेट किया गया था, गैप समापन अधिकतम दूरी 15 पिक्सल के लिए सेट किया गया था, और पटरियों में स्थानों की संख्या ३.५ करने के लिए सेट किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: होलोग्राम पुनर्निर्माण की प्रक्रिया । (एक) लेंस के माध्यम से संस्कृति में हेला कोशिकाओं के कच्चे अधिग्रहण मुक्त माइक्रोस्कोपी (२९.४ mm2के देखने के पूर्ण क्षेत्र) । (b) (a) का विवरण । (ग) (b) का विवरण । (d) आरजीबी को खंगाला चरण छवि (२९.४ mm2के दृश्य का पूरा क्षेत्र) । (ङ) (d) का विवरण । (च) (e) का विवरण । (चरण छवि को unwrapping से पहले (f), की तुलना में करने के लिए चरण unwrapping के बाद प्राप्त की । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: Trackmate फिजी प्लगइन का उपयोग करके किए गए सेल-ट्रैकिंग परिणामों का स्क्रीन कैप्चर. (a) सेल डिटेक्शन एल्गोरिथ्म का परिणाम जो गाऊसी (LoG) डिटेक्टर के Laplacian पर आधारित होता है । चित्र टी0 + 16h40min में लेंस मुक्त अधिग्रहण के दृश्य का पूरा क्षेत्र दिखाता है जिसमें २,४५१ कोशिकाओं का पता चला है । बाद के एक बैंगनी चक्र के साथ घिरे रहे हैं । (b) कक्ष-ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म के परिणाम । सभी सेल पटरियों एक रंग औसत वेग करने के लिए इसी कोड के साथ ५० फ्रेम (~ 8 घंटे) से अधिक दिखाए जाते हैं. (सी, डी) (a) और (b) क्रमशः (पीला आयत) की विस्तृत छवि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5: कक्ष-ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म के कक्ष डिटेक्शन चरण की मांयता. (क) संस्कृति में हेला कोशिकाओं की फसली छवि (६६३ x ६६३ µm2) जहां हाथ से चयनित सेल ब्लू क्रॉस के साथ चिह्नित कर रहे हैं और सेल ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म के साथ उन का पता लगाया है लाल पार से चिह्नित कर रहे हैं. यह झूठी सकारात्मक पता लगाने (लाल वृत्त) और झूठी नकारात्मक डिटेक्शन (नारंगी वृत्त) के निर्धारण को सक्षम करता है । (b) सही डिटेक्शन (हरी रेखा), झूठी धनात्मक (लाल रेखा) और false ऋणात्मक (नारंगी) का पता लगाने की दर को प्रयोग समय के एक फ़ंक्शन के रूप में प्लॉट किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6: कक्ष सेगमेंट के परिणाम. (a) टी0 + 7 एच (६६३ x ६६३ µm2) में समय चूक अधिग्रहण के ब्याज की एक क्षेत्र के चरण छवि खंगाला । (b) एल्गोरिथम चरण छवि को थ्रेशोल्ड करके प्रारंभ करता है (c) सेगमेंट का सीडिंग प्रक्रिया के साथ प्रारंभ होता है, यानी पता लगाए गए कक्षों के केंद्र का पिक्सेल इसी ट्रैक के मान पर सेट होता है. (डी-ई) अगला और iteratively एक भरण प्रक्रिया लागू की गई है जो आरंभिक थ्रेशोल्ड (b) द्वारा निर्धारित कक्ष की सीमाओं के प्रारंभिक सीडिंग को विस्तारित करता है. (f) फॉल्ट एल्गोरिथम का परिणाम ६६३ x ६६३ µm2 क्षेत्र पर एक समय अनुक्रम के लिए दिखाया जाता है ( चित्र 5के समान) । इस सेगमेंट को खंगाला गया चरण छवि के शीर्ष पर मढ़ा गया एक रंगीन सतह के रूप में दिखाया गया है । ध्यान दें कि लेंस मुक्त संकेत मुख्य रूप से परमाणु क्षेत्र से आ रहा है, और खंड क्षेत्रों नाभिक के करीब गिर जाते हैं । (g) निश्चित हेला कक्षों में लेंस रहित माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त चरण को खंगाला । यह २९.४ mm2के दृश्य के पूर्ण क्षेत्र की एक फसली छवि है । (ज) में दिखाए गए क्षेत्र के चरण छवि (g) एक 5x उद्देश्य के साथ डिजिटल होलोग्राम माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त (NA ०.१२) ६४७ एनएम पर एक लेजर के साथ प्रबुद्ध । (i) सेल सूखी जन के द्वारा प्राप्त की साजिश लेंस के माध्यम से मुक्त माइक्रोस्कोपी शुष्क मास के एक समारोह के रूप में DHM के माध्यम से मापा । scatterplot compiles ३०२ कक्ष माप । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: एक २.७ के डेटा विश्लेषण-दिन लेंस मुक्त हेला कोशिकाओं के समय चूक अधिग्रहण । (एक) समय के एक समारोह के रूप में २९.४ mm2 के दृश्य के पूर्ण क्षेत्र में गिना कोशिकाओं की कुल संख्या । (ख) समय के एक समारोह के रूप में सेल ड्राई मास के Scatterplot । प्रत्येक बॉक्स पर, 6 घंटे के एक बिन के लिए संगत, लाल केंद्रीय चिह्न माध्य को इंगित करता है, और बॉक्स के नीचे और ऊपर के किनारों को क्रमशः 25 और 75 वां शतमक इंगित करता है । मूंछ सबसे चरम डेटा अंक outliers विचार नहीं करने के लिए विस्तार । (सी-एफ) सेल के Scatterplots क्षेत्र (सी), सेल औसत मोटाई (घ), सेल प्रमुख धुरी लंबाई (ई) और सेल पहलू अनुपात (एफ) के रूप में समय के एक समारोह । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्रा 8: एक २.७ दिन सेल पथ (10 मिनट फ्रेम अंतराल) के डेटा विश्लेषण । (a) सेल विभाजन के बारे में ६६ घंटे तक चलने वाले एक सेल ट्रैक के समय चूक अधिग्रहण पर प्रदर्शन किया । ब्याज की सेल एक नीले ओवरले के साथ दिखाया गया है । प्रत्येक फसली छवि ५३ x ५३ µm2है । कक्ष विभाजन पीले घेरे के साथ दिखाया गया है । (ख) समय के एक समारोह के रूप में सेल क्षेत्र के प्लाट । (ग) सेल ड्राई मास के समय विकास के लिए Eq के अनुसार खंड सेल क्षेत्र पर चरण के अभिंन से गणना की । (1). (घ) Eq के अनुसार समय के एक समारोह के रूप में गणना की औसत सेल मोटाई की साजिश । (2). सेल मोटाई (बी-सी-डी-ई) में (ए) और लाल लाइनों में सेल डिवीजनों (पीले घेरे) के लिए इसी तेज चोटियों दर्शाती है । (e) कक्ष के प्लाट को समय के एक फंक्शन के रूप में गतिशीलता । (च) टी0 पर ट्रैक की अंतिम फ़्रेम के संगत परिणाम + 66h20min जब कोशिका घनत्व के बारे में ४७५ कोशिकाओं/ छवि २०० x २०० µm2 ब्याज की सेल पर केंद्रित है । सफेद धब्बे (लाल तारक) कोशिका के मलबे के अनुरूप होते हैं जो सेल कल्चर के एक दिन बाद दिखाई देते हैं । (छ) ८०० x ८०० µm2 फसली इस सेल ट्रैक के अंतिम फ्रेम का खंगाला चरण छवि । ब्याज की सेल पीले घेरे से घिरी हुई है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9: कक्ष चक्र विश्लेषण । (क) प्रसंस्कृत हेला कोशिकाओं के २.७-दिवसीय प्रेक्षण के लिए कोशिका चक्र अवधि का वितरण (N = 10584 कोशिका चक्र) । सेल चक्र अवधि के वितरण १६.५ घंटे का एक मतलब के साथ एक गाऊसी के करीब है और १२.३% के एक रिश्तेदार मानक विचलन (मानक विचलन वितरण के माध्य से विभाजित गाऊसी चोटी पर मापा). (b) कक्ष चक्र लंबाई के निर्धारण के लिए मैंयुअल और स्वचालित कक्ष ट्रैकिंग के बीच तुलना । मैनुअल ट्रैकिंग सुविधाएं १०० सेल साइकिल पथ (१०,१४८ सेल स्थान) । (c) स्वचालित रूप से पता लगाए गए कक्ष चक्र पथ के प्रारंभिक समय का वितरण । (d) मापी गई आरंभिक कोशिका सूखी द्रव्यमान की साजिश (बस कक्ष विभाजन, काले डॉट्स के बाद) और अंतिम कोशिका शुष्क द्रव्यमान (बस कक्ष विभाजन से पहले, लाल डॉट्स) समय के एक समारोह के रूप में । प्रत्येक बॉक्स पर, 6 h के एक बिन के संगत, लाल केंद्रीय चिह्न माध्य को इंगित करता है, और बॉक्स के नीचे और ऊपर के किनारों को क्रमशः 25 और 75 वां शतमक इंगित करता है । मूंछ सबसे चरम डेटा अंक outliers विचार नहीं करने के लिए विस्तार । (ङ) प्रारंभिक शुष्क मास के एक समारोह के रूप में अंतिम कोशिका शुष्क द्रव्यमान का Scatterplot । (च) प्रयोग समय के एक समारोह के रूप में सेल शुष्क जन विकास दर का विकास । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

पूरक फ़ाइल 1: कोड ' segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove. m '. यह Matlab कोड ' trackmate ' डेटासेट का उपयोग पूर्ण समय-चूक प्राप्ति के कक्ष विभाजन को करने के लिए करता है जिसमें से खंगाला गया चरण छवियां फ़ोल्डर ' folder_out ' में सहेजी जाती हैं । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: कोड ' lineage_Version_Jove. m '. इस कोड का उपयोग करता है सरणी ' trackmate ' कोशिका विभाजन एल्गोरिथ्म (segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove. m) के साथ संसाधित, सेल चक्र पथ निकालने के लिए और ब्याज के विभिन्न मापदंडों का निर्धारण, उदा, सेल चक्र अवधि, आरंभिक सेल ड्राई मास और अंतिम सेल ड्राई मास । इस कोड को दो भागों में है, विभाजन कोशिकाओं का पता लगाने के साथ पहला हिस्सा सौदों, और कोशिका चक्र पथ के विश्लेषण के साथ दूसरे भाग । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

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Discussion

इस पत्र में, हम बताते है कि लेंस मुक्त वीडियो माइक्रोस्कोपी एक मशीन के अंदर इस्तेमाल किया जा सकता है कोशिकाओं के हजारों की कैनेटीक्स कब्जा । आदेश में समग्र पद्धति का वर्णन करने के लिए हम कैसे एक २.७ दिन समय चूक संस्कृति में हेला कोशिकाओं के अधिग्रहण मानक सेल ट्रैकिंग एल्गोरिदम के साथ विश्लेषण किया जा सकता है समझाया । परिणाम एक २.२ x 106 सेल माप और १०,५८४ सेल चक्र पटरियों की विशेषता डेटासेट है । अधिग्रहण एक अपेक्षाकृत बड़े सेल से सेल दूरी (सेल घनत्व < 500 कोशिकाओं/mm2) और कक्ष आकृति विज्ञान है कि एक डिस्क के साथ अनुमानित किया जा सकता है के साथ हेला कोशिकाओं की एक संस्कृति पर प्रदर्शन किया गया । ये दोनों सुविधाएं एक स्वचालित सेल-ट्रैकिंग विश्लेषण के अनुप्रयोग की सुविधा देती हैं, जो इस तरह के बड़े डेटासेट को इकट्ठा करना संभव बनाती है । छोटे कक्ष-से-कक्ष दूरी के साथ या अधिक जटिल morphologies के साथ अन्य कक्ष रेखाओं को ट्रैक करना अधिक कठिन होगा और बाद में डेटासेट छोटा होगा.

हम मानते है कि इस दृष्टिकोण कई अध्ययनों के लिए दिलचस्प है, उदाहरण के लिए सेल प्रसार और सेल आकार के अध्ययन के लिए । बाद मौलिक जीवविज्ञान में अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र है और कई सवाल अनुत्तरित रहने के रूप में अच्छी तरह से Ginzberg एट अल द्वारा एक समीक्षा में चर्चा की । 29. इस काम में प्रस्तावित प्रोटोकॉल इस प्रकार सेल प्रसार अध्ययनों के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण मीट्रिक को मापने के लिए एक साधन प्रदान करता है, यानी कोशिका चक्र अवधि, सेल ड्राई मास, अंत और चक्र की शुरुआत के बीच कोशिका शुष्क जन अनुपात और सेल शुष्क जन वृद्धि दर । सेल प्रसार के अध्ययन के अलावा, इस विधि सेल प्रवास के अध्ययन के लिए ब्याज की होगी, क्योंकि यह पटरियों, हर एक कई घंटे तक चलने की एक बड़ी संख्या का उत्पादन कर सकते हैं । वर्तमान प्रोटोकॉल कला के राज्य से परे चला जाता है14,30 से अधिक 10 एच के दौरान पहली बार सेल पटरियों के हजारों के अधिग्रहण के लिए प्रदर्शन करके ।

अंत में, हम एक आसान उपयोग लेंस मुक्त तकनीक है कि एक साथ लेबल के हजारों संस्कृति के कई दिनों से मुक्त कोशिकाओं को ट्रैक करने की अनुमति देता है विकसित किया है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों के पास मानने के लिए कुछ नहीं है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cytonote lens-free video microscope  Iprasense
Horus acquisition software Iprasense
6-well glass bottom culture plates MatTek corporation Part No: P06G-0-14-F 
DMEM + GlutaMAX medium  Gibco
heat-inactivated fetal calf serum  Eurobio
penicillin and streptomycin  Gibco
Fibronectin  Sigma Aldrich
Matlab, image processing toolbox  Mathworks

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References

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