Summary
Dies ist eine Zeit und Kosten wirtschaftlicheren in-vitro- Protokoll untersucht die Mechanismen der erworbenen Resistenz gegen gezielte therapeutische Wirkstoffe, die eine höchst medizinischer Bedarf im Krebs-Management.
Abstract
Die letzten zwei Jahrzehnten haben eine Verlagerung von Zytostatika, zielgerichtete Therapie in der medizinischen Onkologie gesehen. Obwohl gezielt Therapeutika beeindruckender klinische Wirksamkeit und minimiert Nebenwirkungen als herkömmliche Behandlungen gezeigt haben, geworden Resistenzen die wichtigste Einschränkung auf ihre Vorteile. Mehreren präklinischen/in vitro/in vivo Modellen der erworbene Resistenz gegen gezielte Mittel in der klinischen Praxis wurden hauptsächlich mit Hilfe von zwei Strategien entwickelt: i) Genmanipulation für die Modellierung von Genotypen der erworbenen Resistenz und (Ii) in-vitro- / in-vivo beständig Modellauswahl. In der vorliegenden Arbeit schlagen wir einen einheitlichen Rahmen für die Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen verantwortlich für erworbene Resistenz zu zielgerichteten Therapeutika, ausgehend von der Generation von Medikamenten-resistenten zellulären Subclones zur Beschreibung der Verfahren zur Wiederherstellung der Empfindlichkeit der Inhibitors-Stummschaltung. Diesem einfache Zeit und Kosten wirtschaftlicheren Ansatz ist vielseitig einsetzbar und kann leicht erweitert werden, um die Resistenzmechanismen gegenüber anderen gezielten therapeutischen Medikamenten in verschiedenen Tumor Histotypes zu untersuchen.
Introduction
Im Anschluss an die entscheidenden Entdeckungen in der molekularen und zellulären Biologie, haben eine Reihe von neuartigen synthetisierten krebsbekämpfende Moleküle entwickelt, um selektiv onkogenen Signalwege in einer Vielzahl von Tumorarten abzielen. Vor allem zwei Kategorien von zielgerichteten Therapeutika mit einzigartigen Eigenschaften in der Onkologie, nämlich synthetische chemische Verbindungen und rekombinanter monoklonaler Antikörper, sind dafür bekannt, klinische Erfolge und dramatisch verändert Krebsbehandlung in erreicht haben den letzten Jahrzehnten1,2,3.
Dennoch, trotz ihrer beeindruckenden ersten Ansprechen auf die Behandlung haben die meisten Krebspatienten Resistenzen auf alle zielgerichteten Therapeutika, monoklonale Antikörper und Kinase-Inhibitoren entwickelt. Infolgedessen ist Resistenzen, die große Hürde für die klassische Anti-Krebs-Medikamente4, nach wie vor eine große Herausforderung für neue zielgerichtete Therapien5,6.
Widerstand gegen gezielte Therapie möglicherweise intrinsischen (d.h.primäre) oder erworbene (d.h., sekundäre). Intrinsische Resistenz beschreibt de Novo mangelnder Ansprechen auf die Therapie, während sekundäre Resistenz nach einer Antwort auf Droge Behandlung7auftritt. Letzteres ist verursacht durch Ausbrüche der kleinen Kohorten von Tumorzellen innerhalb der Großteil des ursprünglichen Tumors oder eingebettet in den distalen kryptische anatomische Nischen, ausstellen von bis zu 90 % Widerstand gegen eine oder mehrere gezielte Therapeutika. Molekulare Mechanismen einer Resistenzentwicklung, gezielte Therapie vor allem ergeben sich aus Ziel-Gen-Mutationen und redundante Aktivierung von anderen pro-Survival Signalwege, deren Verständnis noch lange nicht komplett8 ist.
In dieser Arbeit haben wir vorgeschlagen, einen Zeit und Kosten wirtschaftlicheren Ansatz zur Untersuchung der in-vitro- Mechanismen der erworbenen Resistenz gegen gezielte Therapeutika, ausgehend von der Generation von Medikamenten-resistenten zellulären Subclones zur Beschreibung der zum Schweigen zu bringen Verfahren zur Wiederherstellung der Empfindlichkeit auf den Inhibitor, ein entscheidendes Instrument für testen und validieren der Arbeitshypothesen verwendet. Insbesondere war unser Ansatz verwendet, zu untersuchen, bei Magenkrebs, die Resistenzmechanismen zu Trastuzumab (z.B.Herceptin), ein humanisierter monoklonaler Antikörper gezielt die extrazelluläre Domäne des HER2-Protein-9. Trastuzumab + Chemotherapie ist weithin anerkannt als der standard Erstlinien Behandlung von HER2-positivem metastasierendem Brustkrebs. Dank den letzten präklinischen Studien, die zeigen, dass Anti-HER2 Therapien haben signifikante Aktivität in beide in Vitro und in Vivo HER2-positivem Magenkrebs Modelle10,11, molekulare Medikamente gegen HER2 gewesen umfassend in klinischen Studien untersucht, sind von denen einige noch im Gange, bei Patienten mit Gastroesophageal Krebs12,13,14,15.
Diese Studien haben betont, dass die steigende Zahl von Patienten, bei denen Widerstandsfähigkeit gegen Trastuzumab16, ähnlich wie was für andere gezielte therapeutische Inhibitoren beobachtet wird. Insbesondere die Rücklaufquote von Trastuzumab betrug 47 %, und die mediane Gesamtüberleben für Trastuzumab + Chemotherapie-Patienten betrug nur 2,7 Monate länger als bei Patienten unter Chemotherapie allein17. Dies schlug während primäre Trastuzumab-Resistenz vorherrscht, sekundäre Trastuzumab Widerstand unvermeidlich ist. Aus diesem Grund ist die dringende Notwendigkeit zur Klärung der Mechanismen, die HER2-gezielte Therapieresistenz bei Magenkrebs, was angesichts die Intra-Tumor genetische Heterogenität dieser Neoplasie18noch problematischer ist.
Darüber hinaus haben die Mechanismen der Resistenz gegen Trastuzumab bei Magenkrebs schwierig zu erklären, teilweise aufgrund der Schwierigkeiten bei der Beschaffung von zuverlässigen präklinischen Modellen Vertreter dieser Erkrankung bewährt. Oshima Et Al. berichtet eine in Vivo Auswahlmethode Trastuzumab resistenten Magen-Krebs-Zell-Linien, bestehend aus einer wiederholten Kultur eine kleine verbleibende peritonealen Metastasen nach einer Behandlung mit Trastuzumab19. Allerdings trugen die Notwendigkeit eines Gehäuses, bestimmten tierischen Umgang mit Know-how und der Genehmigung der Tier-Ethik-Kommission, so dass es eine Methode zeitaufwändig und Kosten. Der Ansatz, den wir in dieser Arbeit zu beschreiben ist einfach und vielseitig einsetzbar und kann leicht erweitert werden, um die Resistenzmechanismen gegenüber anderen therapeutischen Medikamenten in verschiedenen Tumor Histotypes20zu untersuchen.
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Protocol
Hinweis: Dieses Protokoll wurde speziell für die Analyse der Mechanismen, die erworbenen Resistenz gegen Trastuzumab HER-positivem Magenkrebs Zell-Linien angepasst. Alle Laborgeräte benötigt werden in der Tabelle der Materialiengemeldet.
1. Generation der gezielten Therapie resistente Subclones
Hinweis: Dies ist der kritische und schwierige Schritt in das Protokoll zu standardisieren, da verschiedene Zelllinien unterschiedliche Empfindlichkeiten, die gezielte therapeutische Inhibitor unabhängig von ihrem Tumor Histotype oder Medikament Konzentration aufweisen können verwendet.
- Kultur NCI-N87 Zelle Line-in RPMI Medium ergänzt mit fetalen Kälberserum (10 %) und Glutamin (2 mM, 1 %), als eine Monolage bei 37 ° C und Samen es auf 25 cm2 Kulturflaschen.
- Fügen Sie zu dem Kulturmedium in jeder Flasche 10 µg/mL Trastuzumab als die Anfangsdosis. Setzen Sie die Zellen, die die Anfangsdosis aus, bis sie wachsen wieder aufzunehmen.
Hinweis: Die Anfangsdosis von der gezielten Therapie Inhibitor sollte 10-Mal niedriger als seine Plasmakonzentration Höhepunkt sein. Plasma-Peak-Konzentration ist die höchste Stufe der Arzneimittelkonzentration im Patientenblut in der Regel durch mehrere Dosen der Standardtherapie erkannt. Dieser Wert kann aus Studien zur Pharmakokinetik abgerufen werden. - Zellwachstum mit dem Trypan blau-Ausschluss-Verfahren zu überwachen; Wenn Zellwachstum (in der Regel nach einem Zeitraum von zwei bis drei Wochen) fortgesetzt wird, setzen Sie Zellen zu einer 10-divisibel höhere Dosis Konzentration von Trastuzumab.
- Setzen Sie Zellen zu einer allmählich zunehmenden Dosis von Trastuzumab (ab 100 µg/mL bis 400 µg/mL) bis Zellen halten trotz der Anwesenheit von einer hohen Wirkstoffkonzentration (mindestens 2,5 - 4-fach höher als der Plasma-Gipfel) (nach ca. 2 Wochen) wachsen.
-
Führen Sie einen klonogenen-Assay, um das Niveau des Widerstands zur gezielten Therapie bei jeder Änderung in der Konzentration von der Ziel-Therapie-Inhibitor in das Kulturmedium zu bewerten, und definieren Sie relative Resistenz IC50 Index (RR IC50) wie folgt.
- Samen Sie 500 Zellen in 24 Multi-gut Kultur Platten.
Hinweis: 5 Brunnen müssen für jede Bedingung vorbereitet werden. - Setzen Sie Zellen zu steigenden Ziel Therapie Inhibitor (Trastuzumab) Konzentrationen von 100 µg/mL bis zu 400 µg/mL.
- 15 Tage inkubieren Sie Zellen in eine CO2 Inkubator bei 37 ° C.
- Nach der Inkubation zu beheben und Proben wie folgt zu beflecken.
- Medium und spülen Sie Zellen mit 10 mL 1 X PBS zu entfernen. Entfernen Sie 1 X PBS zu, und fügen Sie 2-3 mL Fixierung-Lösung (acetic Acid: Methanol, 1:7 (Vol/Vol)). Entfernen Sie die Fixierung Lösung, und fügen Sie 0,5 % Kristallviolett-Lösung. Inkubation bei Raumtemperatur für 2 h
- Entfernen Sie die Kristallviolett-Lösung durch Absaugen mit einer Pipette vorsichtig und Tauchen Sie Platten in Leitungswasser abzuspülen Rückstände Kristallviolett-Lösung. Für bis zu 2 Tage an der Luft trocknen Sie bei Raumtemperatur.
- Anzahl der Kolonien von mehr als 50 Zellen mit einem inversen Mikroskop (4 X Vergrößerung).
Hinweis: Zwei unabhängige Beobachter sind dafür erforderlich. - Berechnen Sie RR IC50 als das Verhältnis zwischen dem IC50 Wert der Target-Therapie-resistente Subclone Zellen und den Wert der Original/naive Zellen.
- Samen Sie 500 Zellen in 24 Multi-gut Kultur Platten.
2. Validierung Protokoll für den Kandidaten gezielte Therapie-Resistenz-Gen (R-gen)
Hinweis: Nach der Charakterisierung der Genexpression, Signaturen zugeordneten erworbene Resistenz Ziel Therapie und jedes Kandidaten-gen als Fahrer des Widerstands durch untersucht werden: (a) RT-PCR und (b) Western blot Analyse.
-
Real-Time RT-PCR
- Gesamt-RNS von Zelllinien mit Säure Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Mischung zu extrahieren (siehe Tabelle der Materialien).
- Reversen Transkription (RT) Reaktionen mit random Hexamer Primer durchzuführen und stellen die Thermocycler folgendermaßen: bei 25 ° C für 5 min, RT bei 46 ° C für 20 min und RT-Inaktivierung bei 95 ° C für 1 min grundieren.
- Einsatz 400 ng von Gesamt-RNS 20 µL zu reagieren. Bereiten Sie das Reaktionsgemisch für Probe wie folgt: 7 µL RNase frei H2O 2 µL cDNA (10 ng/µL) 1 µL 20 x Leuchtstoff-Label gezielt Sonde und 10 µL 2 x Mix enthaltenden Puffer, dNTPs und DNA-Polymerase (siehe Tabelle der Materialien).
- Jede gut Platte 20 µL des Reaktionsgemisches hinzu und führen Sie das folgende Programm: holding Phase bei 50 ° C für 2 min bei 95 ° C für 10 min (1 Zyklus); dann 40 Zyklen bei 95 ° C für 15 s und bei 60 ° C für 1 min.
-
Western-blot
- Zellsuspensionen zu erholen, indem Sie 2 mL 0,05 % Trypsin/EDTA-Lösung hinzufügen und 2-3 min. für Trypsin zu arbeiten.
- Fügen Sie 2 Bände der mittlere mit 10 % fötalen Rinderserum zu neutralisieren (z.B.2 mL Medium für jeweils 1 mL Trypsin) Trypsin und Zentrifugieren bei 1.200 x g für 5 min. verwerfen überstand und waschen Zellen mit kalten 1 X PBS hinzu.
- 1.200 x g für 5 min Zentrifugieren und überstand verwerfen. Aufschwemmen der Zelle Pellet mit Lyse Puffer und eine Wippe bei 4 ° C für 30 min inkubieren.
- Die Höhe der Lyse Puffer hängt von der Anzahl der Zellen (z.B. 100 µL 1 x 106 Zellen); Achten Sie auf frische Lyse Puffer jedesmal vorzubereiten. Für 1 mL Lyse Puffer Vorbereitung (Urlaub auf dem Eis): verwenden Sie 975 µL M-pro Säugetier-lysate Puffer, 15 µL Protease und Phosphatase-Inhibitoren und 10 µL 100 µM PMSF Inhibitoren.
- Wiederherstellen Sie das überstehende Protein durch Zelle lysate Zentrifugation bei 13.000 x g bei 4 ° C für 15 Minuten.
- Bestimmen Sie die Proteinkonzentrationen mithilfe eines BCA Protein Assays.
- Fügen Sie 4 x LaemmLi Probenpuffer Proteinproben (mindestens 20-30 µg Protein) und Hitze bei 100 ° C für 3 Minuten.
- Verwenden Sie vorgefertigte 4-20 % Gele und laden Sie 20-30 µg Proteinlösung LaemmLi und 5-10 µL Protein standard pro Probe.
- Den Western-Blot-Ring mit TRIS/GLICYNE /SDS 1 X Puffer füllen und Gel bei 110 V 30-60 min. ausgeführt werden (wenn die Zeit steht, Check, die der Farbstoff das Ende des Gels still, sonst laufen für ein paar weitere Minuten erreicht hat)
- Electroblot Protein in einer PVDF-Membran übertragen (siehe Tabelle der Materialien) mit einem semi-dry-System.
- Blockieren Sie die Membran durch Einweichen in der entsprechenden Proteinlösung (Milch/BSA 5 %) auf den Shaker für 1 h bei Raumtemperatur.
- Machen Sie eine 1: 400-Lösung mit primären Antikörper Anti-IQGAP1 in einer 5 %-Milch-Lösung (siehe Tabelle der Materialien).
- Legen Sie die Membran in primären Antikörper-Lösung auf einem Shaker in einem kalten Raum über Nacht.
- Am nächsten Tag die Antikörperlösung zu verwerfen und in T-TBS 1 X Lösung einweichen (1 x T-TBS: 1 X Kochsalzlösung Tris-Puffer hinzugefügt durch Tween20 0,1 %) auf einem Schüttler bei Raumtemperatur für 7 Minuten.
- Verwerfen Sie T-TBS 1 x Lösung und ersetzen. Wiederholen Sie 3 Mal.
- Machen Sie eine 1: 10.000 Sekundärantikörper Maus Lösung durch Zugabe von Antikörper für standard Western blot Erkennung (siehe Tabelle der Materialien) und die Membran auf einen Shaker; lassen Sie bei Raumtemperatur für 2 h.
- Die Antikörperlösung zu verwerfen und in T-TBS 1 X Lösung auf einem Schüttler bei Raumtemperatur für 7 min einweichen.
- Verwerfen Sie T-TBS 1 x Lösung und ersetzen. Wiederholen Sie 3 Mal.
- Membran für 5 min in eine Chemolumineszenz Lösung einweichen, und die Membran auf einen Chemilumineszenz-Imager Bild.
3. Wiederherstellung der Target-Therapie Inhibitor Empfindlichkeit von Kandidaten Knock-down-R-gen
-
Handy-Vorbereitung
- Bereiten Sie einzelne Zellsuspension durch Trypsinization. Führen Sie Transfektion auf den Tag, an dem die Zellen überzogen sind.
- NCI-N87 waschen mit PBS Zellen und Inkubation bei 37 ° C mit 0,05 % Trypsin/EDTA Lösung für ca. 5-10 min. Add 2 Volumen von RPMI Medium mit 10 % fetalen Rinderserum, Trypsin (z.B.2 mL Medium für jeweils 1 mL Trypsin) zu neutralisieren.
- Anzahl Zellen mit einer Hemocytometer verwenden Trypan blau zu färben. 2.5 x 105 Samenzellen (60 % Zusammenfluss) auf ein T25 cm2 Fläschchen für jede Bedingung.
Hinweis: Die entsprechende Anzahl von Zellen für die Aussaat richtet sich nach der Verdopplungszeit der Zelllinie und die Dauer des Experiments. Ziel ist es, das Zielgen Knock-down-für die gesamte Dauer des Experiments zu erreichen. Neun T25 cm2 Flaschen sind ideal für Transfektion Bedingungen und der klonogenen-Assay (3 Flaschen für Steuerelemente, 3 Flaschen für negative Transfektion Steuerelemente, 3 Flaschen für gen-Ziel Transfektion).
- Bereiten Sie einzelne Zellsuspension durch Trypsinization. Führen Sie Transfektion auf den Tag, an dem die Zellen überzogen sind.
-
Umgekehrte Transfektion
- Gen-Ziel vorzubereiten und negative Kontrolle Transfektion Mix für jede T25 cm2 Kolben wie folgt.
- Verdünnen Sie 12,5 µL der einzelnen Gene-targeting SiRNA Oligonukleotide oder Negativkontrolle SiRNA Oligonukleotide in minimalen wesentliche Transfektion Medium (Verhältnis 01:55; siehe Tabelle of Materials).
- Fügen Sie eine kationische Liposomen Transfection Reagens (Verhältnis 1:1 mit gen-targeting SiRNA Oligonukleotide; siehe Tabelle of Materials). Bei Raumtemperatur für 20 min inkubieren.
Hinweis: Das Gesamtvolumen der Transfektion Mischung ist 700 µL. - Jedem T25 cm2 Kolben 700 µL der Transfektion Mischung hinzufügen. 1-3 Tage inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C.
- Knock-down gen durch RT-PCR und Western-Blot Analyse zu überprüfen. Überprüfen Sie die Auswirkungen des vermeintlichen R-gen Knock-Down auf die Wiederherstellung der Sensibilität für das gezielte therapeutische Mittel durch Kolonie-Bildung-Experimente (wiederhole Schritt 1.5).
- Gen-Ziel vorzubereiten und negative Kontrolle Transfektion Mix für jede T25 cm2 Kolben wie folgt.
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Representative Results
Abbildung 1 steckt den Rahmen für die Versuchsdurchführung. Drei Magenkrebs-Zelllinien mit dem Ausdruck eines hohen Maß an HER2 und anfällig für Trastuzumab (IC50 < Plasma Spitzenpegel von Drogen, Figur 2A, linke Diagramm) im Kulturmedium, enthält das gezielte therapeutische Mittel gewachsen waren. Eine Dosis 10-Mal niedriger als der Peak-Plasma-Konzentration von Trastuzumab (10 µg/mL) wurde als die Anfangsdosis und schrittweise erhöht bis 400 µg/mL über einen Zeitraum von 8-12 Monaten. Danach erhalten wir drei Subclones zeichnet sich durch eine stabile Widerstand Phänotyp mit IC50 Werte niedriger als die Spitze Plasmaspiegel von Trastuzumab (Abb. 2A, Grafik rechts). Unter anderem erreichte die widerstandsfähigsten Subclone HR NCI N87, einen RR IC50 Wert von 28.57 (Abb. 2 b). IQGAP1 scheint eine Schlüsselrolle in der Widerstand Phänotyp der HR NCI N87 Unterzeile zu spielen. Die Analysen von Protein und gen ausdrücken unterstützt diese Hypothese: die IQGAP1 Protein-Ebene in der beständig Subclone ist etwa 5-fach höher als in den elterlichen Zellen. Ebenso ist der Korrespondent IQGAP1 Genexpression 2,5-fach höher in der HR NCI N87 Unterzeile als in der NCI N87-Linie (Abb. 3A).
IQGAP1 Gen-silencing wurde durchgeführt, um seine Rolle in der Entwicklung von Trastuzumab resistenten Phänotyp zu evaluieren. Das Protokoll verwendet, um IQGAP1 Genexpression zum Schweigen zu bringen erwies sich besonders wirksam, knock down IQGAP1 Protein-Inhalt auf fast alle Zellen in einem T25 cm2 Zelle Kultur Kolben (ca. 2,5 x 105 Zellen) angebaut (Abb. 3A).
Darüber hinaus bestätigt der klonogenen Assay die Arbeitshypothese, die zeigen, dass IQGAP1 Gen-silencing Wiederherstellungen Trastuzumab Empfindlichkeit in HR NCI N87 Zellen als belegt durch die Absenkung der IC50 Wert bis 7 µg/mL (Abb. 3 b).
Abbildung 1: Rahmen für die in-vitro- Analyse der zugrunde liegenden Mechanismen erworben gezielt Therapieresistenz. Drei verschiedene Trastuzumab-resistente Subclones aus drei verschiedenen Trastuzumab-Sensitive Krebszelllinien abgeleitet wurden generiert und für Änderungen an HER2-Signalisierung Mechanismen durch Next Generation Sequencing, immunhistochemische gekennzeichnet, Western-Blot und RT-PCR-Techniken. Alle Subclones zeigten einen unterschiedlichen Resistenzmechanismus. Gezielte Therapie Empfindlichkeit wurde in einem bestimmten Subclone wiederhergestellt, wenn Kandidaten Fahrer gen des Widerstands zum Schweigen gebracht wurde. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Bestimmung der relativen Widerstand IC50 Index (RR IC50) über klonogenen Assay in Magenkrebs Zelllinien. (A) Wachstum Kurven Daten für naiv (linke Grafik) und beständig (Grafik rechts) Zelllinien von koloniebildenden Experimente erzeugt. Die x-Achse ist Trastuzumab Konzentration. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichung (SD). Die Standardabweichung mehr nie als 5 %. (B) repräsentative Bilder unterstützen die Erzeugung von NCI-N87-resistenten Subclone klonogenen-Assay. Dargestellt durch die Zeitleiste benötigt die Generation der HR Trastuzumab NCI N87 Zellen 12 Monate kontinuierliche Exposition gegenüber dem gezielte Erreger. Diese Zahl ist aus der Arbeit von Arienti Et Al. angepasst 9 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Trastuzumab Sensibilität wiederherzustellen, indem Sie IQGAP1 gen Knock-down. (A) IQGAP1 Proteingehalt von densitometrische Analysen im Balkendiagramm, NCI N87 Elternlinie, und in seinen und zum Schweigen gebracht resistente Subclone (linke Grafik). Die mRNA IQGAP1 Ausdruck Ebene wurde auch überprüft, in allen drei Zelllinien durch RT-PCR-Technik (Grafik rechts). Daten wurden als Mittelwert ± SD (B) klonogenen Assay zeigte die unterschiedliche Empfindlichkeit des NCI N87 Elternlinie und in seinen und zum Schweigen gebracht resistente Subclone zu 100 µg/mL Trastuzumab vorgestellt. Die Kolonie wurde nach 14 Tagen der Zelle Samen gezählt. Thumbnail Abbildungen zeigen repräsentative Kolonie Kulturen. Diese Zahl ist aus der Arbeit von Arienti Et Al. angepasst 9 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Schritte | Protokoll | T25 cm2 |
| Samen Zellen 60 % Zusammenfluss | Adhärente Zellen | 1,75 x 103 |
| Verdünnte SiRNA Oligonukleotide in minimalen wesentliche Transfektion Medium (Verhältnis 01:55) | siRNA | 12,5 ΜL |
| Transfektion medium | 687.5 ΜL | |
| Lipofectamine Transfection Reagens hinzufügen | Lipofectamine Reagenz | 12,5 ΜL |
| Inkubieren | Inkubation bei Raumtemperatur für 20 min | |
| Fügen Sie Mischung auf Zellen | Inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C für 1-3 d | |
Tabelle 1: Empfohlene Reagenz Mengen und Volumina für Kandidat Widerstand Gene Knock-down.
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Discussion
Während personalisiert und gezielte Therapien haben wachsende Begeisterung ausgelöst, diese so genannten "intelligenten" Therapien stellen die gleiche Hürde als herkömmliche Chemotherapeutika, d. h., die schnelle und unvorhersehbare Übernahme von Resistenzen. Um die Ergebnisse der gezielten Therapie zu verbessern, müssen Medikamentenresistenz Probleme durch ein besseres Verständnis der Mechanismen gelöst werden, die sie verursachen. Hier haben wir eine leicht zugänglich in-vitro- Methodik zur Untersuchung der Mechanismen der erworbenen Resistenz gegen gezielte Therapie Medikamente in Krebs Zelle Line Modelle vorgestellt.
Die Generation der gezielten therapieresistenter Subclones ist die kritische und schwierige Schritt in diesem Protokoll aufgrund der intrinsischen genetische Heterogenität zwischen den Zelllinien verwendet, und ihre unterschiedlichen Grad der Empfindlichkeit der Droge zu standardisieren. Aus diesen Gründen kann die Zeit erforderlich, um resistente Subclones variieren. Chronischer Exposition gegenüber Anti-Krebs-molekulare Agenten verursacht in der Regel eine starke Tumor Wachstumshemmung. Jedoch wieder Zellen nach einer Variablen Zeit kontinuierliche Arzneimittelexposition (8-12 Monate), wuchs mit einer Rate ähnlich dem von unbehandelten Kontrollzellen aufgenommen.
Darüber hinaus trotz dieser gen-Expression, die Daten verwendet wurden, um gen-bezogene Ziel Therapieresistenz stellen die Hypothese auf, tut eine anderen Ausdruck Ebene nicht immer eine unsachgemäße Proteinfunktion zu reflektieren oder korrelieren mit dem Widerstand Phänotyp. Aufgrund der Komplexität der Beziehung zwischen der Expression des vermeintlichen resistente Gens und der Widerstand gegen die gezielte Therapie sind weitere molekulare Untersuchungen, wie z. B. Bioinformatik-Analyse, einschließlich gen/Protein nötig Interaktion, biologischer Prozess Bereicherung und molecular Modelling.
Ein weiterer kritischer Punkt könnte die Besonderheit und die Genauigkeit der SiRNA Oligonukleotid, Zielausdruck zu reduzieren. Eine mögliche Lösung wäre die Verwendung von Design-Tools für die Auswahl der funktionalen SiRNA und eine Mischung von SiRNA für dasselbe Zielgen.
Schließlich bezieht sich eine geringfügige Einschränkung auf die Methode verwendet, um die Empfindlichkeit um die zielgerichtete Therapie Inhibitor aufgrund vorübergehender Dauer der Transfektion wiederherzustellen. Maximale Knock-Down Ziel mRNA (> 85 %) berichtete am 2. Tag nach Transfektion und hielt > 80 % durch 5-7 Tage. Bedeutende Knock-down-wenn auch in geringerem Maße wurde noch am 6. Tag beobachtet. Aus diesem Grund sollte die Zytotoxizität Assay für die Überprüfung der Wiederherstellung der Droge Empfindlichkeit innerhalb von 5 Tagen von Gen-silencing durchgeführt werden.
Unser Protokoll ist eine Zeit und Kosten wirtschaftlicheren Methode für die Untersuchung von in-vitro- erworbene Resistenz. Die Generation der resistenten Subclones, könnten Spiegelung der Intra-Tumor Heterogenität der Krebszellen, neuartige Mechanismen der erworbenen Resistenz gegen Krebs gezielte Agenten zu enthüllen. Insbesondere sind sie besser geeignet für Hochdurchsatz-genomische oder Proteomik-Screenings für molekulare Veränderungen in resistenten Zellen als ihre sensiblen Kollegen identifizieren.
Diese präklinische Plattform könnte problemlos erweitert werden, um allgemeine Resistenzmechanismen, gezielt Therapeutika in verschiedenen Tumor Histotypes, Bereitstellung eines Standardverfahrens für die Entdeckung der weitere Angriffspunkte für Medikamente Resistenzen überwinden zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Dr. Veronica Zanoni danken für das Manuskript zu bearbeiten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 | TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples |
| ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT | Bio-Rad | 1708891 | The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR. |
| TaqMan gene expression assay | Life Technologies | 4331182 | Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5’ end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3’ end. |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78501 | Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells. |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard. |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample. |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 456-1094 | Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis. |
| Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards | Bio-Rad | 1610376 | Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD). |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | 10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE. |
| Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs | Bio-Rad | 1704156 | Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane. |
| Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate | Bio-Rad | 1610381 | StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots. |
| Immun-Star WesternC solution | Bio-Rad | 5572 | Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein. |
| Universal Negative Control | Invitrogen | 12935300 | Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology. |
| opti-MEM Glutamax Medium | Thermo Fisher Scientific | 51985026 | Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology. |
| Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA | Ambion | 4390824 | RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types. |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778075 | Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types. |
| Mouse anti-IQGAP1 | Invitrigen | 33-8900 | working concentration: 1:400 in 5% milk solution |
| goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005 | Santa Cruz | sc-2005 | working concentration: 1:10000 in 5% milk solution |
| PMSF | Sigma Aldrich | P 7626 | this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase |
| Thermocycler for RT-PCR | MJ Research | MJ Research PTC-200 Thermal Cycler | it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3°C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers |
| Real Time RT-PCR instrument | Applied Biosystems | 7500 RT-PCR system | This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers |
| Microvolume Spectrophotometers | Thermo Scientific | Nanodrop | It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample |
| Blotting system | Bio-Rad | Trans-Blot Turbo system | It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes |
| Image acquisition system and gel documentation | Bio-Rad | Chemidoc image system | It is easy to use for chemiluminescent detection |
References
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