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Biology

동적에 대 한 렌즈 무료 비디오 현미경 및 부착 세포 배양의 정량 분석

Published: February 23, 2018 doi: 10.3791/56580
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 3,4, 3, 1, 1, 1, 5, 5, 4,6, 1
1CEA, LETI, DTBS, LISA, Université Grenoble Alpes, 2CEA, LETI, DTBS, LBAM, Université Grenoble Alpes, 3CEA, INSERM, BIG, Université Grenoble Alpes, 4CNRS, FR CNRS 3425, 5CNRS, UMR 144, Molecular Mechanisms of Intracellular Transport, PSL Research University, Institut Curie, 6TIMC-IMAG

Summary

렌즈 무료 비디오 현미경 셀 문화 인큐베이터 안에 직접 모니터링할 수 있습니다. 여기 우리가 획득 하 고 배양된 HeLa 세포의 2.7 하루 종일 수집 분석 하는 데 사용 하는 전체 프로토콜 설명, 개별 셀 형태학 및 10584 세포 주기6 측정 추적 2.2 x 10의 데이터 집합에 지도.

Abstract

여기, 우리가 보여 그 렌즈 무료 비디오 현미경을 동시에 인큐베이터 안에 직접 세포의 수천의 활동을 캡처 수 있습니다 하 고 모니터링 하 고 여러 세포 주기에 따라 단일 셀 계량 가능 하다. 우리는 모니터 2.7 일 HeLa 세포 배양을 계량 하는 데 사용 하는 전체 프로토콜을 설명 합니다. 첫째, 셀 문화 수집 렌즈 무료 비디오 현미경으로 수행 되 고 다음은 데이터를 4 단계 절차에 따라 분석: 다중 파장 홀로그램 재건, 셀 추적 셀 세분화 및 세포 분열 검출 알고리즘입니다. 결과적으로, 우리는 수집 하는 데이터 집합을 갖춘 10000 세포 주기 트랙과 2 x 10 이상6 셀 형태학 측정 보다는 더 가능 하다는 것을 보여줍니다.

Introduction

여러 가지 세포 주기 전체에 걸쳐 경작된 한 포유류 세포를 모니터링 하 고 정확 하 게 측정 셀 크기와 셀 건조 질량은 어려운 작업. 여러 레이블 없는 광학 기술이 작업1,2를 수행할 수 있습니다: 위상 이동 간섭계3, 디지털 홀로그램 현미경 (DHM)4,,56, 7, quadriwave 측면 전단 간섭계8,9 그리고 양적 단계 단층 촬영10,11. 이러한 방법은 포유류 세포의 세포 주기의 이해에 많은 새로운 통찰력을 끌고있다. 그러나 그들은 거의 알고리즘을 추적 하는 자동 셀과 결합 된 측정 될 때 그들의 처리량 제한 유지 세포 대량 궤도1 (N < 각각3,,45 에서 20 , 6). 따라서 소설 광 방법 큰 통계와 셀 대용량 궤적을 측정 필요 (N > 1000).

이 문서에 동시에 인큐베이터, 내부 직접 세포의 이미지 다음 개별 세포 주기 트랙의 수천에 따라 단일 셀 통계를 계량을 렌즈 무료 비디오 현미경의 기능을 설명 합니다. 현미경 렌즈 무료 양적 위상 이미징 기술을 매우 큰 시야에 밀도가 포장된 셀의 위상 이미지의 인수를 허용 하는 (일반적으로 여러 가지 수만 m m2, 여기 29.4 m m2)12,13 ,,1415. 단일 셀 수준에서 몇 가지 통계 결정 됩니다, 예를 들어, 셀 지역, 건조 질량, 셀 간격, 셀 주요 축 길이 셀 및 가로 세로 비율12,15, 각 이미지에서 셀. 그런 다음 셀 추적 알고리즘을 적용 하 여 이러한 기능 그릴 수 있습니다 모든 단일 셀에 대 한 실험 시간14,15의 기능으로. 또한, 셀 트랙에 세포 분열의 발생을 감지 하 여 그것은 초기 세포 (세포 분열) 후, (세포 분열) 직전 최종 셀 건조 질량 질량과 셀 건조와 같은 다른 중요 한 정보를 추출할 수 기간, 즉, 2 개의 연속적인 사단15시간 주기. 모든이 측정은 매우 좋은 통계 계산 될 수 있다 (N > 1000) 이후 큰 시야 일반적으로 200 ~ 10000 셀 단일 렌즈 무료 획득의 분석 허용.

렌즈 무료 비디오 현미경 검사 법에 따라이 방법론을 설명 하기 위하여 감시 하 고 2.7 일 HeLa 세포 배양을 계량 프로토콜을 설명 합니다. 데이터 분석은 다중 파장 홀로그램 재건, 셀 추적, 셀 분할 및 세포 분열 알고리즘에 따라 4 단계 프로세스입니다. 여기 공간 해상도이 렌즈 무료 비디오 현미경 설치 얻은 비교적 빠른 프레임 속도 (한 인수 10 분 마다) 표준 셀 추적 알고리즘와 호환 되는지 표시 됩니다. 이 데이터 집합의 전체 분석 완전 한 세포 주기에 10,584 셀 트랙의 측정에서 발생합니다.

요약, 렌즈 무료 비디오 현미경은 자동으로 레이블이, 동기화, 수천 및 실험; 당 수정 되지 않은 셀을 모니터링 하는 강력한 도구 여러 가지 세포 주기를 통해 추적 되 고 각 셀입니다. 우리의 측정은 따라서 세포의 큰 인구에 간 세포 가변성을 더 중요 하 게, 하지만 몇 가지 셀 매개 변수 평균 값을 제공합니다.

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Protocol

1. 세포 배양 수집을 모니터링

  1. DMEM + 글루타민 (예, GlutaMAX) 헬러 세포 성장 매체 10% (v/v) 열 비활성화 태아 송아지 혈 청, 1% 페니실린과 스 보완.
  2. 6 잘 유리 하단 문화 접시 fibronectin (25 µ g/mL) 1 h 코트. 다음에 잘 당 2 × 104 셀 씨.
  3. 인수, 동안 매체를 3 일 마다 변경 합니다.
  4. 시간 경과 수집에 대 한 비디오 렌즈 무료 현미경 (상용)을 사용 합니다.
    참고: 이것은 근거한 전산 렌즈 무료 이미징 기술에 Ozcan 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 16 는 37 ° C12,15의 제어 온도에 인큐베이터에서 지속적인 모니터링을 수행 하도록 수정 되었습니다. 그것은 1.67 μ m의 픽셀 피치와 6.4 x 4.6 m m2의 이미징 영역 보완 금속 산화물 반도체 (CMOS) 이미지 센서를 갖추고 있습니다. 여러 파장 조명 장치에 의해 멀티 칩 빛 발광 다이오드 (Led), 빨강, 녹색 및 파랑 조명 제공 제공 됩니다. 파장은 중심, 636, 521, 452 nm 각각 25, 45, 25의 스펙트럼 대역폭으로 nm 각각. 빨강-녹색-파랑 (RGB) Led 세포에서 약 5 cm의 거리에서 150 µ m pinhole 위에 있습니다. 빛 전원 LED 주변 측정은 각 파장에 10 µW 낮은 이며 조명 시간 인수 당만 1 초. 따라서, 셀 문화는 렌즈 무료 비디오 현미경 관찰 사진 독성 문제가 예상 된다.
  5. 셀 문화 컨테이너 CMOS 센서 (그림 1)과 접촉을 넣어. 컨테이너를 사용 하 여 렌즈 무료 취득의 품질에 대 한 중요 한 맨 유리 coverslip로. 플라스틱 용기를 사용할 수 있습니다 하지만 렌즈 무료 취득 이러한 컨테이너의 광학 품질 때문에 타락 될 것 이다.
  6. 제어 비디오 렌즈 무료 현미경 수집 (상용) 소프트웨어와 함께 시간 경과 수집 및 홀로그램 재구성을 수행 합니다. 소프트웨어 인터페이스에서 사용자가 입력 해야 하는 매개 변수는 프레임 속도 실험, 세포 배양, 즉 부착 셀 또는 부동 셀의 종류의 기간.
  7. 수집 소프트웨어의 입력된 매개 변수를 설정 합니다. 1 수집 10 분 간격으로 설정 하 고 '부착' 셀 문화 유형을 설정 프레임 속도 설정 합니다.
    참고: 한 인수 10 분 마다의 프레임 속도 좋은 타협으로 안정적인 셀 추적 분석 결과 데이터 집합의 크기는 여전히 합리적인 보장. 빠른 프레임 속도이 현미경 렌즈 무료 설치와 함께 달성 한 인수 5 분 마다입니다. 과도 한 난방 문화에 있는 세포의 생존 능력에 영향을 미칠 수 있는 CMOS 센서의 결과 프레임 속도 더 증가.
  8. 시간 경과 수집을 시작 하 고 홀로그램 재구성 알고리즘 (상용) 세포 배양의 위상 이미지를 렌즈 무료 수집을 자동으로 처리 됩니다. 홀로그램 재구성 알고리즘 기반으로 다중 파장 위상 검색 알고리즘17 하며 RGB 재건된 단계 이미지의 범위에 [-π, π +] 29.4 m m2의 넓은 시야를 통해 각 단일 셀에 대 한. 밝히는 얇은 샘플 렌즈 무료 인라인 홀로 그래피의 원리는 (z = 0) (진폭 1 정규화 후)의 평면 파로 짧은 거리 z에 후속 회절 강도 이미지 CMOS 센서에 감지 하 고 = Z, 후 일반적으로 1 m m는 샘플입니다. 우리의 설정에서 조명 순차적으로 전환 3 파장 (λ1= 0.450 µ m 이다, λ20.540 µ m 이다, λ3= = 0.647 µ m) 동일한 샘플의 3 개의 회절 패턴 측정 하.

2. 세포 문화 데이터 분석

  1. 셀 추적용 Trackmate 알고리즘, 단일 입자18의 자동화 된 추적에 대 한 오픈 소스 피지 플러그인을 사용 합니다. 에 먼저, 피지 (부하 이미지 시퀀스 명령)에 전체 시간 경과 수집 로드. 일반적으로 400 RGB 프레임 29.7 Mb의 기능, 데이터 집합의 큰 크기 때문에 빠릅니다 8 비트 포맷에 그들을 로드. 다음 Trackmate 피지 플러그인 즉 셀 감지 단계, 셀 추적 단계 및 셀 탐지 및 계산된 트랙에 적용 되는 여러 필터 셀 추적 알고리즘의 여러 단계를 통해 사용자를 안내 합니다. 모든 단계에서 알고리즘을 구성 하 고 결과 표시 즉시를, 필요한 경우, 하나 쉽게 이동할 수 있습니다와 설정을 재조정. Trackmate 인터페이스의 다양 한 메뉴는 HeLa 세포 실험에 사용 된 실제 설정 함께 그림 2 에 표시 됩니다.
  2. ( 그림 2참조) 다음과 같은 수집 소프트웨어의 입력된 매개 변수를 설정 합니다. 15 픽셀, 15 픽셀 간격 닫기 최대 거리 및 3.5 트랙에 관광 명소의 수를 예상된 blob 직경 15 픽셀, 0.25 검출기 임계값, 연결 최대 거리를 설정 합니다.
    참고: 이러한 설정은 분명 다릅니다 한 실험에서 특히 '예상된 blob 직경' (1.67 μ m의 픽셀에 주어진 여기) 셀 크기에 해당 하는 다른. 같은 발언 '연결 최대 거리' 최대 거리에 대 한 계정 (1.67 μ m의 픽셀에 주어진 여기)의 연속 프레임 두 개 내 셀 여행에 적용 됩니다. 최적의 값 셀 운동에 뿐만 아니라 세포 밀도에 따라 것입니다.
  3. 셀 추적 과정의 끝에, 세 개의 텍스트 파일의 형태로 결과 생성 ('분석' 버튼을, 그림 2참조). 인수, 그들의 프레임 번호 및 트랙 번호에 그들의 각각 (x, y) 위치와 검색 된 모든 셀을 나열 하는 테이블 '트랙 통계의 관광 명소' 라는 가장 유용한 파일에 의하여 이루어져 있다. 이 데이터를 기준으로 셀 세분화를 수행 하 고 전용된 알고리즘 (보충 코드 파일 참조)를 사용 하 여 세포 분열을 감지. 두 개의 다른 파일 이름이 '트랙 통계에서 링크'와 '통계를 추적 하 는'와 트랙, 트랙 기간 예를 들면 , 감지 된 간격의 수를 취급 하는 모든 결과 포함, 초기 프레임, 등을 추적.
  4. 셀 분할 알고리즘을 사용 하 여 재건된 단계 이미지에서 셀 형태를 설명 하는 몇 가지 통계를 자동으로 추출 (참조 보충 코드 파일). 이러한 메트릭은 셀 표면적 (S), 세포 주 축 길이 (L), 셀 부 축 길이 (l)와 셀 가로 세로 비율 (L/l)입니다. 위상 현미경 렌즈 무료에서 발견 한 듯이15표본 층의 두께 밀도에 비례 이다.
  5. 세포의 형태학 적 기능 외에 재건된 단계13,,1920 에서 양적 셀 건조 질량 (CDM) 측정을 추출
    Equation 1식 (1)
    φ(x,y)는 재건된 단계 교대19, λ는 파장 및 α = 1.8 x 10-4 m3/k g 건조 질량1, 굴절률의 변화에 관련 된 특정 굴절률 19.
  6. 문화 매체의 굴절률 셀 사이의 차이의 추정을 사용 하 여 셀 간격을 평가 합니다. 셀 두께 h(x,y)와 측정 된 위상 변화 사이의 관계는20에 의해 주어진 다:
    Equation 2식 (2.1)
    Equation 3식 (2.2)
    Δn(x,y) = n셀 (x,y)- n매체 (x,y), 셀 및 문화 매체의 굴절률 차이. 다음, 가정 Δ의 상수 값n 0.025 =, HeLa 세포 핵에서 측정 하는 굴절률에서 추정 되는 (n = 1.35511) 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 문화 미디어의 (n = 1.33). 셀 간격 값은 가정에 기반으로 나타내는, 상대 유사 의미 하 고 나누어 셀을 검출 악용 될 수 있습니다.
  7. 전용된 알고리즘을 사용 하 여 측정 두께 8 µ m 보다 큰 세포가 세포 분열의 발생을 감지 하 여 다음 세포 분열을 탐지 하기 위해 검색 된 셀 사단에 관련 된 셀 트랙을 추출 (참조 보충 코드 파일) 먼저 식별 됩니다, 그리고 확인 여부는 새 셀에 밀접 하 게 나타납니다 공간 시간. 이 방법에서는, 세포 분열의 감지 두 강력한 조건에 의존합니다. 세포 분열 탐지를 위한 더 정교한 방법과 대안 lensfree 시간 경과 인수21,,2223에 적용할 수 있습니다.

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Representative Results

홀로그램 재건 과정에 대 한 가벼운 분야는 스칼라 필드 설명 (어디 Equation 4 샘플, 그리고 측면 위치에서 거리 z 에서 비행기에 A 의 복잡 한 값은 Equation 5 및 파장 λ에서). 빛의 전파 전파 커널 제공 하는 호이 겐 스-프레넬 이론에 의해 모델링 됩니다 Equation 6 . 따라서, 필드 진폭 검출기 비행기에서 z 다음 관계식에 의해 빛의 진폭 0 에 관련 되어:
Equation 7즉Equation 8
와 Equation 9 , 여기서 나 는 복잡 한 수 (내가2=-1)

강도 측정은 간단 하 게 모델링 Equation 10 . 재구성 알고리즘의 목적은 '좋은' 필드 A0는 회절 측정된 강도 일치 관찰된 샘플, 관련 된 찾을 수 나z. 진폭 필드 위상 검출기 비행기 φz 에서 고려 하는 전략은 알 수 없는 개체의 multispectral 총 변형 조건을 최적화 하 고 문제. 필드를 더 명시적으로 고려
Equation 11

Equation 12즉Equation 13
어떤 필드 φz, 단계에 대 한 Equation 14 부터 데이터를 완벽 하 게 일치 Equation 15 . 그래서 후속 필드 Equation 16 주어진 관찰된 강도 이미지 샘플 평면에서 가능한 진폭 필드입니다. 이것은 이유 왜 A0 에 조건 모든 데이터 일치 가능성 중에서 독특한 솔루션을 지정 하는. 최소화 하기 위해 기준으로 선정 되었다.
Equation 17
여기서 x와 y는 비행기에 대 한 좌표 즉 Equation 18 . 이러한 조건을 사용 하 여 모든 가능한 분야 중에서 모든 파장에 대 한 동일한 위치에 날카로운 모서리를 표시 하 여는 물리적으로 의미 있는 샘플 필드를 선택한 수 있습니다. 이 방법은 복원된 필드는 0에 ' 트윈 이미지 '의 발생을 줄일 수 있습니다. ' 트윈-이미지 ' 위상 정보 수집 과정의 부족에서 발생 하는 중요 한 유물 이다.

실용적인 계산에는 전체 공간 샘플링 검출기 해상도로 해당 분할은, 파생 상품 대신 소블 운영자 및 회선 Huygens 프레넬 전파에 의해 Equation 19 가 수행한 푸리에 공간에 있는 Equation 20 포함 된 간단한 식: Equation 21 . (진짜) 설정된 변수 관련 (진짜) 조건 ε의 최소화 Equation 22 비 선형 활용 그라데이션, 필요로 하는 메서드 각각에 대 한 각 감지기 화소와 관련 된 모든 단계에 대 한 계산을 ε의 그라디언트를 사용 하 여 태 클 파장입니다.

셀 재건/단계 unwrapping
그림 3 문화에 HeLa 세포의 시간 경과 수집의 한 프레임의 홀로그램 개조의 결과 보여 줍니다. 그림 3a 29.4 m m2 지역에 파랑 채널의 원시 취득의 보기의 전체 필드를 보여줍니다. 이 이미지와 빨강 및 녹색 채널에 인수 하는 것 들을 바탕으로, 홀로그램 재건 그림 3b 와 3c와 같이 셀의 RGB 단계 이미지를 생성 합니다. 재건된 단계 이미지 위상 시프트 초과 유도 셀 + π 해당 로컬 포장된 단계 유물을 전시 한다. 간단한 단계 unwrapping을 수행 하기 위해 우리 스스로 뜻을 구현, 즉 픽셀 값을 감지 Equation 23 0.3를 초과 하 고이를 픽셀 + π 설정. 이 간단한 방법은 RGB 재건 단계 이미지의 속성을 기반으로 합니다. 각 픽셀에 이론에서 우리는 비율을 측정 해야 한다 Equation 24 와 같은 Equation 25 . 하지만 mitotic 세포의 경우 단계 포장 발생 하면,이 관계는 더 이상 유지 RGB 재건된 단계 이미지 (그림 3 층)에서. 위에서 언급 한 추론 방법의 활용이 속성 간단한 임계 처리 단계 포장을 제시 하는 픽셀을 검색 하는 데 사용 될 수 있습니다. 풀기 전후 재건된 단계 이미지의 결과 그림 3 층 에 3 세대, 각각 표시 됩니다. 이러한 래핑되지 않은 단계 이미지는 다음 셀 추적 알고리즘으로 먹인 다. 이 unwrapping 단계 없이 셀 추적 알고리즘 셀을 검출 부 및 최종 결과 손상 할 것입니다 큰 두께의 셀에 실패 합니다. 재건된 단계 이미지의 해상도 상대적으로 거친 약 5 µ m15 (전체 피치 공간 해상도)을 것으로 추정 했다. 그것은 그럼에도 불구 하 고 lamellipodia 같은 세부 사항을 관찰 하 여 세포 세포질 (3 층 수치 및 3 세대). 가장 중요 한 것은, 렌즈 무료 현미경으로 얻은 이미지는 큰 대비를 표시 하 고 헤일로의 면제 되 다. 이 자동 셀 검출 및 추적 휴대 용이.

세포 문화 데이터 분석
세포 주기를 추출 하려면 추적, 일련의 다른 알고리즘에 의존 하는 데이터 분석, 즉 셀 Trackmate 피지 플러그인 함께 추적, 사단의 탐지 및 궁극적으로 세포의 추출 주기 트랙, 즉 에 두 세포 분열 사이 시퀀스입니다. 다음에 우리는 수동 측정에 비해이 알고리즘의 출력의 품질을 논의.

그림 4 는 셀 추적 결과, 셀 탐지 알고리즘의 결과 셀 추적 분석 결과의 다른 화면 캡처. 렌즈 무료 획득 (그림 4a-4 c)에서 세포의 탐지 셀 추적 알고리즘의 첫 번째 단계입니다. 셀 탐지 알고리즘의 유효성을 검사 하기 위해 우리가 주석 수동으로 시간 경과 렌즈 없는 수집 (214 프레임 663 x 663 µ m2의)의 작은 부분을 처리 됩니다. 우리는 수동으로 총 5365 셀 위치를 선택 하 고 그 Trackmate 피지 플러그인 하 여 얻은 이러한 결과 비교. 그림 5 는 진정한 탐지, 가양성 및 false 네거티브 결과 보여 줍니다. 결과 감도 약 96%와 99.7%로 긍정적인 예측 값입니다. 이러한 높은 값 렌즈 무료 비디오 현미경 설치 얻은 재건된 단계 이미지의 좋은 품질을 반영 합니다. 셀 검출 후 셀 세그먼트화 알고리즘 측정을 허용 한다-각 셀에 대 한-여러 다른 통계, 예를 들어 셀 영역 셀 건조 질량과 셀 두께. 그림 6a 세그먼트화 알고리즘의 원리를 묘사 하 고 ( 그림 5와 동일) 663 x 663 µ m2 의 관심 영역에 대 한 시간 시퀀스에 세그먼트 이미지 보여줍니다 6f 그림 . 임계 단계 이미지 처리에 의해 세분화를 시작 하는 알고리즘 ( 그림 6b참조) 그것은 시드 절차 적용 ( 그림 6 c참조). 즉 검색 된 셀의 중심의 픽셀 해당 트랙의 값으로 설정 됩니다. 셀 및 해당 트랙 번호의 X-Y 위치 셀 추적 후 얻은 '트랙 통계에서 관광 명소' 파일에 의해 제공 됩니다. 다음, 반복 충전 절차 초기 임계 처리 (그림 6b)에 의해 결정 씨 셀 (그림 6 c-e)의 경계를 확장 하는 구현 됩니다. 이 작성 절차는 수학 형태학, 예를 들어, 팽창과 침식에 기본 작업 의존합니다. 세분화 결과에서 다음 단일 셀 수준, 즉 형태학 셀 길이, 그리고 같은 기능 셀 영역 셀 화면 비율에서 여러 통계를 계산 있지만 셀에 따라 질량을 건조 하는 더 중요 한 것은, 또한, Eq. 1입니다. 렌즈 없는 현미경의 신뢰성 평가 측정 셀의 건조 질량, 우리가 디지털 홀로그램에 의하여 취득 하는 동일한 영역 고정된 HeLa 세포 (그림 6 g)의 재건된 단계 렌즈 무료 이미지 비교 5 X 목표 (그림 6 h) 현미경 검사 법. DHM 302에 대 한 측정 건조 질량의 기능 세그먼트 HeLa 세포 6i 그림 쇼 셀 건조 질량 측정 현미경 렌즈 무료의 의미. 2 측정 사이 좋은 상관 관계가 (결정 R2 의 계수는 0.86, 기울기 = 0.9, 오프셋 =-17 세). 그림 6i에서 우리는 렌즈 무료 현미경에 의하여 얻은 셀 건조 질량 측정의 정밀도 추정할 수 있다. 렌즈 없는 데이터와 선형 적합 사이 평균 제곱 오류 측정 정밀도 약 16 세.

전체 시간 경과 인수를 통해 모든 단일 셀 측정을 컴파일할 때 그건 다음 그림 7과 같이 시간의 함수로 여러 통계의 scatterplots를 얻을 수 있습니다. 이러한 scatterplots 경작된 한 세포의 활동에 매우 큰 인구에 정보를 제공합니다. 보기의 필드에 있는 셀의 수 15000 (그림 7a) 최대 2, 000에서 증가합니다. 시간 포인트, 2.2 x 10의 큰 데이터 집합에이 리드의 수를 곱한6 감지 셀 좌표 특징 그들 각각의 기능과 형태학, 즉 셀 건조 질량 (그림 7b), 셀 영역 (그림 7 c) 셀 평균 두께 (그림 7 d), 주요 축 길이 (그림 7e), 및 가로 세로 비율 (그림 7 층).

중요 한 것은, 셀 추적 및 셀 분할 알고리즘의 조합을 우리가 단일 세포 수준에서 활동을 측정 수 있습니다. 예를 들어, 그림 8 표시 셀의 분석 약 66 시간 지속 트랙과 T0 + 4.1 h, T0 + 20.5 h, T0 + 36.7 h와 T0 + 53.3 h. 4 셀 부문 전시 그림 8a 수 있는 자동 셀 세그먼트화 알고리즘의 결과 보여 줍니다. 우리에 게 윤곽을 그리 다 효율적으로이 세포의 표면에. 시간, 예를 들어 셀 표면 영역 (그림 8b)의 기능으로 여러 통계를 계산 하는 다음 셀 분할을 사용 하 여, 셀 건조 질량 (그림 8c), 셀 평균 두께 (그림 8 d)과 셀 운동 성 (그림 8e)입니다. 이 그래프에서 하나 명확 하 게 세포 분열 사이의 이러한 셀룰러 통계의 활동을 측정할 수 있습니다. 특히 하나 세포 주기 동안 셀 영역 및 건조 질량의 증가 관찰할 수 있다. 또한, 세포 분열의 자동 검색을 사용 하 여, 3 개의 다른 세포 주기 트랙에서에서 추출 수 있습니다이 트랙 그리고 세포 주기 기간 즉 2 개의 사단 사이 기간 추정 하실 수 있습니다. 3 세포 주기 기간 측정 그림 8에 표시 된 단일 셀 트랙, 즉 16.4 h, 16.2 h와 모든 세포 주기를 컴파일 16.7 h. 추적 2.7 일의 분석에서 16725 세포 분열의 탐지에 경과 수집 결과 10,584 세포 주기 트랙의 설명입니다. 그것은 다음 평균 및 세포 주기 기간 사운드 통계의 변화를 측정할 수입니다. 우리는 세포 주기 기간의 분포 가우스 분포 (그림 9a) 가까이 16.5 h의 의미와 12.4% (표준 편차 분포의 평균으로 나눈 가우스 피크에 측정의 상대 표준 편차는 발견 ). 평균 16.5 h의 시간을 두 배로 그림 8에 트랙에 수동으로 측정 하는 세포 주기 길이와 일치. 그러나 그것은 거짓말 헬러 게시 된 값의 더 낮은 범위에 있는 시간 두 배로 20 그리고 30 h24,25,,2627사이 보통 있다. 그러나, 참조28, 16.2 ± 1.7 h의 짧은 두 배로 시간은 또한 언급 했다. 더 우리의 측정 세포 주기 길이의 유효성을 검사 하 고 우리의 렌즈 무료 현미경 기술의 신뢰성을 확인, 우리는 100 셀 사이클 트랙 (10,148 셀 위치)의 수동 추적을 수행 했습니다. 셀에 수동으로 얻은 트랙 사이클 (N = 100) 측정 된 세포 주기 길이 16.7±1.9 h (N = 100, 그림 9b). 이것은 매우 가까운 16.5±2.1 h의 측정 (N = 10,584) 자동 셀 추적, 전체 분석의 타당성을 입증와 함께 얻은. 때 잘 측정 하는 사람에 게 상관은 궤적을 우리는 발견 세포 주기 트랙의 67% 성공적으로 검색 된 주기 길이 측정 자동으로 자동으로 결정 하는 세포 주기의 수동 추적 비교 수동으로 (그림 9b). 세포 주기 궤도의 검출 효율 150 셀/m m2아래 밀도에 실험의 첫 번째 32 시간에서 측정 했다. 이 탐지 레이트 분명히 시간, 감소 셀 밀도 ~ 500 세포/mm2증가. 검색 된 세포 주기 트랙의 수에 도달 T0 + 32 h (그림 9c) 고원 셀의 수는 여전히 증가 하는 동안 T0 + 32 h와 T0 + 72 h (그림 7a) 사이 3의 요인에 의해 합니다. 거짓 긍정 및 부정적인 탐지의 속도 고려 하면 그림 9b 선물 5 outliers 포인트: 4 그들의 틀린 부정적인 탐지는 (주기 길이 > 25 h)과 거짓인 긍정적인 탐지에 1 (주기 길이 < 10 h). 이 결과 얻으려면, 우리가 낮은 거짓 긍정적인 평가 부탁 하기 위해 세포 분열 탐지 알고리즘에서 두께 (8 µ m)에 높은 임계값을 사용 했습니다. 또한, 불일치 제시 트랙 밖으로, 즉 세포 주기는 기간 6 h 아래이 고 시간의 기능으로 선형으로 증가 하지 않는 건조 대용량 궤적 추적 필터링 된. 그들은 세포 주기 트랙의 총 수의 3 %입니다. 그 결과, 세포 주기 길이 자동으로 얻은의 분포는 거짓 것을 짧은 트랙 (세포 주기 길이 < 10 h, 트랙의 총 수의 5.1%)의 낮은 수를 가진 가우스 (그림 9a)에 의해 잘 근접 긍정적인 부분 탐지입니다. 마찬가지로, 트랙 표시 하는 것이 부분적으로 허위 부정적인 부문 탐지 결과, 긴 세포 주기는 또한 드문 (세포 주기 길이 > 25 h, 트랙의 총 수의 2.4%). 세포 주기 궤도의 수동 추적도 추가 플러그인으로 수행 하는 셀 추적을 평가 하기 위해 사용 되었다. 우리 6693 셀 일치 포인트에 있는 하나의 픽셀 피치 (1.67 μ m) 1.6 µ m의 전반적인 현지화 정확도 측정 했습니다.

다른 매개 변수 수 검사, (부) 후 셀 초기 건조 질량, (세포 분열), 직전 최종 건조 질량 세포 주기 동안 평균 성장 율 뿐만 아니라. 그림 9 d 시간의 기능으로 초기 및 최종 셀 건조 대 중을 플롯합니다. 그것은 모두 초기 및 최종 셀 건조 대 중 시간 감소를 보여준다. 초기 셀 건조 질량 130 세까지 223 pg에서 감소 하 고 마지막 셀 건조 질량 220 세까지 460 페이지에서의 중간 값입니다. 둘 사이의 비율 전체 실험 동안 1.89 ± 0.12에서 안정적으로 유지 (그림 9 d-e). 마지막으로, 그림 9 층 10,584 세포 주기 트랙 시간의 기능으로 셀 건조 대량 성장 속도의 진화를 보여줍니다 그리고 우리 세포 성장 율에 있는 감소가 특정 실험에 있는 전체 세포 인구에 대 한 일반적인 추세는 발견.

Figure 1
그림 1: 현미경 렌즈 무료. (한) 현미경 렌즈 무료 수집 설치의 회로도. (b) 6-웰 스 렌즈 무료 비디오의 그림으로 현미경 그것은 1.67 μ m의 픽셀 피치와 6.4 m m x 4.6 m m = 29.4 m m2의 이미징 영역 CMOS 이미지 센서를 사용합니다. 조명 샘플에서 약 5 cm의 거리에서 배치 pinhole 함께 멀티 컬러 RGB Led에 의해 제공 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: Trackmate 인터페이스. 헬러 세포에 사용 되는 실제 설정으로 표시 하는 플러그인의 주요 메뉴는 실험. 예상된 blob 직경 15 픽셀으로 설정, 검출기 임계값 0.25로 설정, 연결 최대 거리 15 픽셀으로 설정, 간격 닫기 최대 거리 15 픽셀으로 설정 했다 고 트랙에 반점의 수 3.5로 설정 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 홀로그램 재건 과정. (한) 현미경 렌즈 무료 (29.4 m m2의 전체 필드의 보기)를 통해 문화에 HeLa 세포의 원시 취득. 세부 사항 (b) (a). (b)의 (c) 세부 사항. (d) RGB 재건 단계 이미지 (29.4 m m2의 전체 필드의 보기). (d) (e) 세부. (f) (e)의 세부 사항. (g) 단계 이미지 풀기 전에 (f), 비교 하기 unwrapping 후 얻은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: Trackmate 피지 플러그인을 사용 하 여 수행 하는 셀 추적 결과의 화면 캡처. (한) 셀 검출 알고리즘 기반으로 가우스 (로그) 검출기의 Laplacian의 결과. 사진은 렌즈 무료 취득 T0 + 16h40min 2,451 셀 감지의 보기의 전체 필드를 보여줍니다. 후자는 보라색 원으로 둘러싸여 있다. (b) 셀 추적 알고리즘의 결과. 모든 셀 트랙 중간 속도에 해당 하는 색상 코드와 함께 50 개 이상의 프레임 (~ 8 시간)을 표시 됩니다. (c, d) 각각의 이미지 (a)와 (b) 상세한 (노란색 사각형). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 셀 추적 알고리즘의 셀 검출 단계의 유효성 검사. 어디 셀 선택 손으로 문화 (663 x 663 µ m2) (a) 헬러의 자른 이미지 셀 블루 십자가로 표시 되 고 셀 추적 알고리즘으로 감지 된 빨간 십자가로 표시 됩니다. 거짓인 긍정적인 탐지 (빨간색 원) 및을 false 네거티브 탐지 (주황색 원) 수 있습니다. (b) 진정한 탐지 (녹색 선), 허위의 확실성 (레드 라인) 및 false 네거티브 (오렌지) 검출 실험 시간의 기능으로 구성 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: 셀 분할의 결과. (한) Reconstructed 단계 이미지 T0 + 7 h (663 x 663 µ m2)에서 시간 경과 수집의 관심 영역입니다. (b) 알고리즘 임계 처리 단계 이미지 (c) 세분화 시드 절차, 즉, 검색 된 셀의 센터의 픽셀 해당 트랙의 값으로 설정 됩니다 시작 하 여 세분화를 시작 합니다. (d-e) 다음 하 고 반복적으로 작성 절차는 초기 시드 초기 임계 처리 (b)에 의해 결정 하는 셀의 경계를 확장 하는 구현 됩니다. (f) 세그먼트화 알고리즘의 결과 ( 그림 5와 동일) 663 x 663 µ m2 지역에 시간 시퀀스에 대 한 표시 됩니다. 세분화 재건된 단계 이미지 위에 겹쳐 색으로 표시 됩니다. 주로 핵 지역에서 오는 신호 렌즈 무료 및 세그먼트 영역 핵에 가까운가. (g) Reconstructed 단계 렌즈 무료 현미경 검사 법에 의해 얻은 HeLa 세포를 고정 시켰다. 29.4 m m2의 전체 시야의 자른된 이미지입니다. (h) 단계 (g)에 표시 된 영역의 이미지 디지털 홀로그램 현미경 5 X 목표 (NA 0.12) 647에 레이저로 조명 하 여 얻은 nm. (나) 대량 건조 질량 DHM에 의하여 측정의 기능으로 렌즈 무료 현미경에 의하여 얻은 건조 셀의 줄거리. scatterplot 302 셀 측정을 컴파일합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7: HeLa 세포의 2.7 일 경과 렌즈 없는 인수 데이터 분석. 셀의 개수 (a) 총 시간의 기능으로 29.4 m m2 의 전체 시야에 계산. 시간의 기능으로 (b) Scatterplot 건조 세포의 질량. 각 상자에 해당 6 시간 빈 하, 빨간 중앙 마크 중간, 나타내고 상자의 아래쪽 및 위쪽 가장자리 각각 25 그리고 75 백분위를 나타냅니다. 수염은 outliers를 고려 하지 않은 가장 극단적인 데이터 포인트를 확장 합니다. (c f) 셀의 Scatterplots 지역 (c), 셀 평균 두께 (d), 셀 주요 축 길이 (e)와 셀 가로 세로 비율 (f) 시간의 기능으로 세그먼트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 8
그림 8: 2.7 일 셀 궤적 (프레임 간격 10 분)의 데이터 분석. (한) 셀 분할 약 66 h 지속 셀 트랙의 시간 경과 수집에 수행. 관심의 셀은 파란색 오버레이 표시 됩니다. 각 자른된 이미지는 53 x 53 µ m2입니다. 셀 분할 노란 원형으로 표시 됩니다. (b) 시간의 기능으로 셀 영역에의 음모. 셀의 (c) 시간 진화 건조 설비 (1)에 따라 세그먼트 셀 영역 대량 단계 전체에서 계산. (d)의 평균 셀 두께 식 (2)에 따라 시간의 함수로 계산합니다. 셀 두께 셀 사단 (노란색 동그라미에 (a)와 붉은 라인 (b-c-d-e))에 해당 하는 날카로운 봉우리를 전시 한다. (e) 시간의 기능으로 세포 운동 성의 줄거리. (f) 세분화 결과 셀 밀도 약 475 셀/m m2때 마지막 트랙 T0 + 66h20min에서의 프레임에 해당 합니다. 이미지는 200 x 200 µ m2 의 셀을 중심으로. 화이트 패치 (붉은 별표) 세포 배양의 1 일 후 나타나는 세포 파편에 해당 합니다. (g) 800 x 800 µ m2 이 셀 트랙의 마지막 프레임의 재건된 단계 이미지를 잘립니다. 관심의 셀 노란색 동그라미에 의해 둘러싸여 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 9
그림 9: 세포 주기 분석. (한) 교양된 헬러의 2.7 일 관찰에 대 한 세포 주기 기간의 세포 (N = 10, 584 세포 주기). 세포 주기 기간의 분포는 평균 16.5 시간 및 12.3% (표준 편차 분포의 평균으로 나눈 가우스 피크 측정)의 상대 표준 편차와 가우스 가깝습니다. (b) 비교는 수동 및 자동 사이 세포의 세포 주기 길이 결정에 대 한 추적. 수동 추적 기능 100 세포 주기 궤도 (10,148 셀 위치). 자동으로 검색 된 세포 주기 궤도의 (c) 시작의 시간입니다. (d)는 측정된의 초기 셀 건조 (직후, 세포 분열, 검은 점) 질량 (직전, 세포 분열, 붉은 점) 마지막 셀 건조 질량 시간의 기능으로. 각 상자에 해당 6 h의 빈 하, 빨간 중앙 마크 중간, 나타내고 상자의 아래쪽 및 위쪽 가장자리 각각 25 그리고 75 백분위를 나타냅니다. 수염은 outliers를 고려 하지 않은 가장 극단적인 데이터 포인트를 확장 합니다. 초기 건조 질량의 기능으로 (e) Scatterplot 건조 최종 세포의 질량. (f) 실험 시간의 기능으로 셀 건조 대량 성장 속도의 진화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 파일 1: 코드 'segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m'. 이 Matlab 코드 'trackmate' 데이터 집합을 사용 하 여 수행 하는 복원된 단계 이미지는 'folder_out' 폴더에 저장 됩니다 전체 시간 경과 인수의 셀 분할. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 파일 2: 코드 'lineage_Version_Jove.m'. 이 코드 사용 하 여 배열 셀 세그먼트화 알고리즘 (segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m), 세포 주기 궤도 추출 하 고, 예의 다른 매개 변수를 결정 하 처리 ' trackmate'., 셀 사이클 기간, 초기 셀 대량 건조 하 고 마지막 셀 건조 질량. 이 코드는 두 부분으로, 세포 주기 궤도의 분석으로 나누어 세포의 두 번째 부분 검출 다루는 첫 번째 부분. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

이 문서에서 우리는 그 렌즈 무료 비디오 현미경 세포의 수천의 활동을 캡처 인큐베이터 안에 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 전반적인 방법론을 설명 하기 위해 우리는 어떻게 문화에 HeLa 세포의 2.7 일 경과 수집 표준 셀 추적 알고리즘으로 분석 될 수 있다 설명 했다. 2.2 x 106 셀 측정 및 10,584 세포 주기 트랙을 갖춘 데이터 집합입니다. 인수는 비교적 큰 셀 셀 거리 Hela 세포의 문화에 수행 (셀 밀도 < 500 세포/mm2) 세포 형태학 디스크 접근 될 수 있다. 이 두 기능은 같은 큰 데이터 집합을 수집 가능 하 게 하는 자동 셀 추적 분석의 응용 프로그램을 촉진 한다. 다른 셀 라인 작은 셀 셀 거리 또는 더 복잡 한 형태학 추적 하기 더 어려울 것 이다 고 후속 데이터 집합 더 작을 것 이다.

우리는이 이렇게 많은 연구, 예를 들어 세포 증식과 세포 크기 연구에 대 한 흥미로운 믿습니다. 후자는 기본적인 생물학 연구의 중요 한 영역 및 많은 질문이 대답 없 남아 있다 멋지게 Ginzberg 외. 여 리뷰에서 설명한 29.이 작품에서 제안 된 프로토콜 제공 따라서 중요 한 통계 수치를 측정 하는 수단 셀 확산 연구, 즉 세포 주기 기간에 필요한 셀 건조 질량, 주기와 셀의 시작과 끝 사이 셀 건조 대량 비율 마른 대량 성장 속도입니다. 세포 증식의 연구 외에도이 방법은 생산할 수 있는 많은 트랙, 몇 시간을 지속 한 이후 세포 이동의 연구에 대 한 관심의 있을 것입니다. 현재 프로토콜 10 h 동안 셀 트랙의 수천의 인수를 처음으로 시연 하 여 첨단14,30 넘어 갑니다.

결론적으로, 우리는 사용 하기 쉬운 렌즈 무료 기술 문화의 몇 일 동안 레이블 없는 세포의 수천을 동시에 추적할 수 있게 개발 했습니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

저자는 인정 하는 없다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cytonote lens-free video microscope  Iprasense
Horus acquisition software Iprasense
6-well glass bottom culture plates MatTek corporation Part No: P06G-0-14-F 
DMEM + GlutaMAX medium  Gibco
heat-inactivated fetal calf serum  Eurobio
penicillin and streptomycin  Gibco
Fibronectin  Sigma Aldrich
Matlab, image processing toolbox  Mathworks

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References

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