Summary
וידאו ללא עדשה מיקרוסקופ מאפשר לנו לעקוב אחר תרביות תאים ישירות בתוך החממה. כאן נתאר את פרוטוקול מלא נהגה לרכוש וניתוח של 2.7 היום רכישת בתרבית תאים הלה, שמוביל dataset של 2.2 x 10 שירים6 מדידות של תא בודד ומורפולוגיה 10584 מחזור התא.
Abstract
כאן, נדגים את הסרטון ללא עדשה מיקרוסקופ מאפשרת לנו לתפוס בו זמנית את קינטיקה של אלפי תאים ישירות בתוך החממה וכי ניתן לפקח ולכמת תאים בודדים לאורך כמה מחזורים התא. אנו מתארים פרוטוקול מלא שמשמש כדי לעקוב אחר ולכמת תרבות הלה תא ימים 2.7. ראשית, תא תרבות הרכישה מתבצע באמצעות מיקרוסקופ וידאו ללא עדשה, ולאחר מכן הנתונים זה נותחו בעקבות תהליך ארבעה שלבים: גל מרובה שיקום הולוגרפי, תא-מעקב, תא זיהוי פילוח, חלוקת התא אלגוריתמים. כתוצאה מכך, אנו מראים שאפשר לאסוף של הנתונים (dataset) הכולל יותר מ 10,000 מחזור התא מסלולים ומדידות יותר מ 2 x 106 תאים מורפולוגי.
Introduction
בתרבית של תאים בתרבית במשך כמה מחזורים תא ומדידת במדויק תא וגודל תא יבש הוא משימה מאתגרת. מספר טכניקות ללא תווית אופטי מסוגלים לבצע את המשימה1,2: שלב-shifting אינטרפרומטריה3, מיקרוסקופ דיגיטלי הולוגרפי (סוג התושבות שלהם. מופיעים)4,5,6, 7, quadriwave לרוחב הטיה אינטרפרומטריה8,9 ו כמותיים שלב טומוגרפיה10,11. שיטות אלה הובילו תובנות חדשות רבות ההבנה של מחזור התא של תאי יונקים. אולם הם נמצאים לעתים רחוקות ביחד עם תא אוטומטי מעקב אלגוריתמים התפוקה שלהם נותר מוגבל כאשר מודדים את התא מסלולים מסה1 (N < 20 בהתאמה3,4,5 , 6). לפיכך שיטה אופטי יש צורך למדוד את התא מסלולים המוני עם סטטיסטיקה גדולים (N > 1000).
בנייר זה, נדגים את היכולת של וידאו ללא עדשה מיקרוסקופ בו-זמנית תמונה אלפי תאים ישירות בתוך החממה ולאחר מכן לכמת תא בודד מדדים לאורך אלפי שירים בודדים מחזור התא. ללא עדשה מיקרוסקופ הוא שלב כמותיים הדמיה טכניקה המאפשרת רכישת תמונת שלב של תאים בצפיפות מעל שדה ראייה גדול מאוד (בדרך כלל כמה עשרות של מ מ2, כאן 29.4 מ מ2)12,13 14, ,15. במספר מדדים ברמת תא בודד נקבע, למשל, תא שטח, תא בנפח גדול יבש, עובי התא, אורך ציר מרכזי תא ותא יחס גובה-רוחב12,15, של כל תמונה. לאחר מכן, על-ידי החלת אלגוריתם תא-מעקב, תכונות אלה יכולים להיות מותווים עבור כל תא ותא כפונקציה של ניסוי זמן14,15. יתר על כן, על ידי גילוי המופע של חלוקות תאים על הפסים תא, זה אפשרי לחלץ מידע חשוב אחר כגון התא הראשוני יבש בנפח גדול (רק לאחר חלוקת התא), המסה יבשות תא הסופי (ממש לפני חלוקת התא), התא מחזור משך, כלומר, הזמן בין שתי חטיבות ברציפות15. כל המדידות הללו יכול להיות מחושב עם סטטיסטיקה טובה מאוד (N > 1000) מאז שדה הראייה גדול יאפשר בדרך כלל הניתוח של 200 עד 10,000 תאים ברכישת יחידה ללא עדשה.
על מנת להסביר מתודולוגיה זו מבוסס על וידאו ללא עדשה מיקרוסקופ, נתאר את פרוטוקול כדי לפקח, לכמת תרבות הלה תא ימים 2.7. ניתוח נתונים הוא תהליך ארבעה שלבים בהתבסס על שחזור הולוגרפית גל רב, תא-מעקב, פילוח תא ואלגוריתמים חלוקת התא. כאן הוא הראה כי הרזולוציה המרחבית, את קצב המסגרות מהיר יחסית (רכישה אחת כל 10 דקות) שהושג עם תוכנית התקנה זו וידאו ללא עדשה מיקרוסקופ הוא תואם עם אלגוריתמים תא-מעקב רגיל. ניתוח מלא של ערכת נתונים זה תוצאות המדידה של רצועות תא 10,584 על מחזורי תא שלם.
לסיכום, וידאו ללא עדשה מיקרוסקופ הוא כלי רב עוצמה כדי לפקח באופן אוטומטי אלפי ללא תווית, שאינו מסונכרן ותאים שלא שונתה לכל ניסוי; כל תא במעקב במשך כמה מחזורים התא. המידות שלנו ובכך לספק את הערך הממוצע של מספר פרמטרים תא, אבל יותר חשוב, ההשתנות הבין-תאית על אוכלוסיה גדולה של תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבית תאים פיקוח על רכישת
- לגדול הלה בתאים DMEM + גלוטמין (למשל, GlutaMAX) בינוני בתוספת 10% (v/v) חום-לא פעיל עגל עוברית סרום ו 1% פניצילין, סטרפטומיצין.
- מעיל טוב 6 זכוכית תרבות לוחות עם fibronectin (25 µg/mL) לשעה. ואז זרע 2 x 10 תאים4 לכל טוב.
- במהלך רכישת, לשנות את המדיום כל 3 ימים.
- עבור רכישת זמן לשגות, השתמש וידאו ללא עדשה מיקרוסקופ (זמינים מסחרית).
הערה: זה מבוסס על טכניקת דימות ללא עדשה חישובית כפי שתואר על ידי. Ozcan et al. 16 אשר שונתה כדי לבצע ניטור רציף באינקובטור בטמפרטורה מבוקרת של 37 ° C12,15. הוא כולל חיישן התמונה משלימים תחמוצת מתכת מוליכים למחצה (CMOS) עם זריקה פיקסל של מיקרומטר 1.67 ואזור הדמיה של 6.4 x 4.6 מ מ2. תאורה גל מרובים מסופק על ידי multichip אור פולטות דיודות (נוריות) התקן, אשר מספק תאורה אדום, ירוק וכחול. אורכי הגל מרוכזים, על 636, 521, 452 nm בהתאמה, עם רוחב הפס ספקטרלי של 25, 45 ו- 25 ננומטר בהתאמה. אדום-ירוק-כחול (RGB) הנוריות ממוקמים מעל 150 הקדמוניות מיקרומטר ממרחק של 5 ס מ התאים. הכוח אור נמדד בקרבת ה-LED הוא נמוך כמו 10 µW-כל גל והוא הזמן תאורה רק שנייה אחת לכל רכישה. לפיכך, אין בעיות רעילות צילום צפויים כאשר התא תרבויות מובחנות תחת מיקרוסקופ וידאו ללא עדשה. - לשים את המיכל תרבות תא לשים בקשר עם חיישן CMOS (איור 1). השתמש מיכל עם coverslip זכוכית בתחתית, וזה חשוב על האיכות של הרכישה ללא עדשה. מיכלי פלסטיק יכול לשמש גם אבל הרכישה ללא עדשה תגרע בשל איכות אופטית ירודה של גורמים מכילים אלה.
- בקרת וידאו ללא עדשה מיקרוסקופ עם רכישת התוכנה (זמינים מסחרית), אשר מבצעת את רכישת זמן לשגות והן על שחזור הולוגרפי. הפרמטרים שצריכים להיות מוזנים על ידי המשתמש בממשק התוכנה הן קצב המסגרות, משך הזמן של הניסוי, ואת הסוג של תרבית תאים, תאים חסיד דהיינו או תאים צף.
- הגדר את פרמטרי קלט של רכישת התוכנה. הגדר את קצב המסגרות מוגדר אחד רכישת כל 10 דקות, להגדיר את סוג התרבות התא 'חסיד'.
הערה: קצב רכישת אחד כל 10 דקות היא פשרה טובה שהיא מבטיחה תא אמין מעקב בעוד גודל ערכת הנתונים וכתוצאה מכך שינותח הוא עדיין סביר. קצב המסגרות המהירה השגה עם תוכנית התקנה זו ללא עדשה מיקרוסקופ הוא אחד רכישת כל 5 דקות. להגדיל עוד יותר את קצב המסגרות תוצאות חימום יתר את חיישן CMOS אשר יכול להשפיע על הכדאיות של התאים בתרבות. - להתחיל את רכישת זמן לשגות, האלגוריתם שחזור הולוגרפי (זמינים מסחרית) יעבד באופן אוטומטי את הרכישה ללא עדשה כדי לקבל את התמונה שלב של התרבות תאים. האלגוריתם שחזור הולוגרפי מבוסס על אלגוריתם אחזור מרובת גל שלב17 והוא מספק תמונת שלב המשוחזרת RGB בטווח של [-π, + π] עבור כל תא יחיד מעל שדה ראייה גדול של 29.4 מ מ2. העיקרון של הולוגרפיה ללא עדשה בשורה הוא להאיר מדגם דק (ב- z = 0) עם גל מישורי (של משרעת 1 לאחר נורמליזציה) וכדי לזהות על חיישן CMOS התמונה בעוצמה עקיפה עוקבות במרחק קצר z = Z, בדרך כלל 1 מ מ לאחר לדוגמה. בהגדרת שלנו, ההארה הוא החליף ברצף ל 3 אורכי גל (λ1= מיקרומטר 0.450, λ2= 0.540 מיקרומטר, λ3= מיקרומטר 0.647) כדי למדוד את שלוש תבניות עקיפה באותה דגימת זרע.
2. התא תרבות ניתוח נתונים
- לשימוש התא-מעקב, האלגוריתם Trackmate, תוסף פיג'י קוד פתוח למעקב אוטומטי של חלקיקים יחיד18. At טען תחילה, רכישה מלא זמן לשגות פיג'י (טעינת התמונה רצף הפקודה). בשל גודלו של קבצי הנתונים, הכולל בדרך כלל 400 RGB מסגרות של 29.7 Mb, זה מהר יותר כדי לטעון אותם בתבנית 8 סיביות. הבא התוסף Trackmate פיג'י המדריכים למשתמש דרך מספר שלבים של האלגוריתם תא-מעקב, כלומר שלב זיהוי תא, שלב המעקב תא ו מספר מסננים המוחלים על גילויים של התא, המסילה מחושב. בכל שלב, להגדיר את האלגוריתמים ולהציג את התוצאות באופן מיידי כך, במידת הצורך, אחד יכול בקלות לנווט הלוך ושוב כדי להתאים מחדש את ההגדרות. התפריטים השונים של הממשק Trackmate מוצגים באיור 2 עם ההגדרות בפועל משמש הניסוי תאים הלה.
- הגדר את פרמטרי קלט של התוכנה רכישה בעקבות (ראה איור 2). הגדר את קוטר בועה משוער 15 פיקסלים, הסף גלאי כדי 0.25, המרחק המקסימלי המקשרים 15 פיקסלים, המרחק מקסימום הפער סגירה 15 פיקסלים, ואת מספר המקומות במסלולים ל 3.5.
הערה: הגדרות אלה יהיו שונים מן הסתם מהניסוי אחד למשנהו, במיוחד את 'בועה מוערך קוטר' התואם לגודל התא (מוענקת כאן בפיקסלים של 1.67 מיקרומטר). ההערה באותו חל "המקשרים מקסימום מרחק' באיזה חשבון עבור המרחק המקסימלי על ידי תא בתוך שתי מסגרות רצופים (מוענקת כאן בפיקסלים של 1.67 מיקרומטר). הערך האופטימלי שלו תלוי על תנועתיות תא אלא גם על צפיפות התאים. - בסופו של תהליך מעקב תא, להפיק את התוצאות בצורה של שלושה קבצי טקסט ('ניתוח' כפתור, ראה איור 2). הקובץ השימושי ביותר, בשם 'כתמים בסטטיסטיקה רצועות', מכיל טבלה לרישום תאים כל שזוהו עם העמדות שלהם בהתאמה (x, y) הרכישה, מספר מסגרת שלהם, את מספר המסלול שלהם. על בסיס נתונים אלה, לבצע פילוח תא ולגלות חלוקות תאים באמצעות אלגוריתמים ייעודי (ראה קובצי קוד משלים). שני הקבצים האחרים נקראים 'קישורים בסטטיסטיקה רצועות' ו 'סטטיסטיקת מעקב', כוללים את כל התוצאות התמודדות עם רצועות, למשל מסלול המשכים, מספר פערים שאותרו, לעקוב אחר מסגרת ראשונית, וכו '.
- השתמש האלגוריתם פילוח תא (ראה קובץ קוד משלים) באופן אוטומטי לחלץ במספר מדדים המתארים המורפולוגיה תא מהתמונה שלב המשוחזרת. מדדים אלה הם שטח הפנים של התא (S), אורך ציר מרכזי תא (L), אורך ציר קטין תאים (l), יחס הגובה-רוחב התא (L/l). השלב התאוששה ללא עדשה מיקרוסקופ הוא יחסי צפיפות, עובי השכבה הדגימה כפי שפורט קודם לכן15.
- בנוסף לתכונות מורפולוגי של התא, לחלץ מדידות כמותיים תא יבש (CDM) מסת מ ה19,13,המשוחזרת שלב20
הציוד (1)
כאשר φ(x,y) הוא שלב המשוחזרת shift19, λ אורך הגל וα = 1.8 x-4 10 מ'3/ק ג שבירה מסוים אשר מגולל את הווריאציה של שבירה להתייבש מסה1, 19. - להעריך את עובי התא באמצעות הערכת ההבדל בין תא את מקדם שבירה של תרבות התקשורת. היחס בין את התא עובי h(x,y) משמרת שלב נמדד ניתנת על ידי20:
הציוד (2.1)
הציוד (2.2)
עם Δn(x,y) = nתא (x,y) - nבינוני (x,y), ההבדל שבירה בין התא לבין התקשורת תרבות. בחלק זה, להניח ערך קבוע של Δn = 0.025, אשר מוערך מהאינדקס השבירה נמדד גרעין התא הלה (n = 1.35511) וזו של מדיה תרבות באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) (n = 1.33). למרות הערך עובי התא הוא רק מעיד ככל שהיא מבוססת על ההנחה, הווריאציות היחסי שלו משמעותיים, אפשר לנצל כדי לזהות תאים החלוקה. - השתמש האלגוריתם ייעודי (ראה קובץ קוד משלים) כדי לזהות את המופע של חלוקות תאים ולאחר מכן לחלץ רצועות תא שאינן משוייך לחטיבות תא שאותרו, כדי לזהות את חלוקת התא, תאים עם עובי נמדד שגודלם 8 מיקרומטר לראשונה ניתן לזהות, ולאחר מכן בדוק אם תא חדש תופיע באופן הדוק שהמרחב והזמן. בדרך זו, הגילוי של חלוקות תאים מסתמך על שני קריטריונים חזקים. ניתן להחיל חלופה ושיטות משוכלל יותר לגילוי חלוקת התא עד22,2321,רכישת זמן לשגות lensfree.
הציוד (1)
הציוד (2.1)
הציוד (2.2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עבור תהליך שחזור הולוגרפי, השדה אור מתואר על ידי שדה סקלרי (איפה 
הוא הערך מורכבים של A על המטוס על מרחק z מהמיקום דוגמה ולאחר לרוחב 
ו- גל λ). הפצת האור הוא עוצב בידי בתיאוריה Huygens-פרנל אשר מספק קרנל מפיץ 
. לכן, משרעת שדה-המטוס גלאי, z קשורה את משרעת אור 0 לפי היחס הבא:
קרי
עם 
, איפה המספר המרוכב (אני2=-1)
המדידה בעוצמה הוא המודל פשוט על-ידי 
. המטרה של האלגוריתם השיקום היא למצוא תחום 'טוב' א0, הקשור המדגם ציין, עקיפה אשר יתאימו את עוצמת נמדד אניz. האסטרטגיה היא לשקול שלב שדה משרעת φ המטוס גלאיz גם לא ידוע של הבעיה, כדי למטב את קריטריון וריאציה הכולל מולטי ספקטריאליות של האובייקט. יותר מפורש, התייחסות לשדות
קרי
עבור כל שלב שדה φz, 
בהחלט תואם את הנתונים מאז 
. כך השדה הבאים 
הוא שדה משרעת אפשרי בתוך המטוס מדגם, בהתחשב בעוצמה נצפתה התמונה. זו הסיבה מדוע קריטריון על A0 משמשת כדי לציין פתרון ייחודי בין כל האפשרויות התאמת נתונים. הקריטריון למזער נבחר:
איפה x ו- y הם קואורדינטות המטוס, דהיינו 
. שימוש כזה מהווה קריטריון מאפשר לבחור, בין כל השדות האפשריים, שדה מדגם הצגת קצוות חדים במיקום זהה עבור כל אורכי גל, שהוא בעל משמעות פיזית. שיטה זו מפחיתה את המופע של 'טווין-תמונות' בשטח המשוחזרת 0. 'טווין-התמונה' הוא חפץ חשוב שהם תוצאה של חוסר מידע שלב במהלך תהליך הרכישה.
עבור חישוב מעשי, אינטגרלים הן discretized עם דגימה המרחבי המתאים הרזולוציה גלאי, נגזרות מוחלפים סובול אופרטורים, convolutions על ידי פעולת מפיץ הויגנס-פרנל 
מתבצעים על ידי למרחב פורייה איפה 
יש ביטוי פשוט: 
. להמעיט ככל האפשר חדוה קריטריון (אמיתי) ביחס המשתנים (אמיתי) קבע 
הוא תיקל בשיטת ליניארי מצומדת הדרגתיות, המחייב מעבר הצבע של חדוה יש לחשב עבור כל שלב המשויך לכל גלאי פיקסלים עבור כל אחד אורך הגל.
ביטול הקפת שחזור/שלב התא
איור 3 מראה את התוצאות של השחזור הולוגרפית של מסגרת אחת רכש בצילום מואץ של תאים הלה בתרבות. איור 3a מציגה את שדה הראייה מלא רכישת raw ערוץ הצבע הכחול על שטח2 מ"מ 29.4. שחזור הולוגרפי מבוסס על תמונה זו לבין אלה רכשה בערוצים אדום וירוק, מייצרת תמונת שלב RGB של התאים כפי שמוצג דמויות 3b ו- 3 c. תמונת שלב המשוחזרת מוצגים חפצים שלב עטוף באופן מקומי המתאים תאים זירוז shift שלב העולה + π. על מנת לבצע את שלב פשוט הסרת העטיפה, נוכל ליישם ממוצע היוריסטיקה, כלומר אנו מזהים את הפיקסלים עם הערך 
העולה על 0.3 ולהגדיר את הפיקסלים האלה + π. שיטה פשוטה זו מבוססת על מאפיין של תמונות שלב RGB משוחזר. בתיאוריה על כל פיקסל אנחנו צריכים למדוד את יחס 
שווה ל- 
. אבל במקרה של תא mitotic, שלב גלישת מתרחשת, מערכת היחסים הזו כבר לא נשמר בתמונה RGB שלב ששוחזר (איור 3f). השיטה האוריסטי שהוזכרו לעיל מנצל תכונה זו, כך סף פשוט יכול לשמש כדי לזהות את הפיקסלים מציגים שלב האריזה. התוצאות של תמונת שלב המשוחזרת לפני ואחרי הסרת העטיפה מוצג דמויות 3f , דור 3, בהתאמה. אלה תמונות שלב עטיפתו אז אכלו לתוך האלגוריתם תא-מעקב. ללא שלב זה unwrapping, האלגוריתם אחרי יכשל לזהות תאים חלוקה ותאים של עובי גדול, אשר תסכן את התוצאות הסופיות. הרזולוציה של התמונה שלב המשוחזרת היה מוערך כ 5 מיקרומטר15 (רזולוציה מרחבית צליל מלא), וזה גס יחסית. . זה בכל זאת ניתן להבחין בפרטים כגון lamellipodia תא הציטופלסמה (דמויות 3f ו- 3g). והכי חשוב, התמונה שהתקבל ללא עדשה מיקרוסקופ מציג ניגוד גדול, פטור של הילה חפצים. זה מקל על זיהוי אוטומטי תא ומעקב תא.
ניתוח נתונים תרבות תא
כדי לחלץ את מחזור התא מסלולים, ניתוח הנתונים מסתמך על סדרה של אלגוריתמים שונים, כלומר התא מעקב שבוצעו עם התוסף Trackmate פיג'י, הגילוי של חטיבות ובסופו של דבר החילוץ של תא מחזור שירים, כלומר רצף בין שתי חלוקות תאים. בקישורים הבאים נדון איכות התוצרים של אלגוריתמים אלה לעומת מדידות ידניות.
איור 4 מראה לכידות מסך שונות של תוצאות מעקב תא, התוצאות של אלגוריתם זיהוי תא, את התוצאות של ניתוח מעקב תא. זיהוי תאים ברכישת ללא עדשה (דמויות 4ac -4) הוא הצעד הראשון של האלגוריתם תא-מעקב. על מנת לאמת את אלגוריתם זיהוי תא, אנחנו מבואר ידנית חלק קטן בצילום מואץ ללא עדשה הרכישה (214 מסגרות של מיקרומטר 663 x 6632). אנו באופן ידני נבחרה סך של עמדות תא 5365, לעומת אלו מתקבל על ידי תוסף Trackmate פיג'י תוצאות אלו. איור 5 מראה את התוצאות מבחינת גילוי אמת, תוצאות חיוביות שגויות. ותשלילים שווא. הרגישות וכתוצאה מכך הוא כ- 96%, ערך ניבוי חיובי גדול כמו 99.7%. ערכים גבוהים אלה משקפים את איכות טובה של תמונות שלב המשוחזרת שהושג עם הגדרת וידאו ללא עדשה מיקרוסקופ. לאחר זיהוי תא, באלגוריתם פילוח תא מאפשרת למדוד — עבור כל תא – מדדים שונים מספר, למשל באזור התא, התא יבש מסה ו את עובי התא. איור 6a מתאר את העיקרון של האלגוריתם פילוח ומציג איור 6f מקוטע תמונות ברצף זמן עבור אזור של עניין של מיקרומטר 663 x 6632 (כמו איור 5). האלגוריתם יוזם את פילוח על-ידי קביעת סף תמונת שלב (ראה איור 6b), ולאחר מכן מחילה זה הליך זריעה (ראה איור 6 c). כלומר הפיקסלים של המרכז של התאים שזוהו מוגדרים לערך של המסלול המתאים. העמדות X-Y של התאים ומספר המסלול המקביל שלהם הינם מסופקים באמצעות קובץ 'כתמים בסטטיסטיקה רצועות' שהושג לאחר מעקב תא. לאחר מכן, הליך מילוי איטרטיבי מיושם המרחיבה את הזרע לגבולות של התא (דמויות 6 ג-e) שקבע את סף הראשונית (איור 6b). הליך מילוי זה מסתמך על פעולות בסיסיות מורפולוגיה מתמטי, למשל, התארכות, שחיקה. התוצאה פילוח, אז זה ניתן לחשב במספר מדדים ברמה של תא בודד, קרי תכוניות מורפולוגיות כמו אורך תא, אזור תא יחס הגובה-רוחב התא, אלא גם, וחשוב מכך, התא יבש מסה על פי הציוד 1. כדי להעריך את המהימנות של מיקרוסקופ העדשה ללא מדידה של התא יבש בנפח גדול, לנו יש לעומת התמונה ללא עדשה שלב המשוחזרת של הלה קבוע תאים (איור 6 g) באותו אזור נרכשה על-ידי דיגיטלי הולוגרפית מיקרוסקופ עם יעד X 5 (h איור 6). איור 6i מראה יבש התא המוני נמדדת מתכוון של ללא עדשה מיקרוסקופ כמו פונקציה של המסה יבש עם סוג התושבות שלהם מופיעים יימדדו 302 מקוטע הלה תאים. שישנה התאמה טובה בין שני המדדים (מקדם בנחישות R2 הוא 0.86 ולגובה, שיפוע = 0.9, offset =-17 pg). מ- 6i איור, אנו יכולים להעריך את מידת הדיוק של תא יבש מסה המדידה שהושגו באמצעות מיקרוסקופ ללא עדשה. הדיוק, הנמדדת השגיאה ממוצע הריבועים בין הנתונים ללא עדשה התאם ליניארי, הוא pg כ-16.
בעת הידור כל המדידות תא בודד על פני רכישה מלא זמן לשגות, זה ואז ניתן לקבל scatterplots של מספר מדדים כפונקציה של הזמן, כפי שמוצג באיור 7. Scatterplots אלה מספקים מידע אודות קינטיקה של התאים בתרבית על אוכלוסיה גדולה מאוד. מספר התאים בתוך שדה הראייה מגדילה מ- 2,000 עד 15,000 (איור 7 א). מוכפל מספר נקודות זמן, זה מוביל dataset גדול של 2.2 x 106 אותר תאים, כל אחד מהם מאופיין הקואורדינטות שלה ותכונות מורפולוגיות, קרי תא יבש בנפח גדול (איור 7 ב), תא שטח (איור 7c) , התא עובי ממוצע (איור 7 d), אורך ציר מרכזי (איור 7-אי) יחס גובה-רוחב (איור 7f).
חשוב, השילוב של מעקב תא ואלגוריתמים פילוח תא מאפשר לנו למדוד את קינטיקה ברמת תא בודד. לדוגמה, באיור 8 מציגה הניתוח של תא לעקוב אחר שנמשך כ 66 שעות ואת מפגין ארבע חטיבות תא-T0 + 4.1 h, T0 + 20.5 h, T0 + 36.7 h, T0 + 53.3 ה איור 8a הצגת התוצאות של האלגוריתם פילוח תא אוטומטי המאפשר על פני השטח של התא הזה בצורה יעילה. באמצעות פילוח של התא, אז זה שניתן לחשב במספר מדדים כפונקציה של הזמן, למשל התא פני השטח (איור 8 ב'), התא יבש בנפח גדול (איור 8 ג), העובי הממוצע תא (איור 8 יח) לבין התא תנועתיות (איור 8e). מ גרפים אלה, ניתן למדוד בבירור את קינטיקה של מדדים אלה הסלולר בין חלוקות תאים. בפרט אחד ניתן להבחין העלייה של תא שטח, מסה יבש במהלך מחזור התא. בנוסף, באמצעות הזיהוי האוטומטי של חלוקות תאים, שלושה מסלולים שונים מחזור התא יכול להיות מופק במסלול הזה, משך מחזור התא, כלומר התקופה בין שתי חטיבות, יכול להיות מוערך. על המסלול תא בודד שמוצג באיור 8, מדדנו משלושת המשכים מחזור התא, כלומר 16.4 h, h נמצא 16.2 ו ה' 16.7 הידור כל מחזור התא שירים מתוך הניתוח של ימים 2.7 רכישת זמן לשגות תוצאות זיהוי 16725 תא חטיבות ו התיאור של רצועות מחזור התא 10,584. אז אפשרי למדוד את הממוצע, ההשתנות של משך מחזור התא עם סטטיסטיקה של צליל. מצאנו כי חלוקת משך מחזור התא הוא קרוב הפצה Gaussian (איור 9 א) עם ממוצע של 16.5 h, סטיית תקן היחסי של 12.4% (סטיית תקן נמדד על הפסגה גאוסיאנית מחולק הממוצע של התפלגות ). הממוצע הכפלת זמן של שעה 16.5 הוא תואם אורך מחזור התא נמדד באופן ידני על המסלול המוצג באיור 8. המלון שוכן אולם בטווח התחתון של ערכים שפורסמו עבור הלה הכפלת זמן שבו הם בדרך כלל בין 20 ל 30 h24,25,26,27. עם זאת, תוך התייחסות28, זמן קצר הכפלה של ± נמצא 16.2 1.7 h גם מוזכר. על מנת עוד יותר לאמת את המידות שלנו של מחזור התא אורכים, לאשר את המהימנות של הטכניקה שלנו ללא עדשה מיקרוסקופ, ערכנו מעקב ידני של מחזור התא 100 מסלולים (עמדות תא 10,148). על התא מחזור שירים שהושג באופן ידני (N = 100) האורך נמדד מחזור התא הוא 16.7±1.9 h (N = 100, איור 9b). זה קרוב מאוד המדידה של 16.5±2.1 h (N = 10,584) שהושג עם התא אוטומטי מעקב, הממחיש את תוקפו של הניתוח הכללי. כאשר משווים את מעקב ידני של מחזור התא מסלולים לזו נקבע באופן אוטומטי, מצאנו כי 67% של המסילה מחזור התא זוהו בהצלחה ויש אורך מחזור נמדד באופן אוטומטי הם מתואם היטב לאילו נמדד ידנית (איור 9b). היעילות לאיתור מסלולים מחזור התא נמדדה ב 32 השעות הראשונות של הניסוי, ב צפיפות מתחת תאים/מ מ 1502. זה שיעור זיהוי ברור פוחתת עם הזמן, של התא צפיפות מגדילה למעלה ~ 500 תאים/מ מ2. מספר רצועות זוהה מחזור התא מגיע מישור T0 + h 32 (איור 9 ג) בעוד מספר התאים עדיין גדל פי שלושה בין T0 + 32 h ו T0 + 72 h (איור 7 א). מהברז של שגוי לתגליות חיוביים ושליליים, מציג איור 9b ליניאריים 5 נקודות: 4 מהם הן בשל גילוי שלילי כוזב (מחזור אורך > 25 h) ו- 1 כדי זיהוי חיובי כוזב (מחזור אורך < 10 h). כדי להשיג תוצאות הזה, השתמשנו סף גבוה על העובי (8 מיקרומטר) ב אלגוריתם הזיהוי של חלוקת התא, כדי להעדיף קצב נמוך חיובי כוזב. בנוסף, המסילה מציגים חוסר עקביות עברו סינון החוצה, דהיינו מחזור התא אשר משך מתחת 6 שעות ועוקבת עם מסלול המוני יבש לא להגדיל בצורה לינארית כפונקציה של הזמן. . הם רק 3% של המספר הכולל של מחזור התא מסלולים. כתוצאה מכך, ההתפלגות של אורך מחזור התא מתקבל באופן אוטומטי היא משוערת היטב על ידי Gaussian (איור 9 א) עם מספר נמוך של מסלולים קצרים (אורך מחזור התא < 10שע, 5.1% מספר מסלולים) אשר יכול להגרם שווא גילויים חטיבת חיובי. באופן דומה, רצועות הצגת מחזור התא ארוך, אשר היה חלקית תוצאות חלוקה שלילי כוזב גילויים, גם הם נדירים (אורך מחזור התא > 25 h, 2.4% של המספר הכולל של רצועות). מעקב ידני של מסלולים מחזור התא שימש גם להעריך עוד יותר את מעקב תא הופיעה עם התוסף. לנו יש למדוד על תאים 6693 דיוק לוקליזציה הכוללת של 1.6 מיקרומטר על נקודות תואמות, אשר נמצאים אחד רוחב תווים בפיקסלים (1.67 מיקרומטר).
פרמטרים אחרים יכולים להיבדק, כמו המסה הראשוני תא יבש (רק לאחר חלוקה), המסה יבש הסופי (רק לפני חטיבה התא), כמו גם שיעור הצמיחה הממוצע במהלך מחזור התא. איור 9 d חלקות ההמונים יבשות תא התחלתי וסופי כפונקציה של הזמן. זה מראה כי עם הזמן ירידה בשני גושים יבשים תא התחלתי וסופי. הערך החציוני של התא הראשוני יבש המוני תקטן מעמ' 223 עד 130 pg ויבש התא האחרון בנפח גדול מ pg 460 עד עמ' 220. היחס בין השני נשאר יציב ב- 1.89 אינץ ± 0.12 במהלך הניסוי כולו (איור 9 d-e)- לבסוף, דירה 9-אף דמות מראה את האבולוציה של קצב גדילת מסת יבשות תא כפונקציה של זמן מעל המסילה מחזור התא 10,584, מצאנו כי הירידה קצב צמיחת התאים היא מגמה נפוצות עבור האוכלוסייה התא כולו בניסוי מסוים זה.
איור 1: ללא עדשה מיקרוסקופ. () מפרטים טכניים של ההתקנה רכישה ללא עדשה מיקרוסקופ. מיקרוסקופ (b) תמונה של וידאו ללא עדשה 6-ולס. היא משתמשת a חיישן CMOS עם זריקה פיקסל של 1.67 מיקרומטר, שטח הדמיה של 6.4 מ מ x 4.6 מ מ = 29.4 מ מ2. תאורה מסופק על ידי נוריות במספר צבעים RGB יחד עם הקדמוניות ממוקמים במרחק של 5 ס מ המדגם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: ממשק Trackmate. התפריטים הראשית של התוסף עם ההגדרות בפועל בשימוש עבור התא הלה הניסוי. הקוטר המשוער בועה הוגדר ל 15 פיקסלים, הסף גלאי הוגדר 0.25, המרחק המקסימלי המקשרים הוגדר ל 15 פיקסלים, המרחק מקסימום הפער סגירה הוגדר ל 15 פיקסלים ולאחר מספר כתמים במסלולים הוגדר ל 3.5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: תהליך שיקום הולוגרפי. () רכישת Raw של הלה תאים בתרבות באמצעות ללא עדשה מיקרוסקופ (מלא שדה הראייה של 29.4 מ מ2). פרט (b) (א). פרט (c) (b). תמונת שלב המשוחזרת (d) RGB (מלא שדה הראייה של 29.4 מ מ2). פרט (e) (d). פרט (f) (e). תמונת שלב (g) שהתקבל לאחר שלב הסרת העטיפה ניתן להשוות (נ), לפני הסרת העטיפה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: לכידות מסך של ממצאי תא-המעקב המתבצעת באמצעות התוסף פיג'י Trackmate. () תוצאות של אלגוריתם זיהוי תאים אשר מבוססת על הלפלסיאן של גלאי Gaussian (יומן). התמונה מראה מלא שדה הראייה של רכישת ללא עדשה T0 + 16h40min שבו תאים 2,451 מזוהים. האחרון מוקפים בעיגול סגול. (b) תוצאות של האלגוריתם תא-מעקב. כל הרצועות תא מוצגים יותר מ 50 מסגרות (~ 8 שעות) עם קוד צבע התואם מהירות החציוני. (c, d) מפורט דימוי (א) ו- (ב) בהתאמה (מלבן צהוב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: אימות של שלב איתור תא של האלגוריתם מעקב תא. () Cropped התמונה של הלה תאים בתרבות (מיקרומטר 663 x 6632) איפה התא שנבחר בעבודת יד מסומנים צלבים כחול, אלה שזוהו עם האלגוריתם אחרי מסומנים צלבים אדומים. פעולה זו מאפשרת את קביעת של זיהוי חיובי כוזב (עיגול אדום) ו- false גילויים שליליים (עיגול כתום). (b) שיעור של זיהוי נכון (קו ירוק), false חיוביות (הקו האדום) וזיהוי שלילית (כתום) מותוות כפונקציה של הזמן הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: תוצאות פילוח תא. תמונת שלב () Reconstructed של אזור בעל עניין של רכישת זמן לשגות T0 + 7 שעות (מיקרומטר 663 x 6632). (b) האלגוריתם יוזם את פילוח על-ידי קביעת סף שתמונת שלב (c) פילוח מתחיל הליך זריעה, קרי הפיקסלים של המרכז של התאים שזוהו מוגדרים לערך של המסלול המתאים. (d-e) לאחר מכן, iteratively הליך מילוי מיושם המרחיבה של זריעה הראשונית לגבולות התא שקבע את סף הראשונית (b). (f) התוצאה של האלגוריתם פילוח מוצג על רצף הזמן על אזור2 מיקרומטר 663 x 663 (כמו איור 5). פילוח מוצג משטח צבעוני בשכבות מעל תמונת שלב המשוחזרת. שימו לב כי האות ללא העדשה מגיעה בעיקר מאזור גרעינית, האזורים מקוטע ליפול קרוב לגרעין. שלב (g) Reconstructed מתקבל על ידי ללא עדשה מיקרוסקופ ב קבוע הלה תאים. זוהי תמונה שנחתכה של שדה הראייה המלאה של 29.4 מ מ2. (h) לשלב תמונות של האזור המוצג (g) שהתקבל מיקרוסקופ הולוגרפית דיגיטלי עם יעד X 5 (NA 0.12) מואר עם לייזר-647 ננומטר. (אני) העלילה של התא יבש המוני שהושגו באמצעות ללא עדשה מיקרוסקופ כפונקציה של המסה יבש נמדד באמצעות סוג התושבות שלהם מופיעים. Scatterplot הידור 302 תאי מידות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: ניתוח נתונים הרכישה ללא עדשה בצילום מואץ 2.7-יום של תאים הלה. () הכולל מספר תאים במניין שדה הראייה המלאה של 29.4 מ מ2 כפונקציה של הזמן. (b) Scatterplot של התא יבש מסה כפונקציה של הזמן. על כל תיבה, המתאים סל של 6 שעות, הסימן האדום במרכז מציין את החציון, ולציין הקצוות התחתון ולא העליון של תיבת percentiles את ה-25, 75, בהתאמה. נכון להרחיב נקודות הנתונים הקיצוני ביותר אינו נחשב ליניאריים. (c-f) Scatterplots של התא מקוטע שטח (c), העובי הממוצע תא (d), לאורך ציר מרכזי תא (e), יחס הגובה-רוחב התא (נ) כפונקציה של הזמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8: ניתוח נתונים של מסלול תא היום 2.7 (מרווח מסגרת 10 דקות). () תא פילוח לבצע רכישת מסלול תא שנמשך כ 66 h זמן לשגות. התא עניין מוצג עם כיסוי כחול. כל תמונה שנחתכה היא 53 x 53 מיקרומטר2. לחטיבות תא מוצגים עם עיגולים צהובים. (b) העלילה של אזור תא כפונקציה של הזמן. (ג) זמן התפתחות התא יבש המוני מחושב של האינטגרל של השלב על פני שטח התא ומחולקת לפי הציוד (1). עובי התא (d) חלקת הממוצע מחושב כפונקציה של הזמן על פי הציוד (2). העובי תא תערוכות פסגות חדות המתאים חלוקות תאים (צהוב עיגולים שורות ב (א) ואדום (b-c-d-e)). (e) העלילה של תנועתיות תא כפונקציה של הזמן. (f) פילוח התוצאות המקביל האחרון מסגרת של המסלול T0 + 66h20min כאשר צפיפות התאים היא בערך 475 תאים/מ מ2. התמונה היא 200 x 200 מיקרומטר2 שבמרכזה התא של ריבית. כתמים לבנים (כוכביות אדומות) תואמות שאריות תאים המופיעים אחרי יום אחד של תרבית תאים. מיקרומטר (g) 800 x 8002 תיחתך תמונת שלב המשוחזרת של המסגרת האחרונה על שיר תא. התא עניין מוקפת עיגול צהוב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 9: ניתוח מחזור התא. () חלוקת משך מחזור התא תצפית 2.7-יום של הלה בתרבית תאים (N = 10, מחזורי תא 584). חלוקת משך מחזור התא נמצא קרוב Gaussian עם ממוצע של 16.5 שעות, סטיית תקן היחסי של 12.3% (סטיית תקן נמדד על הפסגה גאוסיאנית מחולק הממוצע של ההתפלגות). תא (b) השוואה בין המדריך לבין אוטומטי מעקב לקביעת אורך מחזור התא. מעקב ידני כולל מחזור התא 100 מסלולים (עמדות תא 10,148). הזמן (c) הפצה של ההתחלה של מסלולים מחזור התא שזוהו באופן אוטומטי. מסה (d) העלילה של התא הראשונית נמדד יבשה (רק לאחר חלוקת התא, שחור נקודות), התא האחרון יבש מסה (לפני חלוקת התא, אדום נקודות) כפונקציה של הזמן. על כל תיבה, המתאים סל של 6 שעות, הסימן האדום במרכז מציין את החציון, ולציין הקצוות התחתון ולא העליון של תיבת percentiles את ה-25, 75, בהתאמה. נכון להרחיב נקודות הנתונים הקיצוני ביותר אינו נחשב ליניאריים. (e) Scatterplot של התא האחרון יבש מסה כפונקציה של המסה יבש הראשונית. (f) האבולוציה של קצב גדילת מסת יבש תא כפונקציה של הזמן הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלימה קובץ 1: קוד 'segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m'- קוד Matlab זה משתמשת את ערכת הנתונים 'trackmate' כדי לבצע את פילוח תא של רכישת זמן לשגות מלאה מהם הדימויים שלב המשוחזרת נשמרים בתיקיה 'folder_out'. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
2 קובץ משלים: קוד 'lineage_Version_Jove.m'- קוד זה משתמש המערך 'trackmate' מעובד עם האלגוריתם פילוח תא (segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m), כדי לחלץ את מחזור התא מסלולים לקבוע את הפרמטרים השונים של עניין, למשל., התא משך מחזור, התא הראשוני יבש בנפח גדול ויבש התא האחרון המוני. קוד זה הוא בשני חלקים, החלק הראשון עוסק זיהוי התאים החלוקה, והחלק השני עם הניתוח של מסלולים מחזור התא. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בנייר זה, אנו מראים שאת מיקרוסקופ וידאו ללא עדשה יכול לשמש בתוך אינקובטור כדי ללכוד את קינטיקה של אלפי תאים. על מנת לתאר את המתודולוגיה הכללית הסברנו כיצד ניתן לנתח של רכישת זמן לשגות היום 2.7 של הלה תאים בתרבות עם אלגוריתמים תא-מעקב רגיל. התוצאה היא dataset שמציעות 2.2 x 10 מדידות תא6 רצועות מחזור התא 10,584. הרכישות נעשו על תרבות של הלה תאים עם מרחק גדול יחסית-לתא (תא צפיפות < תאים/מ מ 5002) ותא מורפולוגיה זה ניתן לקרב את ערכיהן עם דיסק. שתי תכונות אלה מאפשרים היישום של ניתוח התא-מעקב אוטומטי המאפשר לאסוף נתונים כל כך גדולה. שורות תאים אחרים עם המרחק מתא אל תא קטן יותר או עם מורפולוגיות מורכבים יותר יהיה קשה יותר לעקוב אחר ו datasets הבאים יהיה קטן יותר.
אנו מאמינים כי גישה זו היא מעניינת של מחקרים רבים, למשל עבור התפשטות תאים ולימודי גודל התא. האחרונים הם אזור חשוב של מחקר בביולוגיה יסוד, שאלות רבות נותרו ללא מענה יפה נדון בסקירה על-ידי גינזברג. et al. 29. פרוטוקול הצעת העבודה מספק ולכן אמצעי למדידת המדדים החשובים הנדרש ללימודים התפשטות תאים, דהיינו משך מחזור התא, התא יבש מסה, היחס יבשות תא המונית בין הסיום והתחלה של המחזור לבין התא שיעור הצמיחה המוני יבש. מלבד המחקר של התפשטות תאים, שיטה זו תהיה עניין לחקר נדידת תאים, שכן הוא יכול לייצר מספר גדול של רצועות, כל אחד שנמשך כמה שעות. בפרוטוקול הנוכחי מעבר14,המדינה של אמנות30 על ידי הפגנת בפעם הראשונה הרכישה אלפי רצועות תא במהלך יותר מ 10 h.
לסיכום, פיתחנו קל לשימוש ללא עדשה טכניקה המאפשרת לאתר אלפי תאים ללא תווית בו זמנית על פני מספר ימים של תרבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים אין להכיר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytonote lens-free video microscope | Iprasense | ||
| Horus acquisition software | Iprasense | ||
| 6-well glass bottom culture plates | MatTek corporation | Part No: P06G-0-14-F | |
| DMEM + GlutaMAX medium | Gibco | ||
| heat-inactivated fetal calf serum | Eurobio | ||
| penicillin and streptomycin | Gibco | ||
| Fibronectin | Sigma Aldrich | ||
| Matlab, image processing toolbox | Mathworks |
References
- Zangle, T. A., Teitell, M. A. Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics. Nat Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).
- Popescu, G., Park, K., Mir, M., Bashir, R. New technologies for measuring single cell mass. Lab Chip. 14 (4), 646-652 (2014).
- Reed, J., et al. Rapid, massively parallel single-cell drug response measurements via live cell interferometry. Biophys J. 101 (5), 1025-1031 (2011).
- Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci. USA. 108 (32), 13124-13129 (2011).
- Girshovitz, P., Shaked, N. T. Generalized cell morphological parameters based on interferometric phase microscopy and their application to cell life cycle characterization. Biomed Opt Express. 3 (8), 1757-1773 (2012).
- Kemper, B., Bauwens, A., Vollmer, A., Ketelhut, S., Langehanenberg, P. Label-free quantitative cell division monitoring of endothelial cells by digital holographic microscopy. J Biomed Opt. 15 (3), (2010).
- Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PLoS One. 9 (2), 1-8 (2014).
- Bon, P., Savatier, J., Merlin, M., Wattellier, B., Monneret, S. Optical detection and measurement of living cell morphometric features with single-shot quantitative phase microscopy. J Biomed Opt. 17 (7), (2012).
- Aknoun, S., et al. Living cell dry mass measurement usinq quantitative phase imaging with quadriwave lateral shearing interferometry: an accuracy and sensitivity discussion. J Biomed Opt. 20 (1), 1-4 (2015).
- Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
- Choi, W., et al. Tomographic phase microscopy. Nat Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
- Kesavan, S. V., et al. High-throughput monitoring of major cell functions by means of lensfree video microscopy. Sci Rep. 4, 1-11 (2014).
- Zheng, G., Lee, S. A., Antebi, Y., Elowitz, M. B., Yang, C. The ePetri dish, an on-chip cell imaging platform based on subpixel perspective sweeping microscopy (SPSM). Proc Natl Acad Sci USA. 108 (41), 16889-16894 (2011).
- Pushkarsky, I., et al. Automated single-cell motility analysis on a chip using lensfree microscopy. Sci Rep. 4, 4717 (2014).
- Allier, C., et al. Imaging of dense cell cultures by multiwavelength lens-free video microscopy. Cytom Part A. 91 (5), 1-10 (2017).
- Su, T. -W., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. High-throughput lensfree imaging and characterization of a heterogeneous cell solution on a chip. Biotechnol Bioeng. 102 (3), 856-868 (2009).
- Delacroix, R., et al. Cerebrospinal fluid lens-free microscopy: a new tool for the laboratory diagnosis of meningitis. Sci Rep. 7, 39893 (2017).
- Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2016).
- Popescu, G. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).
- Liu, P. Y., et al. Cell refractive index for cell biology and disease diagnosis: past, present and future. Lab Chip. 16, 634-644 (2016).
- Rapoport, D. H., Becker, T., Mamlouk, A. M., Schicktanz, S., Kruse, C. A novel validation algorithm allows for automated cell tracking and the extraction of biologically meaningful parameters. PLoS One. 6 (11), e27315 (2011).
- Al-Kofahi, O., et al. Automated cell lineage construction: A rapid method to analyze clonal development established with murine neural progenitor cells. Cell Cycle. 5 (3), 327-335 (2006).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. Tracking in cell and developmental biology. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 894-902 (2009).
- Posakony, J. W., England, J. M., Attardi, G. Mitochondrial growth and division during the cell cycle in HeLa cells. J Cell Biol. 74 (2), 468-491 (1977).
- Zocchi, E., et al. Expression of CD38 Increases Intracellular Calcium Concentration and Reduces Doubling Time in HeLa and 3T3 Cells. J Biol Chem. 273 (14), 8017-8024 (1979).
- Reitzer, L. J., Wice, B. M., Kennell, D. Evidence that glutamine, not sugar, is the major energy source for cultured HeLa cells. J Biol Chem. 254 (8), 2669-2676 (1979).
- Benedetti, A. D. E., Joshi-barve, S., Rinker-Schaeffer, C., Rhoads, R. E. Expression of Antisense RNA against Initiation Factor eIF-4E mRNA in HeLa Cells Results in Lengthened Cell Division Times, Diminished Translation Rates, and Reduced Levels of Both eIF-4E and the p220 Component of eIF-4F. Mol Cell Biol. 11 (11), 5435-5445 (1991).
- Kumei, Y., Nakajima, T., Sato, A., Kamata, N., Enomoto, S. Reduction of G1 phase duration and enhancement of c-myc gene expression in HeLa cells at hypergravity. J Cell Sci. 93 (2), 221-226 (1989).
- Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. On being the right (cell) size. Science. 348 (6236), 1245075 (2015).
- Mathieu, E., et al. Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments. Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).
