Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Dinamik için objektif-ücretsiz Video mikroskobu ve kantitatif analiz yapisan hücre kültürü

Published: February 23, 2018 doi: 10.3791/56580
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 3,4, 3, 1, 1, 1, 5, 5, 4,6, 1
1CEA, LETI, DTBS, LISA, Université Grenoble Alpes, 2CEA, LETI, DTBS, LBAM, Université Grenoble Alpes, 3CEA, INSERM, BIG, Université Grenoble Alpes, 4CNRS, FR CNRS 3425, 5CNRS, UMR 144, Molecular Mechanisms of Intracellular Transport, PSL Research University, Institut Curie, 6TIMC-IMAG

Summary

Objektif-ücretsiz video mikroskobu hücre kültürleri doğrudan kuluçka makinesi içinde izlemek sağlar. Burada biz almak ve kültürlü HeLa hücreleri 2,7 gün uzun edinimi çözümlemek için kullanılan tam iletişim kuralı tanımlamak, 2.2 x 10 bir veri kümesi için önde gelen6 ölçümleri tek hücre morfolojisi ve 10584 hücre döngüsü izler.

Abstract

Burada, biz o objektif-ücretsiz video göstermek mikroskobu hücreleri doğrudan kuluçka makinesi içinde binlerce Kinetik aynı anda yakalamak için bize sağlar ve birkaç hücre döngüsü boyunca tek hücreleri ölçmek ve izlemek mümkündür. Biz 2,7 gün bir HeLa hücre kültürü ölçmek ve izlemek için kullanılan tam iletişim kuralı tanımlamak. İlk olarak, hücre kültürü edinme objektif-ücretsiz video mikroskopla gerçekleştirilir ve sonra verileri bir dört adımlı süreç aşağıdaki analiz edilir: Çoklu dalga boyu holografik yeniden yapılanma, hücre-izleme, hücre segmentasyon ve hücre bölünmesi algılama algoritmalar. Sonuç olarak, bir veri kümesi 10.000 hücre döngüsü parça ve 2 x 10'dan fazla6 hücre morfolojik ölçümler daha fazla featuring toplamak mümkün olduğunu gösteriyor.

Introduction

Boyut ve hücre hücre birkaç hücre döngüsü boyunca kültürlü memeli hücreleri izleme ve doğru ölçme kuru kütlesi olduğunu zor bir görev. Birkaç etiket içermeyen optik teknikleri bu görev1,2gerçekleştirmek edebiliyoruz: faz kayması Interferometry3, dijital holografik mikroskobu (DHM)4,5,6, 7, quadriwave yanal kesme Interferometry8,9 ve nicel faz tomografi10,11. Bu yöntemler memeli hücrelerinin hücre döngüsü anlayış içine birçok yeni anlayışlar açmıştır. Ancak nadiren algoritmaları izleme otomatik hücre ile birleştiğinde ve onların üretilen iş ne zaman ölçme sınırlı kalır kitle yörüngeleri1 hücre (N < 20 sırasıyla3,4,5 , 6). dolayısıyla bir roman optik yöntemi hücre kitle yörüngeleri büyük istatistikleri ile ölçmek için gereklidir (N > 1000).

Bu yazıda, biz aynı anda hücreleri doğrudan kuluçka makinesi içinde binlerce resim ve tek hücre ölçümleri tek hücre döngüsü parça binlerce boyunca ölçmek için objektif-ücretsiz video mikroskobu yeteneğini göstermek. Objektif-Alerjik mikroskobu mi nicel bir aşama aşama görüntü yoğun paketlenmiş hücre edinimi üzerinde görüş çok büyük bir alan sağlayan teknik görüntüleme (genellikle birkaç on mm2, burada 29.4 mm2)12,13 ,14,15. Tek hücre düzeyinde çeşitli ölçümler belirlenir, örneğin, hücre alanı, cep kuru kitle, hücre kalınlığı, hücre Binbaşı eksen uzunluğu ve en boy oranı12,15, her görüntü hücre. Sonra bir hücre izleme algoritma uygulayarak, bu özellikler tek her hücre için deneme süresi14,15bir fonksiyonu olarak çizilebilir. Ayrıca, hücre bölünmeler oluşumunu hücre parça olarak algılayarak, ilk hücre kuru kitle (hemen sonra hücre bölünmesi), son hücre kuru kitle (hemen önce hücre bölünmesi) ve hücre gibi diğer önemli bilgileri ayıklamak mümkün olduğunu döngüsü süresi, Yani, iki ardışık tümen15arasındaki süre. Bu ölçümler ile çok iyi istatistikler hesaplanabilir (N > 1000) geniş görüş alanı genellikle 200-10.000 hücreleri tek bir objektif-Alerjik kazanım analizi sağlayacak bu yana.

Objektif-ücretsiz video mikroskobu dayalı bu yöntemi açıklamak için protokolü için 2,7 gün bir HeLa hücre kültürü ölçmek ve izlemek için açıklar. Veri analizi çok dalga boyu holografik yeniden yapılanma, hücre izleme, hücre segmentasyon ve hücre bölünmesi algoritmaları dayalı dört adımlı bir işlemdir. Burada Standart hücre izleme algoritmaları ile uyumlu Uzaysal çözünürlük ve bu objektif-ücretsiz video mikroskobu Kur'a elde nispeten hızlı kare hızı (bir edinme her 10 dakikada bir) gösterilir. Bu veri kümesinin tam analiz tam hücre döngüsü 10,584 hücre parça ölçüm sonuçları.

Özet olarak, objektif-ücretsiz video mikroskobu otomatik olarak etiketlenmemiş, eşitlenmemiş binlerce ve deney başına değiştirilmemiş hücre izlemek için güçlü bir araçtır; birkaç hücre döngü üzerinde izlenen her hücre. Bizim ölçümleri böylece birkaç hücre parametreleri, ama daha da önemlisi, arası hücre değişkenlik hücrelerinin büyük bir nüfus üzerinden ortalama değerini sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hücre kültürü edinme izleme

  1. DMEM + (örneğin, GlutaMAX) glutamin HeLa hücreleri büyümek orta % 10 (v/v) fetal buzağı ısı inaktive serum ve % 1 penisilin ve streptomisin ile desteklenmiştir.
  2. 6-iyi cam alt kültür pilakalar ve fibronektin (25 µg/mL) 1 h için kat. O zaman iyi başına 2 x 104 hücre tohum.
  3. Satın alma sırasında orta 3 günde değiştirin.
  4. Hızlandırılmış edinmesinin video mikroskop (ticari olarak mevcut) objektif ücretsiz kullanın.
    Not: Bu objektif-Alerjik Hesaplamalı görüntüleme tekniği üzerinde Özcan vd tarafından açıklandığı gibi temel alır 16 bir kuluçka 37 ° C12,15kontrollü bir sıcaklık sürekli izleme gerçekleştirmek için güncellenmiştir. 1,67 µm bir piksel aralığı ve görüntüleme 6.4 x 4.6 mm2lik bir tamamlayıcı metal oksit yarı iletkeni (CMOS) görüntü algılayıcı bulunuyor. Birden çok dalga boyu aydınlatma kırmızı, yeşil ve mavi aydınlatma sağlayan bir multichip ışık yayan diyot (LED) aygıtı tarafından sağlanır. 636, 521 ve 452 dalga boylarında ortalanır nm sırasıyla, spektral bant genişliği 25, 45 ve 25 ile nm anılan sıraya göre. Kırmızı-yeşil-mavi (RGB) LED hücreleri yaklaşık 5 cm uzaklıkta bir 150 µm iğne deliği yukarıda yer alır. Ölçülen yakın LED ışık güç gibi düşük 10 µW at her dalga boyu ve aydınlatma zaman edinme başına yalnızca bir saniye. Bu nedenle, hücre kültürlerinde objektif-ücretsiz video mikroskop altında gözlendiğinde fotoğraf-toksisite sorun bekleniyor.
  5. CMOS sensör (şekil 1) ile temas koymak hücre kültür kap koymak. Objektif-Alerjik edinme kalitesi için önemlidir alt cam coverslip ile bir kapsayıcı kullanın. Plastik kaplar-ebilmek da var kullanılmış ama objektif-Alerjik edinme görme duyusuyla ilgili kalitesiz bu kapları sayesinde düşer.
  6. Hızlandırılmış edinme ve holografik imar yapan video objektif-Alerjik mikroskop edinme yazılım (ticari olarak mevcut) ile kontrol. Yazılım arayüzü kullanıcı tarafından girilmesi gerekir kare hızı, deneme ve hücre kültürü, yani yapışık hücreleri veya yüzen hücreleri türünü süresi parametrelerdir.
  7. Satın alma yazılım giriş parametrelerini ayarlamak. Her 10 dakikada bir edinme küme ve hücre kültür tipi 'yapışkan' kare hızı ayarlayın.
    Not: güvenilir bir hücre çözümlenmesi için elde edilen veri kümesi boyutunu hala makul olmakla birlikte izleme sağlar bir alım her 10 dakikada bir kare hızı iyi bir uzlaşma gibidir. En hızlı kare hızı bu objektif-Alerjik mikroskobu kurulum ile ulaşılabilir bir 5 dakikada değil. Daha fazla kare hızını artırarak aşırı ısınma kültür hücrelerdeki canlılık etkileyebilecek CMOS sensörünün sonuçlanır.
  8. Hızlandırılmış edinme başlatmak ve holografik imar algoritması (ticari olarak mevcut) otomatik olarak hücre kültürü faz görüntüsünü elde etmek için objektif ücretsiz satın alma etkin olur. Holografik imar algoritması bir çoklu dalga boyu faz alma algoritması17 tarihinde dayanmaktadır ve RGB yeniden oluşturulan faz görüntüyü aralığında sağlar [-π, + π] 29.4 mm2görüş büyük bir alan üzerinde tek her hücre için. Bir objektif içermeyen satır içi Holografi ince bir örnek aydınlatmak için ilkesidir (z = 0) ile bir düzlem dalga (Toplam genlik 1 normalleştirme sonra) ve bir CMOS sensör üzerinde sonraki kırınım yoğunluğu görüntü kısa mesafe z algılamak için Z, sonra genellikle 1 mm = örnek. Bizim kurulum, aydınlatma sırayla 3 boyları için açık olduğundan (λ10,450 µm, λ2= 0.540 µm, λ3= 0.647 µm =) üç kırınım desen aynı örnek ölçmek için.

2. hücre Kültür veri analizi

  1. Hücre-izleme için Trackmate algoritması, tek parçacıklar18otomatik izleme için bir açık kaynak Fiji eklenti kullanın. İlk olarak, yük tam hızlandırılmış edinme Fiji (yük görüntü sırası komutu). Genellikle 400 RGB çerçeveler 29,7 MB özellikleri, veri kümeleri, büyüklüğü nedeniyle onları 8-bit biçimde yük daha hızlı olur. Sonraki Trackmate Fiji eklenti birkaç aşamada hücre izleme algoritması, yani bir hücre algılama sahne, bir hücre izci sahne ve hücre tespitlerde ve hesaplanan parça için uygulanan çeşitli filtreler aracılığıyla kullanıcıya gösterir. Her aşamada algoritmalar yapılandırmak ve sonuçları görüntülemek böylece hemen gerekirse, bir kolayca ileri geri ayarları yeniden düzenlemek için gidebilirsiniz. Trackmate arabiriminin çeşitli menüler Şekil 2 ' HeLa hücreleri deneme için kullanılan gerçek ayarları ile gösterilir.
  2. (Bkz: Şekil 2) takip olarak satın alma yazılım giriş parametrelerini ayarlamak. Tahmini blob çapı 15 piksel, 0,25 dedektörü eşik, bağlantı maksimum mesafe 15 piksel, gap-kapanış en fazla uzaklık 15 piksel ve 3.5 parçalardaki noktaların sayısını ayarlayın.
    Not: Bu ayarlar belli ki bir deneyden başka bir '(burada 1,67 µm piksel cinsinden verilen) hücre boyutu karşılık gelen özellikle tahmini blob çapı' farklı olacaktır. Aynı remark '(burada 1,67 µm piksel cinsinden verilen) iki ardışık çerçeveler içinde bir hücre tarafından hangi hesap için maksimum mesafe yolculuk bağlantı maksimum mesafe' geçerlidir. En uygun değerini hücre hareketliliği aynı zamanda hücre yoğunluğuna bağlı olacaktır.
  3. Hücre izleme işleminin sonunda sonuçları üç metin dosyası şeklinde oluşturma ('Analiz' düğme, bkz: Şekil 2). 'Noktalar parça istatistikleri' adlı en yararlı dosya (x, y) ilgili konumlarını satın alma, onların çerçeve numarası ve onların parça numarası ile algılanan tüm hücreleri listelendiği bir tablo oluşur. Bu bilgiler temelinde hücre segmentasyon gerçekleştirmek ve hücre adanmış algoritmaları (bkz: ek kod dosyaları) kullanarak bölümler algılamak. Diğer iki dosya 'Parça istatistikleri bağlantılar' adlı ve 'İzlemek istatistikleri' ve ilgili parça, örneğin parça sürelerini, algılanan boşluklar sayısı ile tüm sonuçlar içerir, izlemek ilk çerçeve, vb.
  4. Hücre segmentasyon algoritma kullanın (bkz: ek kod dosyasını otomatik olarak yeniden oluşturulan faz görüntüden hücre morfolojisi açıklayan çeşitli ölçümler ayıklamak için). Bu ölçümler hücre yüzey alanı (S), hücre Binbaşı eksen uzunluğu (M), hücre küçük eksen uzunluğu (m) ve hücre en boy oranı (L/m) dir. Objektif-Alerjik mikroskobu kurtarılan yoğunluğu ve15daha önce tartııldıı gibi numune katman kalınlığı orantılı aşamasıdır.
  5. Hücre morfolojik özelliklere ek olarak, nicel hücre kuru kitle (CDM) ölçümleri yeniden oluşturulan faz13,19,20 ayıklayın.
    Equation 1EQ (1)
    yeniden oluşturulan faz kayması19, λ dalga boyu ve α nerede φ(x,y) = 1.8 x 10-4 m3/kg kitle1, Kuru için Kırılma indisi varyasyonu ilgili belirli Kırılma indisi 19.
  6. Hücre Kırılma indisi ile bu kültür ortamının arasındaki fark bir tahmini kullanarak hücre kalınlığı değerlendirin. Hücre kalınlığı h(x,y) ve ölçülen faz kayması ilişkisi20tarafından verilir:
    Equation 2EQ (2,1)
    Equation 3EQ (2,2)
    Δn(x,y) = nhücre (x,y) - nOrta (x,y), hücre ve kültür medya arasındaki Kırılma indisi fark. Aşağıda, Δ sabit bir değer kabuln 0,025 =, hangi HeLa hücre çekirdeği içinde ölçülen Kırılma indisi üzerinden tahmin ediliyor (n = 1.35511) ve fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) kültür ortamının (n 1.33 =). Her ne kadar hücre Kalınlık değeri yalnızca bir varsayıma dayalı olarak göstergesidir, göreli varyasyonları anlamlı ve sayesinde bunun bölünen hücreler algılamak için kullandı.
  7. Özel algoritması kullanın (hücre bölünmeler oluşumunu algılayan ve hücre bölünmesi algılamak için tespit edilen hücre bölümler için ilişkili hücre parçaları ayıklamak için bkz: ek kod dosyası) hücreleri ile ölçülen kalınlık 8 µm büyük kontrol yeni bir hücre yakından olarak görünüp görünmeyeceğini belirtir uzay ve zaman o zaman ilk, tanımlanır. Bu şekilde, hücre bölünmeler algılanması iki sağlam kriterlere dayanır. Alternatif ve hücre bölünmesi algılama için daha ayrıntılı yöntemleri için lensfree hızlandırılmış edinme21,22,23uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Holografik yeniden yapılanma süreci için ışık alan bir skaler bir alan tarafından gösterilmiştir (nerede Equation 4 a karmaşık değerdir mesafe z örnek ve lateral pozisyonda uçakta Equation 5 ve dalga boyu λ). Işık yayma yayıcısı çekirdek sağlayan Huygens-Fresnel teorisi tarafından örnek alınarak Equation 6 . Bu nedenle, alan genlik dedektörü uçakta, birz tarafından aşağıdaki ilişki hafif genlik bir0 ilişkilidir:
Equation 7YaniEquation 8
ile Equation 9 , karmaşık sayı nerede (Ben =2-1)

Yoğunluk ölçüm sadece tarafından modellenmiş Equation 10 . Yeniden yapılanma algoritması amacı bir 'iyi' alan A0, hangi kırınım ölçülen yoğunluğu maç gözlenen örnek için ilgili bulmak mümkün benz. Stratejidir dedektörü uçak φz genlik alan aşamasında dikkate almak sorunun ve spektral toplam değişim önemsemeyerek nesnenin optimize etmek için bilinmeyen. Daha açık olarak, alanları dikkate alınarak
Equation 11

Equation 12YaniEquation 13
herhangi bir alan φz, faz için Equation 14 mükemmel eşleşen veri beri Equation 15 . Böylece sonraki alan Equation 16 gözlenen yoğunluk görüntüsü verilen örnek uçak olası genlik alanındadır. Bu neden A0 bir ölçüte tüm veri eşleştirme olanakları arasında benzersiz bir çözüm belirtmek için kullanılır olmasıdır. En aza indirmek için ölçüt olarak seçildi:
Equation 17
Burada x ve y yani uçak için koordinatlar Equation 18 . Böyle bir ölçüt kullanarak, tüm olası alanlar arasında fiziksel olarak anlamlı olduğu için tüm dalga boylarında, aynı konumda keskin kenarları görüntüleme örnek alan seçmek için sağlar. Bu yöntem 'ikiz-Albümdeki' yeniden oluşturulan alan bir0azaltır. 'Tek Kişilik-image' eksik faz bilgi edinme işlemi sırasında sonuçları önemli bir yapay doku var.

Pratik hesaplama için integraller dedektörü çözünürlük için karşılık gelen bir kayma örnekleme ile discretized, türevleri Sobel operatörleri ve özyinelemelerinin tarafından Huygens-Fresnel yayıcısı tarafından değiştirilir Equation 19 giderek gerçekleştirilir Fourier alana nerede Equation 20 basit bir ifadesi: Equation 21 . (Gerçek) ölçüt ε (gerçek) set değişkenler açısından indirilmesi Equation 22 her biri için her dedektörü piksel ile ilişkili herhangi bir aşama için hesaplanması için ε degrade gerektiren doğrusal olmayan konjuge degrade yöntemini kullanarak tarafından ele dalga boyu.

Hücre yeniden yapılanma/faz unwrapping
Şekil 3 kare kare HeLa hücreleri hızlandırılmış bir alım holografik yeniden inşası kültür sonuçlarını gösterir. Şekil 3a 29.4 mm2 alan mavi kanalda bir ham Alım tam görüş alanı gösterir. Bu görüntü ve kırmızı ve yeşil kanallarını satın olanlar dayalı, holografik yeniden bir RGB faz görüntü rakamlar 3b ve 3 cgösterildiği gibi hücre üretir. Yeniden oluşturulan faz görüntü bir faz kayması aşan teşvik hücreleri + π için karşılık gelen yerel olarak kaydırılan faz eserler sergiler. Bir basit faz unwrapping gerçekleştirmek için biz sezgisel bir ortalaması hayata, yani piksel değeri bulmak Equation 23 0,3 aşan ve ayarla bu piksel olarak + π. Bu basit yöntem yeniden RGB faz görüntülerin bir özelliğine göre. Biz bir oranı ölçmek gerekir her piksel, teoride Equation 24 eşit Equation 25 . Ama faz kaydırma ortaya çıktığında, Mitotik hücre söz konusu olduğunda, bu ilişki artık RGB yeniden oluşturulan faz görüntü (3f rakam) korunur. Böylece basit bir eşik faz kaydırma sunulması piksel algılamak için kullanılan yukarıda belirtilen buluşsal yöntemi bu özelliğin yararlanır. Yeniden oluşturulan faz görüntü önce ve sonra unwrapping sonuçları gösterilir rakamlar 3f ve 3 g, anılan sıraya göre. Bu unwrapped faz görüntüler sonra hücre izleme algoritması beslenir. Çıkartıyorum bu adım hücre izleme algoritması hücre bölünme ve hücreleri kesin sonuçları taviz verecek büyük kalınlığı algılamak başarısız olur. Yeniden oluşturulan faz resminin çözünürlüğü ne kadar yaklaşık 5 mikron15 (tam saha Uzaysal çözünürlük), görece kaba olduğu tahmin edilmiştir. Lamellipodia gibi ayrıntıları gözlemlemek ve hücre sitoplazma (3f rakamlar ve 3 g) yine de mümkündür. En önemlisi, objektif-Alerjik mikroskobu tarafından elde görüntüsü ve büyük bir kontrast görüntüler halo el eşyaları muaftır. Bu otomatik hücre algılama ve hücre izleme kolaylaştırır.

Hücre Kültür veri analizi
Parçalarını hücre döngüsünün ayıklamak için veri analizi bir dizi farklı algoritmaları kullanır, yani Trackmate Fiji eklentisi ile gerçekleştirilen izleme hücre, parça, Yani bölümler tespiti ve sonuçta hücre çıkarma döngüsü sıra iki hücre bölümler arasında. Aşağıda biz zaman elle yapılan ölçümlere göre bu algoritmaları çıkış kalitesini tartışmak.

Şekil 4 farklı ekran görüntüleri cep izleme sonuçları, hücre algılama algoritması sonuçlarını ve hücre izleme çözümleme sonuçlarını gösterir. Objektif-Alerjik edinme (rakamlar 4a-4 c) hücrelerde tespiti hücre izleme algoritması ilk adımdır. Hücre algılama algoritması karşılaştırarak doğrulamak için el ile hızlandırılmış objektif-Alerjik edinme (214 çerçeveler 663 x 663 µm2) küçük bir bölümünü açıklamalı. Biz el ile 5365 hücre konumları toplam Seçili ve ile Trackmate Fiji plugin tarafından elde edilen bu sonuçlar karşılaştırıldığında. Şekil 5 açısından gerçek tespitinde, yanlış pozitif ve yanlış negatif sonuçlar gösterir. Elde edilen hassasiyet yaklaşık % 96'sı ve pozitif öngörü değeri olarak % 99,7 büyüklüğünde olduğunu. Bu yüksek değerler kaliteli lens-ücretsiz video mikroskobu Kur ile elde edilen yeniden oluşturulan faz görüntülerin yansıtır. Hücre algılama sonra ölçmek için bir hücre segmentasyon algoritma sağlar — her hücre için — çeşitli farklı ölçümler, örneğin hücre alan hücre kütlesi ve hücre kalınlığı kuru. Segment oluşturma algoritması prensibi şekil 6a gösteriyor ve şekil 6f 663 x 663 µm2 ( şekil 5ile aynıdır) ilgi bir bölge için bir zaman dizisi kesimli görüntüleri gösterir. Algoritma ayrılmasını eşik faz görüntü tarafından başlatır (bkz. şekil 6b) ve sonra bir tohumlama yordam geçerlidir (bkz. şekil 6 c). Yani Merkezi algılanan hücre piksel karşılık gelen parça değerine ayarlanır. X-Y konumları hücreleri ve onların karşılık gelen parça numarası hücre izleme sonra elde edilen 'Parça istatistiklerinizde noktalar' dosyası tarafından sağlanır. Sonra bir yinelemeli dolum yordamı ilk eşik (şekil 6b) tarafından belirlenen tohum için hücre (rakamlar 6 c-e) sınırlarını genişleten uygulanır. Bu dolgu yordamı matematiksel Morfoloji, Örneğin, genişleme ve erozyon temel işlemleri kullanır. Segmentasyon sonuç sonra tek hücre düzeyinde, Yani Morfolojik özellikleri hücre uzunluğu, hücre alanı ve cep boy oranı gibi çeşitli ölçümler hesaplamak mümkündür, ama Ayrıca, daha da önemlisi, hücre kütlesi göre Kuru EQ 1. Objektif-Alerjik mikroskobu güvenilirliğini değerlendirmek için ölçüm hücrenin kuru kitle, biz sabit HeLa hücreleri (şekil 6 g) yeniden oluşturulan faz objektif ücretsiz görüntü holografik dijital aracılığıyla edinilen aynı bölge ile karşılaştırıldığında var mikroskobu ile 5 X amaç (şekil 6 h). Bir işlev için 302 DHM ile ölçülen kuru kütlesinin HeLa hücreleri parçalara hücre kuru 6i yolunu gösterir kitle tarafından ölçülen objektif-Alerjik mikroskobu yani. İki ölçüm arasında iyi bir bağlantı (belirlenmesi R2 katsayısıdır 0.86, eğim = 0,9, mahsup hesabı-17 pg =). Şekil 6i, objektif-Alerjik mikroskobu aracılığıyla elde edilen hücre kuru kitle ölçüm duyarlığını tahmin edebilirsiniz. Objektif-Alerjik veri ve doğrusal fit arasında ortalama kare hata olarak ölçülen duyarlık, yaklaşık 16 pg olur.

Tüm tek hücre ölçümler üzerinde tam hızlandırılmış edinme derlerken, sonra çeşitli ölçümler scatterplots Şekil 7' de gösterildiği gibi bir fonksiyonu olarak elde etmek mümkündür. Bu scatterplots üzerinde çok büyük bir nüfus kültürlü hücreleri Kinetik bilgileri. 2.000 kadar 15.000 (şekil 7a) üzerinden görüş alanı hücre sayısı artar. Zaman puan, bu götürmek-e doğru 2.2 x 10 büyük bir veri kümesi sayısı ile çarpılır6 hücreler, her-in onları koordinatları ile karakterize ve Morfolojik özellikleri, Yani hücre kuru kitle (şekil 7b), hücre alan (Şekil 7 c) tespit , hücre ortalama kalınlık (Şekil 7 d), Binbaşı eksen uzunluğu (şekil 7e) ve en boy oranı (şekil 7f).

Önemlisi, hücre izleme ve hücre segmentasyon algoritmaları birleşimi tek hücre düzeyinde Kinetik ölçmek sağlar. Örneğin, şekil 8 bir hücre analizini yaklaşık 66 saat süren izlemek ve 4 hücre tümen T0 4.1 h, T0 20,5 h, T0 + 36.7 h ve T0 +++ 53.3 h., sergilenmesi şekil 8a göstermek sağlayan otomatik hücre segmentasyon algoritma sonuçlarını gösterir bize bu hücre yüzeyinin verimli bir şekilde betimlemek için. Hücre ayrılmasını kullanarak, sonra zaman, örneğin hücre yüzey alanı (şekil 8b) bir fonksiyonu çeşitli ölçümler hesaplamak mümkündür, hücre kuru kitle (şekil 8 c), hücre ortalama kalınlık (şekil 8 d) ve hücre motilite (rakam 8e). Bu grafikler dan bir açıkça bu hücresel ölçümler hücre bölümler arasında Kinetik ölçebilirsiniz. Özellikle bir hücre döngüsü sırasında hücre alan ve kuru kütle artışı gözlemleyebilirsiniz. Buna ek olarak, hücre bölümleri otomatik olarak algılanmasını kullanarak, üç farklı hücre döngüsü parça bu parçadan elde edilebilir ve hücre döngüsü, yani dönemin iki tümen arasında tahmini süre. Üç hücre döngüsü süreleri şiddetindeydi şekil 8' de gösterilen tek hücre yolda yani 16.4 h, 16,2 h ve 16,7 hücre döngüsü derleme h. izler 2,7 gün analizinden 16725 hücre bölünmeler tespiti sonuçlarında hızlandırılmış edinme ve 10,584 hücre döngüsü parça açıklaması. Sonra ortalama ve ses istatistikleri ile hücre döngüsü süresi değişkenlik ölçmek mümkündür. Biz hücre döngüsü süresi dağılımı Gauss dağılımı yakın (9a rakam) 16,5 h ortalaması, %12,4 (Standart sapma dağılımın ortalaması tarafından bölünmüş Gauss tepe üzerinde ölçülen göreli standart sapması ile bulundu ). Ortalama 16,5 h zaman katlama el ile şekil 8tarihinde sunulan yolda ölçülen hücre döngüsü uzunlukları ile tutarlıdır. HeLa için yayımlanmış değerler alt aralığı içinde iki katına zaman ancak hangi yatıyor s24,25,26,2720 ve 30 arasında genellikle vardır. Ancak, başvuru2816,2 ± 1.7 h kısa bir katlama zaman da belirtilir. Daha fazla hücre döngüsü uzunlukları bizim ölçümleri doğrulamak ve bizim objektif-Alerjik mikroskobu tekniği güvenilirliğini doğrulamak için el ile bir izleme 100 hücre döngüsü parça (10,148 hücre konumları) gerçekleştirdiniz. Hücre üzerinde el ile elde edilen parça döngüsü (N = 100) 16.7±1.9 h ölçülen hücre döngüsü uzunluğudur (N = 100, şekil 9b). Bu çok 16.5±2.1 h ölçüm yakın olduğunu (N = 10,584) izleme, genel analiz geçerliliğini gösteren otomatik hücresiyle elde. Ne zaman el ile izleme yörüngeleri bir otomatik olarak, hücre döngüsü parça % 67'si başarılı bir şekilde tespit edildi ve döngüsü uzunlukları otomatik olarak ölçülen bulduk belirlenen hücre döngüsünün karşılaştırma ölçülen olanlar iyi ilişkili el ile (şekil 9b). Hücre döngüsü yörüngeleri algılama verimliliği denemeyi, bir yoğunluk 150 hücreler/mm2aşağıda ilk 32 saatlik ölçüldü. Bu tespit oranı belli ki zamanla azalır hücre yoğunluğu ~ 500 hücre/mm2kadar artırır. Hücre sayısı hala artırır iken tespit edilen hücre döngüsü parça sayısı üç T0 + 32 h ve T0 + 72 h (7a rakam) arasında bir faktörle T0 + 32 h (Şekil 9 c) bir plato ulaşır. Yanlış pozitif ve negatif tespitlerde oranı göz önüne alındığında, şekil 9b 5 outliers noktaları sunar: 4 tanesi vardır nedeniyle yanlış negatif algılama (döngüsü uzunluğu > 25 h) ve 1'e bir yanlış pozitif algılama (döngüsü uzunluk < 10 h). Bu sonuçları elde etmek için biz yüksek bir eşiğe göre Değiştir kalınlığı (8 µm) hücre bölünmesi algılama algoritması düşük bir yanlış pozitif oranı iyilik için kullandık. Buna ek olarak, tutarsızlık sunulması parça dışarı, Yani hücre döngüsünün hangi süre 6 h ve parça ile doğrusal bir fonksiyonu olarak artırmaz kuru bir kitle yörünge uygulanmış. Onlar hücre döngüsü parça toplam sayısı sadece % 3 vardır. Sonuç olarak, otomatik olarak elde edilen hücre döngüsünün uzunluğu dağıtım iyi düşük sayısı yanlış yol açacağı kısa parça (Hücre döngüsü uzunluk < 10 h, parça toplam sayının % 5.1) ile Gauss (Þekil 9a) tarafından yaklaşık olumlu bölümü tespitlerde. Benzer şekilde, kısmen yanlış negatif bölümü tespitlerde sonuçlarından istiyorsunuz, uzun bir hücre döngüsü görüntüleme parça da nadirdir (hücre döngüsünün uzunluğu > 25 h, parça toplam sayının % 2.4). El ile hücre döngüsü yörüngeleri izlenmesine de daha fazla hücre izleme eklentisi ile gerçekleştirilen değerlendirmek için kullanılan. 6693 hücrelerdeyse genel Lokalizasyon doğru bir piksel aralığı (1,67 µm) içinde olan 1.6 µm eşleşen noktalarında olarak ölçülen var.

Diğer parametreler, hücre ilk kuru kitle (hemen sonra bir bölümü), son kuru kitle (hemen önce hücre bölünmesi) gibi hücre döngüsü sırasında ortalama büyüme oranı yanı sıra incelenebilir. Şekil 9 d ilk ve son hücre kuru kitleler bir fonksiyonu olarak çizer. Her iki ilk ve son hücre kuru kitleler zamanla azalma gösterir. İlk hücre aşağı 130 pg 223 pg dan kütlesi azalır ve son hücre kütlesi 220 pg aşağı 460 pg dan kuru kuru medyan değeri. İkisi arasındaki oran tüm deneme sırasında 1.89 ± 0,12 sabit kalır (Şekil 9 d-e). Son olarak, şekil 9f hücre kuru kitle büyüme hızı evrimi bir fonksiyonu olarak 10,584 hücre döngüsü parça üzerinde gösterir ve hücre büyüme hızı azalma belirli bu deneyde tüm hücre nüfus için ortak bir eğilimdir bulduk.

Figure 1
Şekil 1: Lens-Alerjik mikroskobu. (bir) objektif-Alerjik mikroskobu edinme kurulumunun şematik. (b) 6-wells objektif-ücretsiz video resmi mikroskop. 1,67 µm bir piksel aralığı ve görüntüleme 6,4 mm x 4.6 mm = 29,4 mm2lik ile bir CMOS görüntü sensörü kullanır. Aydınlatma örnek yaklaşık 5 cm uzaklıkta yerleştirilmiş bir iğne deliği ile birlikte bir çok renkli RGB LED tarafından sağlanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Trackmate arabirimi. Ana menüler, HeLa hücre için kullanılan gerçek ayarları ile gösterilen eklenti deneme. Tahmini blob çapı 15 piksel olarak ayarlayın, Dedektör eşik 0.25 için kuruldu, bağlantı maksimum mesafe 15 piksel olarak ayarlayın, gap-kapanış maksimum mesafe 15 piksel olarak ayarlayın ve içinde iz noktaların sayısını 3.5 için kuruldu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: holografik yeniden yapılanma süreci. (bir) ham HeLa hücreleri kültür mikroskobu (tam görüş alanı 29.4 mm2) objektif ücretsiz aracılığıyla edinimi. (b) detay (a). (b) (c) detay. (d) RGB faz görüntü (tam görüş alanı 29.4 mm2) yeniden. (d), (e) detay. (e), (f) detay. (f), karşılaştırılacak unwrapping önce unwrapping aşaması sonra (g) faz görüntü elde. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: ekran Trackmate Fiji eklentisi kullanarak gerçekleştirilen hücre izleme sonuçlarını yakalar. (bir) sonuçlarını Gauss (günlük) dedektörü Laplasyen'in üzerinde dayalı olan hücre algılama algoritması. Resim T0 + 16h40min içinde 2,451 hücreleri tespit edilir, objektif-Alerjik edinimi tam görüş alanı gösterir. İkinci mor bir daire ile çevrilidir. (b) hücre izleme algoritma sonuçlarını. Tüm hücre parçalar 50'den fazla çerçeve (~ 8 saat) ortalama hız için karşılık gelen bir renk koduyla gösterilir. (c, d) Ayrıntılı görüntü (a) ve (b) sırasıyla (sarı dikdörtgen). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: Hücre izleme algoritması hücre algılama aşamasında doğrulanmasını. Kültür (663 x 663 µm2) (bir) HeLa Cropped görüntü hücre nerede el ile hücre seçildiğinde mavi haç ile işaretlenir ve bu hücre izleme algoritması ile algılanan kırmızı haç ile işaretlenir. Bu yanlış pozitif algılama (kırmızı daire) ve yanlış negatif tespitlerde (turuncu Daire) tayini sağlar. (b) oranı doğru algılama (yeşil hat), yanlış pozitif (kırmızı çizgi) ve yanlış negatif (turuncu) algılama deneme zaman bir fonksiyonu çizilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: hücre ayrılmasını sonuçlarını. (bir) Reconstructed faz görüntüsünü T0 + 7 h (663 x 663 µm2) hızlandırılmış edinimi ilgi bir bölge. (b) tarafından sağlanan bir işlemde, algılanan hücre Merkezi piksel karşılık gelen parça değer ayarlandı Yani faz görüntü (c) ayrılmasını başlar eşik ayrılmasını algoritma başlatır. (d-e) Sonraki ve yinelenen bir dolgu yordam ilk eşik (b) tarafından belirlenen hücre sınırları için ilk tohumlama genişleten uygulanır. (f) bölümleme algoritması sonucu 663 x 663 µm2 bölge (aynı şekil 5) üzerinde bir zaman dizisi için gösterilir. Ayrılmasını yeniden oluşturulan faz resminin üst kısmında bulunan bir renkli yüzeyi olarak gösterilir. Objektif-Alerjik sinyal esas olarak nükleer bölgesinden geliyor ve kesimlere ayrılmış alanları çekirdeği yakın düşüş unutmayın. objektif-Alerjik mikroskobu tarafından elde edilen (g) Reconstructed faz HeLa hücreleri sabit. 29,4 mm2tam görüş alanı kırpılmış bir resmi bu. (g) gösterilen bölge (h) faz görüntüsünü elde edilen dijital holografik mikroskobu 647 bir lazer ile aydınlatılmış bir 5 X hedefi (NA 0,12) tarafından nm. (ben) kitle objektif-Alerjik mikroskobu aracılığıyla DHM aracılığıyla ölçülen kuru kitle bir fonksiyonu olarak elde edilen arsa hücre kuru. Scatterplot 302 hücrelerin ölçümleri derler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: veri analizi HeLa hücreleri 2.7 günlük objektif-Alerjik hızlandırılmış edinimi. hücre (bir) toplam sayısı tam görüş alanı içinde 29.4 mm2 saat bir fonksiyonu olarak sayılır. (b) Scatterplot kuru hücrenin kitle zamanın bir fonksiyonu olarak. Her kutusunda, 6 saatlik bir depo karşılık gelen, kırmızı merkezi işareti ortanca gösterir ve kutusunun alt ve üst kenarları 25th ve 75 testlerinde sırasıyla gösterir. Bıyık aykırı kabul edilmez en uç veri noktalarına genişletir. (c-f) Hücrenin Scatterplots alanı (c), hücre ortalama kalınlık (d), hücre Binbaşı eksen uzunluğu (e) ve hücre en boy oranı (f) zaman bir fonksiyonu bölümlenmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8: 2,7 gün hücre yörünge (10 dk çerçeve aralığı) veri analiz. (bir) hücre segmentasyon yaklaşık 66 saat süren bir hücre parça hızlandırılmış edinimi üzerinde gerçekleştirilen. Hücre ilgi bir mavi kaplamasıyla görüntülenir. Her kırpılmış görüntü 53 x 53 µm2' dir. Hücre bölünmeler sarı daire ile gösterilir. (b) zamanın bir fonksiyonu olarak hücre alanının arsa. (c) zaman evrim hücrenin kuru kitle faz integrali üzerinden hesaplanan kesimli hücre alana göre EQ (1). (d) arsa ortalama hücre kalınlığı EQ (2) göre zamanın bir fonksiyonu olarak hesaplanır. Hücre kalınlığı keskin doruklarına hücre bölümler (Sarı (b-c-d-e) içinde (a) ve kırmızı çizgiler circles) karşılık gelen sergiler. (e) hücre hareketliliği zamanın bir fonksiyonu olarak arsa. (f) bölümleme sonuçları son hücre yoğunluğu yaklaşık 475 hücreler/mm2olduğunda T0 + 66h20min pistte çerçevesinde karşılık gelen. 200 x 200 µm2 faiz cepten merkezli görüntüdür. Beyaz lekeler (Kızıl Yıldız) hücre kültürü bir gün sonra görünür hücre artıkları karşılık gelir. (g) 800 x 800 µm2 bu hücre parçanın son çerçevenin yeniden oluşturulan faz Resim kırpılmış. Hücre ilgi sarı bir daire ile çevrilidir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 9
Şekil 9: Hücre döngüsü analizi. (bir) bir 2.7-gün gözlem kültürlü HeLa hücre döngüsü süresince dağılımı hücreleri (N = 10, 584 hücre döngüsü). Hücre döngüsü süresi dağılımı Gauss 16,5 saat ortalaması, %12,3 (Standart sapma dağılımın ortalaması tarafından bölünmüş Gauss tepe üzerinde ölçülen) göreli standart sapması ile yakındır. (b) karşılaştırma Kılavuzu ve otomatik arasında hücre hücre döngüsünün uzunluğu belirlenmesi için izleme. El ile izleme 100 hücre döngüsü yörüngeler (10,148 hücre konumları) sahiptir. otomatik olarak algılanan hücre döngüsü yörüngeler (c) dağıtım başlangıç saati. (d) ölçülen ilk hücre kuru arsa kitle (hemen sonra hücre bölünmesi, siyah noktalar) ve son hücre kuru kitle (hemen önce hücre bölünmesi, kırmızı nokta) bir fonksiyonu olarak zaman. Her kutu üzerinde 6 h bir depo karşılık gelen, kırmızı merkezi işareti ortanca gösterir ve kutusunun alt ve üst kenarları 25th ve 75 testlerinde sırasıyla gösterir. Bıyık aykırı kabul edilmez en uç veri noktalarına genişletir. (e) Scatterplot kuru son hücrenin ilk kuru kitle kütlesi bir fonksiyonu olarak. (f) hücre kuru kitle büyüme hızı deneyi zamanın bir fonksiyonu olarak evrimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 1: kod 'segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m'. Bu Matlab 'trackmate' veri kümesi hangi klasörde 'folder_out' yeniden oluşturulan faz görüntüler kaydedilir tam hızlandırılmış edinme hücre ayrılmasını gerçekleştirmek için kullanır. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 2: kod 'lineage_Version_Jove.m'. Bu dizi 'trackmate hücre döngüsü yörüngeleri ayıklamak ve faiz, örneğinfarklı parametrelerini belirlemek için hücre segmentasyon algoritması (segmentation_from_trackmate_file_Version_Jove.m), ile işlenen' kullanır., hücre döngüsü süresi, ilk hücre kuru kitle ve son hücre kuru kitle. Bu kod iki bölümde, ilk bölümü sayesinde bunun bölünen hücreler ve ikinci bölümü tespiti ile hücre döngüsü yörüngeleri analizi ile ilgilidir. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yazıda, bu objektif-ücretsiz video mikroskobu içinde bir kuluçka hücreleri binlerce Kinetik yakalamak için kullanılabileceğini göstermektedir. Genel yöntembilim tanımlamak için HeLa hücreleri kültür 2,7 gün hızlandırılmış edinimi Standart hücre izleme algoritmalarıyla nasıl çözümlenebilir açıkladı. 2.2 x 106 hücre ölçümleri ve 10,584 hücre döngüsü parça içeren bir veri kümesi sonucudur. Satın almalar Hela hücreleri nispeten büyük bir hücre hücre mesafe ile bir kültür olarak gerçekleştirilmiştir (hücre yoğunluğu < 500 hücre/mm2) ve hücre bir diskle birlikte yaklaşık morfolojisi. Bu iki özellik büyük bir veri toplamak mümkün kılan bir otomatik olarak hücre izleme analiz uygulanmasının kolaylaştırılması. Diğer hücre hatları ile daha küçük hücre hücre mesafe veya daha karmaşık türleri morfoloji ile izlemek daha zor olacak ve sonraki veri kümelerini daha küçük olur.

Bu yaklaşım birçok çalışma için örneğin hücre çoğalması ve hücre boyutu çalışmaları için ilginç olduğunu düşünüyoruz. İkinci araştırma önemli bir alanı temel Biyolojide vardır ve birçok soru cevapsız kalır gibi güzel bir inceleme Ginzberg vd tarafından ele 29. bu çalışmada önerilen iletişim kuralı böylece önemli ölçütleri ölçmek için bir yol gerekli için Hücre proliferasyonu çalışmaları, yani hücre döngüsü süresi, hücre kuru kitle, hücre döngüsü ve hücre başlangıcı arasındaki sonunda kuru kitle oranı sağlar Kuru kitle büyüme oranı. O-ebilmek üretmek çok sayıda parça, her biri birkaç saat süren hücre çoğalması çalışmanın yanı sıra, bu yöntem hücre göç, incelenmesi için ilgi olacaktır. Mevcut protokolü en son14,30 hücre parça binlerce edinme daha 10 h sırasında ilk kez göstererek gider.

Sonuç olarak, etiket içermeyen hücreleri binlerce kültür birkaç gün içinde aynı anda izlemek için izin veren bir kullanımı kolay lens-Alerjik tekniği geliştirdik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar kabul etmek bir şey yok.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cytonote lens-free video microscope  Iprasense
Horus acquisition software Iprasense
6-well glass bottom culture plates MatTek corporation Part No: P06G-0-14-F 
DMEM + GlutaMAX medium  Gibco
heat-inactivated fetal calf serum  Eurobio
penicillin and streptomycin  Gibco
Fibronectin  Sigma Aldrich
Matlab, image processing toolbox  Mathworks

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zangle, T. A., Teitell, M. A. Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics. Nat Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).
  2. Popescu, G., Park, K., Mir, M., Bashir, R. New technologies for measuring single cell mass. Lab Chip. 14 (4), 646-652 (2014).
  3. Reed, J., et al. Rapid, massively parallel single-cell drug response measurements via live cell interferometry. Biophys J. 101 (5), 1025-1031 (2011).
  4. Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci. USA. 108 (32), 13124-13129 (2011).
  5. Girshovitz, P., Shaked, N. T. Generalized cell morphological parameters based on interferometric phase microscopy and their application to cell life cycle characterization. Biomed Opt Express. 3 (8), 1757-1773 (2012).
  6. Kemper, B., Bauwens, A., Vollmer, A., Ketelhut, S., Langehanenberg, P. Label-free quantitative cell division monitoring of endothelial cells by digital holographic microscopy. J Biomed Opt. 15 (3), (2010).
  7. Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PLoS One. 9 (2), 1-8 (2014).
  8. Bon, P., Savatier, J., Merlin, M., Wattellier, B., Monneret, S. Optical detection and measurement of living cell morphometric features with single-shot quantitative phase microscopy. J Biomed Opt. 17 (7), (2012).
  9. Aknoun, S., et al. Living cell dry mass measurement usinq quantitative phase imaging with quadriwave lateral shearing interferometry: an accuracy and sensitivity discussion. J Biomed Opt. 20 (1), 1-4 (2015).
  10. Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
  11. Choi, W., et al. Tomographic phase microscopy. Nat Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
  12. Kesavan, S. V., et al. High-throughput monitoring of major cell functions by means of lensfree video microscopy. Sci Rep. 4, 1-11 (2014).
  13. Zheng, G., Lee, S. A., Antebi, Y., Elowitz, M. B., Yang, C. The ePetri dish, an on-chip cell imaging platform based on subpixel perspective sweeping microscopy (SPSM). Proc Natl Acad Sci USA. 108 (41), 16889-16894 (2011).
  14. Pushkarsky, I., et al. Automated single-cell motility analysis on a chip using lensfree microscopy. Sci Rep. 4, 4717 (2014).
  15. Allier, C., et al. Imaging of dense cell cultures by multiwavelength lens-free video microscopy. Cytom Part A. 91 (5), 1-10 (2017).
  16. Su, T. -W., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. High-throughput lensfree imaging and characterization of a heterogeneous cell solution on a chip. Biotechnol Bioeng. 102 (3), 856-868 (2009).
  17. Delacroix, R., et al. Cerebrospinal fluid lens-free microscopy: a new tool for the laboratory diagnosis of meningitis. Sci Rep. 7, 39893 (2017).
  18. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2016).
  19. Popescu, G. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).
  20. Liu, P. Y., et al. Cell refractive index for cell biology and disease diagnosis: past, present and future. Lab Chip. 16, 634-644 (2016).
  21. Rapoport, D. H., Becker, T., Mamlouk, A. M., Schicktanz, S., Kruse, C. A novel validation algorithm allows for automated cell tracking and the extraction of biologically meaningful parameters. PLoS One. 6 (11), e27315 (2011).
  22. Al-Kofahi, O., et al. Automated cell lineage construction: A rapid method to analyze clonal development established with murine neural progenitor cells. Cell Cycle. 5 (3), 327-335 (2006).
  23. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. Tracking in cell and developmental biology. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 894-902 (2009).
  24. Posakony, J. W., England, J. M., Attardi, G. Mitochondrial growth and division during the cell cycle in HeLa cells. J Cell Biol. 74 (2), 468-491 (1977).
  25. Zocchi, E., et al. Expression of CD38 Increases Intracellular Calcium Concentration and Reduces Doubling Time in HeLa and 3T3 Cells. J Biol Chem. 273 (14), 8017-8024 (1979).
  26. Reitzer, L. J., Wice, B. M., Kennell, D. Evidence that glutamine, not sugar, is the major energy source for cultured HeLa cells. J Biol Chem. 254 (8), 2669-2676 (1979).
  27. Benedetti, A. D. E., Joshi-barve, S., Rinker-Schaeffer, C., Rhoads, R. E. Expression of Antisense RNA against Initiation Factor eIF-4E mRNA in HeLa Cells Results in Lengthened Cell Division Times, Diminished Translation Rates, and Reduced Levels of Both eIF-4E and the p220 Component of eIF-4F. Mol Cell Biol. 11 (11), 5435-5445 (1991).
  28. Kumei, Y., Nakajima, T., Sato, A., Kamata, N., Enomoto, S. Reduction of G1 phase duration and enhancement of c-myc gene expression in HeLa cells at hypergravity. J Cell Sci. 93 (2), 221-226 (1989).
  29. Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. On being the right (cell) size. Science. 348 (6236), 1245075 (2015).
  30. Mathieu, E., et al. Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments. Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).

Tags

Hücresel biyoloji sayı 132 Lens-Alerjik mikroskobu video sitometresi yoğun hücre kültürleri nicel mikroskobu
Dinamik için objektif-ücretsiz Video mikroskobu ve kantitatif analiz yapisan hücre kültürü
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Allier, C., Vincent, R., Navarro,… More

Allier, C., Vincent, R., Navarro, F., Menneteau, M., Ghenim, L., Gidrol, X., Bordy, T., Hervé, L., Cioni, O., Bardin, S., Bornens, M., Usson, Y., Morales, S. Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture. J. Vis. Exp. (132), e56580, doi:10.3791/56580 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter