Summary
Lins-gratis video mikroskopi gör det möjligt för oss att övervaka cellkulturer direkt i inkubatorn. Här beskriver vi hela protokollet som används för att förvärva och analysera en 2.7 dagen lång förvärv av odlade HeLa celler, vilket leder till en datamängd 2,2 x 106 mätningar av enskilda cellmorfologi och 10584 cellcykeln spår.
Abstract
Här visar vi att linsen-gratis video mikroskopi gör det möjligt för oss att samtidigt fånga kineticsen av tusentals celler direkt inuti inkubatorn och att det är möjligt att övervaka och kvantifiera enstaka celler längs flera cell cykler. Vi beskriver hela protokollet som används för att övervaka och kvantifiera en HeLa cellkultur för 2,7 dagar. Först, cell kultur förvärv sker med lins-gratis video Mikroskop, och sedan data analyseras efter en process i fyra steg: flera våglängder holografisk återuppbyggnad, cell-tracking, cell segmentering och celldelning upptäckt algoritmer. Därför visar vi att det är möjligt att samla en datamängd med mer än 10.000 cellcykeln spår och mer än 2 x 106 cell morfologiska mätningar.
Introduction
Övervakning odlade däggdjursceller under flera cell cykler och mäta exakt Cellstorlek och cell torrvikt är en utmanande uppgift. Flera etikett-fria optiska tekniker kan utföra denna uppgift1,2: fasskiftande interferometri3, digital holografisk mikroskopi (DHM)4,5,6, 7, quadriwave laterala klippning interferometri8,9 och kvantitativa fas tomografi10,11. Dessa metoder har lett till många nya insikter i förståelsen av cellcykeln i däggdjursceller. Men de är sällan sammankopplade med automatisk cell tracking algoritmer och deras genomströmning förblir begränsad när man mäter cell massa banor1 (N < 20 respektive3,4,5 , 6). därför en ny optisk metod behövs för att mäta cell massa banor med stora statistik (N > 1000).
I detta papper visar vi kapaciteten hos lins-gratis video mikroskopi samtidigt bild tusentals celler direkt inuti inkubatorn och sedan kvantifiera enda cell mätvärden längs tusentals enskilda cellcykeln spår. Lins-fri mikroskopi är en kvantitativ fas bildteknik som gör förvärvet av fas bilden av tätt packade celler över ett mycket stort synfält (vanligtvis flera tiotals mm2, här 29,4 mm2)12,13 ,14,15. Flera mätvärden på enstaka cellnivå bestäms, t.ex., cell område, cell torrvikt, cell tjocklek, cell huvudaxeln längd och cell bildförhållande12,15, från varje bild. Sedan, genom att tillämpa en cell-spårning algoritm, dessa funktioner kan ritas för varje enskild cell som en funktion av de experiment tid14,15. Dessutom, genom att upptäcka förekomsten av celldelningar i cell spåren, är det möjligt att extrahera viktig information såsom den initiala cellen torr massa (strax efter celldelning), sista cell torrvikt (strax före celldelning) och cellen cykel längd, dvs, tiden mellan två på varandra följande divisioner15. Alla dessa mätningar kan beräknas med mycket bra statistik (N > 1000) eftersom det stora synfältet skulle vanligtvis möjliggör analys av 200 till 10.000 celler i ett enda objektiv-gratis förvärv.
För att förklara denna metod baserat på objektiv-gratis video mikroskopi, beskriver vi protokollet för att övervaka och kvantifiera en HeLa cellkultur för 2,7 dagar. Dataanalys är en process i fyra steg baserat på flera våglängder holografisk återuppbyggnad, cell-tracking, cell segmentering och celldelning algoritmer. Här är det visat att den rumsliga upplösningen och den relativt snabb bildhastighet (ett förvärv var 10 minut) erhålls med denna lins-gratis video mikroskopi setup är kompatibel med standard cell-tracking algoritmer. Den fullständiga analysen av denna dataset resulterar i mätningen av 10,584 cell spår över komplett cell cykler.
För att sammanfatta, är lins-gratis video mikroskopi ett kraftfullt verktyg automatiskt övervaka tusentals namnlösa, osynkroniserad och omodifierade celler per experiment; varje cell spåras över flera cell cykler. Våra mätningar ger därmed medelvärdet för flera cell parametrar, men ännu viktigare, mellan cell variationer över en stor population av celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cell kultur övervakning förvärv
- Växa HeLa celler DMEM + glutamin (t.ex., GlutaMAX) medium kompletteras med 10% (v/v) Värmeinaktiverade fostrets kalv serum och 1% penicillin och streptomycin.
- Coat 6-väl botten kultur glasplattor med Fibronektin (25 µg/mL) för 1 h. Sedan frö 2 x 104 celler per brunn.
- Under förvärv, ändra mediet efter 3 dagar.
- För time-lapse förvärvet, använda video objektiv-fri Mikroskop (kommersiellt tillgängligt).
Obs: Detta är baserat på den lins-fri computational bildteknik som beskrivs av Ozcan o.a. 16 som ändrades till utföra kontinuerlig övervakning i en inkubator vid en kontrollerad temperatur av 37 ° C12,15. Här finns en kompletterande metalloxid halvledare (CMOS) bild sensoren med en pixelstorlek på 1,67 µm och en tänkbar yta på 6,4 x 4.6 mm2. Flera våglängd belysning tillhandahålls av en multichip light emitting diod (LED) enhet, som ger röda, gröna och blå belysning. Våglängderna är centrerad, på 636, 521 och 452 nm respektive med en spektral bandbredd på 25, 45 och 25 nm respektive. Röd-grön-blå (RGB) lysdioderna finns ovanför en 150 µm hål på ett avstånd av ca 5 cm från cellerna. Ljus kraften mätt nära LED är så låg som 10 µW vid varje våglängd och belysning är bara en sekund per förvärv. Därför förväntas inga foto-toxicitet problem när cellkulturer observeras under mikroskopet lins-gratis video. - Placera behållaren cell kultur sätta i kontakt med CMOS-sensorn (figur 1). Använd en behållare med ett täckglas längst ner, vilket är viktigt för kvaliteten av förvärvet lins-fri. Plastförpackningar kan också användas men lins-fri förvärvet kommer att försämras på grund av den dåliga optiska kvaliteten på dessa behållare.
- Styr video objektiv-fri Mikroskop med programvaran förvärvet (kommersiellt tillgängligt), som utför både time-lapse förvärvet och holografiska återuppbyggnaden. De parametrar som måste anges av användaren i programvarugränssnitt är bildrutehastigheten, varaktigheten av experimentet, och vilken typ av cellkultur, dvs vidhäftande celler eller flytande celler.
- Ange indataparametrar av programvaran förvärvet. Ställa in bildhastigheten inställd på ett förvärv var 10 minut och ange cellen kultur 'anhängare'.
Obs: En bildhastighet av ett förvärv var 10 minut är en bra kompromiss eftersom det garanterar en tillförlitlig cell spårning medan storleken på den resulterande datamängden som ska analyseras är fortfarande rimligt. Den snabbaste hastigheten kan uppnås med denna lins-fri mikroskopi setup är ett förvärv var 5 minuter. Ytterligare öka ramhastigheten resulterar i överdriven uppvärmning av CMOS-sensorn som kan påverka lönsamheten för celler i kultur. - Starta time-lapse förvärvet och den holografiska återuppbyggnad algoritmen (kommersiellt tillgängligt) bearbetar automatiskt förvärvet lins-fri för att få fas bilden av cellkulturen. Holografisk återuppbyggnad algoritmen bygger på en flera våglängder fas hämtning algoritm17 och ger en RGB-rekonstruerade fas bild i intervallet [-π, + π] för varje enskild cell över ett stort synfält 29,4 mm2. Principen om lins-gratis i-line holografi är att belysa ett tunt prov (z = 0) med en plan våg (amplitud 1 efter normalisering) och upptäcka på en CMOS-sensor efterföljande diffraktion intensitet bilden på en kort sträcka z = Z, vanligtvis 1 mm efter den prov. I våra setup, belysningen är sekventiellt bytt till 3 våglängder (λ1= 0.450 µm, λ2= 0.540 µm, λ3= 0.647 µm) att mäta tre diffraktionsmönster av samma prov.
2. cellen kultur dataanalys
- För cell-tracking, använda Trackmate algoritm, en öppen källkod Fiji plugin för automatisk spårning av enstaka partiklar18. At först, Ladda fullt time-lapse förvärvet in i Fiji (kommandot Läs in bild sekvens). På grund av storleken på de datamängder, vilken dragen typiskt 400 RGB ramar 29,7 MB, går det snabbare att ladda dem i 8-bitars format. Nästa vägleder Trackmate Fiji plugin användaren genom flera etapper av cell-spårning algoritmen, nämligen en upptäckt cellstadie, en cell tracker scen och flera filter tillämpas på cell upptäckterna och de beräknade spår. I varje skede, konfigurera algoritmer och visa resultatet omedelbart så att, om det behövs kan man enkelt navigera fram och tillbaka för att justera inställningarna. De olika menyerna av gränssnittet Trackmate visas i figur 2 med riktiga inställningarna som används för HeLa celler experimentet.
- Ange indataparametrar av programvaran förvärvet som följande (se figur 2). Ställa in uppskattade blob diametern till 15 pixlar, detektor tröskeln till 0,25, länka maxavståndet 15 pixlar, gap-stängning max avståndet till 15 pixlar och antalet ställen i spår till 3.5.
Obs: Dessa inställningar varierar naturligtvis från ett experiment till en annan, särskilt 'uppskattade blob diametern' som motsvarar Cellstorlek (här anges i pixlar på 1,67 µm). Samma kommentar gäller 'länka max vägsträcka' som står för det största avståndet som en cell inom två bildrutor (här anges i pixlar på 1,67 µm). Sitt optimala värde skulle bero på cell motilitet men också på cell densiteten. - I slutet av processen cell-tracking, genererar resultat i form av tre textfiler ('Analys' knappen, se figur 2). Mest användbara filen, som heter 'Ställen i spår statistik', består av en tabell över alla identifierade celler med sina respektive (x, y) positioner i förvärvet, deras bildrutenummer och deras spårnummer. På grundval av dessa data, utföra cell segmentering och upptäcka celldelningar med dedikerad algoritmer (se kompletterande koden filer). Två andra filerna heter 'Länkar i spår statistik' och 'Spåra statistik' och omfatta alla resultat arbetar med spår, e.g. spår varaktigheter, antal upptäckta luckor, spåra inledande ram, etc.
- Använd cellen segmentering algoritmen (se kompletterande kodfil) att automatiskt extrahera flera mätetal som beskriver cellmorfologi från rekonstruerade fas bilden. Dessa mått är den cell yta (S), cell huvudaxeln längden (L), cell lillaxeln längden (l) och cell bildförhållande (L/l). Den fasen som återhämtat sig från lins-fri mikroskopi är proportionell mot densiteten och tjocklek av lagrets exemplaret som tidigare diskuterats15.
- Förutom de morfologiska funktionerna i cellen, extrahera kvantitativ cell torr massa (CDM) mätningar från rekonstruerade fas13,19,20
Ekv (1)
där φ(x,y) är rekonstruerade fas Skift19, λ våglängden och α = 1,8 x 10-4 m3/kg specifik brytningsindex som rör variationen av brytningsindex torka massa1, 19. - Utvärdera cell tjocklek med en uppskattning av skillnaden mellan cell brytningsindex och kultur media. Relationen mellan cell tjocklek h(x,y) och uppmätta fasförskjutning fås genom20:
Ekv (2,1)
Ekv (2,2)
med Δn(x,y) = ncell (x,y) - nmedium (x,y), brytningsindex skillnaden mellan cellen och kultur media. I följande förutsätter ett konstant värde på Δn = 0,025, som beräknas från brytningsindex mätt i HeLa cellkärna (n = 1.35511) och fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kultur media (n = 1,33). Även om tjockleken cellvärdet är endast vägledande eftersom den baseras på ett antagande, dess relativa variationer är meningsfulla och kan utnyttjas för att upptäcka delande celler. - Använda den dedikerade algoritmen (se kompletterande kodfil) för att upptäcka förekomsten av celldelningar och sedan extrahera cell spår som är kopplade till de upptäckta celldelningarna, för att upptäcka en celldelning, celler med en uppmätt tjocklek större än 8 µm identifieras först, och sedan kontrollera om en ny cell visas nära i utrymme och tid. På så sätt bygger upptäckt av celldelningar på två robusta kriterier. Alternativa och mer genomarbetade metoder för celldelning detektion kan tillämpas på den lensfree time-lapse förvärv21,22,23.
Ekv (1)
Ekv (2,1)
Ekv (2,2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För holografisk återuppbyggnadsprocessen, fältet ljus beskrivs av en scalar sätter in en (där 
är komplexa värdet av A på planet på avstånd z från prov, och lateral position 
och vid våglängden λ). Ljus förökning är modellerad av Huygens-Fresnel teorin som ger en propagator kärna 
. Därför fältet amplituden på detektorn planet, ettz är relaterad till ljus amplituden 0 av följande förhållande:
dvs.
med 
, där jag är det komplexa talet (jag2=-1)
Intensitet mätningen är helt enkelt modellerad av 
. Syftet med rekonstruktionen algoritmen är att hitta ett 'bra' fält A0, relaterade till observerade provet, som diffraktion skulle matcha uppmätta intensiteten jagz. Strategin är att överväga den amplitud fält fasen på detektorn planet φz lika okänd av problemet och för att optimera en Multispektrala totala variationen kriterium för objektet. Mer explicit, med tanke på fälten
dvs.
för någon fas fält φz, 
perfekt matchar data sedan 
. Så att fältet efterföljande 
är ett möjligt amplitud fält i provet planet, med tanke på den observerade intensitet bilden. Detta är anledningen till varför ett kriterium på A0 används för att ange en unik lösning bland alla data-matchande möjligheter. Kriteriet att minimera valdes:
där x och y är koordinaterna för planet, dvs 
. Med ett sådant kriterium kan välja, bland alla möjliga fält, ett prov fält visar skarpa kanter på samma position för alla våglängder, vilket är fysiskt meningsfull. Denna metod minskar förekomsten av 'twin-bilder' i fältet rekonstruerade 0. 'Twin-bild' är en viktig artefakt som resulterar från en brist på fas information under förvärvsprocessen.
För praktiska uträkningen, integraler är discretized med en rumslig provtagning motsvarande detektor resolutionen, derivat ersättas med Sobel operatörer och vindlingar genom den Huygens-Fresnel propagator 
utförs genom att gå till Fourier utrymme där 
har ett enkelt uttryck: 
. Minimering av den (real) kriteriet ε avseende variablerna (verkliga) set 
bekämpas med hjälp av icke-linjära konjugerad gradient metoden, vilket kräver gradient ε ska beräknas för varje fas som är associerad med varje detektor pixlar för varje våglängd.
Cell återuppbyggnadsfasen/uppackning
Figur 3 visar resultaten av holografiska återuppbyggnaden av en bildruta i en time-lapse förvärv av HeLa celler i kultur. Figur 3a visar hela synfältet för en rå förvärv i den blå kanalen på en 29,4 mm2 -område. Baserat på denna bild och de förvärvade i de röda och gröna kanalerna, producerar holografisk återuppbyggnaden en RGB-fas bild av celler som visas i siffror 3b och 3 c. Rekonstruerade fas bilden uppvisar lokalt förpackade fas artefakter motsvarande celler som inducerar en fas Skift överstiger + π. För att utföra en enkel fas uppackning, vi genomfört en heuristisk menar, nämligen vi upptäcka pixlar med värdet 
överstiger 0,3 och ställa dessa pixlar till + π. Den här enkla metoden är baserat på en egenskap av RGB rekonstruerade fas bilderna. I teorin på varje pixel ska vi mäta förhållandet 
lika med 
. Men när det gäller mitotiska cell, när fas inslagning uppstår, detta förhållande inte längre upprätthålls i RGB rekonstruerade fas bilden (figur 3f). Ovan nämnda heuristisk metod tar fördel av denna egendom, så att ett enkelt tröskelvärde kan användas för att upptäcka de pixlar som presenterar fas inslagning. Resultaten av rekonstruerade fas bilden före och efter uppackning visas i siffror 3f och 3 g, respektive. Bilderna oförpackade fas matas sedan in cell-spårning algoritmen. Utan detta uppackning steg, skulle cell-spårning algoritmen misslyckas att upptäcka celler i delning och celler stor tjocklek, vilket skulle äventyra de slutliga resultaten. Upplösningen på den rekonstruerade fas uppskattades till ca 5 µm15 (full-pitch rumslig upplösning), vilket är relativt grova. Det är ändå möjligt att observera detaljer såsom lamellipodia och cell cytoplasman (siffror 3f och 3 g). Viktigast av allt, bilden erhålls genom linsen-fri mikroskopi visar en stor kontrast och är undantagna av halo artefakter. Detta underlättar automatisk cell upptäckt och cell-spårning.
Cell kultur dataanalys
Att extrahera cellen cyklar spårar, dataanalys är beroende av en rad olika algoritmer, nämligen cellen spårning utförs med Trackmate Fiji plugin, detektion av divisioner och slutligen utvinning av cell cykelbana, dvs den sekvens mellan två celldelningar. I det följande diskuterar vi kvaliteten på resultaten av dessa algoritmer jämfört med manuella mätningar.
Figur 4 visar olika skärmbilder av cell-spårning resultat, resultaten av den cell upptäckt algoritmen och resultaten av den cell-tracking-analysen. Påvisande av celler i lins-fri förvärvet (figurerna 4a-4 c) är det första steget av cell-spårning algoritmen. För att validera den cell upptäckt algoritmen, kommenterade vi manuellt en liten del av time-lapse lins-fri förvärvet (214 bilder av 663 x 663 µm2). Vi valt totalt 5365 cell positioner och jämfört resultaten med de som erhålls av Trackmate Fiji plugin manuellt. Figur 5 visar resultaten vad gäller sann upptäckt, falska positiva och falska negativa. Resulterande känsligheten är ca 96% och det positiva prediktiva värdet lika stor som 99,7%. Dessa höga värden avspeglar den goda kvaliteten på rekonstruerade fas bilder tagna med objektivet-gratis video mikroskopi setup. Efter cell upptäckt, en cell segmentering algoritm gör det möjligt för att mäta — för varje cell — flera olika variabler, t.ex. området cellen cellen torr massa och cell tjocklek. Figur 6a skildrar principen om segmentering algoritmen och räkna 6f visar segmenterade bilder i en tidssekvens för en region av intresserar av 663 x 663 µm2 (samma som bild 5). Algoritmen initierar segmentering av tröskelvärde fas bilden (se figur 6b) och då det gäller en sådd förfarande (se figur 6 c). Nämligen anges pixel i mitten av de upptäckta cellerna till värdet för motsvarande spår. X-Y positionerna för cellerna och deras motsvarande spårnummer tillhandahålls av filen 'Ställen i spår statistik' erhålls efter cell tracking. Sedan genomförs en iterativ fyllning förfarande som sträcker sig från frö till gränserna för cellen (figur 6 c-e) avgörs av de inledande tröskelvärde (figur 6b). Proceduren fyllning är beroende av basfunktioner i matematisk morfologi, exempelvis dilatation och erosion. Från segmentering resultatet, är det sedan möjligt att beräkna flera mätvärden på enstaka cellnivå, dvs morfologiska egenskaper som cellen längd, området cell och cell proportionerna, men också viktigare, cellen torr massa enligt Ekv 1. För att bedöma tillförlitligheten hos lins-fri microscopyen mätning av cellen torr massa, vi har jämfört objektivet-fri rekonstruerade fas bilden av fasta HeLa cells (figur 6 g) med samma region förvärvats genom en digital holografiska mikroskopi med ett 5 X-objektiv (figur 6 h). Figur 6i visar cellen torr massa mätt med medelvärdet av lins-fri mikroskopi som en funktion av torrvikt mätt med DHM för 302 segmenterad HeLa cells. Det finns en god korrelation mellan de två mätningarna (bestämning R2 är 0,86, lutning = 0,9, offset =-17 pg). Från figur 6i, kan vi uppskatta precisionen i cell torr massa mätning erhålls genom linsen-fri mikroskopi. Precision, mätt som mean square felet mellan objektiv-fri data och linjär passformen, är ca 16 pg.
När sammanställa alla enda cell mätningar över full time-lapse förvärvet, är det då möjligt att få scatterplots flera mätvärden som funktion av tiden som visas i figur 7. Dessa scatterplots ger information om kinetiken för de odlade cellerna över en mycket stor population. Antalet celler i synfältet ökar från 2 000 upp till 15,000 (figur 7a). Multiplicerat med antalet tidpunkter, detta leder till en stor datamängd 2,2 x 10 upptäcks6 celler, var och en av dem kännetecknas av dess koordinater och morfologiska egenskaper, dvs cell torrvikt (figur 7b), cell-området (figur 7 c) , cell genomsnittliga tjockleken (figur 7 d), större Axel Längd (figur 7e) och bildförhållande (figur 7f).
Ännu viktigare, kombinationen av cell tracking och cell segmentering algoritmer ger oss möjlighet att mäta kinetik på enstaka cellnivå. Som ett exempel visar figur 8 analysen av en cell spåra varar cirka 66 timmar och figur 8a uppvisar fyra celldelningarna T0 + 4.1 h, T0 + 20,5 h, T0 + 36,7 h och T0 + 53,3 h. och visa resultaten av den automatiska cell segmentering algoritm som gör att oss att avgränsa effektivt ytan på denna cell. Använda cell segmentering, är det sedan möjligt att beräkna flera mätvärden som funktion av tiden, e.g. cell ytan (figur 8b), cellen torr massa (figur 8 c), den genomsnittliga tjockleken för cellen (figur 8 d) och cellen motilitet (figur 8e). Från dessa grafer, kan man tydligt mäta kineticsen av dessa cellulära mätvärden mellan celldelningar. I synnerhet kan en Observera ökningen av cell området och torr massa under en cell cykel. Dessutom använder automatisk identifiering av celldelningar, tre olika cellcykeln spår kan extraheras från denna låt och cellcykelns längd, dvs perioden mellan två divisioner, kan uppskattas. På enstaka cell spår visas i figur 8, vi mätt tre cellcykeln varaktigheter, nämligen 16,4 h, 16,2 h och 16,7 h. sammanställa alla cellcykeln spår från analysen av en 2,7 dagar time-lapse förvärvet resultat för detektion av 16725 celldelningar och Beskrivning av 10,584 cellcykeln spår. Det är sedan möjligt att mäta medelvärdet och variabilityen av cellcykelns längd med ljud statistik. Vi fann att fördelningen av cellcykelns längd är nära Gaussisk fördelning (figur 9a) med ett medelvärde på 16,5 h, och en relativ standardavvikelse på 12,4% (standardavvikelse mätt på Gaussisk topp dividerat med medelvärdet av fördelningen ). Den genomsnittliga fördubbling tid 16,5 h är förenligt med cellcykeln längderna mätt manuellt på banan presenteras i figur 8. Det ligger emellertid i det lägre spänner av publicerade värden för HeLa fördubbling tid som är vanligtvis mellan 20 och 30 h24,25,26,27. Dock i referens28nämns en kort fördubbling tid på 16,2 ± 1.7 h också. För att ytterligare verifiera våra mätningar av cellcykelns längd och bekräfta tillförlitligheten i vår lins-fri mikroskopi teknik, har vi utfört en manuell spårning av 100 cellcykeln spår (10,148 cell positioner). På cellen cykelbana framställs manuellt (N = 100) uppmätt cellcykelns längd är 16.7±1.9 h (N = 100, figur 9b). Detta är mycket nära mätning av 16.5±2.1 h (N = 10,584) erhålls med cellen automatisk spårning, visar den övergripande analysen giltighet. När man jämför Manuell spårning av cellcykeln banor till en bestäms automatiskt, Vi hittade att 67% av cellcykeln spåren upptäcktes framgångsrikt och att cykellängder mäts automatiskt är väl korrelerade med de uppmätta manuellt (bild 9b). Cellcykeln trajectoriesen upptäckt effektivitet mättes i de första 32 timmarna av experimentet, på en densitet under 150 celler/mm2. Den här upptäckten hastighet uppenbarligen minskar med tiden, som cellen densiteten ökar upp ~ 500 celler/mm2. Antalet upptäckta cellcykeln spår når en platå vid T0 + 32 h (figur 9 c) medan antalet celler fortfarande ökar med en faktor tre mellan T0 + 32 h och T0 + 72 h (figur 7a). Med tanke på andelen falskt positiva och negativa upptäckter, figur 9b presenterar 5 extremvärden punkter: 4 av dem är på grund av negativa falsklarm (cykel längd > 25 h) och 1 till en falsk positiv identifiering (cykel längd < 10 h). För att uppnå detta resultat, har vi använt en hög tröskel på tjocklek (8 µm) i celldelning upptäckt algoritm, för att gynna en låg falsk positiv ränta. Dessutom spår presentera inkonsekvens har filtrerats ut, dvs cellcykeln som varaktighet understiger 6 h och spår med en torr massa bana som inte ökar linjärt som funktion av tiden. De är endast 3% av det totala antalet cellcykeln spår. Som ett resultat, är fördelningen av cellcykelns längd erhålls automatiskt väl uppskattade av en Gaussian (figur 9a) med ett lågt antal kort spår (cellcykelns längd < 10 h, 5,1% av det totala antalet spår) som skulle leda från false positiv division upptäckter. Spåren visar en lång cellcykeln, som skulle delvis resultat från falska negativa division upptäckter, är likaså också sällsynta (cellcykelns längd > 25 h, 2,4% av det totala antalet spår). Manuell spårning av cellcykeln trajectoriesen användes också att ytterligare bedöma cell spårningen utförs med plugin. Vi har mätt på 6693 celler en övergripande lokalisering noggrannhet på 1,6 µm på matchande punkter, som ligger inom en pixelstorlek (1,67 µm).
Andra parametrar kan undersökas, såsom cell inledande torrvikt (strax efter en division), slutliga torrvikt (strax före en celldelning), för såväl den genomsnittliga tillväxttakten under cellcykeln. Figur 9 d tomter inledande och avslutande cell torr massorna som funktion av tiden. Det visar att både initiala och finala cell torra massan minskar med tiden. Medianvärdet för den initiala cellen torr massa minskar från 223 pg ned till 130 pg och den sista cellen torr massa från 460 pg ner till 220 pg. Förhållandet mellan två förblir stabil på 1,89 ± 0,12 under hela experimentet (figur 9 d-e). Slutligen, figur 9f visar utvecklingen av cell torr massa tillväxttakten som funktion av tiden över 10,584 cellen cyklar spårar och vi fann att minskningen i cell tillväxttakt är en vanlig trend för hela cellen befolkningen i detta särskilda experiment.
Figur 1: objektiv-fri mikroskopi. (en) Schematisk bild av inställningen lins-fri mikroskopi förvärv. (b), bild 6-wells lins-gratis video Mikroskop. Det använder en CMOS-bildsensor med en pixelstorlek på 1,67 µm och en tänkbar yta på 6,4 mm x 4,6 mm = 29,4 mm2. Belysning tillhandahålls av en multi-färgade RGB LED tillsammans med ett hål som placeras på ett avstånd av ca 5 cm från provet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Trackmate gränssnitt. Huvudmenyerna av plugin visas med faktiska inställningarna som används för HeLa cellen experimentera. Uppskattade blob diameter var satt till 15 pixlar, detektor tröskeln var inställd på 0,25, länka maxavståndet var satt till 15 pixlar, gap-stängning max avståndet var satt till 15 pixlar och antalet ställen i spår var satt till 3,5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: holografisk återuppbyggnadsprocessen. (en) Raw förvärv av HeLa celler i kulturen genom linsen-fri mikroskopi (fullt synfält med 29,4 mm2). (b) detalj av (a). (c) detalj av (b). (d), RGB rekonstruerade fas bilden (fullt synfält med 29,4 mm2). (e) detalj av (d). (f) detalj av (e). (g) fas bild erhålls efter fas uppackning för att jämföras med f, innan uppackning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: skärmdumpar av cell-spårning resultat utförs med insticksmodulen Trackmate Fiji. (en) resultaten av den cell upptäckt algoritm som är baserad på en Laplacian av Gaussisk (LoG) detektor. Bilden visar hela synfältet av förvärvet lins-fri vid T0 + 16h40min där 2 451 celler upptäcks. Den senare är omgiven med en lila cirkel. (b) resultaten av cell-spårning algoritmen. Alla cell spår visas över 50 bildrutor (~ 8 timmar) med en färgkod som motsvarar medianen hastigheten. (c, d) Detaljerad bild av (a) och (b) respektive (gul rektangel). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: validering av cell upptäckt scenen av cell-spårning algoritmen. (en) beskurna bilden av HeLa celler i kultur (663 x 663 µm2) där cellen valts för hand är markerade med blått kors och de upptäcks med cell-spårning algoritmen är markerade med rött kors. Detta möjliggör bestämning av falskt positiva upptäcka (röd cirkel) och falska negativa upptäckter (orangefärgade cirkeln). (b) graden av sann upptäckt (gröna linjen), falskt positiva (röda linjen) och falskt negativa (orange) upptäckt ritas som en funktion av experiment tiden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: resultaten av cell segmenteringen. (en) Reconstructed fas bild av en region av intresse av förvärvet time-lapse T0 + 7 h (663 x 663 µm2). (b) algoritmen initierar segmentering av tröskelvärde fas bilden (c), segmentering börjar med en sådd förfarande, dvs pixel i centrum av de upptäckta cellerna är inställd på värdet av motsvarande spår. (d-e) Nästa och iterativt genomförs en fyllning förfarande som utökar den ursprungliga sådd avgränsningar till cellen avgörs av de inledande tröskelvärde (b). (f) visas resultatet av segmentering algoritmen för en tidssekvens på en 663 x 663 region µm2 (samma som bild 5). Segmenteringen visas som en färgad yta överlagras ovanpå rekonstruerade fas bilden. Observera att linsen-fri signalen huvudsakligen kommer från regionen kärnkraft, och de segmenterade områdena faller nära kärnan. (g), Reconstructed fasen erhålls genom linsen-fri mikroskopi i fast HeLa cells. Detta är en beskuren bild av hela synfältet av 29,4 mm2. (h), fas bilden av regionen visas i (g) erhålls genom digitala holografisk mikroskopi med ett 5 X-objektiv (NA 0.12) belyst med laser på 647 nm. (jag) tomt på cellen torr massa erhålls genom linsen-fri mikroskopi som en funktion av torrvikt mätas med hjälp av DHMEN. Spridningsdiagram sammanställer 302 celler mätningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: dataanalys av en 2,7-dag lins-fri time-lapse förvärv av HeLa cells. (en) totalt antal celler räknas i hela synfältet av 29,4 mm2 som funktion av tiden. (b), spridningsdiagram cellens torr massa som funktion av tid. På varje ruta motsvarar en lagerplats på 6 timmar, röd central märket anger medianen och botten och toppen kanterna på rutan anger 25: e och 75: e percentilerna, respektive. Morrhåren förlänga till de mest extrema datapunkter som inte anses vara avvikare. (c-f) Scatterplots cellens segmenterad område (c), den genomsnittliga tjockleken för cell (d), cell huvudaxeln längd (e) och cell bildförhållande (f) som en funktion av tiden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: dataanalys av en 2.7 dag cell bana (10 min ram intervall). (en) Cell segmentering utförs på time-lapse förvärvet av ett cell-spår som varar cirka 66 h. Cellen av intresse visas med en blå overlay. Varje beskurna bilden är 53 x 53 µm2. Divisionerna cell visas med gula cirklar. (b) handlingen i området cell som en funktion av tiden. (c) tidsutvecklingen av cellen torr massa beräknad från integralen av fasen över området segmenterade cell enligt ekv (1). (d), tomt på genomsnittet cellen tjocklek beräknas som en funktion av tiden enligt ekv (2). Cell tjocklek uppvisar skarpa toppar motsvarar celldelningar (gula cirklar i (a) och röda linjerna i b-c-d-e). (e) handlingen i den cellen motiliteten som funktion av tiden. (f), segmentering resultat motsvarande till den sista bildrutan i spåret på T0 + 66h20min när cell densiteten är cirka 475 celler/mm2. Bilden är 200 x 200 µm2 centrerad på cellen av intresse. Vita fläckar (röda asterisker) motsvarar cellfragment som visas efter en dag i cellkultur. (g), 800 x 800 µm2 beskurna rekonstruerade fas bilden av den sista bildrutan i denna cell spår. Cellen i intresse omges av en gul cirkel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: cellcykeln analys. (en) Distribution av cellcykelns längd för en 2,7-dagars observation av odlade HeLa celler (N = 10, 584 cell cykler). Fördelningen av cellcykelns längd är nära en Gaussisk med ett medelvärde på 16,5 timmar och en relativ standardavvikelse på 12,3% (standardavvikelse mätt på Gaussisk topp dividerat med medelvärdet av fördelningen). (b) jämförelse mellan manuell och automatisk cell tracking för bestämning av cellcykelns längd. Manuell spårning har 100 cellcykeln banor (10,148 cell positioner). (c) fördelning av start tid automatiskt identifierade cellcykeln trajectoriesen. (d) handlingen i den uppmätta ursprungliga cellen torr massa (strax efter celldelning, svarta prickar) och sista cell torrvikt (strax före celldelning, röda prickar) som en funktion av tiden. På varje ruta motsvarar en lagerplats av 6 h, röd central märket anger medianen och botten och toppen kanterna på rutan anger 25: e och 75: e percentilerna, respektive. Morrhåren förlänga till de mest extrema datapunkter som inte anses vara avvikare. (e), spridningsdiagram sista cellens torr massa som funktion av inledande torrvikt. (f) Evolution av den cell torra massa tillväxten som en funktion av experiment tiden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil 1: kod 'segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m'. Denna Matlab-kod använder 'trackmate' datamängden för att utföra cell segmentering av komplett time-lapse förvärvet som rekonstruerade fas bilderna sparas i mappen 'folder_out'. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande fil 2: kod 'lineage_Version_Jove.m'. Denna kod använder matrisen 'trackmate' bearbetas med cell segmentering algoritmen (segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m), för att extrahera cellcykeln trajectoriesen och bestämma de olika parametrarna av intresse, t.ex., cellen cykelns duration, den initiala cellen torr massa och den sista cellen torr massa. Denna kod är i två delar, den första delen handlar om att upptäcka de delande cellerna och den andra delen med analysen av cellcykeln trajectoriesen. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta papper visar vi att linsen-gratis video mikroskopi kan användas inuti en inkubator för att fånga kineticsen av tusentals celler. För att beskriva den övergripande metoden förklarade vi hur en 2.7 dag time-lapse förvärv av HeLa celler i kultur kan analyseras med standard cell-tracking algoritmer. Resultatet är en datamängd med 2,2 x 106 cell mätningar och 10,584 cellcykeln spår. Förvärven utfördes på en kultur av Hela celler med ett relativt stort avstånd cell-till-cell (cell täthet < 500 celler/mm2) och cell morfologi som kan approximeras med en skiva. Dessa två funktioner underlätta tillämpningen av en automatisk cell-tracking-analys som gör det möjligt att samla sådan en stor datamängd. Andra cellinjer med mindre cell till cell avstånd eller mer komplexa morfologier skulle vara svårare att spåra och efterföljande datamängder skulle vara mindre.
Vi anser att detta synsätt är intressant för många studier, till exempel för cellproliferation och cellstudier storlek. Den senare är ett viktigt forskningsområde i grundläggande biologi och många frågor förblir obesvarade så fint diskuterade i en genomgång av Ginzberg et al. 29. protokollet föreslås i detta arbete innehåller således ett sätt att mäta viktiga mått som krävs för cell spridning studier, dvs cellcykelns längd, cell torrvikt, cell torr massa förhållandet mellan slutet och början av cykeln och cellen torr massa tillväxttakt. Förutom studien av cellproliferation, kommer att denna metod vara av intresse för studien av cellmigration, eftersom det kan producera ett stort antal spår, var och en varar flera timmar. Detta protokoll går utöver de toppmodern14,30 genom visar för första gången förvärvet av tusentals cellen spår under mer än 10 h.
Sammanfattningsvis har vi utvecklat en lätt-till-använda objektiv-fri teknik som gör det möjligt för att spåra samtidigt tusentals etikett-fria celler över flera dagar av kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna har ingenting att erkänna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytonote lens-free video microscope | Iprasense | ||
| Horus acquisition software | Iprasense | ||
| 6-well glass bottom culture plates | MatTek corporation | Part No: P06G-0-14-F | |
| DMEM + GlutaMAX medium | Gibco | ||
| heat-inactivated fetal calf serum | Eurobio | ||
| penicillin and streptomycin | Gibco | ||
| Fibronectin | Sigma Aldrich | ||
| Matlab, image processing toolbox | Mathworks |
References
- Zangle, T. A., Teitell, M. A. Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics. Nat Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).
- Popescu, G., Park, K., Mir, M., Bashir, R. New technologies for measuring single cell mass. Lab Chip. 14 (4), 646-652 (2014).
- Reed, J., et al. Rapid, massively parallel single-cell drug response measurements via live cell interferometry. Biophys J. 101 (5), 1025-1031 (2011).
- Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci. USA. 108 (32), 13124-13129 (2011).
- Girshovitz, P., Shaked, N. T. Generalized cell morphological parameters based on interferometric phase microscopy and their application to cell life cycle characterization. Biomed Opt Express. 3 (8), 1757-1773 (2012).
- Kemper, B., Bauwens, A., Vollmer, A., Ketelhut, S., Langehanenberg, P. Label-free quantitative cell division monitoring of endothelial cells by digital holographic microscopy. J Biomed Opt. 15 (3), (2010).
- Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PLoS One. 9 (2), 1-8 (2014).
- Bon, P., Savatier, J., Merlin, M., Wattellier, B., Monneret, S. Optical detection and measurement of living cell morphometric features with single-shot quantitative phase microscopy. J Biomed Opt. 17 (7), (2012).
- Aknoun, S., et al. Living cell dry mass measurement usinq quantitative phase imaging with quadriwave lateral shearing interferometry: an accuracy and sensitivity discussion. J Biomed Opt. 20 (1), 1-4 (2015).
- Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
- Choi, W., et al. Tomographic phase microscopy. Nat Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
- Kesavan, S. V., et al. High-throughput monitoring of major cell functions by means of lensfree video microscopy. Sci Rep. 4, 1-11 (2014).
- Zheng, G., Lee, S. A., Antebi, Y., Elowitz, M. B., Yang, C. The ePetri dish, an on-chip cell imaging platform based on subpixel perspective sweeping microscopy (SPSM). Proc Natl Acad Sci USA. 108 (41), 16889-16894 (2011).
- Pushkarsky, I., et al. Automated single-cell motility analysis on a chip using lensfree microscopy. Sci Rep. 4, 4717 (2014).
- Allier, C., et al. Imaging of dense cell cultures by multiwavelength lens-free video microscopy. Cytom Part A. 91 (5), 1-10 (2017).
- Su, T. -W., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. High-throughput lensfree imaging and characterization of a heterogeneous cell solution on a chip. Biotechnol Bioeng. 102 (3), 856-868 (2009).
- Delacroix, R., et al. Cerebrospinal fluid lens-free microscopy: a new tool for the laboratory diagnosis of meningitis. Sci Rep. 7, 39893 (2017).
- Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2016).
- Popescu, G. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).
- Liu, P. Y., et al. Cell refractive index for cell biology and disease diagnosis: past, present and future. Lab Chip. 16, 634-644 (2016).
- Rapoport, D. H., Becker, T., Mamlouk, A. M., Schicktanz, S., Kruse, C. A novel validation algorithm allows for automated cell tracking and the extraction of biologically meaningful parameters. PLoS One. 6 (11), e27315 (2011).
- Al-Kofahi, O., et al. Automated cell lineage construction: A rapid method to analyze clonal development established with murine neural progenitor cells. Cell Cycle. 5 (3), 327-335 (2006).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. Tracking in cell and developmental biology. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 894-902 (2009).
- Posakony, J. W., England, J. M., Attardi, G. Mitochondrial growth and division during the cell cycle in HeLa cells. J Cell Biol. 74 (2), 468-491 (1977).
- Zocchi, E., et al. Expression of CD38 Increases Intracellular Calcium Concentration and Reduces Doubling Time in HeLa and 3T3 Cells. J Biol Chem. 273 (14), 8017-8024 (1979).
- Reitzer, L. J., Wice, B. M., Kennell, D. Evidence that glutamine, not sugar, is the major energy source for cultured HeLa cells. J Biol Chem. 254 (8), 2669-2676 (1979).
- Benedetti, A. D. E., Joshi-barve, S., Rinker-Schaeffer, C., Rhoads, R. E. Expression of Antisense RNA against Initiation Factor eIF-4E mRNA in HeLa Cells Results in Lengthened Cell Division Times, Diminished Translation Rates, and Reduced Levels of Both eIF-4E and the p220 Component of eIF-4F. Mol Cell Biol. 11 (11), 5435-5445 (1991).
- Kumei, Y., Nakajima, T., Sato, A., Kamata, N., Enomoto, S. Reduction of G1 phase duration and enhancement of c-myc gene expression in HeLa cells at hypergravity. J Cell Sci. 93 (2), 221-226 (1989).
- Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. On being the right (cell) size. Science. 348 (6236), 1245075 (2015).
- Mathieu, E., et al. Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments. Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).
