Summary
Это время - и экономичным в vitro протокол, изучение механизмов приобретенных сопротивление целевых терапевтических агентов, который является весьма неудовлетворенный медицинского управления рака.
Abstract
В последние два десятилетия стали свидетелями перехода от цитотоксических препаратов для целенаправленной терапии в медицинской онкологии. Хотя целевых терапевтических агентов показали более впечатляющим клинической эффективности и минимизация побочных эффектов, чем традиционные методы лечения, лекарственной устойчивости стал основным ограничением для их преимущества. Были разработаны несколько доклинических/в пробирке/в естественных условиях модели приобретенных сопротивления целевых агентов в клинической практике главным образом с помощью двух стратегий: i) генетические манипуляции для моделирования генотипов приобретенных сопротивления, и ii) в пробирке / в естественных условиях выбор устойчивых моделей. В настоящей работе мы предлагаем объединяющей основы, для изучения основных механизмов, ответственных за приобретенные сопротивление целевых терапевтических агентов, начиная от поколения лекарственно-клеточных subclones к описанию глушителей процедуры, используемые для восстановления чувствительности к ингибитор. Этот простой времени и экономичным подход широко применяется и может быть легко расширена для изучения механизмов сопротивления для других целевых лечебных препаратов в различных опухолевых histotypes.
Introduction
Вслед за важнейших открытий в области молекулярной и клеточной биологии, был разработан ряд Роман синтезированных молекул противораковые выборочно целевой онкогенные сигнальные пути в широкий спектр типов опухолей. В частности две категории целевых терапевтических агентов с уникальными свойствами в онкологии, а именно синтетические химические соединения и рекомбинантного моноклональные антитела, известны достигли клинических успехи и значительно изменены рака уход в последние десятилетия1,2,3.
Тем не менее несмотря на их впечатляющие первоначальный ответ на лечение, большинство больных раком разработали лекарственной устойчивости для всех целевых терапевтических агентов, моноклональных антител и ингибитора киназы. Как следствие лекарственной устойчивости, основным препятствием для4классические противораковых лекарств, по-прежнему является большой проблемой для новых целевых терапии5,6.
Сопротивление для целенаправленной терапии может быть внутренней (то есть, основной) или приобретенных (т.е., среднее). Внутренние сопротивления описывает de novo , отсутствие ответа на терапию, тогда как среднее сопротивление происходит после периода ответ наркотиков лечения7. Последний вызванных вспышки небольшой когорты опухолевых клеток в основную часть примитивные опухоли или расположенный в дистальной загадочные анатомические нишах, экспонирования до 90% сопротивление одного или более целевых терапевтических агентов. Молекулярные механизмы, лежащие в основе развития резистентности к таргетной терапии главным образом в результате мутации гена целевой и избыточных активация других про выживание сигнальных путей, чьё понимание все еще далека от полной8.
В этой работе мы предложили времени и экономичным подход к расследованию в vitro механизмы приобретенных сопротивления целевых терапевтических агентов, начиная от поколения лекарственно-клеточных subclones к описанию глушителей процедуры, используемые для восстановления чувствительности к ингибитор, одним из важнейших инструментов, используемых для тестирования и проверки рабочей гипотезы. В частности наш подход был использован для расследования, в рак желудка, сопротивление механизмы (например, Герцептин), трастузумаб гуманизированные моноклональные антитела против внеклеточного домена белок HER29. Трастузумаб + химиотерапии широко признается как стандарт первой линии лечения для HER2-позитивных метастатическим раком молочной железы. Благодаря последние доклинические исследования, показывающие, что анти HER2 терапии имеют значительную активность в обоих в пробирке и в естественных условиях HER2-положительным раком желудка моделей10,11, молекулярной ориентации HER2 наркотиков были подробно рассмотрены в клинических испытаниях, некоторые из которых еще продолжаются, на больных с гастроэзофагеальной рака12,13,14,15.
Эти исследования подчеркивается рост числа пациентов, которые испытывают сопротивление трастузумаб16, подобно к что характерно для других целевых терапевтических ингибиторов. В частности ответ трастузумаб составлял 47%, а средний общей выживаемости пациентов на трастузумаб + химиотерапии был только 2.7 месяца дольше, чем для пациентов химиотерапия только17. Это свидетельствует о том, что хотя преобладает первичной трастузумаб сопротивление, сопротивление вторичной трастузумаб неизбежна. По этой причине существует настоятельная необходимость уточнить механизмы, вызывая HER2-целевой терапии сопротивление в рак желудка, которая еще более проблематичным, учитывая интра опухолевой генетической гетерогенностью данного неоплазии18.
Кроме того механизмы сопротивления трастузумаб в рак желудка оказались сложно объяснить, частично из-за трудностей в получении надежных доклинических моделей представитель этого состояния. Осима et al. сообщили в естественных условиях выбора метода трастузумаб стойкие рака желудка клеточных линий, состоящий из повторяющихся культуры малых остаточных перитонеальных метастазов после лечения с трастузумаб19. Однако необходимость корпуса, конкретных животных обработки знаний и одобрения Комитета по этике животных способствовали его времени и стоимости метод. Подход, который мы расскажем в этой работе является простым и широко применимы и может быть легко расширена для изучения механизмов сопротивления для других лечебных препаратов в различных опухолевых histotypes20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Этот протокол специально настроен для анализа механизмов, лежащих в основе приобретенных сопротивление трастузумаб HER-положительным раком желудка клеточных линий. Все лабораторные инструменты сообщается в Таблице материалов.
1. поколение целенаправленной терапии устойчивостью Subclones
Примечание: Это наиболее критический и трудно стандартизировать шаг в протоколе, с тем, что различных клеточных линий могут демонстрировать различные чувства в целевых терапевтических ингибитор независимо от их опухоли histotype или наркотиков концентрации используется.
- Культура клеток NCI-N87 линия в среде RPMI, дополненная плода телячьей сыворотки (10%) и глютамин (2 мм, 1%), как монослоя при 37 ° C и семени его на 25 см2 культуры колбы.
- Добавьте на носитель культуры в каждом колбе 10 мкг/мл трастузумаб как стартовая доза. Разоблачить клетки в начальной дозе до тех пор, пока они возобновить рост.
Примечание: Начальная доза ингибитора таргетная терапия должна быть в 10 раз ниже, чем его пик концентрации в плазме. Пик концентрации в плазме является высокий уровень концентрации препарата в крови пациента обычно после нескольких доз стандартной терапии. Это значение можно получить из исследования фармакокинетики. - Контролировать рост клеток с методом исключения Трипановый синий; При возобновлении роста клеток (обычно после периода от двух до трех недель) предоставляют клетки в 10 раз выше концентрации дозы трастузумаб.
- Разоблачить клетки постепенно увеличивая дозу трастузумаб (от 100 мкг/мл до 400 мкг/мл) до клетки держать растущий (примерно через 2 недели), несмотря на наличие наркотиков высокой концентрации (по крайней мере 2,5 - 4 раза выше, чем пик плазмы).
-
Выполните колониеобразования пробирного оценить уровень сопротивления для целенаправленной терапии на каждое изменение концентрации ингибитора целевой терапии в среде культуры и определить относительную устойчивость IC50 индекс (ОР IC50) следующим образом.
- Семя 500 клеток в 24 несколькими хорошо культуры пластин.
Примечание: 5 скважин должны быть готовы для каждого состояния набора. - Подвергайте увеличение концентрации ингибитора (трастузумаб) целевой терапии клетки от 100 мкг/мл до 400 мкг/мл.
- Инкубируйте клетки в инкубатор CO2 при 37 ° C на 15 дней.
- После инкубации исправить и пятен образцы следующим образом.
- Удаление средних и промыть клетки с PBS 1 x 10 мл. Удаление ПБС и добавить 2-3 мл раствора фиксации (уксусной кислоты: метанол, 1:7, (vol/vol)). Удаление решения фиксации и добавить 0,5% раствор Фиолетовый Кристалл. Инкубации при комнатной температуре на 2 ч
- Тщательно удалите решение Фиолетовый Кристалл, аспирационных с пипеткой и погрузить плиты в водопроводной воды, чтобы смыть остатки раствора Фиолетовый Кристалл. Просушите при комнатной температуре до 2 дней.
- Граф колонии более чем 50 клеток с помощью инвертированного микроскопа (4 X увеличение).
Примечание: Для этого необходимы два независимых наблюдателей. - Вычислить RR IC50 как соотношение между значением50 IC целевой терапии-устойчивых к subclone клеток и значения ячеек оригинал/наивными.
- Семя 500 клеток в 24 несколькими хорошо культуры пластин.
2. Проверка протокола для кандидата целевой терапии сопротивление ген (R-гена)
Примечание: После характеристика экспрессии генов, подписи связанные с приобретенных сопротивление целевой терапии и любой кандидат ген как водитель сопротивления будут расследоваться через: RT-PCR) и b) западного анализа помаркой.
-
RT-ПЦР в реальном времени
- Извлечение всего РНК из клеточных линий, с помощью кислоты Гуанидиновые тиоцианат фенол хлороформ смеси (см. Таблицу материалы).
- Выполнение обратной транскрипции (RT) реакции с использованием случайных hexamer грунты и установите тепловая велосипедист следующим: грунтовка при 25 ° C за 5 мин, RT на 46 ° C в течение 20 мин и инактивации RT на 95 ° C в течение 1 мин.
- Использование 400 нг всего РНК реакции 20 мкл. Подготовьте смесь реакции для образца следующим: 7 мкл РНКазы бесплатно H2O 2 мкл cДНК (10 нг/мкл), 1 мкл 20 x помечены флуоресцентных зондов целевой объект специфического и 10 мкл 2 x Mix содержащие буфер, дНТФ и ДНК-полимеразы (см. Таблицу материалы).
- 20 мкл реакционной смеси каждый хорошо пластины и запустите следующую программу: проведение этапа при 50 ° C на 2 мин., на 95 ° C в течение 10 мин (1 цикл); затем в 40 циклов при 95 ° C 15 s и при 60 ° C за 1 мин.
-
Западная помарка
- Восстановите клеточных суспензий, добавив 2 мл 0,05% раствора трипсина/ЭДТА и позволяя 2-3 мин для трипсина работать.
- Добавьте 2 тома средних содержащий 10% плода бычьим сывороточным нейтрализовать трипсина (например, 2 мл среды для каждого 1 мл трипсин) и центрифуги на 1200 x g для 5 минут удалить супернатант и вымыть клетки с холодной ПБС.
- Центрифуга на 1200 x g 5 минут и удалить супернатант. Ресуспензируйте клетки лепешка с буфера lysis и инкубировать на рокер на 4 ° C на 30 мин.
- Объем буфера lysis зависит количество клеток (например, 100 мкл для 1 х 106 клеток); Убедитесь, что готовить свежие литического буфера каждый раз. 1 мл препарата буфера lysis (отпуск на льду): используйте 975 мкл М-за млекопитающих lysate буфер, 15 мкл ингибиторы протеазы и фосфатазы и 10 µL 100 мкм PMSF ингибиторов.
- Восстановите супернатанта белка центрифугированием lysate клетки на 13 000 x g при 4 ° C на 15 мин.
- Определите концентрацию белка, используя assay протеина BCA.
- Добавьте 4 x буфер Лэмли образца образцы протеина (по крайней мере 20-30 мкг белка) и тепла при 100 ° C на 3 мин.
- Использование сборного 4-20% гели и загрузить 20-30 мкг Лэмли белка раствора и 5-10 мкл белка стандарта на сэмпл.
- Заполните иммуноблоттинга кольцо с буфера TRIS/GLICYNE /SDS 1 x и Побегите гель на 110 V за 30-60 мин (когда время останавливается, убедитесь, что краска достиг конца геля, в противном случае баллотироваться на несколько дополнительных минут)
- Electroblot для передачи белка в PVDF мембрану (см. Таблицу материалы) с помощью полусухие системы.
- Блокировать мембраны путем замачивания в решении соответствующих белков (5% молока/BSA) шейкер при комнатной температуре за 1 ч.
- Сделайте раствор 1: 400 с основного антитела анти IQGAP1 в 5% растворе молока (см. Таблицу материалы).
- Место мембрану в раствор первичных антител на шейкер в холодной комнате на ночь.
- На следующий день, удалить раствор антител и Замочите в растворе T-TBS 1 x (1 x T-TBS: 1 х добавлен физиологический буфера Tris Tween20 0,1%) на шейкер при комнатной температуре за 7 мин.
- Отказаться от T-TBS 1 x решения и заменить. Повторите 3 раза.
- Сделать мэм раствор вторичных мыши антител, добавив антитела для стандартной западной помарки обнаружения (см. Таблицу материалы) и мембраны на шейкер; Оставьте при комнатной температуре в течение 2 ч.
- Отменить раствор антител и Замочите в растворе 1 x T-TBS на шейкер при комнатной температуре за 7 мин.
- Отказаться от T-TBS 1 x решения и заменить. Повторите 3 раза.
- Замочите мембрана для 5 минут в растворе хемилюминесцентный и изображение мембраны на тепловизор хемилюминесценции.
3. Восстановление целевой терапии ингибитором чувствительность, кандидат R-генов нокдаун
-
Подготовка клетки
- Подготовьте одну ячейку подвеска, trypsinization. Выполняют трансфекции в день, что покрытие клетки.
- Вымойте NCI-N87 клетки с PBS и инкубировать при 37 ° C с 0,05% раствор трипсина/ЭДТА на 5-10 минут добавить 2 объем RPMI средних содержащий 10% плода бычьим сывороточным для нейтрализации трипсина (например, 2 мл среды для каждого 1 мл трипсин).
- Подсчет количества ячеек с Горяева, с помощью окрашивания Трипановый синий. Семян 2,5 x 105 клеток (60% слияния) на колбе T25 см2 для каждого условия.
Примечание: Соответствующее количество клеток для заполнения определяется время удвоения клеток линии и продолжительность эксперимента. Цель заключается в достижении целевых генов нокдаун для всей продолжительности эксперимента. Девять T25 см2 фляги идеальны для transfection условий и пробирного колониеобразования (3 колбы для элементов управления, 3 колбы для отрицательных трансфекции элементов управления, 3 колбы для transfection ген целевой).
- Подготовьте одну ячейку подвеска, trypsinization. Выполняют трансфекции в день, что покрытие клетки.
-
Обратный Трансфекция
- Подготовить ген целевой и негативные управления трансфекции смесь для каждого T25 см2 настой следующим.
- Разбавьте 12,5 мкл каждого олигонуклеотиды гена ориентации малых интерферирующих РНК или отрицательный контроль siRNA олигонуклеотиды в среде минимальным необходимым трансфекции (соотношение 1:55; см. Таблицу материалы).
- Добавление реагента трансфекции Катионный липосомы (соотношение 1:1 с олигонуклеотиды гена таргетинг siRNA; см. Таблицу материалы). Инкубации при комнатной температуре в течение 20 мин.
Примечание: Общий объем трансфекции смеси составляет 700 мкл. - Мкл 700 трансфекции смеси для каждой T25 фляга2 см. Инкубируйте клетки при 37 ° C 1-3 дней.
- Проверка генов нокдаун RT-PCR и Западный анализ помаркой. Перепроверить воздействия предполагаемого R-Джин НОК Даун на восстановление чувствительности целевой терапевтического агента через эксперименты формирования колонии (повторите шаг 1.5).
- Подготовить ген целевой и негативные управления трансфекции смесь для каждого T25 см2 настой следующим.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 излагаются основы экспериментальной процедуры. Три рака желудка-линии клетки выражая высокий уровень HER2 и чувствительны к трастузумаб (IC50 < пик плазменный уровень препарата, рисунок 2A, левый график) были выращены в питательной среды, содержащей целевой терапевтический агент. Дозы в 10 раз ниже, чем пик концентрации в плазме по трастузумаб (10 мкг/мл) был задать в качестве начальной дозы и постепенно увеличивается до 400 мкг/мл в течение 8-12 месяцев. После этого мы получили три subclones, характеризуется стабильной сопротивления фенотип с IC50 значения ниже пика плазменного уровня трастузумаб (рисунок 2A, правый график). В частности наиболее устойчивых subclone, HR NCI N87, достиг50 значение RR IC 28.57 (рис. 2B). IQGAP1, по-видимому, играть ключевую роль в фенотипе сопротивления линии HR NCI N87 Подкомиссии. Анализ выражения протеина и Джин поддержали эту гипотезу: IQGAP1 уровень протеина в устойчивые subclone около 5 раз выше, чем в родительской ячейки. Аналогично корреспондент IQGAP1 экспрессии генов 2,5 раза выше в HR NCI N87 суб чем в строке NCI N87 линии (рис. 3A).
Для оценки его роль в развитии устойчивых трастузумаб фенотипа был проведен IQGAP1 сайленсингом генов. Протокол, используемый для замолчать выражения гена IQGAP1 оказалась особенно эффективной, чтобы сбить содержание белка IQGAP1 на почти всех клеток, выращиваемых в колбе культуры клеток T25 см2 (около 2,5 x 105 клеток) (рис. 3A).
Кроме того пробирного колониеобразования подтвердил рабочей гипотезы, показываю что IQGAP1 гена, глушителей восстанавливает чувствительность трастузумаб в клетках HR NCI N87 свидетельством, опустив значение50 IC 7 мкг/мл (рис. 3B).
Рисунок 1: основа для анализа в vitro механизмов, лежащих в основе приобрела целевой терапии сопротивление. Три различных трастузумаб стойкие subclones, полученных от трех различных рака трастузумаб чувствительных клеточных линий были генерируется и характеризуется секвенирование нового поколения, иммуногистохимии, для внесения изменений в механизмы HER2-сигнализации Западной помарки и методов RT-PCR. Все subclones показали различные сопротивление механизм. Целевые терапии чувствительность был восстановлен в конкретных subclone когда замолчать гена водитель кандидат сопротивления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Определение относительного сопротивления IC50 индекс (ОР IC50) через колониеобразования пробирного в клеточных линиях рака желудка. (A) роста кривых данные для наивного (левый график) и линий клетки устойчивы (правый график), порожденных колонии, образуя экспериментов. Ось x представляет трастузумаб концентрации. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение (SD). Стандартное отклонение не превышает 5%. (B) представитель изображения колониеобразования assay поддержку поколения NCI-N87-устойчивостью subclone. Как показано на графике, генерации HR трастузумаб NCI N87 клеток требуется 12 месяцев непрерывного воздействия для целевого агента. Эта цифра адаптировано из работы Arienti и др. 9 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: восстановление трастузумаб чувствительность нокдаун гена IQGAP1. (A) содержание белка IQGAP1, денситометрических анализа показано в гистограмме, в родительский NCI N87 линии и в его и молчать устойчивостью subclone (левый график). МРНК IQGAP1 выражение уровня также был проверен все три ячейки линии методом RT-PCR (правый график). Данные были представлены как среднее ± SD. (B) колониеобразования пробирного показали различную чувствительность родительских NCI N87 линии и в его и молчать устойчивостью subclone до 100 мкг/мл трастузумаб. Колонии был подсчитан после 14 дней клеток семян. Эскиз фигуры показывают представитель колонии культур. Эта цифра адаптировано из работы Arienti и др. 9 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Шаги | Протокол | T25 см2 |
| Семя клетки 60% притока | Адэрентных клеток | 1,75 x 103 |
| Разбавить олигонуклеотиды малых интерферирующих РНК в минимальным необходимым Transfection среднего (соотношение 1:55) | малых интерферирующих РНК | 12.5 МКЛ |
| Трансфекция среднего | 687.5 МКЛ | |
| Добавление реагента transfection Lipofectamine | Lipofectamine реагент | 12.5 МКЛ |
| Инкубируйте | Инкубации при комнатной температуре в течение 20 мин | |
| Добавить смесь в ячейки | Инкубировать клетки при 37 ° C для 1-3 d | |
Таблица 1: Рекомендуемые суммы реагента и томов для кандидата сопротивления генов нокдаун.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В то время как персонализированные и целевой терапии вызвали рост энтузиазм, эти так называемые «умные» терапии лицом же главным препятствием как традиционных химиотерапевтических препаратов, т.е., быстрых и непредсказуемых приобретение лекарственной устойчивости. Чтобы улучшить результаты таргетной терапии, лекарственной устойчивости проблемы должны решаться путем лучшего понимания механизмов, которые вызывают их. Здесь мы представили широко доступны в vitro методологии для изучения механизмов приобретенной резистентности к препаратам таргетная терапия раковых клеток линии модели.
Поколение целенаправленной терапии устойчивостью subclones является наиболее важным и трудно стандартизировать шаг в настоящем Протоколе, из-за внутренней генетической гетерогенностью между клеточных линий используются и их разной степени лекарственной чувствительности. По этим причинам время, необходимое для получения устойчивых subclones может отличаться. Хронического воздействия противоопухолевых агентов молекулярного обычно вызывает ингибирование роста сильная опухоль. Однако после переменной периода воздействия непрерывного наркотиков (8-12 месяцев), клетки возобновить рост с коэффициентом похож на клетки необработанных управления.
Кроме того несмотря на что экспрессии генов, что данные были использованы для гипотеза терапии гена связанных целевых сопротивления, различные выражения уровня не всегда отражают функцию неправильное белка или коррелируют с фенотипом сопротивления. Ввиду сложности взаимоотношений между экспрессия гена предполагаемого лекарственно- и устойчивость к таргетной терапии молекулярные исследования необходимы дальнейшие, таких как биоинформатика анализа, включая гена/белков взаимодействие, биологический процесс обогащения и молекулярного моделирования.
Другой критической точки могут быть специфичность и точность siRNA олигонуклеотида для уменьшения целевое выражение. Одним из возможных решений может быть использование инструментов дизайна для отбора функциональных siRNA и смесь siRNA же целевого гена.
Наконец незначительные ограничение связано с метод, используемый для восстановления чувствительности для целенаправленной терапии ингибитором за счет переходные продолжительность transfection. Максимальная НОК Даун из целевых мРНК (> 85%) было сообщено на 2 день после transfection и поддерживалась > 80% через 5-7 дней. Значительное НОК Даун, хотя и в меньшей степени, по-прежнему наблюдается на 6 день. По этой причине цитотоксичность assay для проверки восстановления лекарственной чувствительности должны выполняться в течение 5 дней от сайленсинга генов.
Наш протокол является время и экономичным методом для расследования в vitro приобрела сопротивления. Поколение стойкие subclones, зеркального отображения гетерогенности интра опухоли раковых клеток, может помочь раскрыть новые механизмы приобретенной резистентности к противоопухолевой целевых агентов. В частности они больше подходят для высокой пропускной способности геномной или proteomic показы для выявления молекулярные изменения в устойчивостью клеток, чем их коллеги-чувствительных.
Этот доклинических платформы можно легко расширить для изучения механизмов общего сопротивления для целевых терапевтических агентов в различных опухоль histotypes, обеспечивая стандартную процедуру для открытия далее наркотиков цели преодоления резистентности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-р Вероника Занони для редактирования рукопись.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 | TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples |
| ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT | Bio-Rad | 1708891 | The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR. |
| TaqMan gene expression assay | Life Technologies | 4331182 | Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5’ end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3’ end. |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78501 | Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells. |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard. |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample. |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 456-1094 | Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis. |
| Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards | Bio-Rad | 1610376 | Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD). |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | 10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE. |
| Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs | Bio-Rad | 1704156 | Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane. |
| Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate | Bio-Rad | 1610381 | StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots. |
| Immun-Star WesternC solution | Bio-Rad | 5572 | Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein. |
| Universal Negative Control | Invitrogen | 12935300 | Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology. |
| opti-MEM Glutamax Medium | Thermo Fisher Scientific | 51985026 | Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology. |
| Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA | Ambion | 4390824 | RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types. |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778075 | Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types. |
| Mouse anti-IQGAP1 | Invitrigen | 33-8900 | working concentration: 1:400 in 5% milk solution |
| goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005 | Santa Cruz | sc-2005 | working concentration: 1:10000 in 5% milk solution |
| PMSF | Sigma Aldrich | P 7626 | this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase |
| Thermocycler for RT-PCR | MJ Research | MJ Research PTC-200 Thermal Cycler | it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3°C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers |
| Real Time RT-PCR instrument | Applied Biosystems | 7500 RT-PCR system | This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers |
| Microvolume Spectrophotometers | Thermo Scientific | Nanodrop | It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample |
| Blotting system | Bio-Rad | Trans-Blot Turbo system | It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes |
| Image acquisition system and gel documentation | Bio-Rad | Chemidoc image system | It is easy to use for chemiluminescent detection |
References
- Gerber, D. E. Targeted therapies: a new generation of cancer treatments. Am Fam Physician. 77 (3), 311-319 (2008).
- Zhang, J., Yang, P. L., Gray, N. S. Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nat Rev Cancer. 9 (1), 28-39 (2009).
- Nelson, A. L., Dhimolea, E., Reichert, J. M. Development trends for human monoclonal antibody therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 767-774 (2010).
- Chabner, B. A., Roberts, T. G. Timeline: Chemotherapy and the war on cancer. Nat Rev Cancer. 5 (1), 65-72 (2005).
- Gilbert, L. A., Hemann, M. T. Chemotherapeutic resistance: surviving stressful situations. Cancer Res. 71 (15), 5062-5066 (2011).
- Izar, B., Rotow, J., Gainor, J., Clark, J., Chabner, B. Pharmacokinetics, clinical indications, and resistance mechanisms in molecular targeted therapies in cancer. Pharmacol Rev. 65, 1351-1395 (2013).
- Ellis, L. M., Hicklin, D. J. Resistance to Targeted Therapies: Refining Anticancer Therapy in the Era of Molecular Oncology. Clin Cancer Res. 15 (24), 7471-7478 (2009).
- Asić, K. Dominant mechanisms of primary resistance differ from dominant mechanisms of secondary resistance to targeted therapies. Crit Rev Oncol Hematol. 97, 178-196 (2016).
- Arienti, C., et al. Preclinical evidence of multiple mechanisms underlying trastuzumab resistance in gastric cancer. Oncotarget. 7 (14), 18424-18439 (2016).
- Tanner, M., et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol. 16 (2), 273-278 (2005).
- Bang, Y. J., et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet. 376 (9742), 687-697 (2010).
- ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01130337. A Study of Capecitabine [Xeloda] in Combination With Trastuzumab [Herceptin] and Oxaliplatine in Patients With Resectable Gastric Cancer. , Available from: http://clinicaltrials.gov/show/NCT01130337 (2017).
- ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01748773. A Study of the Combination of Oxaliplatin, Capecitabine and Herceptin (Trastuzumab) and Chemoradiotherapy in The Adjuvant Setting in Operated Patients With HER2+ Gastric or Gastro-Esophageal Junction Cancer (TOXAG Study). , Available from: http://www.clinicaltrials.gov/show/NCT01748773 (2017).
- ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01472029. Explorative Phase II Study of Perioperative Treatment in Patients With Adenocarcinoma of the Gastroesophageal Junction or Stomach (HerFLOT). , Available from: http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01472029 (2017).
- ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01196390. Radiation Therapy, Paclitaxel, and Carboplatin With or Without Trastuzumab in Treating Patients With Esophageal Cancer. , Available from: http://clinicaltrials.gov/show/NCT01196390 (2017).
- Shimoyama, S. Unraveling trastuzumab and lapatinib inefficiency in gastric cancer: Future steps (Review). Mol Clin Oncol. 2 (2), 175-181 (2014).
- Kelly, C. M., Janjigian, Y. Y. The genomics and therapeutics of HER2-positive gastric cancer-from trastuzumab and beyond. J Gastrointest Oncol. 7 (5), 750-762 (2016).
- Wong, S. S., et al. Genomic landscape and genetic heterogeneity in gastric adenocarcinoma revealed by whole-genome sequencing. Nat Commun. 5, 5477 (2014).
- Oshima, Y., et al. Lapatinib sensitivities of two novel trastuzumab-resistant HER2 gene-amplified gastric cancer cell lines. Gastric Cancer. 17 (3), 450-462 (2014).
- Pignatta, S., et al. Prolonged exposure to (R)-bicalutamide generates a LNCaP subclone with alteration of mitochondrial genome. Mol Cell Endocrinol. 382 (1), 314-324 (2014).
