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Biology

レンズ無料のビデオ顕微鏡、付着性細胞培養の定量的解析

Published: February 23, 2018 doi: 10.3791/56580
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 3,4, 3, 1, 1, 1, 5, 5, 4,6, 1
1CEA, LETI, DTBS, LISA, Université Grenoble Alpes, 2CEA, LETI, DTBS, LBAM, Université Grenoble Alpes, 3CEA, INSERM, BIG, Université Grenoble Alpes, 4CNRS, FR CNRS 3425, 5CNRS, UMR 144, Molecular Mechanisms of Intracellular Transport, PSL Research University, Institut Curie, 6TIMC-IMAG

Summary

レンズ無料ビデオ顕微鏡は、インキュベーターの中に直接培養細胞を監視することが出来ます。ここで集録し、解析を培養 HeLa 細胞の 2.7 日間の長い取得するために使用完全なプロトコルについて述べる、2.2 x 10 のデータセットにつながる個々 の細胞の形態や 10584 細胞周期の6測定を追跡します。

Abstract

レンズ無料ビデオを紹介ここでは、顕微鏡により直接インキュベーター内の細胞の何千もの速度を同時にキャプチャおよび監視し、いくつかの細胞周期に沿って単一セルを定量化することが可能であります。完全な監視し、2.7 日間の HeLa 細胞培養を定量化に使用プロトコルについて述べる。まず、レンズ無料ビデオ顕微鏡、細胞文化獲得して実行され、次の 4 段階のプロセス データを分析し、: 多波長ホログラフィック再構成、細胞追跡、セル分割と細胞分裂検出アルゴリズム。その結果、以上 10,000 の細胞周期トラックと 2 x 10 以上6細胞形態計測のデータセットの特徴を収集することが可能だと紹介します。

Introduction

いくつかの細胞周期を通じて培養細胞を監視し、正確に測定セルのサイズとセルの乾燥質量はやりがいのある仕事です。いくつかラベル無料光技術がこのタスク1,2を実行することができる: 位相シフト干渉法3、デジタル ホログラフィー顕微鏡法 (DHM)4,5,6,7quadriwave 横方向せん断干渉8,9定量位相トモグラフィ10,11。これらのメソッドは、哺乳動物細胞の細胞周期の理解に多くの新しい洞察力につながっています。しかし、彼らは、ほとんど追尾法自動セルと結合し、そのスループットは制限を測定するときセル大容量の軌跡1 (N < それぞれ3,4、5の 20,6). 光学手法は大規模な統計と細胞質量軌跡の測定に必要なため (N > 1000)。

本稿では、同時に数千、インキュベーターの中に直接細胞のイメージを作成し、単一のセル数千もの個々 の細胞周期トラックに沿って指標を定量化しレンズ無料ビデオ顕微鏡の機能を示します。顕微鏡のレンズ無料は定量位相イメージング技術の非常に広い視野で密集細胞の位相画像の取得を可能にする (通常数十 mm2、ここの 29.4 mm2)12,13 ,14,15。単一セルのレベルでいくつかのメトリックが決定されます、例えば領域をセル、携帯の乾燥質量、セル厚、セルの長軸の長さとセルの縦横比12,15, それぞれのイメージから。その後、細胞追跡アルゴリズムを適用すると、これらの機能をプロットできますすべての単一セルの実験時間14,15の関数として。さらに、セルのトラックで細胞分裂の発生を検出することにより初期の細胞乾燥質量 (細胞分裂) の直後に、(細胞分裂) の直前に最後のセルの乾燥質量とセルの他の重要な情報を抽出することが可能です。期間、すなわち、2 つの連続した分割15間の時間を周期します。これらのすべての測定値を計算する非常によい統計量 (N > 1000) 以来、ビューの大きなフィールドが通常単一レンズ無料取得 200 に 10,000 細胞の解析を許可。

レンズ無料ビデオ顕微鏡検査に基づいたこの方法を説明するために監視および 2.7 日間の HeLa 細胞培養を定量化するプロトコルについて述べる。データ解析、多波長ホログラフィック再構成、細胞追跡、セル分割と細胞分裂のアルゴリズムに基づいた 4 つのステップ プロセスです。ここで空間分解能とこのレンズ無料ビデオ顕微鏡のセットアップで得られた比較的高速なフレーム レート (10 分ごと 1 つ取得) の標準的な細胞追跡アルゴリズムと互換性があることを示します。このデータセットの完全な分析は完全な細胞周期上 10,584 セル トラックの測定結果します。

要約すれば、レンズ無料ビデオ顕微鏡は何千ものラベル、同期されていないと実験; ごとそのままセルを自動的に監視する強力なツール各セルは、いくつかの細胞周期を追跡されています。我々 の測定はこのように細胞の大規模な人口でセル間変動より重要なことは、しかし、いくつかのセルのパラメーターの平均値を提供します。

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Protocol

1. 買収の監視培養

  1. DMEM + グルタミン (例えばGlutaMAX) の HeLa 細胞を成長 10% (v/v) 熱不活化牛胎児血清および 1% ペニシリンとストレプトマイシン培。
  2. フィブロネクチン (25 μ g/mL) 1 h で 6 よくガラス底培養皿をコートします。ウェルあたり 2 x 10 の4セルをシードします。
  3. 買収は、中に 3 日おきに媒体を変更します。
  4. 時間経過の取得ビデオの無料のレンズ顕微鏡 (市販) を使用します。
    注: これは、レンズ無料計算イメージング法に基づいて Ozcan et al.による記述で16 37 ° C12,15の温度制御でインキュベーターで継続的な監視を実行する変更されました。1.67 μ m の画素ピッチ 6.4 x 4.6 mm2のイメージング領域と相補的金属酸化物半導体 (CMOS) イメージ センサーを提供しています。複数の波長の照明は、マルチチップ光発光ダイオード (Led) デバイス、赤、緑、青の照明を提供するによって提供されます。波長が中心に、452、521, 636 nm それぞれ、25、45、25 のスペクトル帯域幅を持つ nm それぞれ。赤、緑、青 (RGB) Led は、セルから約 5 cm の距離で 150 μ m のピンホールの上にあります。LED に近い測定光は各波長で 10 μ と低く、照明時間は 1 秒当たりの取得。したがって、写真毒性の問題も、細胞培養、レンズ無料ビデオ顕微鏡下で観察すると必要ありません。
  5. CMOS センサー (図 1) と接触して置く細胞培養容器を入れなさい。レンズ無料取得の品質にとって重要である下部にガラス基板とコンテナーを使用します。プラスチック容器も使用できますが、レンズ無料獲得がこれらのコンテナーの光質の悪さにより低下します。
  6. ビデオ レンズ無料顕微鏡集録ソフトウェア (市販) が時間経過の取得とホログラフィック再構成を実行するを制御します。ソフトウェア インターフェイスでユーザーが入力する必要があるパラメーターがフレーム レート、実験、細胞培養、すなわち付着性のセルまたは浮遊細胞の種類の期間。
  7. 集録ソフトウェアの入力パラメーターを設定します。1 つ取得 10 分ごとに、「付着」に細胞培養型を設定フレーム レートを設定します。
    注: 追跡分析する結果のデータセットのサイズはまだ合理的な信頼性の高いセルに、1 つ取得 10 分ごとのフレーム レートは良い妥協案です。この顕微鏡のレンズ無料セットアップで達成可能な最速のフレーム レートは、1 つの取得は 5 分ごとです。培養細胞の生存率に影響を与えることができる CMOS センサーの過剰加熱の結果、フレーム レートがさらに向上します。
  8. コマ撮りの集録を開始し、ホログラフィック再構成アルゴリズム (市販) は、細胞培養の位相画像を取得するレンズ無料取得を自動的に処理します。ホログラフィック再構成アルゴリズムの多波長位相検索アルゴリズム17に基づいておりの範囲で RGB 再構成画像を提供します [-π、π +] 29.4 mm2のビューの大きなフィールドを単一セルごとに。レンズ無料で線ホログラフィーの原理は薄いサンプルを照らす (z = 0) (振幅 1 の正規化後) の平面波と短い距離 z 以降の回折強度画像 CMOS センサーで検出する = Z 後、通常 1 mm、サンプルです。セットアップ時に照明が順番に 3 波長に切り替えられた (λ1= 0.450 μ、λ20.540 μ、λ3を = = 0.647 μ m) 同じサンプルの 3 つの回折パターンを測定します。

2. 細胞培養データ解析

  1. セルの追跡を単一粒子18の自動追跡のためのオープン ソース フィジー プラグイン Trackmate アルゴリズムを使用します。At はまず、フィジー (負荷イメージ シーケンス コマンド) にコマ撮り完全買収を読み込みます。29.7 Mb 通常 400 RGB フレームの機能は、データセットのサイズが大きいため 8 ビットの形式でそれらをロードするより高速です。次に Trackmate フィジー プラグインは、すなわち細胞検出期細胞トラッカー期、細胞検出および計算のトラックに適用されるいくつかのフィルター、細胞追跡アルゴリズムのいくつかの段階でユーザーをガイドします。すべての段階でアルゴリズムを構成し、結果を表示すぐにして、必要に応じて、1 つ簡単に移動できます前後設定を再調整します。Trackmate インタ フェースのさまざまなメニューは HeLa 細胞実験に使用される実際の設定で図 2のとおりです。
  2. (図 2参照) を次のよう入力ソフトウェアの入力パラメーターを設定します。15 ピクセル、15 ピクセルにギャップを閉じる最大距離と 3.5 にトラックでのスポットの数に 15 ピクセルに推定される blob 直径 0.25 検出しきい値、リンクの最大距離を設定します。
    メモ: これらの設定が別の特に '推定 blob 直径」(ここでは 1.67 μ m のピクセルで与えられる) セル サイズに対応する異なる 1 つの実験から明らかに。同じ発言は (ここでは 1.67 μ m のピクセルで与えられる) 2 つの連続するフレーム内のセルで、最大距離を占める旅「リンク最大距離」に適用されます。最適な値は、細胞運動、細胞密度にも依存します。
  3. 細胞追跡プロセスの最後に、3 つのテキスト ファイルの形式で結果を生成 (「解析」ボタンを図 2を参照します).最も有用なファイル、'統計追跡のスポット' は、買収、フレーム数、トラック数 (x, y) それぞれの立場で検出されたすべてのセルの一覧で構成されます。このデータに基づいてセル分割を実行し、(サプルメンタリ コード ファイルを参照してください) 専用のアルゴリズムを使用して細胞分裂を検出します。他の 2 つのファイルがという名前の 'トラックの統計情報にリンク' と 'トラック' の統計情報とトラック、トラック期間など、検出されたギャップ数を扱うすべての結果を含む、最初のフレームなどを追跡。
  4. セル分割アルゴリズムを使用して、自動的に再構成画像からの細胞の形態を記述するいくつかの指標を抽出する (を参照してください補足コード ファイル)。これらの指標は、細胞表面積 (S)、細胞の長軸の長さ (L)、セルの短軸の長さ (l) とセルの縦横比 (l)。顕微鏡のレンズ無料から回復フェーズは、密度と前述のとおり15試料の層の厚さに比例です。
  5. 細胞の形態学的特徴、に加えて再構成13,19,20から定量細胞乾燥質量 (CDM) 測定を抽出します。
    Equation 1イコライザー (1)
    φ(x,y) が再建された位相シフト19波長 λ と α = 1.8 × 10-4 m3/kg乾燥質量1、屈折率の変化を関連している特定の屈折 19。
  6. セルの屈折と培地の違いの推定を用いたセル厚を評価します。セル厚h(x,y) と位相シフトの関係は、20で与えられます。
    Equation 2式 (2.1)
    Equation 3式 (2.2)
    Δn(x,y) = nセル(x、y) - n培地(x、y)、細胞と培地との間の屈折率差。以下では、Δ の定数値を想定n = 0.025、HeLa 細胞核で測定した屈折率からと推定されている (n = 1.35511)、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 文化メディアの (n = 1.33)。セルの厚さ値は仮定に基づいているように示して、その相対的な変化が意味のある、分裂細胞を検出するために悪用される可能性が。
  7. 専用のアルゴリズムを使用して測定した厚さ 8 μ m より大きいによる細胞の細胞分裂の発生を検出し、細胞分裂を検出するために検出された細胞の分裂に関連付けられているセルのトラックを抽出する (を参照してください補足コード ファイル)まず識別されます、確認してくださいかどうか新しい細胞が密接に空間し、時間。この方法で細胞分裂の検出は、2 つの堅牢な条件に依存します。Lensfree コマ獲得21,22,23に代替と細胞分裂の検出のためのより精巧な方法を適用できます。

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Representative Results

ホログラフィック再構成プロセスのライト フィールドは、スカラー場によって記述されます (、 Equation 4 Aのサンプル、および横の位置から距離z平面上の複雑な値は、 Equation 5 、波長 λ)。光の伝搬はプロパゲータ カーネルを提供する Huygens フレネル理論によるモデル化Equation 6。したがって、フィールドの振幅検出器平面z光振幅0に関連は次の関係によって。
Equation 7すなわちEquation 8
Equation 9 、複素数が(私 =2-1)

強度測定は単にモデルによるEquation 10。再構成アルゴリズムの目的は、回折強度にマッチ、観測された標本に関連する '良い' フィールドは0を見つけることです私z。戦略は、検出器平面 φzで振幅フィールド位相を考慮する不明と、問題のオブジェクトのマルチ スペクトルの全変動条件を最適化します。分野をより明示的に検討してください。
Equation 11

Equation 12すなわちEquation 13
いずれかのフェーズ フィールド φzのEquation 14からデータを完全に一致Equation 15。その後続フィールドEquation 16観測強度画像を指定されたサンプル平面内の可能な振幅フィールドです。これは理由なぜA0の基準を使用してデータに一致するすべての可能性の間でユニークなソリューションを指定します。最小化する基準としてを選ばれました。
Equation 17
位置 x と y、平面の座標、すなわちEquation 18。このような条件を使用して、すべての使用可能なフィールドの中で、これは物理的に意味がすべての波長の同じ位置にあるシャープなエッジを表示するサンプル フィールドを選択できるようにします。このメソッドは、再建されたフィールド0の 'ツイン イメージ' の発生を低減します。'ツイン イメージ' 取得処理間に位相情報の欠如に起因する重要なアーチファクトであります。

実用的な計算のため積分検出器分解能に対応する空間的なサンプリングと分離、デリバティブに Huygens フレネル プロパゲータ Sobel 演算子と畳み込みによって置き換えられますEquation 19行くことによって実行されます。フーリエ空間に、Equation 20の単純な式を持つ: Equation 21 。(実際の) 設定の変数に関して (本当の) 条件 ε の最小化Equation 22フェーズごとに各探知器ピクセルに関連付けられている計算される ε のグラデーションを必要とする非線形共役勾配法を用いて取り組んでいます。波長。

セルの再構成/位相アンラッピング
図 3培養 HeLa 細胞タイムラプス買収の 1 つのフレームのホログラフィック再構成の結果を示します。図 3 aは、29.4 mm2区域の青のチャンネルで生獲得の全視野を示しています。この画像と赤と緑のチャンネルに買収したものに基づいて、ホログラフィック再構成は図 3 bと3 cで示すように、セルの RGB 位相画像を生成します。再構成画像の位相シフトを超える誘導細胞 + π に対応するローカル ラップ相工芸品を展示します。簡単な位相アンラップを実行するためにヒューリスティックな平均を実施、すなわち我々 は、値を持つピクセルを検出Equation 230.3 を超えると設定これらのピクセル + π。この単純な方法は再構成 RGB 位相画像のプロパティに基づきます。理論的には各ピクセルの比率を測定するEquation 24とEquation 25。しかし、有糸分裂細胞の場合段階の折り返しが発生すると、この関係はメンテナンスされなくなり (図 3 f) RGB 再構成画像で。上記ヒューリスティック法はこのプロパティを活用相折り返しを提示ピクセルを検出するシンプルなしきい値を使用ことができますように。前に、と開梱後の再構成画像の結果が図 3 fと3 g、それぞれ表示されます。これらの位相画像、細胞追跡アルゴリズムに供給されます。ラップを解除しないと、セルの追跡アルゴリズム部門と最終的な結果を危険にさらす大きい厚さの細胞に細胞を検出する失敗します。再構成画像の解像度は、比較的粗である約 5 μ m15 (全角空間分解能) と推定されました。それにもかかわらず、ケラトサイトなどの詳細を観察し、細胞の細胞質 (3階の数字と 3 g) することが可能です。最も重要なは、レンズ無料顕微鏡で得られた画像のコントラストが大きいが表示されます、ヘイローの工芸品の免除。セルの自動検出と細胞の追跡が容易になります。

細胞培養データ解析
細胞周期を抽出する追跡、データ解析は、一連の異なるアルゴリズムに依存している、すなわち Trackmate フィジー プラグインで実行する追跡セル部門の検出と最終的にセルの抽出サイクル トラック、すなわち2 つの細胞分裂の間にシーケンス。次に、手動測定と比較した場合、これらのアルゴリズムの出力の品質をについて説明します。

図 4は、細胞追跡結果、細胞検出アルゴリズムの結果、細胞追跡分析の結果の別の画面キャプチャを示しています。レンズ無料取得 (図 4 a-4 c) 細胞の検出、細胞追跡アルゴリズムの最初のステップです。セル検出アルゴリズムを検証するために我々 はコマ撮りレンズ無料取得 (663 x 663 μ m2の 214 フレーム) の小さい部分を手動で注釈付き。手動で、総数 5365 セル位置を選択し、Trackmate フィジー プラグインによって得られるものとこれらの結果を比較します。図 5は、真の検出、偽陽性と偽陰性の面で結果を示しています。結果として得られる感度は約 96% と肯定的な予測値 99.7% と同じ大きさです。これらの高い値は、レンズ無料ビデオ顕微鏡のセットアップで得られた再構成画像の良質を反映します。セル検出後セル分割アルゴリズムは、測定することができます-各セルの-いくつかの異なる指標、例えばセル領域セル乾燥質量とセル厚。図 6aセグメンテーション アルゴリズムの原理を示しています、図 6 階663 x 663 μ m2 (図 5と同じ) の関心の領域の時系列に分割された画像を示しています。アルゴリズム閾値位相画像による分割が開始されます (図 6b参照) 播種手順を適用し、(図 6 cを参照)。すなわち検出された細胞の中心のピクセルが対応するトラックの値に設定されます。セルと対応するトラック番号の X、Y 位置は、細胞追跡後に得られた '統計追跡のスポット' ファイルによって提供されます。その後、初期しきい値 (図 6 b) によって決まります (図 6 ce) のセルの境界に種子を拡張繰り返し充填手順を実装します。この充填の手順は、数学的な形態、例えば膨張と侵食の基本操作に依存します。領域分割結果から単一セルのレベル、すなわち形態セルの長さ、セル領域とセルの縦横比のようないくつかの指標を計算することが可能ですし、また、さらに重要なは、セル乾燥質量によると式 1。レンズ無料顕微鏡の信頼性を評価するために測定セルの乾燥質量、我々 はデジタル ホログラフィーによって得られる同一地域に固定の HeLa 細胞 (図 6 g) の再建された位相のレンズ無料画像を比較しています。5 × 対物 (図 6 h) 顕微鏡。乾燥重量 302 の DHM の測定の機能分割 HeLa 細胞図 6iショー セル乾燥質量測定顕微鏡のレンズ無料の意味します。2 つの測定の間に良い相関がある (定量 R2の係数は 0.86、斜面 = 0.9、オフセット =-17 pg)。図 6iからレンズ無料顕微鏡によって得られる細胞の乾燥質量測定の精度を見積もることができます。レンズ無料データと線形フィット、平均二乗誤差と測定精度は約 16 の pg です。

完全タイムラプス取込における単一のセル測定はすべてをコンパイルする場合、図 7に示すように、時間の関数として散布図のいくつかの指標を得ることが可能です。これらの散布図は、非常に大規模な人口培養細胞の動態に関する情報を提供します。ビューのフィールドのセルの数は 15,000 (図 7 a) まで 2,000 から増加します。タイム ポイント、これは 2.2 × 10 の大規模なデータセットにつながるの数で乗算6検出それぞれの座標によって特徴付けられる細胞と形態学的特徴、すなわち細胞の乾燥質量 (図 7 b) セル領域 (図 7 c)、セルの平均厚さ (図 7 d)、主要な軸長さ (図 7 e)、アスペクト比 (図 7 階)。

重要なは、セルのトラッキングとセル分割アルゴリズムの組み合わせでは、単一セルのレベルで速度を測定することが出来ます。例として、図 8に示します電池の解析約 66 時間を追跡し、T0 + 4.1 h、T0 + 20.5 h、T0 + 36.7 h と T0 53.3 h. で 4 つの細胞分裂を示す図 8 a表示を可能にする自動セル分割アルゴリズムの結果私たちはこの細胞の表面を効率的に記述します。セル分割を使用すると、時間、例えば細胞表面積 (図 8 b) の関数としていくつかの指標を計算することが可能ですし、セル乾燥質量 (図 8 c)、セル平均厚 (図 8 d) とセル運動 (図 8 e)。これらのグラフから 1 つは明らかに細胞分裂の間のこれらの細胞のメトリックの動態を測定できます。特に 1 つは細胞周期中のセル領域と乾燥質量の増加を観察できます。さらに、細胞の分裂の自動検出を使用して、3 つの異なる細胞周期トラックから抽出できますこのトラックと細胞周期の期間、すなわち 2 つの部門の間にピリオドを推定できます。図 8に示す 3 つの細胞周期の継続時間を測定した単一セルのトラック、すなわち 16.4 h、16.2 h およびすべての細胞周期をコンパイル 16.7 h. 追跡 2.7 日間の解析から 16725 細胞分裂の検出に時間経過の取得結果と10,584 細胞周期トラックの説明です。平均とは音の統計で細胞周期の期間の変動を測定することが可能ですし。細胞周期期間の分布は 16.5 h の平均と 12.4% (標準偏差分布の平均で割った値ガウスのピークで測定の相対標準偏差のガウス分布 (図 9 a) に近いことがわかった).倍加 16.5 h の時間平均は、図 8に表示されるトラックの手動測定細胞周期の長さと一致。Hela 細胞の公開値の低い範囲で倍増時間、しかしそれにある 20 と 30 h24,25,26,27の間に通常あります。ただし、参照28、16.2 ± 1.7 h の倍加時間は短いも記載されています。さらに細胞周期の長さの測定値を検証、当社レンズ無料顕微法の信頼性を確認するために、我々 は 100 の細胞周期トラック (10,148 セル位置) の手動追跡を行った.セルを手動で得られた航路をサイクル (N = 100) 測定の細胞周期の長さは 16.7±1.9 h (N = 100、図 9 b)。これは非常に 16.5±2.1 h の測定に近い (N = 10,584) 得られた細胞の自動追跡、全体的な分析の有効性を示します。測定物によく相関している細胞周期細胞周期トラックの 67% が正常に検出されたことがわかったサイクルの長さが自動的に測定に自動的に 1 つに軌道を決定の手動追跡を比較するとき手動で (図 9 b)。細胞周期軌道の検出効率は 150 セル/mm2以下の密度で、実験の最初の 32 時間で測定しました。この検出率は、明らかに時間とともに減少セル密度増加 〜 500 セル/mm2を。検出された細胞周期トラックの数は、細胞数はまだ増加中 T0 + 32 h と T0 (図 7 a) 72 時間の間 3 つの要因によって T0 + 32 h (図 9 c) 高原を達する。正と負の誤検出率を考慮した図 9 bが 5 外れ値にポイントを提示: 偽否定的な検出がそれらの 4 (長サイクル > 25 h) と偽陽性検出に 1 (サイクル長 < 10 h)。この結果を得るためには、低偽陽性率を支持するために細胞分裂の検出アルゴリズムで厚み (8 μ m) の高いしきい値を利用させていただきました。さらに、矛盾を提示トラックが除外された、すなわち細胞周期どの持続期間は 6 時間以下と時間の関数として線形増加しません乾燥質量軌道のトラックします。彼らは、細胞周期トラックの合計数のわずか 3% です。その結果、自動的に得られる細胞周期長の分布はガウス分布 (図 9 a) false からなる短いトラック (細胞周期長 < 10 h、総トラック数の 5.1%) の低い数字によってよく近似肯定的な部門が検出されました。同様に、偽否定的な部門の検出の結果は部分的に、長い細胞周期を表示するトラックが珍しい (細胞周期の長さ > 25 h、総トラック数の 2.4%)。細胞周期軌道の追跡は、さらにセルのトラッキングのプラグインで実行を評価するためにも使われました。6693 細胞の 1 つの画素ピッチ (1.67 μ m) 内にある一致するポイントで、1.6 μ m の全体的なローカリゼーション精度で測定しました。

細胞周期間の平均成長率だけでなく、セルの初期乾燥質量 (部門) の直後に、(細胞分裂) の直前に最終的な乾燥質量など、他のパラメーターに検査することが。図 9 dは、最初と最後のセルの乾燥質量を時間の関数としてプロットされます。両方の最初と最後のセルの乾燥質量が時間とともに減少を示しています。最初のセルの中央値乾燥質量が減少する 130 pg まで 223 pg からと最後のセル乾燥質量 460 頁 220 頁下から。2 つの比率のまま全体の実験中に 1.89 ± 0.12 で安定している (図 9 d-e).最後に、図 9 階10,584 の細胞周期トラックを時間の関数としてセル乾燥質量成長率の進化を示しています、セル成長率の低下がこの実験のセル全体の人口のための一般的な傾向であることがわかった。

Figure 1
図 1: 顕微鏡のレンズ無料します。(、) 顕微鏡のレンズ無料取得セットアップの模式図。(b) 6 井戸レンズ無料ビデオの画像顕微鏡。1.67 μ m の画素ピッチ 6.4 mm × 4.6 mm = 29.4 mm2のイメージング領域と CMOS イメージ センサーを使用します。照明は、サンプルから約 5 cm の距離で配置ピンホールと共に複数の色 RGB の Led によって提供されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: Trackmate インターフェイス。HeLa 細胞に使用される実際の設定で表示されるプラグインのメイン メニューの実験します。推定される blob 直径が 15 ピクセルに設定された検出しきい値は 0.25 に設定されたリンクの最大距離は 15 ピクセルに設定された、ギャップを閉じる最大距離は 15 ピクセルに設定された、トラックのスポット数が 3.5 に設定されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: ホログラフィック再構成プロセス。(な) レンズ無料顕微鏡 (全視野 29.4 mm2) による培養 HeLa 細胞の生取得。(b) の詳細 (、)。(c) (b) の詳細。(d) RGB 再構成画像 (全視野 29.4 mm2)。(e) (d) の詳細。(f) (e) の詳細。位相アンラッピングの前に (f) と比較する導出アルゴリズム後に (g) 位相画像が得られます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: Trackmate フィジー プラグインを用いて細胞追跡結果の画面キャプチャします。(、) ガウス (ログ) 検出器のラプラシアンに基づいているセル検出アルゴリズムの結果です。画像は、T0 + 2,451 細胞が検出された 16h40min レンズ無料取得の全視野を示しています。後者は紫色の円で囲まれています。(b) 細胞追跡アルゴリズムの結果。セルのすべてのトラックが平均速度に対応するカラー コード以上 50 フレーム (約 8 時間) 表示されます。(c、d)それぞれのイメージ (a) と (b) の詳細 (黄色の四角形)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 5
図 5: 細胞追跡アルゴリズムの細胞検出の段階の検証します。ブルーの十字が付いているセルを手動で選択 (を) トリミング画像 hela 細胞の細胞の培養 (663 x 663 μ m2)、細胞追跡アルゴリズムで検出されたは赤い × 印が付いています。これにより、誤検知 (赤い円) と偽否定的な検出 (オレンジ色の円) の決定。true 検出 (グリーン ライン)、偽率 (b) 肯定的な (赤い線) と偽陰性 (オレンジ) 検出は実験時間の関数としてプロットされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 6
図 6: セル分割の結果。T0 + 7 h (663 x 663 μ m2) 時間経過の取得の関心領域の再建位相画像が (、)。(b) アルゴリズムは、位相画像セグメンテーション (c) から始まる播種手順、すなわち検出セルの中心部のピクセルが対応するトラックの値に設定されるしきい値によって分割を開始します。(d e)次に、繰り返し、(b) の初期の閾値によって決定されますセルの境界に初期シードを拡張する満ちるプロシージャに実装されます。(f) (図 5と同じ) 663 x 663 μ m2の地域の時系列のセグメンテーション アルゴリズムの結果が表示されます。セグメンテーションは、着色された表面再構成画像の上にオーバーレイとして表示されます。レンズ無料信号は主に核の領域から来ている、原子核に近い領域に捉われずに落ちることに注意してください。レンズ無料顕微鏡によって得られる (g) 災害復興相は、HeLa 細胞を固定しました。29.4 mm2の全視野のトリミングされたイメージです。647 でレーザー照射 5 × 対物 (NA 0.12) とデジタル ホログラフィー顕微鏡によって得られる位相 (h) (g) に示す地域像 nm。(私) 質量レンズ無料顕微鏡による DHM によって測定される乾燥質量の関数として得られる乾燥のセルのプロット。散布図は、302 細胞測定をコンパイルします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 7
図 7: 2.7 日レンズ無料時間経過による HeLa 細胞のデータ解析します。セル (、) の合計数は、時間の関数として 29.4 mm2の全視野でカウントされます。時間の関数としての質量を乾燥細胞の散布図 (b)。それぞれのボックスに 6 時間の箱に対応して、赤い印は中央を示します、中央とボックスの上部と下部のエッジは、25 と 75 パーセン タイルをそれぞれ示します。ひげを外れ値とは見なされません最も極端なデータ ポイントを拡張します。(c f)セルの散布図は、時間の関数としてセルの縦横比 (f) セルの長軸の長さ (e)、セル平均厚 (d) (c) 領域を分割しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 8
図 8: 2.7 日セル軌道 (10 分フレーム間隔) のデータ解析します。約 66 時間を持続させるセル トラックの時間経過の取得 (、) セル分割が実行されます。興味のセルには、ブルーのオーバーレイが表示されます。各トリミングされた画像は 53 × 53 μ m2です。細胞の分裂は、黄色の丸で表示されます。(b) 時間の関数としてのセル領域のプロット。セルの (c) の時間発展は乾燥式 (1) に従って分割セル領域の上相の積分から計算される質量。平均のプロット (d) セルの厚さは、式 (2) によると時間の関数として計算されます。セル厚は、細胞の分裂 (黄色のサークル (b c d e) (a) と赤ライン) に対応する鋭いピークを展示します。(e) 細胞運動時間の関数としてプロットします。(f) セグメンテーション結果細胞密度は約 475 セル/mm2とき最後の T0 + 66h20min でトラックのフレームに対応します。画像は興味のセルを中心とした 200 x 200 μ m2です。白い斑点 (赤いアスタリスク) は細胞培養 1 日後に出現する細胞の残骸に対応します。(g) 800 x 800 μ m2は、この細胞のトラックの最後のフレームの再構成画像をトリミングしました。興味のセルが黄色の円で囲まれています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 9
図 9: 細胞周期の分析。(、) 2.7 日観察培養 hela 細胞の細胞周期期間の分布の細胞 (N = 10, 584 細胞周期)。細胞周期期間の分布は 16.5 時間の平均と 12.3% (ガウスのピーク分布の平均で割った値で測定した標準偏差) の相対的な標準偏差のガウスに近い。(b) 比較マニュアルと自動間細胞を細胞周期の長さの決定のため追跡。手動追跡 100 細胞周期軌道 (10,148 セル位置) を備えています。自動的に検出された細胞周期軌道の (c) 配布開始の時間です。(d) プロット測定の初期細胞は、時間の関数として (細胞分裂、黒ドット) の直後に質量と最後のセル (細胞分裂、赤いドット) の直前に乾燥質量を乾燥します。それぞれのボックスに 6 h の箱に対応して、赤い印は中央を示します、中央とボックスの上部と下部のエッジは、25 と 75 パーセン タイルをそれぞれ示します。ひげを外れ値とは見なされません最も極端なデータ ポイントを拡張します。初期の乾燥質量の関数としての質量を乾燥最終セルの散布図 (e)。(f) 実験時間の関数としてセル乾燥質量成長率の進化。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

補足ファイル 1: コード 'segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m'.この Matlab コードを再構成画像は、フォルダー 'folder_out' に保存されます完全な時間経過の買収のセル分割を実行する 'trackmate' データセットを使用します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

補足ファイル 2: コード 'lineage_Version_Jove.m'.このコードを使用して、配列 'trackmate' セル分割アルゴリズム (segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m) 細胞周期軌道を抽出し、興味などのさまざまなパラメーターを決定する処理します、セル。サイクルの期間、初期の細胞の乾燥質量と最後のセルの乾燥質量。このコードは、2 つの部分では、最初の部分が細胞周期軌道の分析と分割のセルと 2 番目の部分の検出では。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

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Discussion

本稿ではそのレンズ無料ビデオ顕微鏡は、細胞の何千もの速度をキャプチャするインキュベーター内使用ことができますを示す.全体的な方法論を記述するために、標準細胞追跡アルゴリズムの 2.7 日コマ撮りによる培養 HeLa 細胞の分析方法を説明しました。結果は、2.2 × 106セル測定と 10,584 細胞周期トラックを備えデータセットです。買収を行った比較的大規模な細胞間距離と Hela 細胞の培養 (細胞の密度 < 500 セル/mm2) とディスクが近似できる形態の細胞します。これらの 2 つの機能は、このような大規模なデータセットを収集することが可能になる自動細胞トラッキング解析の応用を促進します。他の細胞株細胞間距離が小さいまたはより複雑な形態を追跡するより難しいと以降のデータセットは小さくなります。

このアプローチは多くの研究、例えば細胞増殖と細胞サイズの研究は面白いと考えています。後者は基礎生物学の研究の重要な領域し、多くの質問が未解決のまま素敵なレビューでギンズバーグらで議論29. 本研究で提案されたプロトコルはこうして細胞増殖研究、細胞周期時間をすなわち乾燥質量のセル、セルの乾燥質量比サイクルとセルの開始と終わりの間に必要な重要な指標を測定するための手段提供乾燥質量増加率。細胞増殖に関する研究、ほかこのメソッドになります細胞遊走の研究の興味の多くのトラック、各 1 つのいくつかの時間を持続させる生成できるので。この議定書は最初に 10 時間以上の間にセル トラックの何千もの取得を示すことによって最先端の14,30を越えて行きます。

結論としては、文化の数日間で何千もの無料のラベルのセルを同時に追跡することができます簡単に使用できるの無料のレンズの技術を開発しました。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

著者が認めることを何もありません。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cytonote lens-free video microscope  Iprasense
Horus acquisition software Iprasense
6-well glass bottom culture plates MatTek corporation Part No: P06G-0-14-F 
DMEM + GlutaMAX medium  Gibco
heat-inactivated fetal calf serum  Eurobio
penicillin and streptomycin  Gibco
Fibronectin  Sigma Aldrich
Matlab, image processing toolbox  Mathworks

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References

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Allier, C., Vincent, R., Navarro, F., Menneteau, M., Ghenim, L., Gidrol, X., Bordy, T., Hervé, L., Cioni, O., Bardin, S., Bornens, M., Usson, Y., Morales, S. Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture. J. Vis. Exp. (132), e56580, doi:10.3791/56580 (2018).

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