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Cancer Research

Alla ricerca di Driver delle vie di acquisito resistenza alla terapia mirata: generazione farmacoresistenti Subclone e sensibilità ripristino di Gene Knock-down

Published: December 11, 2017 doi: 10.3791/56583
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS

Summary

Si tratta di un protocollo di tempo e costi efficaci in vitro indagare i meccanismi della resistenza acquisita agli agenti terapeutici mirati, che è un bisogno medico altamente insoddisfatto in gestione del cancro.

Abstract

Negli ultimi due decenni hanno visto uno spostamento da farmaci citotossici a terapia mirata in oncologia medica. Anche se gli agenti terapeutici mirati hanno dimostrato efficacia clinica più impressionante e ridotto al minimo gli effetti negativi rispetto ai trattamenti tradizionali, farmacoresistenza è diventata la principale limitazione alla loro benefici. Diversi modelli preclinici/in vitro/in vivo di resistenza acquisita ad agenti mirati nella pratica clinica sono stati sviluppati utilizzando principalmente due strategie: manipolazione i) genetica per la modellazione di genotipi di resistenza acquisita e ii) in vitro / in vivo selezione dei modelli resistenti. Nel presente lavoro, proponiamo un quadro unificante, per indagare i meccanismi responsabili della resistenza acquisita agli agenti terapeutici mirati, a partire dalla generazione di subcloni cellulari resistenti alla droga alla descrizione del le procedure utilizzate per ripristinare la sensibilità all'inibitore di silenziamento. Questo approccio semplice di tempo e costi efficaci è ampiamente applicabile e può essere facilmente estesa per studiare i meccanismi di resistenza ad altri farmaci terapeutici mirati in istotipi differenti del tumore.

Introduction

In seguito le scoperte cruciali nella biologia molecolare e cellulare, un numero di nuove molecole antitumorali sintetizzati è stato sviluppato per mirare selettivamente oncogeniche vie di segnalazione in una vasta gamma di tipi di tumore. In particolare, composti di due categorie di agenti terapeutici mirati con proprietà uniche in oncologia, vale a dire sintetici chimici e anticorpi monoclonali ricombinanti, sono noti ad aver raggiunto successi clinici e cura del cancro drammaticamente alterato in ultimi decenni1,2,3.

Tuttavia, nonostante la loro impressionante risposta iniziale al trattamento, la maggior parte dei malati di cancro hanno sviluppato resistenza ai farmaci a tutti gli agenti terapeutici mirati, sia gli anticorpi monoclonali e gli inibitori della chinasi. Di conseguenza, farmacoresistenza, il grande ostacolo per farmaci anti-cancro classico4, è ancora una grande sfida per emergenti terapie mirate5,6.

Resistenza alla terapia mirata può essere intrinseco (cioè, primario) o acquisito (cioè, secondario). Resistenza intrinseca descrive una de novo in mancanza di risposta alla terapia, mentre la resistenza secondaria si verifica dopo un periodo di risposta alla droga trattamento7. Quest'ultimo è causato da focolai di piccole coorti di cellule del tumore all'interno della massa del tumore primitivo o immerso nelle nicchie anatomiche criptici distale, che esibiscono fino al 90% resistenza a uno o più mirati agenti terapeutici. Meccanismi molecolari alla base di uno sviluppo di resistenza alla terapia mirata principalmente il risultato di mutazioni del gene bersaglio e ridondante attivazione di altre vie di segnalazione pro-sopravvivenza, cui la comprensione è lungi dall'essere completa8.

In questo lavoro, abbiamo proposto un approccio a tempo e a costi efficaci per studiare in vitro i meccanismi di resistenza acquisita agli agenti terapeutici mirati, a partire dalla generazione di subcloni cellulari resistenti alla droga alla descrizione di silenziamento procedure utilizzate per ripristinare la sensibilità all'inibitore, uno strumento fondamentale utilizzato per testare e convalidare le ipotesi di lavoro. In particolare, il nostro approccio è stato usato per studiare, nel cancro gastrico, i meccanismi di resistenza al trastuzumab (per esempio, Herceptin), un anticorpo monoclonale umanizzato il dominio extracellulare di HER2 proteina9di targeting. Trastuzumab + chemioterapia è ampiamente accettata come il trattamento standard di prima linea per tumore mammario metastatico HER2-positivo. Grazie a studi preclinici recenti che mostrano quello anti-HER2 terapie hanno attività significativa in entrambi in vitro e in vivo il cancro gastrico HER2-positivi modelli10,11, farmaci molecolari destinazione HER2 sono stati ampiamente esaminato negli studi clinici, alcuni dei quali sono ancora in corso, su pazienti con gastroesofageo cancro12,13,14,15.

Questi studi hanno sottolineato il crescente numero di pazienti che avvertono la resistenza a trastuzumab16, similmente a ciò che è osservato per altri inibitori terapeutici mirati. In particolare, il tasso di risposta di trastuzumab era 47%, e la sopravvivenza globale mediana per i pazienti su trastuzumab + chemioterapia era solo 2,7 mesi più lungo per i pazienti in chemioterapia da solo17. Ciò ha suggerito che, mentre la resistenza primaria trastuzumab è prevalente, resistenza secondaria trastuzumab è inevitabile. Per questo motivo, c'è bisogno urgente di chiarire i meccanismi che causano la resistenza di terapia mirata di HER2 nel carcinoma gastrico, che è ancora più problematico dato l'eterogeneità genetica intra-tumorale di questa neoplasia18.

Inoltre, meccanismi di resistenza al trastuzumab nel cancro gastrico hanno dimostrato difficile da spiegare, parzialmente a causa della difficoltà nell'ottenere il rappresentante di modelli preclinici affidabili di questa circostanza. Oshima et al ha segnalato un metodo di selezione in vivo di linee cellulari di carcinoma gastrico trastuzumab-resistente, composto da una cultura ripetuta di piccola metastasi peritoneale residua dopo il trattamento con trastuzumab19. Tuttavia, la necessità di un recinto, di competenza di gestione specifica degli animali e dell'approvazione del Comitato di etica animale hanno contribuito a renderlo un metodo che richiede tempo e costi. L'approccio che descriviamo in questo lavoro è semplice e ampiamente applicabile e può essere facilmente estesa per studiare i meccanismi di resistenza ad altri farmaci terapeutici differenti del tumore istotipi20.

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Protocol

Nota: Questo protocollo è stato regolato in modo specifico per l'analisi dei meccanismi di resistenza acquisita al trastuzumab di linee cellulari di cancro gastrico HER-positivi. Tutti gli strumenti di laboratorio necessari sono riportati nella Tabella materiali.

1. generazione di subcloni resistente di terapia mirate

Nota: Questo è il più critico e difficile da standardizzare passo nel protocollo, dovuto al fatto che diverse linee cellulari possono presentare diverse sensibilità all'inibitore terapeutico mirato indipendentemente dalla loro concentrazione di droga o istotipo del tumore utilizzato.

  1. Cultura NCI-N87 cella linea in medium RPMI completate con siero fetale di vitello (10%) e glutamina (2 mM, 1%), come un monostrato a 37 ° C e semi in matracci di cultura di 25 cm2 .
  2. Aggiungere al terreno di coltura in ogni bottiglia 10 µ g/mL di trastuzumab come dose iniziale. Esporre le cellule per la dose iniziale fino a riprendere la crescita.
    Nota: La dose iniziale dell'inibitore terapia mirata dovrebbe essere 10 volte inferiore al suo picco di concentrazione plasmatica. Concentrazione di picco plasmatica è il più alto livello di concentrazione del farmaco rilevati nel sangue del paziente solito a seguito di dosi multiple di terapia standard. Questo valore può essere recuperato da studi sulla farmacocinetica.
  3. Monitorare la crescita delle cellule con il metodo di esclusione del trypan blu; Quando la crescita delle cellule è ripresa (in genere dopo un periodo di due o tre settimane), esporre le cellule ad una concentrazione di dose 10 volte superiore di trastuzumab.
  4. Esporre le cellule ad una dose gradualmente crescente di trastuzumab (da 100 µ g/mL a 400 µ g/mL) fino alle cellule continuare a crescere (dopo circa 2 settimane) nonostante la presenza di una concentrazione di farmaco alta (almeno 2,5 - 4 volte superiore rispetto al picco del plasma).
  5. Eseguire un'analisi clonogenic per valutare il livello di resistenza alla terapia mirata ad ogni cambiamento nella concentrazione dell'inibitore terapia target nel terreno di coltura e definire la resistenza relativa IC50 indice (IC RR50) come segue.
    1. 500 cellule 24 multi-pozzetto in piastre a coltura del seme.
      Nota: 5 pozzi devono essere preparati per ogni set di condizioni.
    2. Esporre le cellule a concentrazioni crescenti di inibitore (trastuzumab) terapia target da 100 µ g/mL fino a 400 µ g/mL.
    3. Incubare le cellule in un incubatore a CO2 a 37 ° C per 15 giorni.
    4. Dopo l'incubazione, difficoltà e macchia campioni come segue.
      1. Rimuovere le cellule medie e risciacquo con 10 mL di PBS 1X. Rimuovere 1X PBS e aggiungere 2-3 mL di soluzione di fissaggio (acido acetico: metanolo, 1:7, (vol/vol)). Rimuovere la soluzione di fissazione ed aggiungere la soluzione di cristalvioletto di 0,5%. Incubare a temperatura ambiente per 2 h
      2. Rimuovere con attenzione la soluzione di cristalvioletto aspirando con una pipetta e immergere le piastre in acqua di rubinetto per lavare via i residui di soluzione di cristallo viola. Asciugare a temperatura ambiente per 2 giorni.
    5. Contare le colonie di oltre 50 celle utilizzando un microscopio invertito (ingrandimento 4x).
      Nota: Due osservatori indipendenti sono necessari per questo.
    6. Calcolare IC RR50 come il rapporto tra il valore di IC50 delle cellule bersaglio-terapia-resistente subclone e il valore delle celle originale/ingenuo.

2. convalida protocollo per il candidato mirata terapia Gene di resistenza (R-gene)

Nota: Dopo la caratterizzazione dell'espressione genica, firme associate con la resistenza acquisita alla terapia target e qualsiasi gene candidato come driver di resistenza si studieranno attraverso: a) RT-PCR e b) Western blot analisi.

  1. RT-PCR in tempo reale
    1. Estrarre RNA totale da linee cellulari usando acido guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio miscela (Vedi Tabella materiali).
    2. Eseguire reazioni di trascrizione inversa (RT) utilizzando primers hexamer casuale e impostare il termociclatore come segue: adescamento a 25 ° C per 5 min, RT a 46 ° C per 20 min e l'inattivazione di RT a 95 ° C per 1 min.
    3. Uso 400 ng di RNA totale per una reazione di 20 µ l. Preparare la miscela di reazione per esempio come segue: 7 µ l RNasi free H2O, 2 µ l cdel DNA (10 ng / µ l), 1 µ l 20 x fluorescenti-labeled sonda specifica della destinazione e 10 µ l 2 x Mix contenente tampone, dNTPs e DNA polimerasi (Vedi Tabella materiali).
    4. Aggiungere 20 µ l di miscela di reazione per ogni piatto ben ed eseguire il seguente programma: holding fase a 50 ° C per 2 min, a 95 ° C per 10 min (1 ciclo); quindi 40 cicli a 95 ° C per 15 s e a 60 ° C per 1 min.
  2. Occidentale della macchia
    1. Recuperare le sospensioni cellulari aggiungendo 2 mL di soluzione di tripsina/EDTA 0,05% e permettendo di 2-3 min per tripsina a lavorare.
    2. Aggiungere 2 volumi di media contenente 10% siero bovino fetale per neutralizzare la tripsina (ad es., 2 mL di terreno per ogni 1 mL di tripsina) e centrifugare a 1.200 x g per 5 min. Discard surnatante e lavare le cellule con PBS 1X freddo.
    3. Centrifugare a 1.200 x g per 5 min ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare con buffer di lisi e incubare su un attuatore a 4 ° C per 30 min.
      1. La quantità di tampone di lisi dipende dal numero di celle (ad esempio, 100 µ l per 1 x 106 cellule); Assicurarsi di preparare il tampone di lisi fresco ogni volta. 1 ml di preparazione di buffer di lisi (lasciare il ghiaccio): utilizzare µ l 975 M-PER mammiferi lysate buffer, 15 inibitori di proteasi e fosfatasi µ l e 10 µ l 100 µM PMSF inibitori.
    4. Recuperare il surnatante proteina mediante centrifugazione lisato cellulare a 13.000 x g a 4 ° C per 15 min.
    5. Determinare le concentrazioni di proteina mediante un'analisi della proteina BCA.
    6. Aggiungere 4 x tampone di LaemmLi campioni proteici (almeno 20-30 µ g di proteine) e riscaldare a 100 ° C per 3 min.
    7. Utilizzare gel prefabbricati 4-20% e di carico 20-30 µ g di soluzione proteica LaemmLi e 5-10 µ l di proteina standard per campione.
    8. Riempire l'anello occidentale della macchia con il TRIS/GLICYNE /SDS 1x tampone ed esegua il gel a 110 V per 30-60 min (quando il tempo si ferma controllare che il colorante ha raggiunto la fine del gel, in caso contrario eseguire per alcuni minuti supplementari)
    9. Electroblot trasferire proteina in una membrana PVDF (Vedi Tabella materiali) utilizzando un sistema semi-secco.
    10. Bloccare la membrana mediante immersione in soluzione della proteina appropriato (latte/BSA 5%) sull'agitatore a temperatura ambiente per 1 h.
    11. Fare una soluzione di 1: 400 con l'anticorpo primario anti-IQGAP1 in una soluzione di latte del 5% (Vedi Tabella materiali).
    12. Posizionare la membrana in soluzione di anticorpo primario su un agitatore in una stanza fredda durante la notte.
    13. Il giorno seguente, scartare la soluzione di anticorpo e immergere in soluzione di T-TBS 1x (1 x T-TBS: 1x tampone salino Tris aggiunto di Tween20 0,1%) su un agitatore a temperatura ambiente per 7 min.
    14. Scartare T-TBS 1 x soluzione e Sostituisci. Ripetere 3 volte.
    15. Fare una soluzione di anticorpo secondario di 1: 10.000 con l'aggiunta dell'anticorpo per standard Western blot di rilevamento (Vedi Tabella materiali) e posizionare la membrana in un agitatore; lasciare a temperatura ambiente per 2 h.
    16. Scartare la soluzione di anticorpo e immergere in soluzione di 1 x T-TBS su un agitatore a temperatura ambiente per 7 min.
    17. Scartare T-TBS 1 x soluzione e Sostituisci. Ripetere 3 volte.
    18. Immergere la membrana per 5 minuti in una soluzione a chemiluminescenza e l'immagine della membrana su un imager di chemiluminescenza.

3. ristabilimento della sensibilità di inibitore di terapia Target di candidati R-gene Knock-down

  1. Preparazione delle cellule
    1. Preparare la sospensione unicellulare di trypsinization. Eseguire transfezione il giorno in cui le cellule sono placcate.
      1. NCI-N87 lavare le cellule con PBS e incubare a 37 ° C con soluzione di tripsina/EDTA 0,05% per 5-10 minuti aggiungere 2 volume di RPMI medium contenente 10% siero bovino fetale per neutralizzare la tripsina (ad es., 2 mL di terreno per ogni 1 mL di tripsina).
      2. Contare le celle con un emocitometro usando la macchiatura blu di trypan. Cellule di5 seme 2,5 x 10 (60% confluenza) in un pallone di2 cm di T25 per ogni condizione.
        Nota: Il numero appropriato di cellule per il seeding è determinato dal tempo di raddoppio della linea cellulare e la durata dell'esperimento. L'obiettivo è raggiungere il gene bersaglio knock-down per tutta la durata dell'esperimento. Boccette2 di nove T25 cm sono ideali per condizioni di transfezione e analisi clonogenic (3 boccette per i controlli, 3 boccette per i controlli negativi transfezione, 3 boccette per la transfezione del gene-bersaglio).
  2. Invertire la transfezione
    1. Preparare gene-bersaglio e negativi mix di transfezione di controllo per ciascuna beuta di2 cm T25 come segue.
      1. Diluire 12,5 µ l di ogni gene-targeting siRNA oligonucleotidi o oligonucleotidi di siRNA di controllo negativo in mezzo minimo essenziale transfezione (rapporto 01:55; Vedi Tabella materiali).
      2. Aggiungere un reagente di transfezione di liposomi cationici (rapporto 1:1 con oligonucleotidi di siRNA gene-targeting; Vedi Tabella materiali). Incubare a temperatura ambiente per 20 min.
        Nota: Il volume totale della miscela di transfezione è 700 µ l.
      3. Aggiungere 700 µ l della miscela transfezione ciascun matraccio di2 cm T25. Incubare le cellule a 37 ° C per 1-3 giorni.
    2. Verificare gene knock-down tramite RT-PCR e Western blot. Verificare l'impatto del presunto R-gene knock-down sul restauro sensibilità all'agente terapeutico mirato attraverso esperimenti di formazione di Colonia (ripetere passo 1.5).

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Representative Results

Figura 1 delinea il quadro delle procedure sperimentali. Tre cancro gastrico-linee cellulari che esprimono un elevato livello di HER2 e sensibile al trastuzumab (IC50 < livello del plasma di picco del grafico di sinistra di droga, Figura 2A,) sono state coltivate in terreno di coltura contenente l'agente terapeutico mirato. Una dose 10 volte inferiore la concentrazione plasmatica di picco di trastuzumab (10 µ g/mL) è stata impostata come la dose iniziale e gradualmente aumentata a 400 µ g/mL per un periodo di 8-12 mesi. In seguito, abbiamo ottenuto tre subcloni caratterizzate da un fenotipo di resistenza stabile con valori di IC50 inferiori i livelli plasmatici di picco di trastuzumab (Figura 2A, il grafico di destro). In particolare, il subclone più resistente, HR NCI N87, raggiunto un valore di50 RR IC di 28,57 (Figura 2B). IQGAP1 sembra svolgere un ruolo fondamentale nel fenotipo di resistenza della Sub-linea HR NCI N87. Le analisi del gene e della proteina espressioni supportano questa ipotesi: il livello della proteina di IQGAP1 nel subclone resistente è circa 5 volte superiore nelle cellule parentali. Allo stesso modo, il corrispondente IQGAP1 espressione genica è 2,5 volte maggiore nella sub-linea HR NCI N87 rispetto nella linea NCI N87 (Figura 3A).

Silenziamento del gene IQGAP1 è stato effettuato per valutare il relativo ruolo nello sviluppo del fenotipo resistente trastuzumab. Il protocollo usato per silenziare l'espressione genica di IQGAP1 si è rivelata particolarmente efficace per abbattere il contenuto di proteina IQGAP1 su quasi tutte le cellule coltivate in un matraccio di cultura cellulare2 cm di T25 (circa 2,5 x 105 cellule) (Figura 3A).

Inoltre, l'analisi clonogenic ha confermato l'ipotesi di lavoro, mostrando che il silenziamento genico IQGAP1 ripristini trastuzumab sensibilità in HR NCI N87 cellule come evidenziato dall'abbassamento del valore di50 IC a 7 µ g/mL (Figura 3B).

Figure 1
Figura 1: destinazione Framework per l'analisi in vitro dei meccanismi che ha acquisito resistenza di terapia. Tre differenti subcloni trastuzumab-resistente derivate da tre linee cellulari tumorali sensibili al trastuzumab differenti erano generati e caratterizzate per le alterazioni nei meccanismi di HER2-segnalazione di sequenziamento di nuova generazione, immunohistochemical, Western Blot e tecniche di RT-PCR. Tutti i subcloni ha mostrato un meccanismo di resistenza differenti. Terapia mirata sensibilità è stata ristabilita in un subclone specifico quando gene driver candidato della resistenza fu messa a tacere. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Determinazione dell'indice di resistenza relativa IC50 (IC RR50) tramite analisi clonogenic in linee cellulari di cancro gastrico. (A) crescita curve dati per ingenuo (grafico di sinistro) e resistente (grafico a destra)-linee cellulari generati da esperimenti di formazione di colonie. L'asse x rappresenta la concentrazione di trastuzumab. Barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD). La deviazione standard mai superato il 5%. (B) immagini rappresentative di analisi clonogenic sostenere la generazione di un subclone NCI-N87-resistente. Come mostrato dalla linea del tempo, la generazione di cellule di trastuzumab NCI N87 HR richiesto 12 mesi di esposizione all'agente mirato. Questa figura è adattata dal lavoro di Arienti et al. 9 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: ripristino di trastuzumab sensibilità di IQGAP1 gene knock-down. (A) IQGAP1, in contenuto proteico, da analisi densitometrica mostrato nel grafico a barre, a linea parentale NCI N87 e nel suo subclone silenziato-resistente e resistente (grafico). Il mRNA livello di espressione di IQGAP1 inoltre è stato verificato in tutte le tre linee cellulari mediante tecnica di RT-PCR (grafico di destro). I dati sono stati presentati come media ± Clonogenic SD. (B) analisi ha mostrato la diversa sensibilità della linea parentale NCI N87 e nel suo subclone silenziato-resistente e resistente a 100 µ g/mL di trastuzumab. La Colonia è stata contata dopo 14 giorni di semenza cellulare. Anteprime figure mostrano culture Colonia rappresentativo. Questa figura è adattata dal lavoro di Arienti et al. 9 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Passaggi Protocollo T25 cm2
Seme celle 60% confluenti Cellule aderenti 1.75 x 103
Oligonucleotidi di siRNA diluita in mezzo minimo essenziale transfezione (rapporto 01:55) siRNA 12,5 Μ l
Medio di transfezione 687.5 Μ l
Aggiungere il reagente di transfezione di Lipofectamine Lipofectamine reagente 12,5 Μ l
Incubare Incubare a temperatura ambiente per 20 min
Aggiungere la miscela di cellule Incubare le cellule a 37 ° C per 1-3 d

Tabella 1: Raccomandata per quantità di reagente e volumi per candidato resistenza gene knock-down.

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Discussion

Mentre personalizzate e mirate terapie hanno suscitato entusiasmo crescente, queste cosiddette terapie 'intelligente' affrontano il grande ostacolo stesso come farmaci chemioterapici tradizionali, vale a dire, l'acquisizione rapida e imprevedibile di farmaco resistenza. Per migliorare i risultati della terapia mirata, farmaco-resistenza problemi devono essere risolti attraverso una migliore comprensione dei meccanismi che li provocano. Qui, abbiamo presentato una metodologia ampiamente accessibili in vitro per studiare i meccanismi di resistenza acquisita ai farmaci terapia mirata nei modelli di linea cellulare del cancro.

La generazione di subcloni resistente di terapia mirate è il più critico e difficile da standardizzare passo in questo protocollo, a causa della intrinseca eterogeneità genetica tra le linee cellulari utilizzate e al loro diverso grado di sensibilità ai farmaci. Per questi motivi, il tempo necessario per ottenere subcloni resistenti può variare. L'esposizione cronica a farmaci antitumorali molecolari causa tipicamente un'inibizione della crescita del tumore forte. Tuttavia, dopo un periodo variabile continuo dell'esposizione della droga (8-12 mesi), cellule riprendere la crescita con un tasso simile a quello delle cellule di controllo non trattato.

Inoltre, nonostante che l'espressione genica sono stati utilizzati dati di ipotizzare la resistenza di terapia correlato al gene bersaglio, un livello di espressione diversa non sempre riflettono una funzione impropria della proteina o correlare con il fenotipo di resistenza. A causa della complessità del rapporto tra l'espressione del gene presunto farmaco-resistente e la resistenza alla terapia mirata, ulteriori indagini molecolari sono necessari, quali l'analisi bioinformatica, compreso proteina/del gene interazione, arricchimento del processo biologico e modellistica molecolare.

Un altro punto critico potrebbe essere la specificità e l'accuratezza del oligonucleotide di siRNA per ridurre l'espressione di destinazione. Una possibile soluzione potrebbe essere l'uso di strumenti di progettazione per la selezione funzionale siRNA e una miscela di siRNA per il gene dell'obiettivo stesso.

Infine, una minore limitazione è relativo al metodo utilizzato per ripristinare la sensibilità all'inibitore terapia mirata a causa della durata transitoria della transfezione. Maximal knock-down del mRNA di destinazione (> 85%) è stato segnalato il post-transfezione giorno 2 ed è stata mantenuta > 80% attraverso i giorni 5-7. Significativo colpo, seppur in misura minore in, ancora è stato osservato il giorno 6. Per questo motivo, l'analisi di citotossicità per verificare il ripristino della sensibilità ai farmaci deve essere eseguita entro circa 5 giorni dal silenziamento genico.

Il nostro protocollo è un metodo di tempo e costi efficaci per lo Studio in vitro ha acquisito resistenza. La generazione di subcloni resistente, rispecchiando l'eterogeneità intra-tumore delle cellule di cancro, potrebbe contribuire a svelare nuovi meccanismi di resistenza acquisita ai farmaci antitumorali mirati. In particolare, sono più adatti per high throughput genomic o proiezioni di proteomica per l'identificazione di alterazioni molecolari in cellule resistenti rispetto alle loro controparti sensibili.

Questa piattaforma preclinica può essere facilmente estesa per studiare i meccanismi di resistenza generale agli agenti terapeutici mirati in istotipi differenti del tumore, fornendo una procedura standard per la scoperta di ulteriori bersagli farmacologici per sormontare la farmacoresistenza.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Veronica Zanoni per la modifica il manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trizol Reagent Invitrogen 15596026 TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples
ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT Bio-Rad 1708891 The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR.
TaqMan gene expression assay Life Technologies 4331182 Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5’ end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3’ end.
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent Thermo Scientific 78501 Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells.
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Scientific 78440 Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates.
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard.
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747 Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample.
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 456-1094 Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis.
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards Bio-Rad 1610376 Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD).
10x Tris/Glycine/SDS Bio-Rad 1610732 10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE.
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs Bio-Rad 1704156 Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane.
Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate Bio-Rad 1610381 StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots.
Immun-Star WesternC solution Bio-Rad 5572 Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein.
Universal Negative Control Invitrogen 12935300 Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology.
opti-MEM Glutamax Medium Thermo Fisher Scientific 51985026 Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology.
Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA Ambion 4390824 RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types.
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent Invitrogen 13778075 Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types.
Mouse anti-IQGAP1 Invitrigen 33-8900 working concentration: 1:400 in 5% milk solution
goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005 Santa Cruz sc-2005 working concentration: 1:10000 in 5% milk solution
PMSF Sigma Aldrich P 7626 this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase
Thermocycler for RT-PCR MJ Research MJ Research PTC-200 Thermal Cycler it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3°C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Real Time RT-PCR instrument Applied Biosystems 7500 RT-PCR system This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Microvolume Spectrophotometers Thermo Scientific Nanodrop It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample
Blotting system Bio-Rad Trans-Blot Turbo system It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes
Image acquisition system and gel documentation Bio-Rad Chemidoc image system It is easy to use for chemiluminescent detection

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References

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Biologia del cancro problema 130 modello In vitro analisi clonogenic terapia mirata farmacoresistenza ri-sensibilizzazione trasfezione con siRNA
Alla ricerca di Driver delle vie di acquisito resistenza alla terapia mirata: generazione farmacoresistenti Subclone e sensibilità ripristino di Gene Knock-down
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Arienti, C., Pignatta, S., Zanoni,… More

Arienti, C., Pignatta, S., Zanoni, M., Cortesi, M., Zamagni, A., Piccinini, F., Tesei, A. Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down. J. Vis. Exp. (130), e56583, doi:10.3791/56583 (2017).

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