Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

ابحث عن برنامج تشغيل مسارات اكتسبت مقاومة للعلاج المستهدفة: جيل سوبكلون المقاومة للأدوية وحساسية استعادة بواسطة خبط الجينات لأسفل

Published: December 11, 2017 doi: 10.3791/56583
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS

Summary

هذا الوقت--وفعالة من حيث التكلفة في المختبر بروتوكول تحقق آليات المقاومة المكتسبة للعوامل العلاجية المستهدفة، وحاجة طبية العالية التي لم تلب في إدارة السرطان.

Abstract

خلال العقدين الماضيين شهدت تحولاً من العقاقير السامة للخلايا للعلاج المستهدفة في الأورام السرطانية. على الرغم من أن العوامل العلاجية المستهدفة وأظهرت الفعالية السريرية أكثر إثارة للإعجاب، والآثار الضارة مصغر من العلاجات التقليدية، أصبحت المقاومة للعقاقير إلى القيد الرئيسي لفوائدها. تم تطوير عدة نماذج الإكلينيكية في المختبر/المجراة في المقاومة المكتسبة لوكلاء المستهدفة في الممارسة السريرية أساسا باستخدام استراتيجيتين: التلاعب ط) الوراثية للنمذجة الوراثية المقاومة المكتسبة، والثاني) في المختبر/ المجراة في اختيار النماذج مقاومة. في هذا العمل، فإننا نقترح إطارا موحدا، للتحقيق في الآليات الأساسية المسؤولة عن المقاومة المكتسبة للعوامل العلاجية المستهدفة، بدءاً من توليد سوبكلونيس الخلوية المقاوم لوصف إسكات الإجراءات المستخدمة لاستعادة الحساسية للمانع. هذه المرة-وفعالة من حيث التكلفة نهج بسيط قابلاً للتطبيق على نطاق واسع، ويمكن أن تمتد بسهولة إلى التحقيق في آليات المقاومة للعقاقير العلاجية الأخرى المستهدفة في هيستوتيبيس ورم مختلفة.

Introduction

متابعة الاكتشافات الهامة في مجال البيولوجيا الجزيئية والخلوية، قد وضعت عددا من جزيئات السرطان تجميعي رواية لاستهداف مسارات إشارات النمطان في طائفة واسعة من أنواع الأورام بشكل انتقائي. على وجه الخصوص، المركبات الكيميائية الاصطناعية هي فئتين من العوامل العلاجية المستهدفة مع خصائص فريدة من نوعها في علم الأورام، والمعروف مونوكلونل المؤتلف، حققت نجاحات السريرية والرعاية سرطان غيرت جذريا في العقود الأخيرة1،،من23.

ومع ذلك، وضعت غالبية مرضى السرطان استجابتها الأولية مثيرة للإعجاب للعلاج، وعلى الرغم من مقاومة الأدوية لجميع العوامل العلاجية المستهدفة، كل من الأجسام المضادة ومثبطات كيناز. نتيجة لذلك، المقاومة للعقاقير، العقبة الرئيسية للأدوية المضادة للسرطان الكلاسيكية4، لا يزال يشكل تحديا كبيرا للناشئة العلاجات المستهدفة5،6.

قد تكون مقاومة للعلاج المستهدفة الجوهرية (أيالابتدائية) أو مكتسبة (أي، الثانوية). يصف المقاومة المتأصلة حيثياته عدم الاستجابة للعلاج، بينما المقاومة الثانوي يحدث بعد فترة من استجابة للمخدرات العلاج7. بسبب تفشي أفواج صغيرة من الخلايا السرطانية داخل الجزء الأكبر الورم بدائية أو تقع في منافذ التشريحية خفي القاصي والعارضة تصل إلى 90% مقاومة لواحد أو أكثر يستهدف العوامل العلاجية. الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور مقاومة للعلاج المستهدفة أساسا نتيجة لطفرات الجينات المستهدفة وتفعيل مسارات الإشارات الأخرى الموالية البقاء على قيد الحياة، التفاهم الذي لا يزال بعيداً عن كامل8زائدة عن الحاجة.

واقترحنا في هذا العمل، نهجاً الوقت--وفعالة من حيث التكلفة للتحقيق في المختبر آليات المقاومة المكتسبة للعوامل العلاجية المستهدفة، بدءاً من توليد سوبكلونيس الخلوية المقاوم للأدوية إلى وصف لإسكات الإجراءات المستخدمة لاستعادة الحساسية للمانع، أداة حاسمة المستخدمة للاختبار والتحقق من صحة فرضيات العمل. على وجه الخصوص، استخدمت نهجنا للتحقيق، في الإصابة بسرطان المعدة، آليات المقاومة تراستوزوماب (مثلاً، هيرسيبتين)، جسم [مونوكلونل] أنسنة استهداف المجال خارج الخلية ل بروتين HER29. تراستوزوماب + العلاج الكيميائي مقبول على نطاق واسع كعلاج الخط الأول القياسية لسرطان الثدي المنتشر إيجابية HER2. بفضل الدراسات السريرية الحديثة تبين أن مكافحة-HER2 العلاجات لها نشاط كبير في على حد سواء في المختبر و في فيفو سرطان المعدة إيجابية HER2 نماذج10،11، كانت العقاقير الجزيئية استهداف HER2 درس على نطاق واسع في التجارب السريرية، التي لا تزال جارية، في المرضى الذين يعانون من السرطان المعدي12،13،،من1415.

وأكدت هذه الدراسات ارتفاع عدد المرضى التي تواجه مقاومة تراستوزوماب16، على نحو مماثل لما يتم ملاحظته لمثبطات العلاجية المستهدفة الأخرى. على وجه الخصوص، كان معدل الاستجابة من تراستوزوماب 47 في المائة، ومتوسط بقاء الشاملة للمرضى على العلاج الكيميائي + تراستوزوماب أطول من المرضى على العلاج الكيميائي وحدها172.7 شهرا فقط. هذا يشير إلى أن المقاومة تراستوزوماب الابتدائي منتشر، لكن المقاومة تراستوزوماب الثانوي أمر لا مفر منه. لهذا السبب، هناك حاجة ملحة توضيح الآليات التي تسبب مقاومة العلاج المستهدفة HER2 في الإصابة بسرطان المعدة، وحتى أكثر صعوبة نظراً لعدم تجانس الوراثية داخل مداواة هذا نيوبلسا18.

وبالإضافة إلى ذلك، أثبتت آليات المقاومة إلى تراستوزوماب في سرطان المعدة صعبة أن يفسر، جزئيا بسبب صعوبة الحصول على نماذج موثوقة السريرية الممثل لهذا الشرط. أوشيما وآخرون عن أسلوب انتقاء في فيفو من خطوط الخلايا تراستوزوماب مقاومة سرطان المعدة، تتكون ثقافة المتكررة خبيث البريتوني الصغيرة المتبقية بعد العلاج مع تراستوزوماب19. ومع ذلك، ساهمت الحاجة من ضميمة وخبرات محددة في التعامل مع الحيوانات، وموافقة "لجنة الأخلاقيات الحيوان" يجعلها أسلوب استهلاكاً لوقت وتكلفة. النهج الذي يصف لنا في هذا العمل بسيطة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع، ويمكن أن تمتد بسهولة إلى التحقيق في آليات المقاومة للعقاقير العلاجية الأخرى في ورم مختلفة هيستوتيبيس20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: عدلت هذا البروتوكول لتحليل الآليات الكامنة وراء المقاومة المكتسبة إلى تراستوزوماب هير المصابات بسرطان المعدة خلية خطوط على وجه التحديد. وترد في الجدول للموادجميع الصكوك المختبرية اللازمة.

1-جيل سوبكلونيس مقاومة للعلاج المستهدف

ملاحظة: هذا هو أكثر المسائل حساسية وصعوبة في توحيد خطوة في البروتوكول نظراً إلى أن خطوط الخلايا المختلفة قد يحمل حساسيات مختلفة للمانع العلاجية المستهدفة بشكل مستقل من تركزها الورم هيستوتيبي أو المخدرات المستخدمة.

  1. الثقافة NCI-N87 الخلية خط في المتوسط ربمي تستكمل مع مصل العجل الجنين (10 في المائة) والجلوتامين (مم 2، 1%)، كأحادي الطبقة عند 37 درجة مئوية، والبذور على 25 سم2 قوارير الثقافة.
  2. إضافة إلى متوسط الثقافة في كل قارورة 10 ميكروغرام/مل من تراستوزوماب كجرعة البداية. تعرض الخلايا لجرعة البداية حتى أنهم استئناف النمو.
    ملاحظة: يجب أن تكون بداية جرعة مثبط العلاج المستهدفة أقل بعشرة إضعاف من تركيز الذروة في البلازما. هو تركيز البلازما الذروة أعلى مستوى لتركيز المخدرات اكتشفت في دم المريض عادة بعد عدة جرعات من العلاج القياسي. ويمكن استرجاع هذه القيمة من دراسات بشأن الدوائية.
  3. رصد نمو الخلايا باستخدام أسلوب الاستبعاد تريبان الأزرق؛ عندما يتم استئناف نمو الخلايا (عادة بعد فترة من أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع)، تعرض الخلايا إلى جرعة أعلى إذ تركز تراستوزوماب.
  4. تعرض الخلايا إلى جرعة تراستوزوماب (من 100 ميكروغرام/مل إلى 400 ميكروغرام/مل) تتزايد تدريجيا حتى تبقى الخلايا المتزايد (بعد حوالي 2 أسابيع) على الرغم من وجود تركيز عالية من المخدرات (على الأقل 2.5-4-fold أعلى من ذروة البلازما).
  5. القيام فحص كلونوجينيك لتقييم مستوى المقاومة للعلاج المستهدفة عند كل تغيير في تركيز مثبط العلاج المستهدف في الأجلين المتوسط والثقافة، وتعريف الفهرس50 IC المقاومة النسبية (RR IC50) على النحو التالي.
    1. بذور الخلايا 500 في 24 الثقافة المتعددة لوحات.
      ملاحظة: يجب إعداد الآبار 5 لكل مجموعة الشرط.
    2. يعرض الخلايا للعلاج بهدف زيادة المانع (تراستوزوماب) التركيزات من 100 ميكروغرام/مل ما يصل إلى 400 ميكروغرام/مل.
    3. احتضان الخلايا في حاضنة2 CO في 37 درجة مئوية لمدة 15 يوما.
    4. وبعد الحضانة، إصلاح ووصمة عار عينات كما يلي.
      1. إزالة الخلايا المتوسطة والشطف مع برنامج تلفزيوني 1 x 10 مل. إزالة برنامج تلفزيوني x 1 وإضافة 2-3 مل من محلول التثبيت (حمض الخليك: الميثانول، 1:7، (المجلد/المجلد)). إزالة تثبيت الحل وإضافة الحل البنفسجي كريستال 0.5%. احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 2
      2. إزالة الحل البنفسجي كريستال بعناية عن طريق يسفط مع ماصة وتزج لوحات في مياه الحنفية شطف أي مخلفات الحل البنفسجي كريستال. أيردري في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 2 يوما.
    5. عد مستعمرات الخلايا أكثر من 50 باستخدام مجهر مقلوب (4 X التكبير).
      ملاحظة: تحتاج اثنين من المراقبين المستقلين لهذا.
    6. حساب RR IC50 كالنسبة بين القيمة50 IC للخلايا المستهدفة-العلاج-مقاومة سوبكلون والقيمة للخلايا الأصلية/ساذجة.

2. بروتوكول التحقق من صحة للمرشح الذي استهدف العلاج بالجينات المقاومة (R-جين)

ملاحظة: بعد أن وصف التعبير الجيني، التواقيع المقترنة بالمقاومة المكتسبة للعلاج المستهدف وأي الجينات المرشحة كما سيتم التحقيق في برنامج التشغيل للمقاومة من خلال: أ) RT-PCR، وب) الغربية لطخة تحليل.

  1. RT-PCR الوقت الحقيقي
    1. استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من خطوط الخلايا باستخدام خليط ثيوسيانات-الفينول-كلوروفورم حمض جوانيدينيوم (انظر الجدول للمواد).
    2. إجراء النسخ العكسي (RT) ردود فعل استخدام كبسولة تفجير هيكسامير عشوائي وتعيين cycler الحرارية كما يلي: فتيلة عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، الرايت في 46 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، والمنظمة RT عند 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
    3. استخدام 400 نانوغرام من مجموع الحمض النووي الريبي لفعل 20 ميليلتر. إعداد الخليط رد فعل للعينة على النحو التالي: 7 ميليلتر رناسي مجاناً ح2س، 2 ميليلتر جالحمض النووي (10 نانوغرام/ميليلتر)، 1 ميليلتر 20 x الفلورسنت المسمى مسبار محددة الهدف، و 10 ميليلتر 2 × مزيج يحتوي على المخزن المؤقت، دنتبس وبوليميريز الحمض النووي (انظر الجدول للمواد).
    4. إضافة 20 ميليلتر من خليط رد فعل لكل لوح جيدا وتشغيل البرنامج التالي: عقد المرحلة عند 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (المرحلة 1)؛ ثم 40 دورات في 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية وعند 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
  2. لطخة غربية
    1. استرداد تعليق الخلية بإضافة 2 مل من محلول التربسين/يدتا 0.05% والسماح 2-3 دقيقة التربسين للعمل.
    2. إضافة 2 مجلدات متوسطة الحجم تحتوي على 10% الجنين البقري المصل لتحييد التربسين (مثلاً، 2 مل متوسط لكل 1 مل من التربسين) والطرد المركزي في 1,200 س ز للحد الأدنى 5 تجاهل طافية وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني الباردة x 1.
    3. الطرد المركزي في 1,200 س ز لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية. ريسوسبيند بيليه الخلية مع المخزن المؤقت لتحلل واحتضان في الروك عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      1. كمية تحلل المخزن المؤقت يعتمد على عدد الخلايا(مثلاً 100 ميليلتر للخلايا6 1 x 10)؛ تأكد من إعداد المخزن المؤقت لتحلل جديدة في كل مرة. 1 مل من تحلل إعداد المخزن المؤقت (إجازة في الجليد): استخدام ميليلتر 975 م-كل المخزن المؤقت ليستي الثدييات ومثبطات البروتياز والفوسفاتيز 15 ميليلتر 10 ميليلتر 100 ميكرومتر مثبطات بمسف.
    4. استرداد البروتين طافية بالطرد المركزي ليساتي الخلية في 13,000 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    5. تحديد تركيزات البروتين باستخدام مقايسة بروتين اتفاق التعاون الأساسي.
    6. إضافة 4 × لايمملي عينة المخزن المؤقت لعينات البروتين (على الأقل 20-30 ميكروغرام من البروتين) والحرارة عند 100 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
    7. استخدام المواد الهلامية الخرسانة الجاهزة 4-20% وتحميل 20-30 ميكروغرام من البروتين لايملي الحل و 5-10 ميليلتر من البروتين القياسية كل عينة.
    8. ملء الطوق لطخة غربية مع المخزن المؤقت 1 x/SDS تريس/جليسيني وتشغيل جل في 110 V لمدة 30-60 دقيقة (عندما يتوقف الوقت تحقق من أن الصبغة قد وصلت إلى نهاية الهلام، إلا تشغيل لبضع دقائق إضافية)
    9. اليكتروبلوت لنقل البروتينات إلى غشاء PVDF (انظر الجدول للمواد) باستخدام نظام شبه جاف.
    10. كتلة الغشاء مغطس في الحل المناسبة من البروتين (اللبن/جيش صرب البوسنة 5 ٪) على شاكر في درجة حرارة الغرفة ح 1.
    11. جعل حلاً 1: 400 مع جسم الأساسي مكافحة IQGAP1 في حل حليب 5 في المائة (انظر الجدول للمواد).
    12. وضع الغشاء في حل جسم الأولية على شاكر في غرفة باردة بين عشية وضحاها.
    13. في اليوم التالي، تجاهل حل جسم ونقع في الحل 1 x T-تبس (1 × تي-تبس: x 1 أضاف "تريس المالحة المخزن المؤقت" قبل Tween20 0.1%) على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 دقائق.
    14. تجاهل تي-تبس 1 × الحل واستبدال. كرر 3 مرات.
    15. جعل حلاً جسم ماوس ثانوي المضيفين بإضافة جسم الغربية القياسية لطخة الكشف (انظر الجدول للمواد) ومكان الغشاء على شاكر؛ تترك في درجة حرارة الغرفة ح 2.
    16. تجاهل حل جسم ونقع في تي-تبس 1 x الحل على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 دقائق.
    17. تجاهل تي-تبس 1 × الحل واستبدال. كرر 3 مرات.
    18. نقع غشاء لمدة 5 دقائق في حل تشيميلومينيسسينت، وصورة الغشاء في تصوير تشيميلومينيسسينسي.

3-استعادة حساسية المانع المستهدفة-العلاج بمرشح R-جين تدق إلى أسفل

  1. إعداد الخلية
    1. إعداد تعليق خلية واحدة من تريبسينيزيشن. أداء تعداء في اليوم الذي يتم مطلي بالخلايا.
      1. أغسل NCI-N87 الخلايا مع برنامج تلفزيوني، واحتضان في 37 درجة مئوية مع حل التربسين/يدتا 0.05% 5-10 دقيقة 2 إضافة حجم ربمي المتوسطة تحتوي على 10% الجنيني البقري المصل لتحييد التربسين (مثلاً، 2 مل متوسط لكل 1 مل من التربسين).
      2. حساب عدد الخلايا مع هيموسيتوميتير استخدام التلوين تريبان الأزرق. بذور 2.5 × 105 خلايا (التقاء 60 ٪) على قارورة2 سم T25 لكل شرط.
        ملاحظة: يتحدد العدد المناسب من الخلايا لبذر الوقت مضاعفة خط الخلية ومدة التجربة. ويهدف إلى تحقيق الجينات المستهدفة أسفل تدق لمدة التجربة بأكملها. تسعة T25 سم2 قوارير تعتبر مثالية لظروف تعداء والتحليل كلونوجينيك (3 قوارير لعناصر التحكم، 3 قوارير لعناصر سلبية تعداء، 3 قوارير للجينات المستهدفة تعداء).
  2. عكس تعداء
    1. إعداد الجينات المستهدفة والسلبية تحكم تعداء ميكس لكل قارورة2 سم T25 كما يلي.
      1. تمييع ميليلتر 12.5 كل استهداف الجين siRNA النوكليوتيد أو "المراقبة السلبية" siRNA النوكليوتيد في المتوسط تعداء الأساسية الحد الأدنى (نسبة 01:55؛ انظر الجدول للمواد).
      2. إضافة كاشف تعداء الحويصلية الأيوني (نسبة 1:1 مع استهداف الجين النوكليوتيد siRNA؛ انظر الجدول للمواد). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
        ملاحظة: الحجم الإجمالي لهذا المزيج تعداء هو 700 ميليلتر.
      3. إضافة 700 ميليلتر من مزيج تعداء لكل قارورة2 سم T25. احتضان خلايا في 37 درجة مئوية لمدة 1-3 أيام.
    2. تحقق من الجينات تدق لأسفل RT-PCR وتحليل لطخة غربية. إعادة التحقق من أثر المفترضة R-جين تدق لأسفل على استعادة حساسية لوكيل العلاجية المستهدفة من خلال تجارب تشكيل مستعمرة (كرر الخطوة 1، 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الشكل 1 يبين الإطار الداخلي التجريبية. ثلاثة سرطان المعدة خلية خطوط التعبير عن مستوى عال من HER2 وحساسة إلى تراستوزوماب (IC50 < مستوى البلازما الذروة من المخدرات، الشكل 2 ألف، الرسم البياني الأيسر) كانت تزرع في الثقافة المتوسطة التي تحتوي على عامل العلاجية المستهدفة. 10 إضعاف أقل جرعة من تركيز البلازما الذروة تراستوزوماب (10 ميكروغرام/مل) تم تعيين كجرعة بداية، وزادت إلى 400 ميكروغرام/مل تدريجيا على مدى فترة من 8-12 شهرا. وبعد ذلك حصلنا على ثلاثة سوبكلونيس تميزت النمط الظاهري مقاومة مستقرة مع IC50 قيم أقل من مستويات البلازما الذروة تراستوزوماب (الشكل 2A، الرسم البياني الأيمن). على وجه الخصوص، سوبكلون الأكثر مقاومة، HR NCI N87, بلغت قيمة50 RR IC 28.57 (الشكل 2). IQGAP1 يبدو أن تلعب دوراً محوريا في النمط الظاهري المقاومة للخط الفرعي N87 NCI الموارد البشرية. تحليل البروتينات والجينات تعبيرات يؤيد هذه الفرضية: نحو إضعاف أعلى من مستوى البروتين IQGAP1 في سوبكلون مقاومة في خلايا الوالدين. وبالمثل، المراسل التعبير الجيني IQGAP1 أعلى 2.5-fold في السطر الفرعية N87 NCI الموارد البشرية مما في السطر NCI N87 (الشكل 3A).

وأجرى IQGAP1 إسكات الجينات لتقييم دورها في تطوير النمط الظاهري مقاومة تراستوزوماب. البروتوكول المستخدم لإسكات IQGAP1 التعبير الجيني أثبتت أنها فعالة لا سيما نهدم محتوى البروتين IQGAP1 تقريبا كافة الخلايا التي نمت في T25 سم2 خلية ثقافة قارورة (حوالي 2.5 × 105 خلايا) (الشكل 3A).

وعلاوة على ذلك، أكدت الإنزيم كلونوجينيك فرضية عمل، عرض ذلك الجين IQGAP1 إسكات يعيد تراستوزوماب حساسية في الخلايا N87 NCI الموارد البشرية كما تدل على ذلك بتخفيض قيمة50 IC إلى 7 ميكروغرام/مل (الشكل 3B).

Figure 1
رقم 1: إطار للتحليل في المختبر للآليات الكامنة وراء الحصول على استهداف المقاومة العلاج. ولدت ثلاثة سوبكلونيس تراستوزوماب مقاومة مختلفة مستمدة من ثلاثة خطوط الخلايا مختلفة تراعي تراستوزوماب السرطان وتميزت يسلسل الجيل القادم، المناعي، لإدخال تعديلات في آليات إشارات HER2 لطخة الغربية، وتقنيات RT-PCR. وأظهرت جميع سوبكلونيس إليه مقاومة مختلفة. استعادة حساسية العلاج المستهدفة في سوبكلون محددة عندما تم إسكات الجينات سائق المرشح للمقاومة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: تحديد المقاومة النسبية IC50 مؤشر (RR IC50) عن طريق الفحص كلونوجينيك في خطوط خلايا سرطان المعدة. منحنيات النمو (أ) بيانات ساذجة (الرسم البياني الأيسر) ومقاومة (الرسم البياني الصحيح) خطوط الخلايا المتولدة عن مستعمرة تشكيل التجارب. ويمثل المحور السيني تركيز تراستوزوماب. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري (SD). الانحراف المعياري لم تتجاوز 5 في المائة. (ب) الصور التمثيلية للانزيم كلونوجينيك دعم توليد سوبكلون NCI-N87-مقاومة. كما هو موضح بالجدول الزمني، توليد خلايا تراستوزوماب NCI N87 الموارد البشرية المطلوبة 12 شهرا تعرض المستمر للوكيل المستهدفة. وهذا الرقم مقتبس من أعمال أرينتي et al. 9 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: استعادة حساسية تراستوزوماب بواسطة IQGAP1 الجينات تدق المنسدلة. (أ) محتوى البروتين IQGAP1، بتحليل دينسيتوميتريك هو مبين في الرسم البياني بار الوالدين NCI N87 الخط، وفي مقاومة وإسكات المقاومة سوبكلون (الرسم البياني الأيسر). مرناً كما تم التحقق من مستوى التعبير IQGAP1 في جميع خطوط الخلايا الثلاث بتقنية RT-PCR (الرسم البياني الأيمن). وقدمت البيانات كما يعني المقايسة كلونوجينيك التنمية المستدامة. (ب) ± أظهرت حساسية مختلفة للوالدين NCI N87 الخط وفي به سوبكلون مقاومة وإسكات المقاومة إلى 100 ميكروغرام/مل تراستوزوماب. كان يعول المستعمرة بعد 14 يوما بذور الخلية. وتظهر الأرقام المصغرة ثقافات مستعمرة الممثل. وهذا الرقم مقتبس من أعمال أريينتي et al. 9 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الخطوات بروتوكول T25 سم2
بذور الخلايا روافد 60% خلايا ملتصقة 1.75 × 103
النوكليوتيد siRNA مخفف في "الحد الأدنى من تعداء الأساسية" المتوسطة (نسبة 01:55) siRNA ميليلتر 12.5
تعداء المتوسطة ميليلتر 687.5
إضافة كاشف تعداء ليبوفيكتاميني كاشف ليبوفيكتاميني ميليلتر 12.5
احتضان احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة
إضافة الخليط إلى الخلايا احتضان خلايا في 37 درجة مئوية لمد 1-3

الجدول 1: أوصى المبالغ الكاشف ووحدات التخزين لمرشح المقاومة الجينات تدق لأسفل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بينما شخصية واستهدفت العلاجات أثارت الحماس المتزايد، تواجه هذه العلاجات ما يسمى 'الذكية' العقبة الرئيسية نفسها كالمخدرات العلاج الكيميائي التقليدي، أي، واكتساب المقاومة للأدوية سريعة ولا يمكن التنبؤ بها. لتحسين نتائج العلاج المستهدفة، يجب أن تحل مشاكل مقاومة العقاقير من خلال فهم أفضل للآليات التي تسبب لهم. هنا، وقد عرضنا منهجية متاحة على نطاق واسع في المختبر للتحقيق في آليات المقاومة المكتسبة على أدوية العلاج المستهدف في نماذج خط خلية سرطان.

جيل سوبكلونيس مقاومة للعلاج المستهدف هو أكثر المسائل حساسية وصعوبة في توحيد خطوة في هذا البروتوكول، بسبب عدم تجانس الوراثية المتأصلة بين خطوط الخلية المستخدمة، ودرجة مختلفة من الحساسية المخدرات. ولهذه الأسباب، قد يختلف الوقت اللازم للحصول على مقاومة سوبكلونيس. عادة ما يسبب التعرض المزمن للسرطان وكلاء الجزيئية تثبيط نمو ورم قوية. ومع ذلك، بعد فترة متغير التعرض المستمر المخدرات (8-12 شهرا)، خلايا استئناف النمو بنسبة مماثلة لتلك التي تحكم دون علاج الخلايا.

وبالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن البيانات قد استخدمت لأفترض مقاومة العلاج بالجينات ذات الصلة هدف التعبير الجيني، مستوى تعبير مختلفة ليست دائماً تعكس وظيفة بروتين غير لائق أو ترتبط بالنمط الظاهري المقاومة. نظراً لتعقيد العلاقة بين التعبير عن الجين المقاوم للأدوية المفترضة والمقاومة للعلاج المستهدفة، كذلك الجزيئية هي الحاجة إلى إجراء تحقيقات، مثل تحليل المعلوماتية الحيوية، بما في ذلك الجينات/البروتين تفاعل وإثراء عملية بيولوجية، والنمذجة الجزيئية.

يمكن أن تكون نقطة حرجة أخرى الخصوصية ودقة اليغنوكليوتيد siRNA للحد من التعبير الهدف. يمكن أن يكون أحد الحلول الممكنة استخدام أدوات التصميم لتحديد siRNA الوظيفية، وهي مزيج من siRNA لنفس الجين المستهدف.

أخيرا، وجود قيود بسيطة تتصل بالأسلوب المستخدم لاستعادة الحساسية للمانع العلاج المستهدفة بسبب فترة عابرة من تعداء. القصوى لأسفل تدق لاستهداف مرناً (> 85%) أبلغ في تعداء بعد يوم 2 وأبقى > 80% من خلال أيام 5-7. ضرب كبير إلى أسفل، أن كان لا يزال لوحظ قدر في أقل من يوم 6. ولهذا السبب، ينبغي إجراء الفحص سيتوتوكسيسيتي للتحقق من استعادة حساسية المخدرات في غضون حوالي 5 أيام من إسكات الجينات.

لدينا بروتوكول أسلوب الوقت--وفعالة من حيث التكلفة للتحقيق في المختبر اكتسبت المقاومة. النسخ المتطابق لعدم التجانس داخل ورم الخلايا السرطانية، يمكن أن تساعد توليد مقاومة سوبكلونيس، كشف النقاب عن آليات رواية المقاومة المكتسبة للسرطان وكلاء المستهدفة. على وجه الخصوص، فأكثر ملاءمة للجينوم الفائق أو عروض البروتين البشري لتحديد التعديلات الجزيئية في خلايا مقاومة من نظرائهم الحساسة.

يمكن تمديد هذا البرنامج السريري بسهولة للتحقيق في آليات المقاومة العامة للعوامل العلاجية المستهدفة في ورم مختلفة هيستوتيبيس، توفير إجراءات موحدة لاكتشاف المزيد المخدرات أهدافا للتغلب على المقاومة للعقاقير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

الكتاب أود أن أشكر الدكتور فيرونيكا زانوني لتحرير المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trizol Reagent Invitrogen 15596026 TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples
ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT Bio-Rad 1708891 The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR.
TaqMan gene expression assay Life Technologies 4331182 Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5’ end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3’ end.
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent Thermo Scientific 78501 Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells.
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Scientific 78440 Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates.
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard.
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747 Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample.
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 456-1094 Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis.
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards Bio-Rad 1610376 Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD).
10x Tris/Glycine/SDS Bio-Rad 1610732 10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE.
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs Bio-Rad 1704156 Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane.
Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate Bio-Rad 1610381 StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots.
Immun-Star WesternC solution Bio-Rad 5572 Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein.
Universal Negative Control Invitrogen 12935300 Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology.
opti-MEM Glutamax Medium Thermo Fisher Scientific 51985026 Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology.
Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA Ambion 4390824 RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types.
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent Invitrogen 13778075 Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types.
Mouse anti-IQGAP1 Invitrigen 33-8900 working concentration: 1:400 in 5% milk solution
goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005 Santa Cruz sc-2005 working concentration: 1:10000 in 5% milk solution
PMSF Sigma Aldrich P 7626 this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase
Thermocycler for RT-PCR MJ Research MJ Research PTC-200 Thermal Cycler it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3°C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Real Time RT-PCR instrument Applied Biosystems 7500 RT-PCR system This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Microvolume Spectrophotometers Thermo Scientific Nanodrop It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample
Blotting system Bio-Rad Trans-Blot Turbo system It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes
Image acquisition system and gel documentation Bio-Rad Chemidoc image system It is easy to use for chemiluminescent detection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gerber, D. E. Targeted therapies: a new generation of cancer treatments. Am Fam Physician. 77 (3), 311-319 (2008).
  2. Zhang, J., Yang, P. L., Gray, N. S. Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nat Rev Cancer. 9 (1), 28-39 (2009).
  3. Nelson, A. L., Dhimolea, E., Reichert, J. M. Development trends for human monoclonal antibody therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 767-774 (2010).
  4. Chabner, B. A., Roberts, T. G. Timeline: Chemotherapy and the war on cancer. Nat Rev Cancer. 5 (1), 65-72 (2005).
  5. Gilbert, L. A., Hemann, M. T. Chemotherapeutic resistance: surviving stressful situations. Cancer Res. 71 (15), 5062-5066 (2011).
  6. Izar, B., Rotow, J., Gainor, J., Clark, J., Chabner, B. Pharmacokinetics, clinical indications, and resistance mechanisms in molecular targeted therapies in cancer. Pharmacol Rev. 65, 1351-1395 (2013).
  7. Ellis, L. M., Hicklin, D. J. Resistance to Targeted Therapies: Refining Anticancer Therapy in the Era of Molecular Oncology. Clin Cancer Res. 15 (24), 7471-7478 (2009).
  8. Asić, K. Dominant mechanisms of primary resistance differ from dominant mechanisms of secondary resistance to targeted therapies. Crit Rev Oncol Hematol. 97, 178-196 (2016).
  9. Arienti, C., et al. Preclinical evidence of multiple mechanisms underlying trastuzumab resistance in gastric cancer. Oncotarget. 7 (14), 18424-18439 (2016).
  10. Tanner, M., et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol. 16 (2), 273-278 (2005).
  11. Bang, Y. J., et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet. 376 (9742), 687-697 (2010).
  12. ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01130337. A Study of Capecitabine [Xeloda] in Combination With Trastuzumab [Herceptin] and Oxaliplatine in Patients With Resectable Gastric Cancer. , Available from: http://clinicaltrials.gov/show/NCT01130337 (2017).
  13. ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01748773. A Study of the Combination of Oxaliplatin, Capecitabine and Herceptin (Trastuzumab) and Chemoradiotherapy in The Adjuvant Setting in Operated Patients With HER2+ Gastric or Gastro-Esophageal Junction Cancer (TOXAG Study). , Available from: http://www.clinicaltrials.gov/show/NCT01748773 (2017).
  14. ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01472029. Explorative Phase II Study of Perioperative Treatment in Patients With Adenocarcinoma of the Gastroesophageal Junction or Stomach (HerFLOT). , Available from: http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01472029 (2017).
  15. ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01196390. Radiation Therapy, Paclitaxel, and Carboplatin With or Without Trastuzumab in Treating Patients With Esophageal Cancer. , Available from: http://clinicaltrials.gov/show/NCT01196390 (2017).
  16. Shimoyama, S. Unraveling trastuzumab and lapatinib inefficiency in gastric cancer: Future steps (Review). Mol Clin Oncol. 2 (2), 175-181 (2014).
  17. Kelly, C. M., Janjigian, Y. Y. The genomics and therapeutics of HER2-positive gastric cancer-from trastuzumab and beyond. J Gastrointest Oncol. 7 (5), 750-762 (2016).
  18. Wong, S. S., et al. Genomic landscape and genetic heterogeneity in gastric adenocarcinoma revealed by whole-genome sequencing. Nat Commun. 5, 5477 (2014).
  19. Oshima, Y., et al. Lapatinib sensitivities of two novel trastuzumab-resistant HER2 gene-amplified gastric cancer cell lines. Gastric Cancer. 17 (3), 450-462 (2014).
  20. Pignatta, S., et al. Prolonged exposure to (R)-bicalutamide generates a LNCaP subclone with alteration of mitochondrial genome. Mol Cell Endocrinol. 382 (1), 314-324 (2014).

Tags

بيولوجيا السرطان، 130 قضية، في المختبر النموذجي، الإنزيم كلونوجينيك، العلاج المستهدفة، والمقاومة للعقاقير، وإعادة التوعية، تعداء siRNA
ابحث عن برنامج تشغيل مسارات اكتسبت مقاومة للعلاج المستهدفة: جيل سوبكلون المقاومة للأدوية وحساسية استعادة بواسطة خبط الجينات لأسفل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arienti, C., Pignatta, S., Zanoni,… More

Arienti, C., Pignatta, S., Zanoni, M., Cortesi, M., Zamagni, A., Piccinini, F., Tesei, A. Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down. J. Vis. Exp. (130), e56583, doi:10.3791/56583 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter