À la recherche de pilote Pathways of acquis une résistance à la thérapie ciblée : génération sous-clone résistantes aux médicaments et sensibilité restauration par gène précipitation

Summary

Il s’agit d’un protocole de temps - et rapport coût - entrée en vitro étudie les mécanismes de résistance acquise aux agents thérapeutiques ciblées, qui est un très besoin médical dans le traitement du cancer.

Abstract

Les deux dernières décennies ont vu un changement de médicaments cytotoxiques à une thérapie ciblée en oncologie médicale. Bien que les agents thérapeutiques ciblés ont montré une efficacité clinique plus impressionnante et réduit au minimum les effets négatifs que les traitements traditionnels, la résistance aux médicaments est devenu la principale limite à leurs prestations. Plusieurs modèles précliniques/in vitro/in vivo de la résistance acquise aux agents ciblés dans la pratique clinique ont été développés principalement à l’aide de deux stratégies : manipulation i) génétique pour la modélisation des génotypes de résistance acquise et ii) in vitro / in vivo sélection de modèles résistants. Dans le présent travail, nous proposons un cadre fédérateur, pour étudier les mécanismes sous-jacents responsables de la résistance acquise aux agents thérapeutiques ciblés, à partir de la génération des sous-clones cellulaires résistantes aux médicaments, à la description de faire taire les procédures utilisées pour la restauration de la sensibilité à l’inhibiteur. Cette approche simple de temps - et rapport coût - entrée est largement applicable et pourrait être facilement étendue pour étudier les mécanismes de résistance aux autres médicaments ciblés dans différentes tumeurs histotypes.

Introduction

Suite aux découvertes cruciales en biologie moléculaire et cellulaire, un certain nombre de nouvelles molécules anticancéreuses synthétisées ont été développé pour cibler sélectivement les voies de signalisation oncogènes dans un large éventail de types de tumeurs. En particulier, deux catégories d’agents thérapeutiques ciblés aux propriétés uniques en oncologie, des composés chimiques synthétiques à savoir et on sait que les anticorps monoclonaux recombinants, ont obtenu des succès cliniques et considérablement altérée du cancer dans ces dernières décennies^1,2,3.

Néanmoins, malgré leur impressionnante réponse initiale au traitement, la majorité des patients atteints de cancer ont développé la résistance à tous les agents thérapeutiques ciblées, les anticorps monoclonaux et inhibiteurs de la kinase. En conséquence, la résistance aux médicaments, l’obstacle majeur pour des médicaments anticancéreux classique⁴, est toujours un grand défi pour les nouvelles thérapies ciblées^5,6.

Résistance à la thérapie ciblée peut être intrinsèque (c'est-à-direprimaire) ou acquis (p. ex., secondaire). Résistance intrinsèque décrit un manque de novo de la réponse au traitement, tandis que la résistance secondaire survient après une période de réponse aux médicaments traitement⁷. Ce dernier est causé par des flambées de petites cohortes des cellules tumorales dans la majeure partie de la tumeur primitive ou niché dans des créneaux anatomiques cryptiques distales, présentant jusqu'à 90 % résistance à un ou plusieurs ciblées agents thérapeutiques. Les mécanismes moléculaires qui sous-tendent un développement de la résistance à la thérapie ciblée principalement résultent de mutations du gène cible et redondante activation d’autres voies de signalisation apoptotiques, dont la compréhension est encore loin d’être complet⁸.

Dans ce travail, nous avons proposé une approche temps - et rapport coût - entrée pour étudier in vitro des mécanismes de résistance acquise aux agents thérapeutiques ciblés, à partir de la génération des sous-clones cellulaires résistantes aux médicaments, à la description de réduire au silence procédures utilisées pour la restauration de la sensibilité à l’inhibiteur, un outil crucial pour tester et valider les hypothèses de travail. En particulier, notre approche a été utilisée pour étudier, dans le cancer gastrique, les mécanismes de résistance au trastuzumab (p. ex., Herceptine), un anticorps monoclonal humanisé ciblant le domaine extracellulaire de protéine HER2⁹. Trastuzumab + chimiothérapie est largement reconnue comme le traitement standard de première ligne du cancer du sein métastatique HER2-positif. Grâce à des études précliniques récentes montrant qu’anti-HER2 thérapies ont une activité significative dans les deux in vitro et in vivo de cancer gastrique HER2 positive modèles^10,11, médicaments moléculaires ciblant HER2 ont été largement étudié dans les essais cliniques, dont certains sont toujours en cours, sur des patients avec gastro cancer^12,13,14,15.

Ces études ont souligné le nombre croissant de patients souffrant de résistance au trastuzumab¹⁶, similaire à ce qui est observé d’autres inhibiteurs de thérapeutiques ciblées. En particulier, le taux de réponse de trastuzumab a été de 47 % et la médiane de survie globale pour les patients sous trastuzumab + chimiothérapie a été plus longues que pour les patients sous chimiothérapie seule¹⁷2,7 mois seulement. Ceci suggère que, tandis que la résistance primaire de trastuzumab est répandue, résistance secondaire trastuzumab est inévitable. Pour cette raison, il est urgent de clarifier les mécanismes causant la résistance de la thérapie ciblée HER2 dans le cancer gastrique, qui est encore plus problématique compte tenu de l’hétérogénéité génétique intra-tumorale de cette néoplasie¹⁸.

En outre, les mécanismes de résistance au trastuzumab dans le cancer gastrique ont prouvé difficiles à expliquer, partiellement en raison de la difficulté à obtenir des représentant des modèles précliniques fiable de cette condition. Oshima et coll. ont signalé une méthode de sélection in vivo de lignées cellulaires de cancer de l’estomac résistant au trastuzumab, consistant en une culture répétée d’une petite métastase péritonéale résiduelle après traitement par trastuzumab¹⁹. Toutefois, la nécessité d’un meuble, de l’expertise de gestion animale spécifique et de l’approbation du Comité d’éthique de l’Animal ont contribué à ce qui en fait une méthode de beaucoup de temps et de coût. L’approche que nous décrivons dans ce travail est simple et largement applicable et pourrait être facilement étendu pour étudier les mécanismes de résistance aux autres médicaments dans différentes tumeurs histotypes²⁰.

Protocol

Remarque : Ce protocole a été ajusté spécialement pour l’analyse des mécanismes qui sous-tendent la résistance acquise au trastuzumab de lignées de cellules de cancer gastrique HER-positive. Tous les instruments de laboratoire nécessaires figurent dans la Table des matières.

1. génération des sous-clones résistant à la thérapie ciblées

NOTE : Ceci est la plus critique et difficile à normaliser pas dans le protocole dû au fait que différentes lignées cellulaires peuvent présenter des sensibilités différentes à l’inhibiteur de thérapeutique ciblée indépendamment de leur concentration de tumeur histotype ou drogue utilisé.

1. Cellule NCI-N87 culture line en milieu RPMI additionné de sérum de veau foetal (10 %) et de la glutamine (2 mM, 1 %), comme une monocouche à 37 ° C et il des graines sur les flacons de culture 25 cm² .
2. Ajouter au milieu de culture dans chaque fiole 10 µg/mL de trastuzumab comme la dose de départ. Exposer les cellules à la dose de départ jusqu'à ce qu’ils reprennent de plus en plus.
   Remarque : La dose initiale de l’inhibiteur de la thérapie ciblée doit être 10 fois plus faible que son pic de concentration plasmatique. La concentration plasmatique maximale est le plus haut niveau de concentration du médicament détectée dans le sang de patients habituellement après des doses multiples d’un traitement standard. Cette valeur peut être récupérée à partir d’études sur la pharmacocinétique.
3. Surveiller la croissance des cellules avec la méthode d’exclusion du bleu trypan ; est reprise de la croissance des cellules (généralement après une période de deux à trois semaines), exposer les cellules à une concentration 10 fois de dose plus élevée de trastuzumab.
4. Exposer les cellules à une dose progressivement croissante du trastuzumab (à partir de 100 µg/mL à 400 µg/mL) jusqu'à garder les cellules en croissance (après environ 2 semaines), malgré la présence d’une concentration élevée de médicaments (au moins 2,5 - 4 fois plus élevé que le pic plasmatique).
5. Effectuer un dosage clonogéniques pour évaluer le niveau de résistance à la thérapie ciblée à chaque variation de la concentration de l’inhibiteur de la cible thérapeutique dans le milieu de culture et de définir la résistance relative IC₅₀ index (RR IC₅₀) comme suit.
   1. Graines de 500 cellules dans 24 plaques multipuits culture.
      NOTE : 5 puits doivent être établis pour chaque ensemble de conditions.
   2. Exposez les cellules à des concentrations croissantes cible thérapeutique inhibiteur (trastuzumab) 100 µg/mL jusqu'à 400 µg/mL.
   3. Incuber les cellules dans un incubateur à CO₂ à 37 ° C pendant 15 jours.
   4. Après incubation, difficulté et tacher les échantillons comme suit.
      1. Supprimer des cellules moyennes et rincer avec du PBS 1 x 10 mL. Retirer 1 x PBS et ajouter 2 à 3 mL de solution de fixation (1:7, (vol/vol), l’acide acétique : méthanol). Enlever la solution de fixation et ajouter 0,5 % solution de violet de gentiane. Incuber à température ambiante pendant 2 h
      2. Enlever la solution de violet de gentiane soigneusement par aspiration avec une pipette et immerger les plaques dans l’eau du robinet pour rincer les résidus de solution de violet de gentiane. Sécher à l’air à température ambiante pendant 2 jours.
   5. Dénombrer les colonies de plus de 50 cases à l’aide d’un microscope inversé (grossissement de X 4).
      Remarque : Deux observateurs indépendants sont requis pour cela.
   6. Calculer RR IC₅₀ comme le rapport entre la valeur₅₀ de cellules sous-clone cible-thérapie-résistant et la valeur des cellules original/naïve.

2. validation protocole pour le candidat ciblé thérapie résistance gène (R)

Remarque : Après la caractérisation de l’expression génique, signatures associées à l’acquisition de la résistance à la thérapie de la cible et n’importe quel gène candidat comme conducteur de résistance sera étudié à travers : a) RT-PCR et b) Western blot analyse.

1. RT-PCR en temps réel
   1. Extraire l’ARN total de lignées cellulaires utilisant acide guanidinium thiocyanate-phénol-chloroforme mélange (voir Table des matières).
   2. Effectuer des réactions de transcription inverse (RT) en utilisant des amorces hexamère aléatoire et définissez le thermocycleur comme suit : amorçage à 25 ° C pendant 5 min, RT à 46 ° C pendant 20 min et l’inactivation de la RT à 95 ° C pendant 1 min.
   3. Utilisation 400 ng d’ARN total pour une réaction de 20 µL. Préparer le mélange réactionnel pour échantillon comme suit : 7 µL RNase libre H₂O, 2 µL cADN (10 ng/µL), 1 µL 20 x sonde spécifique à la cible marquée par fluorescence et 10 µL 2 x Mix contenant tampon dNTPs et ADN polymérase (voir Table des matières).
   4. Ajouter 20 µL du mélange réactionnel pour chaque plaque de puits et exécuter le programme suivant : tenue de scène à 50 ° C pendant 2 min, à 95 ° C pendant 10 min (1 cycle) ; puis 40 cycles à 95 ° C pendant 15 s et à 60 ° C pendant 1 min.
2. Tache occidentale
   1. Récupérer des suspensions cellulaires en ajoutant 2 mL de solution de trypsine/EDTA 0,05 % et permettant à 2-3 min pour la trypsine travailler.
   2. Ajouter les 2 volumes de moyenne contenant 10 % sérum de veau fœtal pour neutraliser la trypsine (p. ex., 2 mL de milieu pour chaque 1 mL de trypsine) et centrifuger à 1 200 g pendant 5 min. jeter surnageants et laver les cellules avec du PBS 1 x contre le rhume.
   3. Centrifuger à 1 200 g pendant 5 min et jeter le surnageant. Resuspendre le culot cellulaire avec tampon de lyse et incuber sur un balancier à 4 ° C pendant 30 min.
      1. Le montant de tampon de lyse dépend du nombre de cellules (par exemple, 100 µL pour 1 x 10⁶ cellules) ; Veillez à préparer de tampon de lyse frais chaque fois. 1 ml de la préparation de tampon de lyse (congé sur la glace) : utiliser µL 975 M-par tampon lysat mammifères, inhibiteurs de protéase et phosphatase 15 µL et 10 µL 100 µM PMSF inhibiteurs.
   4. Récupérer la surnageante protéine par centrifugation lysat cellulaire à 13 000 x g à 4 ° C pendant 15 min.
   5. Déterminer les concentrations de protéine à l’aide d’un dosage protéique BCA.
   6. Ajouter 4 x LaemmLi solution tampon à échantillons de protéines (au moins 20 à 30 µg de protéines) et de la chaleur à 100 ° C pendant 3 min.
   7. Utiliser des gels de préfabriqué de 4 à 20 % et charger 20-30 µg de LaemmLi solution de protéine et de 5 à 10 µL de protéine étalon par échantillon.
   8. Remplissez l’anneau de Western blot avec tampon 1 x TRIS/GLICYNE /SDS et exécutez le gel à 110 V pendant 30-60 min (quand le temps s’arrête Vérifier que la teinture a atteint la fin du gel, sinon tourner pendant quelques minutes supplémentaires)
   9. Electroblot à la protéine de transfert dans une membrane PVDF (voir Table des matières) en utilisant un système semi sèche.
   10. Bloquer la membrane en trempant dans la solution appropriée de protéines (lait/BSA 5 %) sur l’agitateur à température ambiante pendant 1 h.
   11. Préparer une solution de 1 : 400 avec anti-IQGAP1 anticorps primaire dans une solution de lait 5 % (voir la Table des matières).
   12. Placer la membrane dans une solution d’anticorps primaire sur un agitateur dans une chambre froide pendant la nuit.
   13. Le lendemain, jeter la solution d’anticorps et tremper dans la solution 1 x T-TBS (1 x T-TBS : 1 x tampon Saline Tris ajouté par Tween20 0,1 %) sur un agitateur à température ambiante pendant 7 min.
   14. Jeter T-SCT 1 x solution et remplacer. Répéter 3 fois.
   15. Préparer une solution de souris-anticorps secondaire de 1/10 000 en ajoutant des anticorps pour Western standard détection tache (voir Table des matières) et placer la membrane sur un agitateur ; laisser à température ambiante pendant 2 h.
   16. Jeter la solution d’anticorps et tremper dans la solution 1 x T-TBS sur un agitateur à température ambiante pendant 7 min.
   17. Jeter T-SCT 1 x solution et remplacer. Répéter 3 fois.
   18. Tremper la membrane pendant 5 min dans une solution par chimiluminescence et l’image de la membrane sur un imageur de chimiluminescence.

3. restauration cible-traitement inhibiteur de la sensibilité par précipitation R-gène candidat

1. Préparation de cellules
   1. Préparation suspension monocellulaire par trypsinisation. Effectuer la transfection le jour où les cellules sont plaqués.
      1. NCI-N87 laver les cellules avec du PBS et incuber à 37 ° C avec une solution de trypsine/EDTA 0,05 % pour 5-10 min. Ajouter 2 volume de RPMI moyen contenant 10 % sérum de veau fœtal pour neutraliser la trypsine (p. ex., 2 mL de milieu pour chaque 1 mL de la trypsine).
      2. Compter les cellules avec un hémocytomètre utilisant une coloration bleu trypan. Cellules de⁵ graines 2,5 x 10 (confluence de 60 %) dans une fiole de² cm de T25 pour chaque condition.
         Remarque : Le nombre de cellules pour l’amorçage approprié est déterminé par le temps de doublement de la ligne de la cellule et la durée de l’expérience. Le but est de réaliser le gène cible précipitation pendant toute la durée de l’expérience. Neuf T25 flacons de² cm sont idéales pour les conditions de la transfection et l’essai clonogéniques (3 flacons pour les contrôles, 3 flacons pour les contrôles négatifs de transfection, 3 flacons pour la transfection du gène-cible).
2. Inverser la transfection
   1. Préparer le gène-cible et négatifs mix de transfection de contrôle pour chaque fiole T25 de² cm comme suit.
      1. Diluer 12,5 µL de chaque oligonucléotides de siARN ciblant les gènes ou les oligonucléotides siARN contrôle négatif dans un milieu minimal essentiel transfection (ratio 01:55 ; voir Table des matières).
      2. Ajouter un réactif de transfection de liposomes cationiques (ratio 1:1 avec ciblage de gène siARN oligonucléotides ; voir Table des matières). Incuber à température ambiante pendant 20 min.
         Remarque : Le volume total du mélange transfection est 700 µL.
      3. Ajouter 700 µL du mélange transfection dans chaque fiole T25 de² cm. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 1 à 3 jours.
   2. Vérifiez le gène précipitation par RT-PCR et analyse par Western blot. Vérifiez à nouveau l’impact de la présumée des gènes R précipitation sur la restauration de la sensibilité à l’agent thérapeutique ciblée grâce à des expériences de formation de colonie (répéter l’étape 1.5).

Representative Results

La figure 1 donne un aperçu du cadre de la procédure expérimentale. Trois cancers gastriques lignées cellulaires exprimant un niveau élevé de HER2 et sensible au trastuzumab (IC₅₀ < concentration plasmatique maximale du graphe de gauche de médicament, Figure 2 a,) ont été cultivées dans un milieu de culture contenant l’agent thérapeutique ciblée. Une dose a 10 fois inférieure à la concentration plasmatique maximale du trastuzumab (10 µg/mL) a été définie comme la dose de départ et augmentée progressivement à 400 µg/mL sur une période de 8 à 12 mois. Par la suite, nous avons obtenu trois sous-clones caractérisés par un phénotype de résistance stable avec des valeurs de l’IC₅₀ inférieurs aux niveaux de plasma de pointe du trastuzumab (Figure 2 a, graphique de droite). En particulier, le sous-clone plus résistant, HR NCI N87, atteint une valeur de₅₀ RR IC de 28,57 (Figure 2 b). IQGAP1 semble jouer un rôle crucial dans le phénotype de résistance de la sous-ligne HR NCI N87. Les analyses de protéines et gènes expressions appuie cette hypothèse : le niveau de protéine IQGAP1 dans le sous-clone résistant est environ 5 fois plus élevé que dans les cellules parentales. De même, le correspondant de l’expression des gènes IQGAP1 est 2,5 fois plus élevé dans la sous-ligne HR NCI N87 que dans la ligne de NCI N87 (Figure 3 a).

IQGAP1 gene silencing a été réalisée afin d’évaluer son rôle dans le développement du phénotype résistant trastuzumab. Le protocole utilisé pour faire taire l’expression des gènes IQGAP1 s’est avérée particulièrement efficace pour faire tomber la teneur en protéines IQGAP1 sur presque toutes les cellules cultivées dans un flacon de culture cellulaire² cm T25 (environ 2. 5 x 10⁵ cellules) (Figure 3 a).

De plus, le test clonogénique a confirmé l’hypothèse de travail, montrant que le gène IQGAP1 silencieux restaurations trastuzumab sensibilité dans les cellules de HR NCI N87 comme en témoigne par l’abaissement de la valeur₅₀ à 7 µg/mL (Figure 3 b).

Figure 1 : cadre pour l’analyse in vitro les mécanismes sous-jacents acquis ciblées résistance thérapie. Trois différents sous-clones trastuzumab résistant provenant de trois lignées de cellules différentes trastuzumab sensible du cancer ont été générés et caractérise des modifications dans les mécanismes de signalisation HER2 par séquençage de nouvelle génération, immunohistochimiques, Western Blot et techniques de RT-PCR. Tous les sous-clones a montré un mécanisme de résistance différents. Sensibilité thérapie ciblée a été restaurée en un sous-clone spécifique lorsque le gène de candidat pilote de résistance a été réduit au silence. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Détermination de la résistance relative IC₅₀ indice (RR IC₅₀) via clonogéniques essai sur des lignées cellulaires de cancer gastrique. Courbes de croissance (A) données pour naïve (graphe de gauche) et des lignées cellulaires résistantes (graphique droite) générées par les expériences de formation de colonies. L’axe des abscisses représentant la concentration de trastuzumab. Barres d’erreur représentent déviation standard (SD). L’écart n’a jamais dépassé 5 %. (B) les images représentatives du dosage clonogéniques soutenant la génération d’un sous-clone NCI-N87-résistant. Comme indiqué par la ligne de temps, la création de cellules de trastuzumab NCI N87 HR requis 12 mois d’exposition continue à l’agent ciblé. Ce chiffre a été adapté de le œuvre de Arienti et al. ⁹ S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : restaurer le trastuzumab sensibilité par IQGAP1 gène précipitation. (A) teneur en protéines IQGAP1 par analyse densitométrique indiqué dans le graphique à barres, dans la lignée parentale NCI N87 et dans son sous-clone et réduite au silence-résistant (graphe de gauche). L’ARNm IQGAP1 niveau d’expression a été également vérifié dans toutes les lignées de cellules trois par technique de RT-PCR (graphique de droit). Les données ont été présentées comme moyenne ± clonogéniques SD. (B) test a montré la sensibilité différente de la lignée parentale NCI N87 et dans son sous-clone et réduite au silence-résistant à 100 µg/mL trastuzumab. La colonie a été comptée après 14 jours de cellules semences. Les chiffres miniature cultures représentatives de colonie. Ce chiffre a été adapté de le œuvre de Arienti et al. ⁹ S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Mesures	Protocole	T25 cm2
Confluent de 60 % des cellules des graines	Cellules adhérentes	1,75 x 103
Diluer les oligonucléotides de siARN dans un milieu Minimal essentiel Transfection (ratio 01:55)	siARN	12,5 ΜL
	Moyen de transfection	687.5 ΜL
Ajouter le réactif de transfection de Lipofectamine	Réactif Lipofectamine	12,5 ΜL
Incuber	Incuber à température ambiante pendant 20 min
Ajouter le mélange aux cellules	Incuber les cellules à 37 ° C pendant 1 à 3 jours

Tableau 1 : Recommandé des quantités de réactifs et les volumes de précipitation du gène de résistance candidat.

Discussion

Alors que personnalisé et ciblé des thérapies ont suscité l’enthousiasme croissant, ces thérapies dites « intelligentes » face à l’obstacle majeur même comme les médicaments de chimiothérapie traditionnelle, c'est-à-dire, l’acquisition rapide et imprévisible de la pharmacorésistance. Pour améliorer les résultats de la thérapie ciblée, des problèmes de résistance aux médicaments doivent être résolus par une meilleure compréhension des mécanismes qui les causent. Ici, nous avons présenté une méthode largement accessible in vitro pour étudier les mécanismes de résistance acquise aux médicaments de thérapie ciblée dans les modèles de ligne cancer cell.

La génération des sous-clones résistant à la thérapie ciblées est la plus critique et difficile à normaliser l’étape dans le présent protocole, en raison de l’hétérogénéité génétique intrinsèque entre les lignées cellulaires utilisées et à leur degré de sensibilité aux médicaments. Pour ces raisons, le temps nécessaire pour obtenir des sous-clones résistants peuvent varier. En règle générale, l’exposition chronique à des agents anticancéreux moléculaires entraîne une inhibition de la croissance de tumeur solide. Cependant, après une période variable d’exposition au médicament continu (8-12 mois), les cellules reprendre la croissance avec un taux similaire à celui des cellules témoins non traités.

En outre, malgré cette expression de gène données ont servi à émettre l’hypothèse-lié au gène de résistance thérapie, un niveau d’expression différente ne pas toujours refléter une fonction incorrecte de protéine ou sont en corrélation avec le phénotype de résistance. En raison de la complexité de la relation entre l’expression du gène résistant à la drogue présumé et la résistance à la thérapie ciblée, plus des études moléculaires sont nécessaires, comme l’analyse bio-informatique, y compris les gènes/protéines interaction, enrichissement des processus biologiques et modélisation moléculaire.

Un autre point critique pourrait être la spécificité et la précision des siARN oligonucléotide pour réduire l’expression de la cible. Une solution possible pourrait être l’utilisation d’outils de conception pour la sélection des siARN fonctionnel et un mélange de siARN pour le même gène cible.

Enfin, une limitation mineure est liée à la méthode utilisée pour restaurer la sensibilité à l’inhibiteur de la thérapie ciblée en raison de la durée transitoire de la transfection. Précipitation maximale de cibler les ARNm (> 85 %) a été signalé sur les après transfection jour 2 et a été maintenue > 80 % lors des journées-5-7. Précipitation significative, quoiqu’en moindre, a encore observé le jour 6. Pour cette raison, le test de cytotoxicité pour la vérification de la restauration de la sensibilité aux médicaments devrait être utilisée environ 5 jours de silençage génique.

Notre protocole est une méthode de temps - et rapport coût - entrée pour l’étude in vitro a acquis de la résistance. La génération des sous-clones résistants, reflétant l’hétérogénéité intra-tumeur des cellules cancéreuses, pourrait aider à dévoiler de nouveaux mécanismes d’acquisition de la résistance à des agents anticancéreux ciblés. En particulier, ils conviennent mieux pour le haut débit génomique ou protéomiques préalables pour l’identification des altérations moléculaires dans les cellules résistantes que leurs homologues sensibles.

Cette plate-forme préclinique pourrait être facilement étendue pour étudier les mécanismes de résistance générale aux agents thérapeutiques ciblés dans différentes tumeurs histotypes, prévoyant une procédure standard de la découverte d’autres cibles de médicaments pour surmonter la résistance aux médicaments.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizol Reagent	Invitrogen	15596026	TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples
ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT	Bio-Rad	1708891	The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR.
TaqMan gene expression assay	Life Technologies	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5’ end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3’ end.
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent	Thermo Scientific	78501	Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells.
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Scientific	78440	Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates.
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard.
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747	Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample.
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels	Bio-Rad	456-1094	Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis.
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards	Bio-Rad	1610376	Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD).
10x Tris/Glycine/SDS	Bio-Rad	1610732	10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE.
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs	Bio-Rad	1704156	Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane.
Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate	Bio-Rad	1610381	StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots.
Immun-Star WesternC solution	Bio-Rad	5572	Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein.
Universal Negative Control	Invitrogen	12935300	Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology.
opti-MEM Glutamax Medium	Thermo Fisher Scientific	51985026	Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology.
Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA	Ambion	4390824	RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types.
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	13778075	Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types.
Mouse anti-IQGAP1	Invitrigen	33-8900	working concentration: 1:400 in 5% milk solution
goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005	Santa Cruz	sc-2005	working concentration: 1:10000 in 5% milk solution
PMSF	Sigma Aldrich	P 7626	this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase
Thermocycler for RT-PCR	MJ Research	MJ Research PTC-200 Thermal Cycler	it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3°C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Real Time RT-PCR instrument	Applied Biosystems	7500 RT-PCR system	This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Microvolume Spectrophotometers	Thermo Scientific	Nanodrop	It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample
Blotting system	Bio-Rad	Trans-Blot Turbo system	It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes
Image acquisition system and gel documentation	Bio-Rad	Chemidoc image system	It is easy to use for chemiluminescent detection