Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Udkig efter Driver veje af erhvervet modstand mod målrettede terapi: resistente Subclone Generation og følsomhed gendannelse af genet Knock-down

Published: December 11, 2017 doi: 10.3791/56583
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS

Summary

Dette er en tid og omkostninger effective in vitro- protokollen at undersøge mekanismerne af erhvervet modstand mod målrettede terapeutiske agenter, som er en yderst udækket medicinsk behov i kræft forvaltning.

Abstract

De seneste to årtier har set et skift fra cytotoksiske stoffer til målrettet terapi i medicinsk onkologi. Selv om målrettede terapeutiske agenter har vist mere imponerende klinisk effekt og minimerede bivirkninger end traditionelle behandlinger, er resistens over for lægemidler blevet den største begrænsning til deres ydelser. Flere prækliniske undersøgelser/in vitro- / in vivo modeller af erhvervet modstand mod målrettede agenter i klinisk praksis er blevet udviklet hovedsageligt ved hjælp af to strategier: i) genetisk manipulation til modellering genotyper af erhvervet modstand, og ii) in vitro / in vivo udvalg af resistente modeller. I den nuværende arbejde foreslår vi en samlende ramme for at undersøge de underliggende mekanismer er ansvarlige for erhvervet modstand mod målrettede terapeutiske agenter, startende fra generation af resistente cellulære subclones til beskrivelse af hæmning procedurer, der anvendes til at genoprette følsomheden til inhibitoren. Denne enkle tid og omkostninger effective tilgang er alment gældende og let kunne udvides for at undersøge resistensmekanismer til andre målrettede terapeutiske lægemidler i forskellige tumor histotypes.

Introduction

Opfølgning på de afgørende opdagelser i molekylær og cellulær biologi, er en række nye syntetiserede anticancer molekyler blevet udviklet for at selektivt målrette muterede signaling veje i en bred vifte af tumortyper. Navnlig to kategorier af målrettede terapeutiske agenter med unikke egenskaber i onkologi, nemlig syntetiske kemiske forbindelser og rekombinant monoklonale antistoffer, er kendt for at have opnået kliniske succeser og dramatisk ændret kræft pleje i de seneste årtier1,2,3.

Alligevel, trods deres imponerende første respons på behandlingen, størstedelen af kræftpatienter har udviklet resistens over for lægemidler til alle målrettede terapeutiske agenter, både monoklonale antistoffer og kinase hæmmere. Som følge heraf er medicinresistens, den største hurdle for klassiske anti-cancer medicin4, stadig en stor udfordring for nye målrettede behandlinger5,6.

Modstand mod målrettede terapi kan være iboende (dvs., primære) eller erhvervet (dvs.sekundære). Iboende modstand beskriver en de novo manglende respons på terapi, mens sekundære resistens opstår efter en periode med svar på stof behandling7. Sidstnævnte er forårsaget af udbrud af små årgange af tumorceller i hovedparten af den primitive tumor eller beliggende i distale kryptiske anatomiske nicher, udstiller op til 90% resistens over for et eller flere målrettede terapeutiske agenter. Molekylære mekanismer bag en resistens udvikling til målrettet behandling primært et resultat af target genmutationer og redundante aktivering af andre Pro overlevelse signaling veje, hvis forståelse er stadig langt fra komplet8.

I dette arbejde foreslog vi en tid og omkostninger effective tilgang for at undersøge i vitro mekanismer af erhvervet modstand mod målrettede terapeutiske agenter, startende fra generation af resistente cellulære subclones til beskrivelse af tavshed procedurer anvendes til genoprette følsomhed til inhibitor, et afgørende værktøj til test og validering af arbejdshypoteser. Især blev vores tilgang brugt til at undersøge, i mavekræft, resistensmekanismer til trastuzumab (fxHerceptin), en humaniseret monoklonalt antistof rettet mod det ekstracellulære domæne af HER2 protein9. Trastuzumab + kemoterapi er bredt accepteret som den standard første-linie behandling til HER2-positiv metastaserende brystkræft. Takket være de seneste prækliniske undersøgelser viser, at anti-HER2 behandlingsformer har betydelig aktivitet i både in vitro- og i vivo HER2-positive gastrisk kræft modeller10,11, Molekylær medicin målretning HER2 har været grundigt undersøgt i kliniske forsøg, er hvoraf nogle stadig i gang, på patienter med gastroøsofageal kræft12,13,14,15.

Disse undersøgelser har understreget det stigende antal patienter, der oplever resistens over for trastuzumab16, ligeledes til hvad er observeret for andre målrettet terapeutisk hæmmere. Især svarprocent af trastuzumab var 47%, og median samlet overlevelse for patienter på trastuzumab + kemoterapi var kun 2,7 måneder længere end for patienter i kemoterapi alene17. Dette foreslog, at mens primære trastuzumab modstand er fremherskende, sekundære trastuzumab modstand er uundgåelig. Af denne grund er der presserende behov for at præcisere de mekanismer, der forårsager HER2-målrettet terapi modstand i gastrisk kræft, som er endnu mere problematisk givet den samhandel tumorsygdomme genetiske heterogenitet af denne neoplasi18.

Derudover har mekanismer af resistens over for trastuzumab i mavekræft bevist udfordrende at forklare, delvist på grund af vanskeligheden ved at opnå pålidelige prækliniske modeller repræsentant af denne betingelse. Oshima et al. rapporterede en i vivo udvælgelsesmetode af trastuzumab-resistente gastrisk kræft cellelinjer, bestående af en gentagen kultur i en lille resterende peritoneal metastaser efter behandling med trastuzumab19. Men behovet for en indhegning, specifikke animalske håndtering ekspertise og godkendelse af dyr etiske komité bidraget til at gøre det en gang - og cost-forbrugende metode. Den tilgang, vi beskriver i dette arbejde er simpel og bredt anvendelig, og let kunne udvides for at undersøge resistensmekanismer til andre terapeutiske lægemidler i forskellige tumor histotypes20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Denne protokol er blevet specifikt justeret til analyse af de underliggende erhvervet resistens over for trastuzumab af HER-positive gastrisk kræft cellelinjer mekanismer. Alle laboratorieinstrumenter nødvendige indberettes i Tabel af materialer.

1. generation af målrettet terapi resistente Subclones

Bemærk: Dette er den mest kritiske og vanskeligt at standardisere trin i protokollen, at forskellige cellelinjer kan udvise forskellige følsomheder til målrettet terapeutisk inhibitoren uafhængigt fra deres tumor histotype eller narkotika koncentration anvendes.

  1. Kultur NCI-N87 celle linje i RPMI medium suppleret med føtalt kalveserum (10%) og glutamin (2 mM, 1%), som en éncellelag ved 37 ° C, og frø det på 25 cm2 kultur kolber.
  2. Tilføj til næringssubstratet i hver kolbe 10 µg/mL af trastuzumab som den startdosis. Udsætte celler til den startdosis, indtil de genoptage voksende.
    Bemærk: Startdosis af de målrettede terapi hæmmer bør 10-fold lavere end dens peak plasmakoncentration. Peak plasmakoncentration er det højeste niveau af narkotika koncentration registreres i patientens blod normalt efter flere doser af standard terapi. Denne værdi kan hentes fra undersøgelser af farmakokinetik.
  3. Overvåge cellevækst med metoden trypan blå udstødelse; Når cellevækst er genoptaget (typisk efter en periode på to til tre uger), udsætte celler til en 10-fold højere dosis koncentration af trastuzumab.
  4. Udsætte celler til en gradvist stigende dosis af trastuzumab (fra 100 µg/mL til 400 µg/mL) indtil celler holde voksende (efter ca. 2 uger) på trods af tilstedeværelsen af en høj drug koncentration (mindst 2,5 - bukkes 4 gange højere end plasma peak).
  5. Udfører en clonogenic analyse til at vurdere niveauet af resistens over for målrettet terapi ved hver ændring i koncentrationen af target terapi inhibitor i substratet, og definere relative modstand IC50 indekset (RR IC50) som følger.
    1. Seed 500 celler i 24 multi godt kultur plader.
      Bemærk: 5 brønde skal forberedes for hver betingelse.
    2. Udsætte celler til stigende target terapi inhibitor (trastuzumab) koncentrationer fra 100 µg/mL op til 400 µg/mL.
    3. Inkuber celler i en CO2 inkubator ved 37 ° C i 15 dage.
    4. Efter inkubationen fix og plette prøver som følger.
      1. Fjerne medium og skyl celler med 10 mL 1 x PBS. Fjern 1 x PBS og tilsæt 2-3 mL af fiksering (eddikesyre syre: methanol, 1:7, (vol/vol)). Fjern fiksering løsning og tilsæt 0,5% krystalviolet løsning. Inkuber ved stuetemperatur for 2 h
      2. Fjern krystalviolet løsning omhyggeligt ved sugning med en pipette og fordybe plader i vand fra hanen til at skylle ud krystalviolet løsning rester. Lufttørre ved stuetemperatur i op til 2 dage.
    5. Antal kolonier af mere end 50 celler ved hjælp af en omvendt mikroskop (4 X forstørrelse).
      Bemærk: To uafhængige observatører er behov for dette.
    6. Beregne RR IC50 som forholdet mellem IC50 værdien af target-terapi-resistent subclone celler og værdien af de oprindelige/naive celler.

2. valideringsprotokollen for kandidaten målrettet terapi resistens gen (R-gen)

Bemærk: Efter karakterisering af genekspression, signaturer forbundet med de erhvervede modstand mod målet terapi og enhver kandidat gen som driver modstand vil blive undersøgt gennem: a) RT-PCR, og b) Western blot analyse.

  1. Real-time RT-PCR
    1. Uddrag total RNA fra celle linjerne ved hjælp af syre guanidinium kaliumthiocyanat-phenol-chloroform blanding (Se Tabel af materialer).
    2. Udføre reverse transkription (RT) reaktioner ved hjælp af tilfældige hexamer primere og indstille den termiske cycler som følger: priming ved 25 ° C i 5 min, RT på 46 ° C i 20 min., og RT inaktivering ved 95 ° C i 1 min.
    3. Brug 400 ng af total RNA 20 µL reaktioner. Forberede reaktionsblandingen til prøven som følger: 7 µL RNase gratis H2O, 2 µL cDNA (10 ng/µL), 1 µL 20 x fluorescerende-mærket target-specifikke sonde og 10 µL 2 x blanding indeholdende buffer, dNTP'er og DNA-polymerase (Se Tabel af materialer).
    4. Tilføj 20 µL af en reaktionsblanding til hver godt plade og køre følgende program: holding fase ved 50 ° C i 2 min. ved 95 ° C i 10 min. (1 cyklus); derefter 40 cyklusser ved 95 ° C til 15 s og ved 60 ° C i 1 min.
  2. Vestlige skamplet
    1. Genskab celle suspensioner af tilsætning 2 mL 0,05% trypsin/EDTA-oploesning og så 2-3 min. til trypsin at arbejde.
    2. Tilføj 2 bind af medium indeholdende 10% føtal bovint serum til at neutralisere trypsin (f.eks.2 mL af medium for hver 1 mL trypsin) og centrifugeres ved 1.200 x g i 5 min. Fjern supernatanten og vask celler med koldt 1 x PBS.
    3. Der centrifugeres ved 1.200 x g i 5 min og kassér supernatanten. Resuspenderes celle med lysisbuffer og Ruger på en rocker ved 4 ° C i 30 min.
      1. Mængden af lysisbuffer afhænger af antallet celler (fx, 100 µL til 1 x 106 celler); Sørg for at forberede frisk lysisbuffer hver gang. 1 ml af lysis buffer forberedelse (orlov på is): bruge 975 µL M-PER pattedyr lysate buffer, 15 µL protease og fosfatase hæmmere og 10 µL 100 µM PMSF hæmmere.
    4. Genskab den supernatanten protein af celle lysate centrifugering ved 13.000 x g ved 4 ° C i 15 min.
    5. Fastslå protein koncentrationer ved hjælp af en BCA protein assay.
    6. Tilføj 4 x LaemmLi prøvebuffer protein prøver (mindst 20-30 µg protein) og varme ved 100 ° C i 3 min.
    7. Bruge præfabrikerede 4-20% geler og indlæse 20-30 µg af LaemmLi protein løsning og 5-10 µL af protein standard pr. prøve.
    8. Fyld den vestlige skamplet ring med TRIS/GLICYNE /SDS 1 x buffer og køre gel på 110 V i 30-60 min. (når tid stopper kontrollere, at farvestoffet har nået slutningen af gel, ellers køre et par ekstra minutter)
    9. Electroblot til at overføre protein i en PVDF membran (Se Tabel af materialer) ved hjælp af en semi-tør system.
    10. Blokere membranen af iblødsætning i passende protein løsning (mælk/BSA 5%) på shaker ved stuetemperatur i 1 time.
    11. Gøre en 1: 400 løsning med anti-IQGAP1 primære antistof i en 5% mælk løsning (Se Tabel af materialer).
    12. Sted membran i primære antistof løsning på en shaker i et koldt rum natten over.
    13. Den følgende dag, kassere antistof løsning og lægges i blød i T-TBS 1 x løsning (1 x T-TBS: 1 x Tris saltvand Buffer tilføjet af Tween20 0,1%) på en shaker ved stuetemperatur i 7 min.
    14. Kassér T-TBS 1 x løsning og erstat. Gentag 3 gange.
    15. Gøre en 1:10,000 sekundære mus-antistof løsning ved at tilføje antistof til standard Western duppes påvisning (Se Tabel af materialer) og placere membranen på en shaker; forlade ved stuetemperatur i 2 timer.
    16. Kassér antistof løsning og lægges i blød i T-TBS 1 x løsning på en shaker ved stuetemperatur i 7 min.
    17. Kassér T-TBS 1 x løsning og erstat. Gentag 3 gange.
    18. Blød membran i 5 min i en kemiluminescens løsning, og billed membran på en kemiluminescens imager.

3. gendanne Target-terapi hæmmer følsomhed af kandidat R-gen Knock-down

  1. Celle forberedelse
    1. Forbered enkelt cellesuspension ved trypsinization. Udføre Transfektion på den dag, hvor cellerne er forgyldt.
      1. Vaske NCI-N87 celler med PBS og inkuberes ved 37 ° C med 0,05% trypsin/EDTA-oploesning i 5-10 min. tilføje 2 bind af RPMI medium indeholdende 10% føtal bovint serum til at neutralisere trypsin (f.eks.2 mL af medium for hver 1 mL trypsin).
      2. Tælle celler med en hemocytometer, der benytter trypan blå farvning. Frø 2,5 x 105 celler (60% sammenløbet) på en T25 cm2 kolbe for hver betingelse.
        Bemærk: Det passende antal celler for såning bestemmes af den fordobling tid i cellelinie og varigheden af forsøget. Formålet er at opnå målet gen knock-down for hele varigheden af forsøget. Ni T25 cm2 kolber er ideelle til Transfektion betingelser og clonogenic analyse (3 flasker for kontrol, 3 flasker for negative Transfektion kontrol, 3 flasker for gen-target Transfektion).
  2. Omvendt Transfektion
    1. Forberede gen-mål og negative kontrol Transfektion blanding for hver T25 cm2 kolbe som følger.
      1. Fortynde 12,5 µL af hvert gen-targeting siRNA oligonukleotider eller negativ kontrol siRNA oligonukleotider i minimal væsentlige Transfektion medium (forhold 1:55; Se Tabel af materialer).
      2. Tilføje en kationiske Liposom Transfektion reagens (1:1 ratio med gen-targeting siRNA oligonukleotider; Se Tabel af materialer). Inkuber ved stuetemperatur i 20 min.
        Bemærk: Det samlede volumen af Transfektion mix er 700 µL.
      3. Tilføje 700 µL af Transfektion mix til hver T25 cm2 kolbe. Inkuber celler ved 37 ° C i 1-3 dage.
    2. Kontrollere gen knock-down af RT-PCR og Western blot analyse. Dobbelttjek virkningen af den formodede R-gen knock-down på følsomhed restaurering til målrettet terapeutisk agent gennem koloni dannelse eksperimenter (Gentag trin 1,5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 beskriver rammerne af forsøgsmetoden. Tre gastrisk kræft celle-linjer giver udtryk for et højt niveau af HER2 og følsomme over for trastuzumab (IC50 < peak plasma niveau af narkotika, figur 2A, venstre graf) blev dyrket i kultur medium indeholdende den målrettede terapeutisk agens. En dosis 10-fold lavere end peak plasmakoncentration af trastuzumab (10 µg/mL) var placere nemlig den startdosis, og gradvist øges til 400 µg/mL over en periode på 8-12 måneder. Bagefter fået vi tre subclones karakteriseret ved en stabil modstand fænotype med IC50 værdier lavere end peak plasmaniveauer af trastuzumab (figur 2A, rigtige graf). Navnlig nåede de mest resistente subclone, HR NCI N87, en RR IC50 værdi af 28.57 (figur 2B). IQGAP1 synes at spille en central rolle i modstand Fænotypen af HR NCI N87 sub linje. Analyser af protein og gen udtryk støttet denne hypotese: IQGAP1 protein niveau i den resistente subclone er omkring 5-fold højere end i forældrenes cellerne. Korrespondent IQGAP1 genekspression er ligeledes 2.5-fold højere HR NCI N87 sub linje end i NCI N87 linje (figur 3A).

IQGAP1 genhæmning blev udført for at vurdere dens rolle i udviklingen af trastuzumab resistente fænotype. Den protokol, der bruges til at lukke munden på IQGAP1 genekspression viste sig især virkningsfuldt at vælte IQGAP1 proteinindhold på næsten alle celler dyrkes i en T25 cm2 celle kultur kolbe (ca 2,5 x 105 celler) (figur 3A).

Derudover bekræftede clonogenic analysen arbejdshypotese, viser at IQGAP1 genhæmning gendanner trastuzumab følsomhed i HR NCI N87 celler som det fremgår af en sænkning af IC50 værdi til 7 µg/mL (figur 3B).

Figure 1
Figur 1: rammer for in vitro- analyse af de underliggende mekanismer erhvervet målrettet terapi modstand. Tre forskellige trastuzumab-resistent subclones stammer fra tre forskellige trastuzumab-følsomme kræft cellelinjer blev genereret og kendetegnet for ændringer i HER2-signalering mekanismer ved næste generation sequencing, immunhistokemisk, Western Blot, og RT-PCR teknik. Alle subclones viste en anden modstand mekanisme. Målrettet terapi følsomhed blev restaureret i en bestemt subclone når kandidat driver genet for resistens blev bragt til stilhed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Bestemmelse af relativ modstand IC50 indekset (RR IC50) via clonogenic analyse i gastrisk kræft cellelinjer. (A) vækst kurver data for naive (venstre graf) og resistente (højre graf) cellelinjer genereret af kolonidannende eksperimenter. X-aksen repræsenterer trastuzumab koncentration. Fejllinjer udgør standardafvigelse (SD). Standardafvigelsen oversteg aldrig 5%. (B) repræsentative billeder af clonogenic analysen støtter generation af en NCI-N87-resistente subclone. Som det fremgår af tid linjen, kræves generation af HR trastuzumab NCI N87 celler 12 måneder af kontinuerlig eksponering til målrettede agent. Dette tal er tilpasset af Arienti et al. arbejde 9 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: genoprette trastuzumab følsomhed af IQGAP1 gen knock-down. (A) IQGAP1 proteinindhold, densitometric analyse vist i søjlediagrammet, forældrenes NCI N87 linje og dens resistente og tavshed-resistent subclone (venstre graf). MRNA IQGAP1 udtryk niveau blev også bekræftet i alle de tre cellelinjer af RT-PCR teknik (højre graf). Data blev præsenteret som mean ± SD. (B) Clonogenic Analysen viste forskellige følsomheden af forældrenes NCI N87 linje og i dens resistente og tavshed-resistent subclone til 100 µg/mL trastuzumab. Kolonien blev optalt efter 14 dage i celle frø. Miniature tal viser repræsentative koloni kulturer. Dette tal er tilpasset af Arienti et al. arbejde 9 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Trin Protokol T25 cm2
Frø celler 60% sammenflydende Vedhængende celler 1,75 x 103
Fortyndet siRNA oligonukleotider i Minimal væsentlige Transfektion medium (forhold 1:55) siRNA 12,5 ΜL
Transfektion medium 687.5 ΜL
Tilføj Lipofectamine Transfektion reagens Lipofectamine reagens 12,5 ΜL
Inkuber Inkuber ved stuetemperatur i 20 min.
Tilsæt blandingen til celler Inkuber celler ved 37 ° C i 1-3 d

Tabel 1: Anbefalet reagens beløb og mængder for kandidat resistens gen knock-down.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mens tilpassede og målrettede behandlinger har fremkaldt voksende begejstring, disse såkaldte "smarte" behandlingsformer står over for de samme store hurdle som traditionel kemoterapi narkotika, dvs., den hurtige og uforudsigelige erhvervelse af resistens over for lægemidler. For at forbedre resultaterne af målrettede terapi, skal resistens problemer løses gennem en bedre forståelse af de mekanismer, der forårsager dem. Her, præsenterede vi et bredt tilgængelige in vitro- metode til at undersøge mekanismerne af erhvervet modstand mod målrettede terapi stoffer i kræft celle linje modeller.

Generation af målrettet terapi resistente subclones er de mest kritiske og vanskeligt at standardisere skridt i denne protokol, på grund af den iboende genetiske heterogenitet mellem cellelinjer anvendes, og deres forskellige grad af narkotika følsomhed. Af disse grunde, kan tid til at få resistente subclones variere. Kronisk udsættelse for kræft molekylær agenter typisk forårsager en stærk tumor væksthæmning. Men efter en variabel periode med kontinuerlig stof eksponering (8-12 måneder), celler genoptage vækst med en sats svarende til ubehandlet kontrol celler.

Desuden, trods at genekspression data har været brugt til hypotesen gen-relaterede mål therapy resistance, et andet udtryk niveau ikke altid afspejler en forkert protein funktion eller korrelerer med modstand fænotype. På grund af kompleksiteten af forholdet mellem udtryk for den formodede resistente gen og modstand mod de målrettede terapi, er yderligere molekylære undersøgelser nødvendige, såsom Bioinformatik analyse, herunder gen/protein interaktion, biologisk proces berigelse og molekylær modellering.

Et andet kritisk punkt kunne være specificitet og nøjagtighed af siRNA oligonukleotid at reducere target udtryk. En mulig løsning kunne være anvendelsen af designværktøjer til at vælge funktionelle siRNA, og en blanding af siRNA for de samme mål gen.

Endelig, en mindre begrænsning vedrører metoden bruges til at gendanne følsomhed til målrettet behandling hæmmer på grund af forbigående varigheden af Transfektion. Maksimal knock-down af målrette mRNA (> 85%) blev rapporteret på dag 2 efter Transfektion og fastholdtes > 80% gennem dage 5-7. Betydelig knock-down, omend mindre i omfang, var stadig observeret på dag 6. Af denne grund, bør cytotoksicitet analysen til at kontrollere restaurering af narkotika følsomhed udføres efter omkring 5 dage fra genhæmning.

Vores protokol er en tid og omkostninger effective metode til undersøgelse af in vitro- erhvervet modstand. Generation af resistente subclones, kunne spejling intra-tumor heterogenitet af kræftceller, hjælpe afsløre roman mekanismer af erhvervet modstand mod anticancer målrettede agenter. Navnlig, er de mere egnet til høj overførselshastighed genomisk eller proteom screeninger til at identificere molekylære ændringer i resistente celler end deres følsomme modstykker.

Denne prækliniske platform kunne let udvides for at undersøge generelle resistensmekanismer til målrettede terapeutiske agenter i forskellige tumor histotypes, giver en standardprocedure for opdagelsen af yderligere stof mål at overvinde medicinresistens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Dr. Veronica Zanoni redigeringsværktøjer håndskriftet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trizol Reagent Invitrogen 15596026 TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples
ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT Bio-Rad 1708891 The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR.
TaqMan gene expression assay Life Technologies 4331182 Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5’ end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3’ end.
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent Thermo Scientific 78501 Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells.
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Scientific 78440 Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates.
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard.
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747 Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample.
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 456-1094 Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis.
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards Bio-Rad 1610376 Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD).
10x Tris/Glycine/SDS Bio-Rad 1610732 10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE.
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs Bio-Rad 1704156 Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane.
Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate Bio-Rad 1610381 StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots.
Immun-Star WesternC solution Bio-Rad 5572 Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein.
Universal Negative Control Invitrogen 12935300 Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology.
opti-MEM Glutamax Medium Thermo Fisher Scientific 51985026 Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology.
Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA Ambion 4390824 RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types.
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent Invitrogen 13778075 Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types.
Mouse anti-IQGAP1 Invitrigen 33-8900 working concentration: 1:400 in 5% milk solution
goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005 Santa Cruz sc-2005 working concentration: 1:10000 in 5% milk solution
PMSF Sigma Aldrich P 7626 this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase
Thermocycler for RT-PCR MJ Research MJ Research PTC-200 Thermal Cycler it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3°C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Real Time RT-PCR instrument Applied Biosystems 7500 RT-PCR system This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Microvolume Spectrophotometers Thermo Scientific Nanodrop It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample
Blotting system Bio-Rad Trans-Blot Turbo system It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes
Image acquisition system and gel documentation Bio-Rad Chemidoc image system It is easy to use for chemiluminescent detection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gerber, D. E. Targeted therapies: a new generation of cancer treatments. Am Fam Physician. 77 (3), 311-319 (2008).
  2. Zhang, J., Yang, P. L., Gray, N. S. Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nat Rev Cancer. 9 (1), 28-39 (2009).
  3. Nelson, A. L., Dhimolea, E., Reichert, J. M. Development trends for human monoclonal antibody therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 767-774 (2010).
  4. Chabner, B. A., Roberts, T. G. Timeline: Chemotherapy and the war on cancer. Nat Rev Cancer. 5 (1), 65-72 (2005).
  5. Gilbert, L. A., Hemann, M. T. Chemotherapeutic resistance: surviving stressful situations. Cancer Res. 71 (15), 5062-5066 (2011).
  6. Izar, B., Rotow, J., Gainor, J., Clark, J., Chabner, B. Pharmacokinetics, clinical indications, and resistance mechanisms in molecular targeted therapies in cancer. Pharmacol Rev. 65, 1351-1395 (2013).
  7. Ellis, L. M., Hicklin, D. J. Resistance to Targeted Therapies: Refining Anticancer Therapy in the Era of Molecular Oncology. Clin Cancer Res. 15 (24), 7471-7478 (2009).
  8. Asić, K. Dominant mechanisms of primary resistance differ from dominant mechanisms of secondary resistance to targeted therapies. Crit Rev Oncol Hematol. 97, 178-196 (2016).
  9. Arienti, C., et al. Preclinical evidence of multiple mechanisms underlying trastuzumab resistance in gastric cancer. Oncotarget. 7 (14), 18424-18439 (2016).
  10. Tanner, M., et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol. 16 (2), 273-278 (2005).
  11. Bang, Y. J., et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet. 376 (9742), 687-697 (2010).
  12. ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01130337. A Study of Capecitabine [Xeloda] in Combination With Trastuzumab [Herceptin] and Oxaliplatine in Patients With Resectable Gastric Cancer. , Available from: http://clinicaltrials.gov/show/NCT01130337 (2017).
  13. ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01748773. A Study of the Combination of Oxaliplatin, Capecitabine and Herceptin (Trastuzumab) and Chemoradiotherapy in The Adjuvant Setting in Operated Patients With HER2+ Gastric or Gastro-Esophageal Junction Cancer (TOXAG Study). , Available from: http://www.clinicaltrials.gov/show/NCT01748773 (2017).
  14. ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01472029. Explorative Phase II Study of Perioperative Treatment in Patients With Adenocarcinoma of the Gastroesophageal Junction or Stomach (HerFLOT). , Available from: http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01472029 (2017).
  15. ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01196390. Radiation Therapy, Paclitaxel, and Carboplatin With or Without Trastuzumab in Treating Patients With Esophageal Cancer. , Available from: http://clinicaltrials.gov/show/NCT01196390 (2017).
  16. Shimoyama, S. Unraveling trastuzumab and lapatinib inefficiency in gastric cancer: Future steps (Review). Mol Clin Oncol. 2 (2), 175-181 (2014).
  17. Kelly, C. M., Janjigian, Y. Y. The genomics and therapeutics of HER2-positive gastric cancer-from trastuzumab and beyond. J Gastrointest Oncol. 7 (5), 750-762 (2016).
  18. Wong, S. S., et al. Genomic landscape and genetic heterogeneity in gastric adenocarcinoma revealed by whole-genome sequencing. Nat Commun. 5, 5477 (2014).
  19. Oshima, Y., et al. Lapatinib sensitivities of two novel trastuzumab-resistant HER2 gene-amplified gastric cancer cell lines. Gastric Cancer. 17 (3), 450-462 (2014).
  20. Pignatta, S., et al. Prolonged exposure to (R)-bicalutamide generates a LNCaP subclone with alteration of mitochondrial genome. Mol Cell Endocrinol. 382 (1), 314-324 (2014).

Tags

Kræft biologi spørgsmålet 130 In vitro model clonogenic assay målrettet behandling resistens over for lægemidler re sensibilisering siRNA Transfektion
Udkig efter Driver veje af erhvervet modstand mod målrettede terapi: resistente Subclone Generation og følsomhed gendannelse af genet Knock-down
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arienti, C., Pignatta, S., Zanoni,… More

Arienti, C., Pignatta, S., Zanoni, M., Cortesi, M., Zamagni, A., Piccinini, F., Tesei, A. Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down. J. Vis. Exp. (130), e56583, doi:10.3791/56583 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter