Summary
Objektivet-fri video mikroskopi kan vi overvåke cellekulturer direkte i inkubator. Her beskriver vi full protokollen for å hente og analysere en 2,7 dagen oppkjøpet av kultivert HeLa celler, fører til et datasett 2.2 x 10 spor6 målinger av personlige celle morfologi og 10584 celle syklus.
Abstract
Her viser vi at linsen-fri video mikroskopi kan vi samtidig fange kinetics av celler direkte inne inkubator, og at det er mulig å overvåke og kvantifisere enkeltceller langs flere cellen sykluser. Vi beskriver hele protokollen som brukes til å overvåke og kvantifisere en HeLa cellekultur for 2,7 dager. Først celle kultur oppkjøpet utføres med en linse-fri video mikroskop, og deretter dataene er analysert etter en fire-trinns prosess: flere bølgelengde holografiske gjenoppbygging, celle-sporing, celle segmentering og celledeling gjenkjenning algoritmer. Resultatet viser vi at det er mulig å samle en datasett med mer enn 10.000 cell sykkelstier og mer enn 2 x 106 celle morfologiske målinger.
Introduction
Kultivert pattedyrceller gjennom flere cellen sykluser og nøyaktig celle størrelsen og celle tørr er en utfordrende oppgave. Flere etikett uten optisk teknikker er stand til å utføre denne aktiviteten1,2: fase-shifting interferometry3, digital holografiske mikroskopi (DHM)4,5,6, 7, quadriwave lateral klipping interferometry8,9 og kvantitativ fase tomografi10,11. Disse metodene har ført til mange ny innsikt i forståelsen av cellen syklus av pattedyrceller. Men de er sjelden kombinert med automatisk cellen sporing algoritmer og deres gjennomstrømming fortsatt begrenset når du måler celle masse baner1 (N < 20 i henholdsvis3,4,5 , 6). derfor romanen optisk metode er nødvendig for å måle cellen masse baner med store statistikk (N > 1000).
I dette papiret demonstrere vi evnen linse-fri video mikroskopi samtidig bilde tusen celler direkte i inkubator, og deretter kvantifisere enkeltcelle beregninger langs tusenvis av individuelle cell sykkelstier. Objektivet-fri mikroskopi er en kvantitativ fase tenkelig teknikk som lar oppkjøpet av fase bilde av tett pakket cellene over en stor synsfelt (vanligvis flere titalls mm2, her 29,4 mm2)12,13 ,14,15. Flere beregninger på ett cellenivå bestemmes, f.ekscelle området, celle tørr masse, celle tykkelse, celle store lengden og celle størrelsesforholdet12,15, fra hvert bilde. Deretter bruker en celle-sporing algoritme, kan disse funksjonene tegnes for hver enkelt celle som en funksjon av eksperimentet tid14,15. Videre ved å registrere forekomsten av celledelinger i cellen sporene, er det mulig å trekke annen viktig informasjon som den første cellen tørr masse (bare etter celledeling), den siste tørr cellemasse (like før celledeling) og cellen syklus varighet, dvs, tiden mellom to etterfølgende divisjoner15. Alle disse målingene kan beregnes med veldig god statistikk (N > 1000) siden store synsfelt ville vanligvis tillater analyse av 200 til 10.000 celler i en enkelt linse-fri oppkjøpet.
For å forklare denne metodikken basert på objektivet-fri video mikroskopi, beskriver vi protokollen for å overvåke og kvantifisere en HeLa cellekultur 2,7 dager. Dataanalyse er en fire-trinns prosess basert på flere bølgelengde holografiske gjenoppbygging, celle-sporing, celle segmentering og celledeling algoritmer. Her er det vist at romlig oppløsning og relativt rask bildefrekvens (en acquisition hvert 10. minutt) med dette objektivet-fri video mikroskopi oppsettet er kompatibel med standard celle-sporing algoritmer. Full analyse av dataset resulterer i måling av 10,584 celle spor over hele cellen sykluser.
For å oppsummere, er linse-fri video mikroskopi et kraftig verktøy for å automatisk overvåke tusenvis av umerkede, usynkroniserte og uforandret celler per eksperimentet. hver celle spores over flere sykluser for cellen. Våre målinger dermed gir middelverdien av flere celle parametere, men enda viktigere, mellom cellen variasjon over en stor bestand av celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cellekultur overvåking oppkjøp
- Vokse HeLa celler i DMEM + glutamin (f.eksGlutaMAX) medium med 10% (v/v) fetal kalv inaktivert serum og 1% penicillin og streptomycin.
- Coat 6-vel glass bunnplater kultur med fibronectin (25 µg/mL) 1t. Så frø 2 x 104 celler per brønn.
- Under oppkjøpet, endre mediet hver tredje dag.
- Time-lapse oppkjøpet, bruke video linse-fri mikroskopet (kommersielt tilgjengelig).
Merk: Dette er basert på det objektiv uten beregningsorientert tenkelig teknikken som beskrevet av Özcan et al. 16 som ble endret til å utføre kontinuerlig overvåking i en inkubator ved en kontrollert temperatur på 37 ° C12,15. Den har en complementary metal Oxice semiconductor (CMOS) image sensor med en pixel pitch på 1,67 µm og et tenkelig 6.4 x 4.6 mm2. Flere bølgelengde belysning er levert av en multichip lys utslipp diode (LED) enhet, som gir røde, grønne og blå belysning. Bølgelengdene midtstilles, 636, 521 og 452 nm henholdsvis med en spektral båndbredde på 25, 45 og 25 nm henholdsvis. Rød-grønn-blå (RGB) lysdioder er plassert over et 150 µm pinhole i en avstand på ca 5 cm fra cellene. Lys kraften målt nær LED er så lavt som 10 µW på hver bølgelengde og belysning tiden er bare ett sekund per kjøp. Derfor forventes ingen bilde-toksisitet problemer når cellekulturer er observert under linse-fri video mikroskop. - Sett celle kultur beholderen satt i kontakt med CMOS-sensor (figur 1). Bruk en beholder med et glass dekkglassvæske på bunnen, som er viktig for kvaliteten på linsen uten oppkjøpet. Plastbeholdere kan også brukes, men linsen uten oppkjøpet vil reduseres på grunn av den dårlige optiske kvaliteten på disse beholderne.
- Kontrollere video linse-fri mikroskopet med oppkjøpet programvaren (kommersielt tilgjengelig), som utfører både time-lapse oppkjøpet og holografiske gjenoppbygging. Parameterne må angis av brukeren i programvaregrensesnittet er bildefrekvens, varigheten av eksperimentet, og hvilken cellekultur, dvs tilhenger celler eller flytende celler.
- Angi inndataparameterne oppkjøpet programvaren. Velg bildefrekvensen satt til én oppkjøpet 10 minutter og angi kultur cellen til "tilhenger".
Merk: En bildefrekvens på en oppkjøpet 10 minutter er et godt kompromiss som den sikrer en pålitelig celle sporing mens størrelsen på den resulterende datasettet som skal analyseres, er fortsatt rimelig. Raskeste bildefrekvensen oppnåelig med dette objektivet uten mikroskopi oppsettet er en oppkjøpet hver 5 minutter. Ytterligere øke bildefrekvens fører til overoppheting av CMOS-sensor som kan påvirke levedyktigheten til cellene i kultur. - Start time-lapse oppkjøpet, og holografiske rekonstruksjon algoritmen (kommersielt tilgjengelig) behandler automatisk linse-fri oppkjøpet å få fase bildet av cellekultur. Holografisk rekonstruksjon algoritmen er basert på en multi bølgelengde fase henting algoritmen17 og gir et RGB-bilde rekonstruert fase i området [-π, + π] for hver enkelt celle over en stor synsfelt av 29,4 mm2. Prinsippet om linsen uten innebygde holography er å belyse en tynn prøve (på z = 0) med planet bølge (av amplituden 1 etter normalisering) og oppdage på en CMOS-sensor påfølgende Diffraksjon intensitet bildet på et stykke z = Z, vanligvis 1 mm etter den prøven. I vår oppsett, belysning står sekvensielt i 3 bølgelengder (λ1= 0.450 µm, λ2= 0.540 µm, λ3= 0.647 µm) å måle tre Diffraksjon mønstre på samme utvalget.
2. celle kultur dataanalyse
- For celle-sporing, bruk Trackmate algoritmen, en åpen kildekode Fiji plugin for automatisk sporing av enkelt partikler18. At Legg først full time-lapse oppkjøpet i Fiji (kommandoen Last inn bildet sekvens). På grunn av den store størrelsen på datasett, som inneholder vanligvis 400 RGB rammer 29.7 MB, er det raskere å laste dem i 8-biters format. Neste leder Trackmate Fiji plugin deg gjennom flere stadier av celle-sporing algoritmen, nemlig en celle gjenkjenning scene, en celle tracker scene og flere filtre som brukes på cellen detektiv og beregnede sporene. På hvert trinn, konfigurere algoritmer og vise resultatene umiddelbart slik at eventuelt en lett kan gå frem og tilbake for å justere innstillingene. De ulike menyene på Trackmate grensesnittet er vist i figur 2 med innstillingene brukes for HeLa celler eksperimentet.
- Angi inndataparameterne oppkjøpet programvaren som fulgte (se figur 2). Angi anslått blob diameteren til 15 piksler, detektor terskelen til 0,25, knytte Maksimumsavstanden 15 piksler, gapet-avsluttende max avstanden til 15 piksler og antall flekker i spor til 3.5.
Merk: Disse innstillingene vil selvsagt variere fra et eksperiment til hverandre, spesielt 'beregnet blob diameter"som tilsvarer cellestørrelsen (her gitt i piksler på 1,67 µm). Det samme bemerke gjelder "linking Maks avstand" som utgjør den maksimale avstanden reist en celle innenfor to påfølgende rammer (her gitt i piksler på 1,67 µm). Optimale verdien vil avhenge på cellen motilitet men også på cellen tetthet. - På slutten av celle-sporing, generere resultatene i form av tre tekstfiler ('Analyse' knappen, se figur 2). Nyttigste filen, som heter "Spots i spor statistikk", består av en tabell over alle registrerte celler med sine respektive (x, y) posisjoner i oppkjøpet, deres bildenummer og deres spornummer. Basert på disse dataene, utføre celle segmentering og oppdage celledelinger ved hjelp av dedikert algoritmer (se utfyllende filer). De to andre filene navngis 'Linker i spor statistikk' og 'Spor statistikk' og omfatter alle resultatene håndtere spor, f.eks spor varighet, antall oppdaget hull, spore første ramme, osv.
- Bruke celle segmentering algoritmen (se utfyllende koden arkiv) å automatisk ekstra flere beregninger som beskriver cellen morfologi av rekonstruert fase bildet. Disse verdiene er cellen overflaten (S), celle store lengden (L), cellen lille akse lengden (l) og celle størrelsesforhold (L/l). Fasen utvinnes fra objektivet uten mikroskopi er proporsjonal med tetthet og tykkelsen på prøven laget som beskrevet tidligere15.
- I tillegg til den morfologiske funksjoner i cellen, ekstra kvantitative celle tørr masse (CDM) målinger fra rekonstruert fase13,19,20
EQ. (1)
hvor φ(x,y) er rekonstruert fase Skift19, λ bølgelengde og α = 1.8 x 10-4 m3/kg den bestemte brytningsindeksen som gjelder variasjonen av brytningsindeks tørke masse1, 19. - Vurdere celle tykkelse ved hjelp av en vurdering av forskjellen mellom brytningsindeks cellen og kultur media. Forholdet mellom cellen tykkelse h(x,y) og målt faseskift er gitt med20:
EQ. (2.1)
EQ. (2.2)
med Δn(x,y) = ncelle (x,y) - nmedium (x,y), brytningsindeks forskjellen mellom cellen og kultur media. Nedenfor antar en konstant verdi på Δn = 0.025, som er beregnet fra brytningsindeks målt i HeLa celle kjerner (n = 1.35511) og fosfat-bufret saltvann (PBS) kultur medier (n = 1,33). Selv om tykkelse celleverdien er bare veiledende som den er basert på en antakelse, sin relative variasjoner er meningsfulle og kan utnyttes for å oppdage dele celler. - Bruke dedikert algoritmen (se utfyllende koden arkiv) oppdage forekomsten av celledelinger og deretter trekke ut celle spor som er knyttet til de oppdaget celledelinger, for å oppdage en celledeling, celler med målte tykkelse større enn 8 µm identifiseres først, så sjekk om en ny celle vises tett i rom og tid. På denne måten avhengig oppdagelsen av celledelinger av to robust kriterier. Alternative og mer forseggjort metoder for påvisning av celledeling kan brukes lensfree time-lapse oppkjøpet21,22,23.
EQ. (1)
EQ. (2.1)
EQ. (2.2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For holografiske gjenoppbyggingsprosessen, lys feltet er beskrevet av en skalar felt en (der 
er komplekse verdien av på flyet på vei z fra eksempel og lateral posisjon 
og bølgelengde λ). Lys overføring er modellert av Huygens-Fresnel teorien som gir kjerne Bjørnson 
. Derfor feltet amplituden på detektoren flyet, enz er knyttet til lys amplituden 0 ved følgende relasjon:
dvs.
med 
, der i er det komplekse tallet (jeg2=-1)
Intensitet målingen er bare modellert av 
. Formålet med gjenoppbygging algoritmen er å finne en "god" feltet A0, knyttet til observert prøven, som Diffraksjon passer målt intensiteten jegz. Strategien er å vurdere amplituden feltet fase på detektoren flyet φz som ukjent problemet og optimalisere et multispectral totale variant kriterium for objektet. Mer eksplisitt, vurderer feltene
dvs.
for noen fase feltet φz, 
passer perfekt data siden 
. Slik at feltet etterfølgende 
er et mulig amplituden i prøven flyet, gitt observert intensitet bildet. Dette er grunnen til hvorfor et kriterium på A0 brukes til å angi en unik løsning blant alle datautjevdatautveksling muligheter. Kriteriet å minimere ble valgt som:
der x og y er koordinatene til flyet, 
. Med slike et kriterium kan velge blant alle mulige felt, et eksempel felt viser skarpe kanter på samme plassering for alle bølgelengder, som er fysisk meningsfull. Denne metoden reduserer forekomsten av "twin-bilder" i feltet rekonstruert 0. 'twin-image' er en viktig gjenstanden som skyldes mangel på informasjon under oppkjøpet.
For praktisk beregning, på integraler er discretized med en romlig prøvetaking tilsvarende detektor oppløsningen, derivater er erstattet av kantmengde operatører og convolutions av Huygens-Fresnel Bjørnson 
utføres ved å gå Fourier-plass der 
har et enkelt uttrykk: 
. Minimering av (real) kriterium ε forhold (ekte) Angi variablene 
er håndtert ved hjelp av ikke-lineær konjugert gradient metoden, som krever gradient av ε beregnes for noen fase tilknyttet hver detektor piksler for hver bølgelengde.
Cellen gjenoppbyggingen/fase pakke dem ut
Figur 3 viser resultatene av holografiske gjenoppbyggingen av en ramme med en time-lapse oppkjøpet av HeLa celler i kultur. Figur 3a viser hele synsfeltet en rå oppkjøpet i den blå kanalen på et 29,4 mm2 område. Basert på dette bildet og de i de røde og grønne kanalene, produserer holografisk gjenoppbygging et RGB fase bilde av cellene som vist i tall 3b og 3 c. Rekonstruert fase har lokalt innpakket fase gjenstander tilsvarer celler som induserer en fase Skift overstiger + π. For å utføre en enkel fase pakke dem ut, vi implementert en heuristisk mening, nemlig vi oppdage piksler med verdien 
overstiger 0,3 og sette disse piksler til + π. Denne enkle metoden er basert på en egenskap av RGB rekonstruert fase bildene. I teorien i hvert bildepunkt skal vi måle forholdet 
til 
. Men når det gjelder mitotisk celle, når fasen innpakning oppstår, dette forholdet er ikke lenger opprettholdt i RGB rekonstruert fase bildet (figur 3f). Ovennevnte heuristisk metoden tar nytte av denne egenskapen, slik at en enkel terskelverdi kan brukes til å oppdage bildepunktene presentere fase innpakning. Resultatene av rekonstruert fase bildet før og etter pakke dem ut vises i tallene 3f og 3 g, henholdsvis. Bildene pakket fase er deretter matet inn i celle-sporing algoritmen. Uten dette unwrapping trinnet ville celle-sporing algoritmen mislykkes å oppdage celler i divisjon og cellene i store tykkelse, som ville kompromiss de endelige resultatene. Oppløsningen til den rekonstruerte fasen ble anslått for å være ca 5 µm15 (full avstand romlig oppløsning), som er relativt grov. Det er likevel mulig å observere detaljer som lamellipodia og cellen cytoplasma (tall 3f og 3 g). Viktigst, bildet ved linsen uten mikroskopi viser en stor kontrast og unntatt av halo gjenstander. Dette forenkler automatisk celle gjenkjenning og celle-sporing.
Celle kultur dataanalyse
Trekke ut celle syklusen spor, dataanalyse er avhengig av en rekke forskjellige algoritmer, nemlig cellen sporing utføres med Trackmate Fiji plugg, gjenkjenning av divisjoner og til slutt utvinning av cellen syklus spor, dvs den sekvens mellom to celledelinger. Nedenfor diskutere vi kvaliteten på resultatene av disse algoritmene i forhold til manuelle målinger.
Figur 4 viser ulike skjermbilder av celle-sporing resultatene, resultatene av cellen algoritme og resultatene av celle-sporing analysen. Gjenkjenning av celler i linsen uten kjøp (tall 4a-4 c) er første trinn i celle-sporing algoritmen. For å validere celle algoritme, merket vi manuelt en liten del av time-lapse linse-fri oppkjøpet (214 rammer 663 x 663 µm2). Vi manuelt valgt totalt 5365 celle posisjoner og sammenlignet disse resultatene med de fått av Trackmate Fiji plugg. Figur 5 viser resultatene ut virkelig oppdagelse, falske positiver og feilaktige negativer. Den resulterende følsomheten er ca 96% og den positive prediktive verdien så stor som 99,7%. Disse høye verdier gjenspeiler den gode kvaliteten rekonstruert fase bilder med linsen-fri video mikroskopi oppsettet. Etter celle, en celle segmentering algoritme kan måle, for hver celle-flere ulike beregninger, f.eks området celle cellen tørr masse og celle tykkelsen. Figur 6a viser prinsippet om segmentering algoritmen og finne 6f viser segmenterte bilder i en tidssekvens regioner rundt 663 x 663 µm2 (det samme som i figur 5). Algoritmen starter segmenteringen av terskelverdi fase bildet (se figur 6b) så det gjelder en seeding prosedyre (se figur 6 c). Nemlig er pikslene i midten av oppdaget cellene satt til verdien av tilsvarende sporet. XY plasseringen av cellene og deres tilsvarende spornummer tilbys av filen "Spots i spor statistikk" innhentet etter celle sporing. Deretter implementeres en iterativ fylling prosedyre som utvider frø til grensene av cellen (tall 6 c-e) bestemmes av den første terskelverdi (figur 6b). Denne fylling prosedyren er avhengig av grunnleggende operasjoner i matematiske morfologi, f.eks dilatasjon og erosjon. Fra segmentering resultatet, det er da mulig å beregne flere beregninger enkeltcelle nivå, dvs morfologiske funksjoner som cellen lengden, celle området og celle størrelsesforholdet, men også cellen tørr viktigere masse ifølge EQ. 1. For å vurdere påliteligheten av linsen uten mikroskopi måling av cellen tørr masse, har vi sammenlignet linse-fri rekonstruert fase bildet av fast HeLa celler (figur 6 g) med samme region ervervet via en digital holografiske mikroskopi med en 5 X mål (figur 6 h). Finne 6i viser cellen tørr masse målt ved mener av linsen uten mikroskopi som en funksjon av den tørre målt med DHM for 302 segmentert HeLa celler. Det er en god sammenheng mellom to målinger (koeffisient av besluttsomhet R2 er 0,86, skråningen = 0,9, offset =-17 pg). Fra figur 6i, kan vi beregne presisjonen for cellen tørr masse målingen fått med linsen uten mikroskopi. Presisjon, målt som betyr kvadratisk feil mellom linsen uten dataene og lineær passform, er om lag 16 pg.
Når kompilering alle enkeltcelle mål over full time-lapse oppkjøpet, er det da mulig å skaffe scatterplots av flere beregninger som en funksjon av tid som vist i figur 7. Disse scatterplots gir informasjon om the kinetics av kultivert cellene over en stor befolkning. Antall celler i synsfeltet øker fra 2000 opp til 15.000 (figur 7a). Multiplisert med antall tidspunkt, dette fører til store datasett 2.2 x 10 oppdaget6 celler, hver av dem preget av koordinatene og morfologiske funksjoner, dvs tørr cellemasse (figur 7b), celle-området (figur 7 c) , gjennomsnittlig tykkelse (figur 7 d), store lengden (figur 7e) og størrelsesforhold (figur 7f).
Viktigere, kan kombinasjonen av cellen sporing og celle segmentering algoritmer vi måle kinetics på enkeltcelle nivå. Som et eksempel viser Figur 8 analysen av en celle spore varer ca 66 timer og viser fire celledelinger ved T0 + 4.1 h, T0 + 20.5 h, T0 + 36.7 h og T0 + 53.3 h. figur 8a vise resultatene av den automatiske celle segmentering algoritmen som lar oss å avgrense effektivt overflaten av denne cellen. Bruke celle segmentering, det er da mulig å beregne flere beregninger som en funksjon av tid, f.eks cellen overflaten (figur 8b), cellen tørr masse (Figur 8 c), den celle gjennomsnittlige tykkelsen (Figur 8 d) og cellen motilitet (figur 8e). Fra disse grafer, kan man tydelig måle the kinetics av disse mobilnettet beregninger mellom celledelinger. Spesielt kan man observere økningen i celle området og tørr masse under en celle syklus. I tillegg bruker automatisk språkidentifisering for celledelinger, tre forskjellige cell sykkelstier kan hentes fra dette sporet og hele cellen syklus, dvs i perioden mellom to divisjoner, kan anslås. På enkeltcelle spor vist i Figur 8, vi målt tre celle syklus varighetene, nemlig 16.4 h, 16,2 h og 16.7 h. kompilering alle cellen syklusen spor fra analysen av en 2,7 dager time-lapse oppkjøpet resultater i registreringen av 16725 celledelinger og Beskrivelse av 10,584 cell sykkelstier. Det er da mulig å måle gjennomsnittet og variasjon av hele cellen syklus med lyd statistikk. Vi fant at fordelingen av hele cellen syklus er nær gauss-fordeling (figur 9a) med et gjennomsnitt på 16,5 h og 12.4% (standardavvik målt på Gaussian toppen delt middelverdien relative standardavvik ). Den gjennomsnittlige dobling tid 16,5 h er konsistent med cellen syklus lengder målt manuelt på sporet på Figur 8. Det ligger imidlertid i nedre område av publiserte verdier for HeLa dobling tid som er vanligvis mellom 20 og 30 h24,25,26,27. Men i referanse28nevnt kort dobling tid på 16,2 ± 1,7 h også. For å ytterligere validere våre målinger av cellen syklus lengder og bekrefte påliteligheten til vår linse-fri mikroskopi teknikk, har vi utført en manuell sporing av 100 cell sykkelstier (10,148 celle posisjoner). Cellen syklus spor innhentet manuelt (N = 100) målt celle syklus er 16.7±1.9 h (N = 100, figur 9b). Generasjons måling av 16.5±2.1 h (N = 10,584) med automatisk cellen sporing, demonstrere gyldigheten av generelle analysen. Når sammenlignende manuell sporing av cellen syklus baner til en bestemt automatisk, fant vi at 67% av cellen syklus sporene ble oppdaget og at syklusen lengder målt automatisk er godt korrelert til de målt manuelt (figur 9b). Gjenkjenning effektiviteten av cellen syklus baner ble målt i de første 32 timene av eksperimentet på en tetthet under 150 celler/mm2. Denne oppdagelsen rate åpenbart reduseres med tiden, som celle tetthet øker opp ~ 500 celler/mm2. Antall oppdaget celle syklus spor når et platå på T0 + 32 h (figur 9 c) mens antall celler fremdeles øker med en faktor på tre mellom T0 + 32 h og T0 + 72 h (figur 7a). Vurderer ofte falske positive og negative oppdagelser, figur 9b presenterer 5 outliers poeng: 4 av dem er på grunn av false negativ oppdagelsen (syklus lengde > 25t) og 1 til falske positiver (syklus lengden < 10 h). For å få dette resultatet, har vi brukt en høy terskel på tykkelsen (8 µm) i algoritme celledeling for å favorisere en lav falsk positiv rate. I tillegg sporene presentere inkonsekvens er filtrert ut, dvs celle syklus varighet er under 6 h og spor med en tørr masse bane som ikke øker lineært som en funksjon av tid. De er bare 3% av totalt antall cell sykkelstier. Som et resultat, er distribusjon av cellen syklus lengde fått automatisk godt tilnærmet av en Gaussian (figur 9a) med et lavt antall kort spor (celle syklus lengden < 10t, 5.1% av det totale antallet spor) som fører fra false positiv divisjon oppdagelser. Tilsvarende spor viser en lang cellen syklus, som ville delvis resultater fra falske negative divisjon oppdagelser, er også sjeldne (celle syklus lengde > 25 h, 2.4% av det totale antallet spor). Manuell sporing av cellen syklus baner ble også brukt til ytterligere vurdere celle sporing utføres med plugg. Vi har målt på 6693 celler samlet lokalisering nøyaktighet 1.6 µm på identiske punkter, som i en Pikseldybde (1,67 µm).
Andre parametere kan undersøkes, som den første tørr cellemasse (bare etter en avdeling), den siste tørr massen (like før en celledeling), samt den gjennomsnittlige veksten under cellen syklus. Figur 9 d tomter innledende og avsluttende celle tørr massene som en funksjon av tid. Det viser at både første og siste celle tørr massene redusere tid. Median verdien av den første cellen tørr masse reduseres 223 pg ned 130 pg og den siste cellen tørr masse fra 460 pg ned 220 pg. Forholdet mellom to ligger stabilt på 1.89 ± 0,12 under hele eksperimentet (figur 9 d-e). Endelig figur 9f viser utviklingen av cellen tørr masse veksten som en funksjon av tid over 10,584 celle syklus sporene og vi fant at nedgangen i celle vekst er en felles trend for hele cellen befolkningen i dette bestemte eksperimentet.
Figur 1: Lens-fri mikroskopi. (en) skjematisk av linsen uten mikroskopi oppkjøpet. (b) bilde av 6-wells linse-fri video mikroskop. Den bruker en CMOS bildesensor med en pixel pitch på 1,67 µm og et tenkelig 6.4 mm x 4.6 mm = 29,4 mm2. Belysning er levert av en multi-farget RGB LED sammen med et pinhole plassert i en avstand på ca 5 cm fra utvalget. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Trackmate grensesnittet. Hovedmenyer av plugin vises med faktiske innstillingene som brukes for HeLa cellen eksperimenter. Anslått blob diameter er satt til 15 piksler, detektor terskelen ble satt til 0,25, knytte Maksimumsavstanden er satt til 15 piksler, gapet-avsluttende Maks avstand var satt til 15 piksler og antall flekker i spor ble satt til 3.5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: holografisk rekonstruksjonsprosess. (en) rå oppkjøpet av HeLa celler i kultur gjennom linsen uten mikroskopi (hele synsfeltet 29,4 mm2). (b) detalj av (a). (c) detalj (b). (d) RGB rekonstruert fase bilde (full synsfeltet 29,4 mm2). (e) detalj av (d). (f) detalj (e). (g) fase bilde fremstilt etter fase pakke dem ut for å være i forhold til (f), før pakke dem ut. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: skjermbilder av celle-sporing resultatene utført med Trackmate Fiji plugin. (en) resultatene av celle-algoritme som er basert på en Laplacian av Gaussian (Logg) detektor. Bildet viser hele synsfeltet av linsen uten oppkjøpet T0 + 16h40min der 2,451 celler er oppdaget. Sistnevnte er omgitt med en lilla sirkel. (b) resultater av celle-sporing algoritmen. Alle spor er cellen vises over 50 rammer (~ 8 timer) med en farge som tilsvarer median hastigheten. (c, d) Detaljert bilde av (a) og (b) henholdsvis (gul rektangel). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: validering av celle gjenkjenning scenen av celle-sporing algoritmen. (en) beskåret bilde av HeLa celler i kultur (663 x 663 µm2) der cellen valgt for hånd er merket med blå kors og de oppdaget med celle-sporing algoritmen er merket med røde kors. Dette gjør at fastsetting av false positiv oppdagelsen (røde sirkelen) og false negativ oppdagelsen (oransje sirkel). (b) frekvensen av virkelig oppdagelse (grønn linje), falske positive (rød linje) og falske negative (oransje) oppdagelsen tegnes som en funksjon av eksperimentet tiden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: resultatene av cellen segmenteringen. (en) Reconstructed fase bilde av et område av interesse time-lapse oppkjøpet T0 + 7 h (663 x 663 µm2). (b) algoritmen starter segmenteringen av terskelverdi fase bildet (c) segmenteringen starter med en seeding prosedyre, dvs pikslene i sentrum av oppdaget cellene er satt til verdien av tilsvarende sporet. (d-e) Neste og iteratively implementeres en fylling prosedyre som utvider den innledende seeding til grensene av cellen bestemmes av den første terskelverdi (b). (f) resultatet av segmentering algoritmen vises for en tidssekvens på en 663 x 663 µm2 region (samme som i figur 5). Segmenteringen vises som en farget overflate lagt oppå rekonstruert fase bildet. Merk at linsen uten signalet kommer hovedsakelig fra kjernefysiske regionen, og segmentert områdene faller nær kjernen. (g) Reconstructed fase ved linsen uten mikroskopi i fast HeLa celler. Dette er et beskåret bilde av hele synsfeltet 29,4 mm2. (h) fase bilde av regionen i (g) fremstilt ved digital holografiske mikroskopi med en 5 X mål (NA 0,12) opplyst med en laser på 647 nm. (jeg) tomt cellen tørr masse fått med linsen uten mikroskopi som en funksjon av den tørre målt ved DHM. Scatterplot kompilerer 302 celler målinger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: dataanalyse av en 2.7-dagers linse-fri time-lapse oppkjøpet av HeLa celler. (en) totalt antall celler som telles i hele synsfeltet 29,4 mm2 som en funksjon av tid. (b) Scatterplot av cellen tørr masse som en funksjon av tid. Hver boks tilsvarer en hylle av 6 timer, røde sentrale merket angir median og bunn og topp kantene i boksen Angi 25 og 75 persentil, henholdsvis. Kinnskjegg strekker seg til de mest ekstreme datapunktene ikke vurdert outliers. (c-f) Scatterplots av cellen segmentert området (c), den celle gjennomsnittlige tykkelsen (d), celle store lengden (e) og celle størrelsesforhold (f) som en funksjon av tid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: dataanalyse av en 2,7 dag cellen bane (10 min ramme intervall). (en) cellen segmentering utført på time-lapse oppkjøpet av en celle spor varer ca 66 h. Cellen rundt vises med en blå overlegg. Hver beskåret bilde er 53 x 53 µm2. Celledelinger vises med gule sirkler. (b) tomt celle området som en funksjon av tid. (c) tid evolusjon av cellen tørr masse beregnet fra integralet av fasen over segmentert celle området etter Eq. (1). (d) Plot av gjennomsnittlig celle tykkelse beregnet som en funksjon av tid etter Eq. (2). Cellen tykkelsen utstillinger skarpe topper tilsvarer celledelinger (gule sirkler i (a) og røde linjene i (b, c, d, e)). (e) tomt celle motilitet som en funksjon av tid. (f) segmentering resultater tilsvarende til den siste rammen i sporet på T0 + 66h20min når cellen tetthet er ca 475 celler/mm2. Bildet er 200 x 200 µm2 sentrert på cellen rundt. Den hvite flekkene (røde stjerner) tilsvarer celle rusk som vises etter en dag med cellekulturer. (g) 800 x 800 µm2 beskåret rekonstruert fase bilde av det siste bildet i denne cellen spor. Cellen rundt er omgitt av en gul sirkel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: cellen syklus analyse. (en) distribusjon av cellen syklus varigheten for en 2.7-dagers observasjon av kultivert HeLa celler (N = 10, 584 cellen sykluser). Fordelingen av hele cellen syklus er nær en Gaussian med et gjennomsnitt på 16,5 timer og relativ standardavvik på 12,3% (standardavvik målt på Gaussian toppen delt middelverdien). (b) sammenligning mellom manuell og automatisk celle sporing for fastsettelse av cellen syklus lengden. Manuell sporing har 100 celle syklus baner (10,148 celle posisjoner). (c) fordeling av start tid på automatisk oppdages celle syklus baner. (d) handlingen i den målte første celle tørr masse (bare etter celledeling, svarte prikker) og siste tørr cellemasse (like før celledeling, røde prikker) som en funksjon av tid. I hver boks tilsvarer en hylle 6 h, røde sentrale merket angir median og bunn og topp kantene i boksen Angi 25 og 75 persentil, henholdsvis. Kinnskjegg strekker seg til de mest ekstreme datapunktene ikke vurdert outliers. (e) Scatterplot siste cellen tørr masse som en funksjon av det første tørre massen. (f) utviklingen av cellen tørr masse veksten som en funksjon av eksperimentet tiden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra fil 1: koden 'segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m'. Denne Matlab kode bruker 'trackmate' datasettet å utføre celle oppdeling av komplett time-lapse oppkjøpet som rekonstruert fase bildene lagres i mappen "folder_out". Klikk her for å laste ned denne filen.
Ekstra fil 2: koden 'lineage_Version_Jove.m'. Denne koden bruker tabellen 'trackmate' behandlet med cellen segmentering algoritmen (segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m), for å hente celle syklus baner og angi forskjellige parametrene av interesse, f.eks., cellen varighet, den første cellen tørr masse og den siste cellen tørr masse. Denne koden er i to deler, den første delen omhandler påvisning av dele cellene, og den andre delen med analyse av cellen syklus baner. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette papiret viser vi at linsen-fri video mikroskopi kan brukes i en inkubator for å fange kinetics av celler. For å beskrive generelle metodene forklarte vi hvordan en 2,7 dag time-lapse oppkjøpet av HeLa celler i kultur kan analyseres med standard celle-sporing algoritmer. Resultatet er et datasett med 2.2 x 106 celle målinger og 10,584 cell sykkelstier. Oppkjøpene ble utført på en kultur for Hela celler med en relativt stor avstand i celle til celle (celle tetthet < 500 celler/mm2) og celle morfologi som kan tilnærmes med en plate. Disse to funksjonene lette anvendelsen av en automatisk celle-sporing analyse som gjør det mulig å samle et stort datasett. Andre linjer med mindre celle til celle avstand eller mer komplekse morphologies ville være vanskeligere å spore og påfølgende datasett ville bli mindre.
Vi tror at denne tilnærmingen er interessant for mange studier, for eksempel for celle spredning og celle størrelsen studier. Sistnevnte er et viktig område av forskning i grunnleggende biologi og mange spørsmål forblir ubesvart pent diskutert i en gjennomgang av Ginzberg et al. 29. protokollen foreslått i dette arbeidet gir dermed et middel til å måle viktige beregninger kreves for celle spredning studier, dvs hele cellen syklus, celle tørr masse, celle tørr masse forholdet mellom slutten og starten av syklusen og cellen tørr masse vekst. Foruten studiet av celle spredning, vil denne metoden være av interesse for studiet av celle migrasjon, siden den kan produsere et stort antall spor, hver av dem varer i flere timer. Nåværende protokollen går utover det toppmoderne14,30 ved å demonstrere for første gang oppkjøpet av cellen spor i mer enn 10 h.
I konklusjonen, har vi utviklet en lett-å-bruke linse-fri teknikk som lar deg spore samtidig tusen etikett-fri celler over flere dager med kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ikke å erkjenne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytonote lens-free video microscope | Iprasense | ||
| Horus acquisition software | Iprasense | ||
| 6-well glass bottom culture plates | MatTek corporation | Part No: P06G-0-14-F | |
| DMEM + GlutaMAX medium | Gibco | ||
| heat-inactivated fetal calf serum | Eurobio | ||
| penicillin and streptomycin | Gibco | ||
| Fibronectin | Sigma Aldrich | ||
| Matlab, image processing toolbox | Mathworks |
References
- Zangle, T. A., Teitell, M. A. Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics. Nat Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).
- Popescu, G., Park, K., Mir, M., Bashir, R. New technologies for measuring single cell mass. Lab Chip. 14 (4), 646-652 (2014).
- Reed, J., et al. Rapid, massively parallel single-cell drug response measurements via live cell interferometry. Biophys J. 101 (5), 1025-1031 (2011).
- Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci. USA. 108 (32), 13124-13129 (2011).
- Girshovitz, P., Shaked, N. T. Generalized cell morphological parameters based on interferometric phase microscopy and their application to cell life cycle characterization. Biomed Opt Express. 3 (8), 1757-1773 (2012).
- Kemper, B., Bauwens, A., Vollmer, A., Ketelhut, S., Langehanenberg, P. Label-free quantitative cell division monitoring of endothelial cells by digital holographic microscopy. J Biomed Opt. 15 (3), (2010).
- Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PLoS One. 9 (2), 1-8 (2014).
- Bon, P., Savatier, J., Merlin, M., Wattellier, B., Monneret, S. Optical detection and measurement of living cell morphometric features with single-shot quantitative phase microscopy. J Biomed Opt. 17 (7), (2012).
- Aknoun, S., et al. Living cell dry mass measurement usinq quantitative phase imaging with quadriwave lateral shearing interferometry: an accuracy and sensitivity discussion. J Biomed Opt. 20 (1), 1-4 (2015).
- Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
- Choi, W., et al. Tomographic phase microscopy. Nat Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
- Kesavan, S. V., et al. High-throughput monitoring of major cell functions by means of lensfree video microscopy. Sci Rep. 4, 1-11 (2014).
- Zheng, G., Lee, S. A., Antebi, Y., Elowitz, M. B., Yang, C. The ePetri dish, an on-chip cell imaging platform based on subpixel perspective sweeping microscopy (SPSM). Proc Natl Acad Sci USA. 108 (41), 16889-16894 (2011).
- Pushkarsky, I., et al. Automated single-cell motility analysis on a chip using lensfree microscopy. Sci Rep. 4, 4717 (2014).
- Allier, C., et al. Imaging of dense cell cultures by multiwavelength lens-free video microscopy. Cytom Part A. 91 (5), 1-10 (2017).
- Su, T. -W., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. High-throughput lensfree imaging and characterization of a heterogeneous cell solution on a chip. Biotechnol Bioeng. 102 (3), 856-868 (2009).
- Delacroix, R., et al. Cerebrospinal fluid lens-free microscopy: a new tool for the laboratory diagnosis of meningitis. Sci Rep. 7, 39893 (2017).
- Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2016).
- Popescu, G. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).
- Liu, P. Y., et al. Cell refractive index for cell biology and disease diagnosis: past, present and future. Lab Chip. 16, 634-644 (2016).
- Rapoport, D. H., Becker, T., Mamlouk, A. M., Schicktanz, S., Kruse, C. A novel validation algorithm allows for automated cell tracking and the extraction of biologically meaningful parameters. PLoS One. 6 (11), e27315 (2011).
- Al-Kofahi, O., et al. Automated cell lineage construction: A rapid method to analyze clonal development established with murine neural progenitor cells. Cell Cycle. 5 (3), 327-335 (2006).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. Tracking in cell and developmental biology. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 894-902 (2009).
- Posakony, J. W., England, J. M., Attardi, G. Mitochondrial growth and division during the cell cycle in HeLa cells. J Cell Biol. 74 (2), 468-491 (1977).
- Zocchi, E., et al. Expression of CD38 Increases Intracellular Calcium Concentration and Reduces Doubling Time in HeLa and 3T3 Cells. J Biol Chem. 273 (14), 8017-8024 (1979).
- Reitzer, L. J., Wice, B. M., Kennell, D. Evidence that glutamine, not sugar, is the major energy source for cultured HeLa cells. J Biol Chem. 254 (8), 2669-2676 (1979).
- Benedetti, A. D. E., Joshi-barve, S., Rinker-Schaeffer, C., Rhoads, R. E. Expression of Antisense RNA against Initiation Factor eIF-4E mRNA in HeLa Cells Results in Lengthened Cell Division Times, Diminished Translation Rates, and Reduced Levels of Both eIF-4E and the p220 Component of eIF-4F. Mol Cell Biol. 11 (11), 5435-5445 (1991).
- Kumei, Y., Nakajima, T., Sato, A., Kamata, N., Enomoto, S. Reduction of G1 phase duration and enhancement of c-myc gene expression in HeLa cells at hypergravity. J Cell Sci. 93 (2), 221-226 (1989).
- Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. On being the right (cell) size. Science. 348 (6236), 1245075 (2015).
- Mathieu, E., et al. Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments. Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).
