Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تطوير Biosensor الكهروكيميائية الحمض النووي للكشف عن مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية

Published: June 3, 2018 doi: 10.3791/56585
Automatic Translation
1, 2,3, 1, 4
1Laboratory of Food Safety and Food Integrity, Institute of Tropical Agriculture and Food Security, Universiti Putra Malaysia, 2Laboratory of Functional Device, Institute of Advanced Technology, Universiti Putra Malaysia, 3Department of Chemistry, Faculty of Science, Universiti Putra Malaysia, 4La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University

Summary

ويرد على بروتوكول لتطوير بيوسينسور الحمض النووي الكهروكيميائية تضم polylactic الذهب، واستقرت حمض الكربون تعديل الجسيمات النانوية، والتحكم كهربائي للكشف عن Vibrio parahaemolyticus .

Abstract

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) من مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية مشتركة التي تساهم بنسبة كبيرة من مشاكل الصحة العامة على الصعيد العالمي، التي تؤثر إلى حد كبير في معدل الاعتلال والوفيات البشرية. الأساليب التقليدية للكشف عن V. parahaemolyticus مثل الأساليب القائمة على الثقافة وفحوصات المناعية، والأساليب الجزيئية يتطلب معالجة العينة معقدة وتستغرق وقتاً طويلاً وشاقة ومكلفة. في الآونة الأخيرة، أجهزة استشعار العوامل البيولوجية قد ثبت أن طريقة الكشف عن واعدة وشاملة مع مزايا الكشف السريع والفعالية من حيث التكلفة، والتطبيق العملي. هذا البحث يركز على تطوير أسلوب سريع لكشف V. parahaemolyticus بانتقائية عالية وحساسية باستخدام مبادئ التهجين الحمض النووي. في العمل، تحقق وصف المركبة polylactic حمض استقر الذهب جسيمات نانوية (جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس) باستخدام "حيود الأشعة السينية" (XRD)، مطيافية الأشعة فوق البنفسجية-المرئية (تجاه الأشعة فوق البنفسجية)، وانتقال الميكروسكوب الإلكتروني (TEM)، ميدان الانبعاثات المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (فسيم)، ودوري فولتاميتري (CV). كما قمنا بتنفيذ اختبار المزيد من الاستقرار، وحساسية، وإمكانية تكرار نتائج لجيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس. ووجدنا أن جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس تشكيل بنية سليمة لجسيمات نانوية استقرت في المحلول. لاحظنا أيضا أن تحسن الحساسية نتيجة أصغر قيمة المقاومة (Rct) نقل التهمة، وزيادة المساحة السطحية النشطة (0.41 سم2). تطوير أعمالنا بيوسينسور الحمض النووي يستند إلى التعديل الكربون موضع القطب (SPCE) مع جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس واستخدام الميثيلين الأزرق (ميغا بايت) كمؤشر الأكسدة والاختزال. قمنا بتقييم أحداث التثبيت والتهجين بالنبض تفاضلي فولتاميتري (دبف). وجدنا أن تكميلية وغير متكاملة، وعلى وجه التحديد كانت تتميز النوكليوتيد غير متطابقة biosensor ملفقة. كما أظهر الكشف الحساسة موثوق في دراسات ه ضد مختلف مسببات الأمراض التي تنقلها الأغذية، وفي تحديد V. parahaemolyticus في الأصداف البحرية الطازجة.

Introduction

موضوعا رئيسيا للمناقشة العامة والعلمية في السنوات الأخيرة، التسمم الغذائي يرتبط أساسا بعوامل 3: الكائنات الحية الدقيقة1،2من المواد الكيميائية، والطفيليات3. الأغذية الملوثة يمكن أن يسبب عواقب صحية خطيرة في البشر، ولا سيما في مجموعة المخاطر أعلى من أولئك مع ضعف نظم المناعة والنساء المسنات، والنساء الحوامل، والأطفال الرضع والأطفال الصغار4. مع أكثر من 1 مليون من حالات الإسهال الحادة التي تحدث سنوياً في الأطفال دون سن 5 سنوات من العمر في أفريقيا، وآسيا، وأمريكا اللاتينية، التسمم الغذائي هو5،عالمي لأمراض رئيسية6 وقد أنشأت "منظمة الصحة العالمية" الكائنات الحية الدقيقة ك مساهم أهم7. Vibrio parahaemolyticus تبرز من بين سلالات ضراوة المعترف بها على نطاق واسع. عادة ما تكون موجودة في البيئات الساحلية ومصبات الأنهار، والبحرية8، هو بكتيريا سلبية الغرام، الذي ينشط في البيئات المالحة عالية، وتسبب الأمراض المعوية البشرية الخطيرة عندما تؤكل في البحرية المطبوخة، أساءوا أو الخام 9من المنتجات. بالإضافة إلى ذلك، الظروف الطبية الموجودة في بعض الناس جعلها عرضه للجرح بعدوى الإذن، وتسمم الدم أو الإصابة الناجمة عن V. parahaemolyticus10. عوامل الفوعة V. parahaemolyticus هيموليسينس تنقسم إلى نوعين التي تسهم في إمراضية المرض: الحرارة هيموليسين المباشر (TDH) ترميز الجينات tdh، والمتصلة بمقر قوات الدفاع الإقليمي هيموليسين ترميز الجينات trh11. وتوجد علامات الفوعة (الجينات tdh و trh) من باراهايموليتيكوس ف الغالب في العينات السريرية وليس في العينات البيئية.

V. parahaemolyticus تمتلك القدرة على البقاء في ظل طائفة واسعة من الظروف، الاستجابة السريعة للتغييرات البيئية12. إليه انتشار يتصاعد إمكاناتها المخاطر كما سميته يزيد بالتوازي مع الخلية الجماعية13. بل الأسوأ من ذلك، تغير المناخ هو توفير هذه البكتيريا مع شروط وافرة للتعجيل النمو السكاني خلية14. بسبب ما تردد عال، V. parahaemolyticus يجب أن يتم رصدها على طول سلسلة الإمدادات الغذائية، لا سيما في التجارة وإنتاج المأكولات البحرية نظراً لتلك المنتجات حيث أنها توجد في كميات هائلة15،16 في جميع أنحاء العالم. حاليا هي التعرف على البكتيريا ومعزولة باستخدام مجموعة من الأساليب، بما في ذلك الاختبارات الكيميائية الحيوية والإثراء وانتقائية الإعلام17، المرتبط بالانزيم إيمونوماجنيتيك ماصة الاعتداء (أليسا)18، جل نبض الميدان التفريد (بفجي) 19واختبارات تراص اللاتكس بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد) الاختبارات20. عادة ما تتطلب هذه الأساليب الموظفين المؤهلين وأدوات متطورة وتقنيات الشاقة التي لا توفر معلومات حول التلوث فورا. وهذا يحد بشدة من احتمال الكشف فورا عن التلوث الضارة والتطبيقات في الموقع. أدوات الكشف السريع يبقى تحديا غير المسددة.

بيوسينسينج أخذ في الظهور كخيار وأعد للكشف عن مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية لأنه يوفر تحليل توفير الوقت وفعالة من حيث التكلفة، وعملياً، وفي الوقت الحقيقي أسلوب21،،من2223،24 . ومع ذلك، على الرغم من أن هناك العديد من النتائج الإيجابية للكشف أكثر في عينات ارتفعت والحل القياسية باستخدام أجهزة استشعار العوامل البيولوجية، لا يزال هناك نقص في البحوث المطبقة على عينات حقيقية أما في خليط مائي أو مقتطفات العضوية25. في الآونة الأخيرة، الكهروكيميائية أجهزة استشعار العوامل البيولوجية باستخدام الكشف المباشر و/أو غير المباشرة الحمض الخلوي الصبغي (DNA) قد حظيت باهتمام متزايد بين العلماء، بسبب كشفها محددة الهدف التكميلية عن طريق حدث تهجين26 , 27 , 28 , 29-هذه النهج الفريد أكثر استقرارا بالمقارنة مع هذه الأجهزة المستندة إلى الإنزيم، وبالتالي تقدم تكنولوجيا واعدة للتصغير وتسويقها. الهدف من هذه الدراسة ذكرت هنا هو بناء أداة سريعة ويمكن كشف V. parahaemolyticus بانتقائية عالية، وحساسية، والتطبيق العملي، استناداً إلى خصوصية تسلسل الحمض النووي أثناء التهجين. وتشمل الاستراتيجيات تحديد تركيبة polylactic حمض استقر الجسيمات النانوية الذهبية (جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس)30 والأقطاب الكربونية التحكم (سبسيس) حضور المؤشر التهجين، أزرق الميثيلين (ميغابايت). هو استكشاف إمكانات بناء المتقدمة الكشف عن زيادة استخدام البكتيريا عينات الحمض النووي القواقع ليساتي والطازجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: جميع الكواشف الكيميائية والبيوكيميائية لاستخدامها ينبغي أن تكون تحليلية الصف واستخدامها دون مزيد من تنقية. إعداد جميع الحلول باستخدام المياه المعقمة. اﻷوتوكﻻف جميع الأواني الزجاجية قبل التعقيم.

تنبيه: الرجاء استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة عند القيام بأنشطة المختبرات بما في ذلك استخدام هندسة عناصر التحكم (الأبخرة هود، الدرج الأمامي) ومعدات الحماية الشخصية (سلامة النظارات، قفازات، معطف مختبر، كامل طول السراويل، وتو مغلقة أحذية).

1-تصنيع وتوصيف قطب تعديل استخدام جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس

  1. إعداد وتوصيف لجيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس
    1. بسرعة بإضافة 10 مل من محلول سترات الصوديوم (38.8 مم) إلى 100 مل من الغليان حل حمض تشلورواوريك مائي (1 مم) وبارد عليه وصولاً إلى درجة الحرارة المحيطة. مراقبة التغييرات في الألوان في حل أونبس الاستعداد الذي يبدأ كالأصفر، التغييرات إلى داكن وأخيراً ينتهي كالأحمر الداكن روبي.
    2. مكان الكريات جيش التحرير الشعبي الصيني في قالب الفولاذ المقاوم للصدأ لعملية ذوبان وتسخَّن لهم عند درجة حرارة 190 درجة مئوية لأدنى 10 المتابعة مع إجراءات ملحة: وضعها تحت ضغط الآلام والكروب الذهنية 2.2 لمدة 1 دقيقة كجزء من إعداد صحيفة جيش التحرير الشعبي الصيني. صحيفة جيش التحرير الشعبي الصيني سوف تكون جاهزة للاستخدام بعد التبريد لحوالي 3 ساعات.
    3. التحريك بقوة، حل مغ 0.68 أوراق جيش التحرير الشعبي الصيني في 5 مل كلوروفورم في درجة حرارة الغرفة. مزيج جيش التحرير الشعبي المذاب مع 10 مل الحل أونبس معدّة مسبقاً والبلوتينيوم إثارة ذلك في درجة حرارة الغرفة. ثم يمكن أن يكون دينوتيد كجيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس مخاليط متجانسة وتتميز باستخدام الأشعة فوق البنفسجية بالنسبة زرد، TEM وفسيم مع EDX.
  2. إعداد وتوصيف قطب الكربون موضع تعديل
    ملاحظة: SPCE المستخدمة في هذه الدراسة ويتألف نظام القطب ثلاثة: عداد كهربائي وكهربائي عامل الكربون قطب مرجعي Ag/AgCl.
    1. بسرعة ميليلتر ماصة 25 الحل متجانسة لجيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس على SPCE ومن ثم الهواء الجاف ل 24 ساعة قبل الاستخدام.
    2. اليكتروتشيميكالي تميز أقطاب المعدلة، SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني--أونبس، في سيانيد البوتاسيوم فيرو (ك3[Fe(CN)]6[3-/4-) لقياس المساحة السطحية النشطة، ومقاومة الكهروكيميائية التحليل الطيفي، والتكرار، إمكانية تكرار نتائج، و30من الاستقرار.

2-تطوير Biosensor الكهروكيميائية الحمض النووي

  1. إعداد التحقيق
    ملاحظة: تسلسل مسبار سدنا والحمض النووي التكميلية اختيرت استناداً إلى المعلومات الواردة من المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (نكبي) قاعدة البيانات.
    1. شراء النوكليوتيد الاصطناعية (20-مير ssDNA المسبار والحمض النووي التكميلية 20-مير، 20-مير غير متطابقة الحمض النووي والحمض النووي غير مكملة 21-مير) كمسحوق المجففة بالتبريد من المختبرات التجارية، استناداً إلى التسلسل التالي:
      مسبار سدنى ثيولاتيد: 5 '--/5ThioMC6-د/كجاتاتجكاجاجكاكتج-3
      الحمض النووي التكميلية:-كاجتجكتكتجكاتاتككج-5 '3'
      قاعدة واحدة غير مطابقة الحمض النووي:-كاجتجكتكتجك ṪTAATCCG-5 '3'
      3-قاعدة غير مطابقة الحمض النووي:-كاجتجكتكت Ċ ṪṪTAATCCG-5 '3'
      الحمض النووي غير متكاملة: 3 '5'--كجكاكاجكتكجاكجكتجا-
    2. إعداد حلول الأسهم من جميع النوكليوتيد (100 ميكرومتر) باستخدام حل الشركة المصرية للاتصالات عقيمة (10 مم تريس-HCl، 1 مم يدتا، درجة الحموضة 7.5)، مقسمة إلى أجزاء التحليلية. الحفاظ على هذا في-4 درجة مئوية ثم قم بإجراء تخفيف مناسبة فقط قبل استخدامها.
  2. الأمثل للتثبيت والتهجين
    ملاحظة: SPCE تعديل مع جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس، تتم الإشارة إليها ك SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس، واستخدمت لهذه الدراسة، وقد استخدمت طريقة صب قطره لتجميد الحمض النووي والتهجين.
    1. أولاً، شل 25 ميليلتر من مسبار سدنى ثيولاتيد على SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس وثم الجوية الجافة عن 24 ساعة عند درجة حرارة الغرفة، بعد ذلك أنها سوف أخيرا الإشارة إلى ك SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس/سدنى. تحديد الاستغلال الأمثل لحالة التثبيت باستخدام ثلاثة عوامل: تركيز سدنا (تتراوح من 0.2 إلى 1.4 ميكرومتر) والوقت (تتراوح من 30 إلى 210 دقيقة)، ودرجة الحرارة (تتراوح بين 25 إلى 75 درجة مئوية).
    2. "الماصة؛" 25 ميليلتر من الحمض النووي التكميلية إلى سطح SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس/سدنى إجراء الحدث التهجين بعدها أنه يمكن أخيرا الإشارة إلى ك SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس/دسدنا. تحديد الاستغلال الأمثل للشرط التهجين عن طريق العاملين من الزمن (تتراوح من 5 إلى 30 دقيقة) ودرجة الحرارة (تتراوح بين 25 إلى 75 درجة مئوية).
    3. تزج المعطل تداولها وإزالة أقطاب المهجن في ميكرومتر 20 ميغابايت للدقيقة 30 في الممتزة غير تحديداً الحمض النووي وميغابايت الزائدة بالغسيل مع 0.5 م إس/20 مم كلوريد الصوديوم (pH 4.5) وثم الشطف بواسطة المياه. قياس الحالية ذروة للتخفيض في بروميد الميثيل باستخدام تقنية دبف. تنفيذ قياس دبف استخدام 0.1 M برنامج تلفزيوني (pH 7) التي تحتوي على أي مؤشر.
  3. وصف بيوسينسور الحمض النووي ملفقة
    1. تزج SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس في ميكرومتر 20 ميغابايت لمدة 30 دقيقة، يغسل مع 0.5 م إس/20 ملم كلوريد الصوديوم (pH 4.5)، ومن ثم شطف بالمياه قبل قياس. اتبع إجراء مماثل لكل التفاعلات بينها مسبار الحمض النووي والحمض النووي التكميلية، والحمض النووي غير متطابقة، وعينات الحمض النووي غير متكاملة.
    2. قياس الحد الكهروكيميائية.
      ملاحظة: قمنا بقياس استخدام أوتولاب المصنوعة تجارياً مع البرمجيات واجهة دبف.
      قياسات دبف ميغابايت الحد الكهروكيميائية في إمكانات تتراوح بين 0.5-V 0.25 V، مع خطوة محتملة من 0.005 الخامس السعة التحوير 0.05 الخامس، والمسح الضوئي بمعدل 7.73 mVs-1 في برنامج تلفزيوني م 0.1 (pH 7)، الذي يحتوي على أي مؤشر. ودرست كذلك الانتقائية وحساسية، وإمكانية تكرار نتائج، واستقرار الحرارة بيوسينسور الحمض النووي ملفقة. عرضت النتائج المبلغ عنها متوسط قيمة القياسات في replicates الثلاثة.

3-التحقق بيوسينسور الحمض النووي ملفقة باستخدام عينات حقيقية

  1. إعداد السلالات البكتيرية
    1. تحديد العينات البكتيرية استناداً على التلوث الكبيرة من المأكولات البحرية31،32 .
      ملاحظة: V. parahaemolyticus السلالات المرجعية و 8 أخرى السلالات البكتيرية (والعطيفه الصائمية، الليستريه المستوحدة، typhimurium السالمونيلا، السالمونيلا الأمعاء، والالتهاب الرئوي الكلبسيله، الإشريكيّة القولونية O157:H7، العصوية الشمعية، و الضمة الجينوليتيكوس) من المنقولة المشتركة استخدمت الممرض للمصادقة على الحمض النووي biosensor الكهروكيميائية في هذه الدراسة.
    2. إجراء ثقافة فرعية روتينية من السلالات البكتيرية في أجار كل منهما على كل أسبوعين للحفاظ على قدرتها على الاستمرار، ويشير الجدول 1 لشروط الثقافة.
    3. الحفاظ على الحفاظ على المدى الطويل من السلالات البكتيرية في بهم المرق المتزايد كل منها يحتوي على الجلسرين 20% (v/v) في-80 درجة مئوية كما يحمي والغليسيرول البكتيريا عن طريق منع تكوين بلورات الجليد التي يمكن أن تلحق الضرر بها أثناء عملية التجميد. بعد ذلك، تطعيم حلقة ثقافة الحفاظ على الخلايا البكتيرية في مخزونات والغليسيرول في المرق كل منهما. احتضان المرق وفقا لنمو كل الوقت ودرجة الحرارة عند الحاجة إلى أحياء هذه البكتيريا.
    4. تحديد الكمية V. parahaemolyticus الخلايا باستخدام تقنية لوحة انتشار33ومعيار وأسلوب معروف لتعداد الكائنات الحية الدقيقة المستمدة من سلسلة من تخفيف.
      1. الثقافة V. parahaemolyticus في "مرق فول الصويا تريبتيكاسي" (TSB + 3% كلوريد الصوديوم) عند 37 درجة مئوية في حالة اهتزاز 140 لفة في الدقيقة. ثم قم بنقل 1 مل ثقافة الخلية البكتيريا إلى 9 مل TSB + 3% كلوريد الصوديوم للحصول على عامل تخفيف 10-1 .
    5. كرر هذه الخطوة من تسع مرات للحصول على سلسلة كاملة من يصل إلى 10-10 إضعاف عامل. بعد ذلك، انتشار 0.1 مل لكل عامل من عوامل التخفيف (بدءاً من 10-1 إلى 10-10) على لوحة أجار انتقائية ضمه لمستعمرة العد، على التوالي. احتضان لوحات المحتضنة في 37 درجة مئوية ح 24.
    6. استخدام عداد مستعمرة لعد المستعمرات الفردية ومن ثم العودة-حساب (حساب مقدار زيمبابوي/بيبيتيد × معامل التخفيف) للحصول على وحدة لتشكيل مستعمرة في المليلتر الكثافة (زيمبابوي مل-1). وتستمد تركيز مستعمرة تشكيل وحدات (كفوس) في تعليق خلية البكتيريا من مؤامرة المعايرة من زيمبابوي مل-1 ضد امتصاص.
  2. إعداد التحليل PCR
    1. استخراج الحمض النووي بعد تعديل المغلي تحلل الداخلي34. أولاً، متواصلة البكتريا فردية ضغوطا على وسائل الإعلام أجار وتطعيم ذلك في وسائل الإعلام مرق، تليها تفرخ في حالته النمو النسبي، دورة في الدقيقة 140 تهز الشرط.
    2. "الماصة؛" ثقافة 1 مل من مرق في أنبوب مايكرو أجهزة الطرد مركزي. الطرد المركزي هذه في 4830 x ز و 4 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة للحصول على الكريات. استخدم حوالي 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات العقيمة لإعادة تعليق مع بيليه. إجراء تعليق الناتجة عن 10 دقيقة في 98 ± 2 درجة مئوية في كتلة تدفئة والبرد فورا عند-18 درجة مئوية لمدة 10 دقائق الخلايا والإفراج عن الحمض النووي.
    3. الطرد المركزي الحمض النووي في 4830 x ز و 4 درجات مئوية لمدة 3 دقيقة الحصول على تعليق واضح وإبقاء المادة طافية في-20 درجة مئوية لاستخدامها مرة أخرى. استخدام مقياس بيوفوتوميتير بامتصاص الأشعة فوق البنفسجية في طول موجه 260 nm (الأحماض النووية استيعاب الطول الموجي للضوء) وأيضا في طول جه 280 نانومتر (كالبروتينات استيعاب الطول الموجي للضوء) لتحديد تركيز ونقاء استخراج الحمض النووي وثم تحديد جميع سلالات استخدام الاختبارات البيوكيميائية القياسية35 والتحقق من لهم 16S الرنا الريباسي مورثة تسلسل36. وأخيراً، تؤذي الحمض النووي الجينومي في 92 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة وبارد عليه سريعاً في الماء المثلج قبل التطبيق إلى بيوسينسور.
    4. كذلك تأكيد الوجود V. parahaemolyticus استخدام PCR لاستهداف الجين توزر. تنفيذ هذا الإجراء في ثيرموسيكلير استخدام زوج التمهيدي (5 '-جتكتكتجاكجكاتكجتج-3' و 5 '-أتاكجاجتجتجكتجتكاتج-3'). تحسين [بكر] تضخيم في حجم رد فعل إجمالي 25 ميليلتر تتألف من الماء المعقم (15.5 ميليلتر) والمخزن المؤقت (5 ميليلتر)، التمهيدي (1 ميليلتر، 10 ميكرومتر)، دنتب ميكس (1 ميليلتر)، وقالب الحمض النووي (2 ميليلتر)، وبوليميراز "الدنا بوليميراز" (0.2 ميليلتر، 10 x).
    5. تخلط المكونات جيدا وترتيب [بكر] تضخيم تسلسل المستهدفة في ثيرموسيكلير المبرمجة لدورات 30 من التضخيم. في دراستنا، تتألف كل دورة من ثلاث خطوات ردود فعل أي.، تمسخ الأولية (94 درجة مئوية، 3 دقيقة) تليها دورات 30 تمسخ (94 درجة مئوية، 1 دقيقة)، والصلب (63 درجة مئوية، 1.5 دقيقة) وملحق (72 درجة مئوية، 1.5 دقيقة)، متبوعاً بالتمديد النهائي (72 درجة مئوية، 7 دقيقة).
    6. تحديد المنتجات تضخيم وأحجامها عن طريق التفريد على 1.5% [اغروس] هلام. التقاط الصور هلام مع نظام توثيق جل منتجة تجارياً.
  3. إعداد عينات القواقع
    1. الحصول على عينات جديدة.
      ملاحظة: لدينا الأصداف البحرية الطازجة (أجريت جرانوسا) التي تم الحصول عليها من السوق الرطب في Serdang، سيلانغور، وجلب بسرعة إلى المختبر في مربع برودة الثلج للتحليل. تقسيم العينات إلى 2 مجموعات، هي المجموعة المعالجة وغير المعالجة، على افتراض أن الأصداف البحرية تحصد موحد من بداية موسم الحصاد حتى وضعها في مستودع التخزين البارد.
    2. علاج قبل جمع الأصداف في المجموعة المعالجة عن طريق تخزينها في-20 درجة مئوية ح 24، يليه التعرض للأشعة فوق البنفسجية في 20 درجة مئوية ح 4 قبل استخراج الحمض النووي.
      ملاحظة: درجة حرارة التجميد والتعرض للأشعة فوق البنفسجية المستخدمة الخاضعة للضوابط الفريق يقتل أو يحد على الأقل تراكم بطبيعة الحال V. parahaemolyticus في جمع الأصداف. لا يتم تطبيق نظام بسترة أعلى من 70 درجة مئوية كما هدف الشرط التي تسيطر عليها في هذه الدراسة لمحاكاة الوضع الفعلي للأصداف البحرية الطازجة. وفي الوقت نفسه، تحليل العينات مباشرة من المجموعة غير المعالجة دون أي معالجة مسبقة بمجرد وصولها إلى المختبر.
    3. سلالة من V. parahaemolyticus ATCC 17802 في لجان فرعية (3% كلوريد الصوديوم). تحديد مستوى خلايا قابلة للحياة في العدوى عن طريق الطلاء لتخفيف مناسبة من TSB (3% كلوريد الصوديوم) في كاليفورنيا من أجل الحصول العدوى من 104 زيمبابوي مل-1 من V. parahaemolyticus. تغسل كل القواقع في الماء المقطر وفرك خالية من الاوساخ قبل استخدام الملقط العقيمة في تدفق الصفحي مجلس الوزراء لإزالة الأنسجة من shell.
    4. مجانسة حوالي 10 غم عينات الأنسجة القواقع مع الخالطون في 90 مل TSB العقيمة (3% كلوريد الصوديوم) 60 س. أضف كمية معروفة من V. parahaemolyticus إلى 9 مل مرق عينة المتجانس للعينات التي ارتفعت. استخدام العينات أونسبيكيد كعنصر سلبي. تقدير عدد خلايا من V. parahaemolyticus ارتفعت إلى عينات القواقع بطلاء 0.1 مل العينات في كاليفورنيا، وفي وقت لاحق، بيبيتينج 1 مل عينات في أنبوب ميكروسينتريفوجي للحمض النووي عينة الاستخراج، لاستخدامها في بيوسينسور وفحص PCR.
    5. استخراج الحمض النووي الجينومي V. parahaemolyticus من العينات التي ارتفعت وأونسبيكيد بعد تعديل المغلي تحلل الداخلي36. وأخيراً، تحديد تركيز الحمض النووي ونقاء باستخدام قياس الحيوي شحني بامتصاص الأشعة فوق البنفسجية في طول موجه 260 شمال البحر الأبيض المتوسط (الأحماض النووية استيعاب الطول الموجي للضوء) وأيضا في طول جه 280 نانومتر (كالبروتينات استيعاب الطول الموجي للضوء).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم الكشف عن تشكيل أونبس من خلال التغير في لون المحلول مع سترات الصوديوم الحالية. هذا بسبب اللون لتغيير من الضوء الأصفر إلى أحمر روبي عميقة. وأكد الجيل من جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس من الأشعة فوق البنفسجية-vis الأطياف (الشكل 1) حيث تم العثور على نمو ذروة الرنين (موارد البرنامج الخاصة) السطحية مأكل مثل الطحين في حوالي 540 نانومتر. وذكر بتشكيل ووجود جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس في نطاقات الطول الموجي نانومتر 500-600، تبعاً لحجم الجسيمات37. يتم عرض أنماط زرد أونبس وجيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس في الشكل 2. جميع كريستاليتي قمم لوحظت في 2θ من 31.7 38.2، 44.4، 64.7 و 77.7°. قد نسبت إلى (100) (111) (200) (220)، وطائرات بلورية (311) مكعب-لجنة الاتصالات الفدرالية (تركز على الوجه مكعب) الذهب (المعادن) النانو (جكبدس ملف رقم-00-004-0783). أيضا زيادة كثافة ذروة كريستاليتي أونبس جيش التحرير الشعبي الصيني كذروة حيود أوسع تركزت على 31.7 درجة، مما يعني أن أونبس كانت جزءا لا يتجزأ في جيش التحرير الشعبي، واقتراح تشكيل polyphasic الذهب النانو38. وعلاوة على ذلك، جميع قمم الحيود أونب على جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس أشارت إلى أن أونبس هيكل مستقر. حجم متوسط لجيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس حسبت باستخدام معادلة شيرر في (L = kλ/βcosθ)، بتحديد العرض للتفكير في براج (100). من فوم ود-المباعدة بين الولادات (الجدول 2)، تم حساب حجم كريستاليتي من جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس ك 27 شمال البحر الأبيض المتوسط.

تم أبعاد جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس ولها مورفولوجيا مزيدا من التحقيق باستخدام ال. من منحنى توزيع الجسيمات TEM وصور لجيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس، فقد رئي أن جسيمات نانوية ذهبية كانت كروية تقريبا في الشكل (الشكل 3). وكان حجم الجسيمات النانوية في المجموعة من حوالي 37 شمال البحر الأبيض المتوسط، أكبر قليلاً من الحصول عليها من صيغة شيرر، مما يوحي بطابع الكريستالات ل تصنيعه كجسيمات نانوية39. حجم أصغر الناتجة عن زرد على النقيض من تيم قد لوحظ أيضا في البحوث السابقة، على الأرجح لأن هيكل الجسيمات الكريستالات في الطبيعة بسبب كمية كبيرة من بذر بلوري التي هي أصغر (الجسيمات الفرعية)40 . ويبين الشكل 4 الصورة فسيم من جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس-أعد في SPCE. فمن الواضح من فسيم الصور والأطياف EDX أن SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس كان أعلى نسبة وزن الذهب، أكبر كثافة، والسطح أكبر من التغطية نانوحبيبات. يمكن أيضا ملاحظة، لا سيما، أن الشكل 4() تظهر صورة فسيم SPCE العارية. وتوضح الصورة فسيم في الشكل 4(ب) أونبس جيش التحرير الشعبي الصيني موزعة جيدا. تأكيد التركيب الكيميائي المركبة PLA-أونبس، استخدمت EDX للتحقيق في التركيبة الكيميائية أنتجت كجيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس، وفقا الرقم 4()و 4(ب). الطيف EDX أكد أن جيش التحرير الشعبي الصيني أونبس المنتجة كمؤلفة من الذهب (Au) فقط، وعرض أي عنصر آخر باستثناء ذروة المقابلة للكربون (C) والأكسجين (O). ويعزى وجود ذروة ج مسرى الكربون إلى الذي كان العينة قطره المدلى بها.

كما أظهر الطيف EDX وجود س تشير إلى أن الأوكسجين كان تمتز على مسرى الكربون نظراً لأن الفيلم تعرض للهواء. وهذا يؤكد أن الأوكسجين هو تمتز على الأنابيب النانوية الكربونية إذا تعرضوا للهواء ل وقت طويل41. على الرغم من أن هناك جزيئات الغاز مختلفة في الهواء، الأكسجين يعتقد أن أدسورباتي الرئيسي في المعرضة للهواء الكربون الأنابيب النانوية42، ربما بسبب أن الامتزاز أسرع بالمقارنة مع غيرها من الجزيئات43. وقد استند العثور على أن الأكسجين أدسورباتي الرئيسي في مسرى الكربون خلال التعرض الجوية بين عشية وضحاها في إعداد نموذج وعززت نقاء الكيميائية لجيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس. نسبة الذروة انوديك والكاثوديه (أناpa/ipc) كان ما يقرب من 1، الذي أعطى إمكانات الذروة المستمر كما التفحص معدل زيادة44. وعلاوة على ذلك، تتفق إمكانات الذروة انوديك والكاثوديه في تفحص مختلف معدلات45 مما يوحي بأن رد فعل الكهروكيميائية تم عكسها استناداً إلى ذروة فصل (الشكل 5). المساحة السطحية النشطة القطب معدلة كانت محسوبة باستخدام المعادلة سيفيك راندليس (أناpc = (2.69 × 105)1/2 ج ن3/2 إعلانالخامس1/2. من منحدر الأرض أناالكمبيوتر مقابل الخامس1/2 في الشكل 5() (ب)، تم حساب المساحة السطحية لأقطاب كهربائية كسم 0.262 و 0.41 سم2 SPCE العارية وجيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس، على التوالي. وأكدت هذه النتيجة أن تحسين توفرها أونبس جيش التحرير الشعبي الصيني في منطقة سطحية نشطة كان نسبيا أعلى بالمقارنة مع SPCE العارية. وكانت النتيجة مشتقة يمكن مقارنته بالذهب جزءا لا يتجزأ من البوليمر جسيمات نانوية (مصفوفة β-CD-EDAS(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylene-diamine مغلفة الجسيمات النانوية الذهبية)، التي كشفت عن أن مساحة سطحية نشطة عالية تعزز العملية نقل الإلكترون و حساسية أفضل وادي ذلك إلى46.

كان رد فعل الكهروكيميائية SPCE المعدلة في عملية نشر الخاضعة للمراقبة، وأظهرت انخفاض في ك3[Fe(CN)]6[3-/4- الذروة الحالية، التي بدورها تعتمد على الحالية من الجذر التربيعي معدل المسح الضوئي (الخامس 1/2). للحصول على عرض أفضل لخصائص القطب المعدلة، أجريت دراسة التحليل الطيفي (EIS) معاوقة الكهروكيميائية ترتبط بأداء مسرى المعدلة المقدمة من حيث القياسات السيرة الذاتية. المقطع المحيطية في الترددات العالية التي ترتبط بعملية الحد من نقل الإلكترون في الموقع. تم قياس المقاومة نقل التهمة (Rct) مباشرة كقطر المحيطية. تدوين هذه النتيجة مع قيمة Rct من SPCE العارية، الذي كان Ω عام 1932 والتي انخفض فيها تعديل SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس إلى Ω 1444 (الشكل 6). انخفاض قيمة Rct SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس قد يكون ناجماً عن انخفاض ثابت محلي و/أو زيادة في سمك كهربائية مزدوجة الطبقة47، مما يوحي بأن ك3[Fe(CN)]6[3- /4- تعمل بواسطة الامتزاز في الواجهة المعدنية/الحل. وهذه النواتج امتثلت تلك المستمدة من القياسات من السيرة الذاتية (الشكل 7). التيارات ذروة زادت تدريجيا مع تعديل سبسيس استخدام جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس، الذي أظهر أن حساسية أعلى معكوس انخفاضctص48. وهكذا، الزيادة في القيمة للسيرة الذاتية لأقطاب معدلة، والانخفاض في قيم Rct قد يكون سبب الاستبدال التدريجي لجزيئات الماء (وهو حجم جزيئات المياه 27.19 Å3) من الامتزاز ك3 [Fe(CN)]6[ 3-/4- على السطح المعدني، تقليل مدى رد فعل فسخ49.

3 الجدول يشير إلى الانحراف المعياري النسبي (RSD) للتكرار وإمكانية تكرار نتائج القطب معدلة. تسجيل السيرة الذاتية الروتينية من ك3[Fe(CN)]6[3-4- كانت قدمت لستة مجموعات متتالية للتحقيق في التكرار أقطاب معدلة. واستمد تحديد وضع اللاجئ من SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس 4.26 في المائة. مسرى مع التعديل أونبس جيش التحرير الشعبي الصيني قدم أفضل تحديد مركز اللاجئ بعد عدة قياسات. وعلاوة على ذلك، باستخدام نفس الإجراء، ستة أقطاب معدلة كانت بشكل مستقل ملفقة، مما أعطى القيم تحديد وضع اللاجئ 4.05% ل SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس، مما يشير إلى إمكانية تكرار نتائج أفضل من تلفيق قطب كهربائي لجيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس. أبقى الركيزة تعديله تبعاً لجيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس في 37 درجة مئوية لمدة طويلة. قد استخدمت أيضا لسجل دورات 20 وانخفاضا بنسبة 18% في جودة الإشارة. وبحثت من أجل تحقيق الحد الأقصى لإخراج من بيوسينسور، فترة التثبيت، ودرجة الحرارة، جنبا إلى جنب مع تركيز سدنى ومعايير التهجين. هذه الشروط اللازمة ليكون الأمثل، كما أنها تؤثر الحالية ذروة من دبف. لتحسين تركيز سدنى، وكان بيبيتيد SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس مع تركيز مختلفة (0.2، 0.4، 0.6، 0.8، 1.0، 1.2 و 1.4 ميكرومتر) من سدنى لمدة 60 دقيقة حتى أن تقرر تركيز ssDNA الأمثل. استناداً إلى الرقم 8، زادت ذروة دبف الحالية كما استخدمت أعلى تركيزات الحمض النووي. ووجدت الدراسة أيضا أن تركيز الأمثل للحمض النووي كان 1.2 ميكرومتر ssDNA.

لتحسين أمثلية فترة التثبيت التي تنطوي على الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل في SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس، تم اختبار 25 ميليلتر من سدنى (1.2 ميكرومتر) خلال أوقات مختلفة (30، 60، 90، 120، 150، 180 و 210 دقيقة). في الشكل 9، تظهر النتائج زيادة في فترة تجميد أدى إلى الزيادة المستمرة في ذروة دبف الحالية. وهكذا، اختير وقت التثبيت الأمثل ssDNA 180 دقيقة. لتحسين درجة حرارة التثبيت، وكان بيبيتيد SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس مع سدنا (1.2 ميكرومتر) في درجات حرارة مختلفة (75 و 65، 55، 45، 35 و 25 درجة مئوية) لمدة 180 دقيقة. وجدنا أن عندما تمت زيادة درجة حرارة التثبيت إلى 55 درجة مئوية، الحالية ذروة دبف في البداية صعدت متبوعاً إهلاك لاحقة (الشكل 10)؛ وهكذا، تم اختيار 55 درجة مئوية كدرجة حرارة التثبيت الأمثل لاستخدامها في التجارب اللاحقة. فصل سدنا هو غير متحرك من السطوح العجز الكهربائي والتهجين بسبب ارتفاع درجات الحرارة. كانت هناك تقارير أخرى مع نتائج مماثلة50. حدث تقسيم أسرع وانحطاط من الحمض النووي من السطوح من جسيمات نانوية ذهب في أعلى درجات الحرارة51. البحوث التي أجريت مؤخرا عن أن السندات بين الذهب وثيول يكسد ويتحلل بسرعة وبساطة في حالة المحيط، على سبيل المثال عندما تتعرض للمياه، الهواء، والضوء52،،من5354. وكان التحقيق أثر التهجين الوقت أيضا في هذه الدراسة.

ملفقة SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس/سدنى كان قطره الصب مع إيجاد حل للهدف الحمض النووي (0.2 ميكرومتر) في التهجين مختلفة الأوقات (5، 10، 15، 20، 25 و 30 دقيقة). رد دبف ارتفع من الواضح، مع زيادة 5-دقيقة في الوقت المناسب للحضانة (من 5 إلى 10 دقيقة) (الشكل 11). بمجرد الحصول على هذه القيمة، لوحظ وجود نمط انخفاض 10 إلى 30 دقيقة حتى الوقت المطلوب التهجين وتم اختيار 10 دقيقة. زيادة كفاءة التهجين مع زيادة في درجة الحرارة من 25 درجة مئوية إلى 35 درجة مئوية (الشكل 12). واعتبر الحالية المرتفعة الانخفاض ببطء في درجة حرارة أعلى من 35 درجة مئوية. السبب في ذلك يرجع إلى ساندويتش هيكل تمسخ خفض إشارة الكشف. ومن ثم، كانت درجة الحرارة المثلى التهجين مختارة 35 درجة مئوية. العملية نحن المستخدمة في الكشف عن V. parahaemolyticus تتألف أونبس لزيادة المساحة السطحية النشطة القطب العامل، جيش التحرير الشعبي الصيني التوسط من أجل تعديل السطح والأكسدة المعقدة، ميغابايت، لخفض ذلك إلى رطل. وكان نتيجة لعملية الأكسدة هذه تقارب أفضل بين سدنى وميغابايت55. دبف الحالي انخفض بسبب انخفاض عدد جزيئات MB المرفقة أثناء التهجين ssDNA مع تسلسل مكملة لها.

ونحن كذلك أجرى تحقيقات في أداء بيوسينسور المتقدمة. وتظهر النتائج دبف في الشكل 13 أن كان قادراً على التمييز بشكل انتقائي مسبار الحمض النووي والحمض النووي التكميلية وقاعدة واحدة غير مطابقة الحمض النووي، وثلاثة-قاعدة عدم تطابق الحمض النووي والحمض النووي غير التكميلية حضور ميغابايت ك تسمية الكشف عن56، 57. كان تعرض أدنى ذروة الحالي (0.73 µA) بواسطة الحمض النووي التكميلية، التي ازدادت ببطء بقاعدة واحدة غير مطابقة الحمض النووي (0.94 µA)، ثلاث قواعد متطابقة الحمض النووي (µA 1.05)، الحمض النووي غير متكاملة (3.25 µA)، والتحقيق في الحمض النووي (4.79 µA). الحمض النووي الهدف الحالي كان أصغر من جميع التيارات من تسلسلات اليغنوكليوتيد يسمح لنا بيوسينسور تميز بين تسلسل اليغنوكليوتيد حساسية، وعلى وجه التحديد. ميغا بايت ملزمة بشدة مع ssDNA المعطل تداولها مسبار الحمض النووي إنتاج ذروة دبف كبير الحالي. تخفيض الحمض النووي SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس/غير-تكميلية المعطل تداولها مسبار الحمض النووي الحالي بمقدار النصف تقريبا كسوي كمية صغيرة من تجميعها على سطح SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس/دسدنا ميغابايت. وهذا يحتمل أن يكون بسبب التفاعلات التي يتعذر الوصول إليها بين ميغابايت وجوانين القواعد. وسائط التفاعل من الحمض النووي وميغابايت تعتمد بشدة على مثل هذه الظروف التجريبية الأس الهيدروجيني ودرجة الحرارة وتركيز الحمض النووي، والقوة الأيونية ونوع من المخزن المؤقت،من5859. ميغابايت عادة يربط دسدنا الاخدود ووسائل إينتيركالاتيفي، أدى إلى تراكم ميغابايت على السطح دسدنا60. تعرض لنا التقاط مسبار الحمض النووي لقاعدة واحدة غير مطابقة الحمض النووي والحمض النووي غير متطابقة ثلاثة-قاعدة استمرار انخفاض دبف ذروة التيارات والحمض النووي التكميلية المستهدفة استمرار هذا الاتجاه. ويبين الجدول 4 النسبة المئوية لمعدل الانتقائية لذروة ميغابايت الحالية. لدينا الاستنتاج العام أن التهجين بيوسينسور الحمض النووي شيدت انتقائية للغاية عن طريق الحمض النووي المعطل تداولها المسبار على سطح SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني--أونبس.

وكان حساسية بيوسينسور الحمض النووي المتقدمة مزيدا من التحقيق بتركيزات مختلفة من اليغنوكليوتيد الهدف مكملة. ويصور الشكل 14 نضوب التدريجي الحالي ذروة دبف ميغا بايت على SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس كتركيز الحمض النووي التكميلية زيادة. الرقم 15 المعارض معامل انحدار خطي 0.96 الذي تولد بين سجل انخفاض ذروة ميغابايت الحالي وسجل عدة تركز الهدف الحمض النووي (12:02 م إلى 0.02 مم). رسم بياني للتغييرات الحالية الذروة (ΔP) كان المرسومة باستخدام الصيغة 3σ/m (σ يجري الانحراف المعياري لحل فارغ وم يجري منحدر المنحنى الخطي)61،،من6263. وحسبت حد الكشف بيوسينسور الحمض النووي ملفقة أن 04:43 م الذي كان أكبر من أن أصغر في الواقع قياس العينة. هذه النتيجة كان باﻻتفاق مع الحقيقة أن ΔP ل 12:02 م و 02:00 م (2.65 × 10-6 ألف و 2.81 × 10-6 أ) مع انحراف معياري 1.19 × 10-7 ألف و 1.06 × 10-7 ، على التوالي، تتداخل.

لحساب لوق ل biosensor الحمض النووي ملفقة، استخدمنا الصيغة 10σ/m الذي (σ هو الانحراف المعياري حل فارغ وهو م منحدر المنحنى الخطي) والعثور على النتائج أن مكسب من 02:08 م. أجرى تمسخ المتكررة من الحمض النووي التكميلية لتقييم بيوسينسور الحمض النووي من حيث قدرتها على التجدد. لقد فعلنا ذلك حضانة قطب تعديل الحمض النووي التكميلية 0.2 ميكرون في الماء الساخن عند 86 درجة مئوية لمدة 8 دقائق تؤذي الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل، متبوعاً بالتبريد السريع في حمام الثلج للحفاظ على الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل التشويه والتحريف64.

واستمر النشاط التهجين في 91% ردها الأولى بعد الجهود 8 التجديد (n = 5، تحديد وضع اللاجئ = 4.05%). وكان بيوسينسور الحمض النووي استناداً إلى أسلوب سام لتجميد مسبار الحمض النووي إلى SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس مستقرة جداً، تحقيق استجابة جيدة في الكشف عن الحمض النووي التكميلية بعد العمليات المتكررة تمسخ. وكان مواصلة استكشاف استقرار biosensor الحمض النووي لدينا فيما يتعلق بالحرارة. للقيام بهذا، نحن تخزين مسرى جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس/SPCE/سدنى عند درجة حرارة 4 درجة مئوية 25 درجة مئوية و 45 درجة مئوية في حقيبة ألومنيوم مختومة التي تحتوي على السليكا المواد الهلامية. في نهاية 6 أشهر، قيمنا الحمض النووي التكميلية وتقدر النسبة المئوية لانتعاش الإنتاج إشارة. يظهر الرقم 16 أن المسبار SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس/سدنى مستقرة جداً مع أكثر من 80% الإشارات الأولية لا تزال قابلة للاسترداد بعد تخزين 6 أشهر. تم العثور على رد الفعل القوى بين جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس وسدنى للاستقرار طويل الأجل في درجة حرارة أقل من 45 درجة مئوية.

تسعة أنواع مختلفة من البكتيريا (الشمعية باء، لام الليستريه، ج. الصائمية، O157:H7 كولاي، ف. الجينوليتيكوس، S. typhimurium، س. التهاب الأمعاء، ك. الالتهاب الرئوي و الخامس. باراهايموليتيكوس) تم فرزهم بالكشف عن PCR. ويبين الشكل 17منتجات التضخيم PCR للكشف عن إبلاغها من V. parahaemolyticus من ثقافة البكتيريا. واستخدمت الجينات توزر من V. parahaemolyticus التمهيدي PCR V. parahaemolyticus تحديد سبب وجودها في يعزل المسببة للأمراض. من تحليل PCR, V. parahaemolyticus أظهرت نتائج إيجابية نظراً للخصوصية التمهيدي PCR الجينات توكسر نحو V. parahaemolyticus. لم يتم اكتشاف أية منتجات PCR من السلالات البكتيرية الأخرى. دبف الذروة الحالية التي تم الحصول عليها بعد إجراء تقييم ه أظهر الكشف واضحة جداً من V. parahaemolyticus مقارنة بالأنواع الأخرى من البكتيريا، كما هو مبين في الشكل 18. إشارة دبف زيادة عدد الأزواج الأساسية انخفضت، نظراً لكمية أكبر من جزيئات MB ترتبط التحقيقات. V. parahaemolyticus بوضوح قادرة على التمييز من مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية الأخرى التي تحاكي البيئة العينة الغذائية.

واختيرت الأصداف البحرية كعينات حقيقية للتحقق من صحة بيوسينسور الحمض النووي في هذه الدراسة نظراً لأنهما عنصران شعبية في عدة أنواع من الأغذية المحلية. فمن المعروف جيدا أن الأصداف البحرية الخام كثيرا ما تحمل الخامس الممرضة. باراهايموليتيكوس ، ويمكن أن تنقل هذه البكتيريا إلى البشر، ولا سيما إذا كانوا هم المبردة غير كاف أثناء التخزين بعد الحصاد65. مجموعة معالجة العينات القواقع المخزنة في-20 درجة مئوية ح 24، وتتعرض للأشعة فوق البنفسجية في 20 درجة مئوية ح 4 قبل استخراج الحمض النووي خلال جهودنا خطوة ما قبل المعالجة. الرقم 19 يبين أن تحليل PCR وجدت V. parahaemolyticus في كلا العينتين (ارتفعت) المعالجة وغير المعالجة. يظهر هذا في حارة 7، 8، 9، 10، 11، و 12 ربط مع المستعمرة العد في المناقشة السابقة. لا ت. باراهايموليتيكوس تظهر في العينات المعالجة وغير المعالجة (أونسبيكيد)، كما هو موضح في حارة 1، 2، 3، 4، 5 و 6 في نتائج PCR على الرغم من أن العد مستعمرة تشير إلى وجودها في العينات. سبب المحتمل لهذا هو وجود تلوث نواتج الأيض مثل البروتين في الحمض النووي المستخرج66.

الرقم 20 يلخص نتائج الكشف عن استخدام بيوسينسور الحمض النووي المتقدمة، التي تحدد الوجود V. parahaemolyticus في المجموعة المعالجة يتألف من عينات ارتفعت وأونسبيكيد بنجاح. هذه النتائج إيجابية ترتبط بنتائج PCR نوقش سابقا. واكتشفت كل عينة من PCR التي أظهرت نتائج إيجابية باستخدام تقنية biosensor الكهروكيميائية التي استقرت في جيش التحرير الشعبي الصيني، وتستند إلى أونب، ومنطقة ذروة دبف وضوح تقابل مع عصابات كثافة PCR الناتجة (الرقم 19 و الرقم 20). تشير هذه النتائج إلى أن الاستشعار الكهروكيميائية المستندة إلى نانوحبيبات المقترحة في هذه الدراسة اكتشف V. parahaemolyticus بنجاح في العينات الحقيقية، مما يثبت أنها متفوقة على بكر مع أي تأثير على صحة النتائج.

Figure 1
الشكل 1 : امتصاص لجيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : الطيف حيود الأشعة السينية لجيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس. تكييف بإذن من الرقم [30]. حقوق التأليف والنشر (2016) شركة Brasileira de Química- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : تيم تردد قطر التوزيع وصور لجيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس في قياس حجم 50 نانومتر. طبع بإذن من الرقم [30]. حقوق التأليف والنشر (2016) شركة Brasileira de Química- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : EDX الأطياف والصور فسيم SPCE و (ب) SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس (أ) العارية. طبع بإذن من الرقم [30]. حقوق التأليف والنشر (2016) شركة Brasileira de Química- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : مؤامرة أكسدة الذروة الحالية ضد الجذر التربيعي معدل المسح الضوئي ودوري فولتاموجرامس: (أ) العارية SPCE و (ب) SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس في 1.0 مليمول لتر-1 ك3[Fe(CN)6] (pH 7). كانت معدلات المسح 300 و 250، 200، 150، 100 و 50 mV ق−1. تكييف بإذن من الرقم [30]. حقوق التأليف والنشر (2016) شركة Brasileira de Química- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 : أطياف مقاومة أقطاب معدلة في 1.0 مليمول لتر-1 ك 3 [Fe(CN)6] (pH 7). السعة: 5 أم، ونطاق التردد: 0.1-105 هرتز-مواءمة مع إذن من الرقم [22]. حقوق التأليف والنشر (2016) السفير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7 : ذروة انوديك الحالية لتعديل كهربائي في 1.0 مليمول لتر-1 ك 3 [Fe(CN)6] (pH 7) بفحص معدل 0.1 V s -1 استخدام قياس فولتاميتري دوري الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 8
الشكل 8 : تأثير تركيز لتجميد ssDNA على SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس في 0.1 mol L-1 برنامج تلفزيوني (pH 7) بفحص معدلات 0.1 V s -1 بعد 30 دقيقة حضانة في 20 ميكرومتر ميجابايت باستخدام قياس النبض تفاضلي فولتاميتري الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 9
الرقم 9 : تأثير ssDNA تجميد الوقت في أونبس-SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني في 0.1 mol L -1 برنامج تلفزيوني (pH 7) بمعدل 0.1 V s المسح الضوئي -1 بعد 30 دقيقة حضانة في 20 ميكرومتر ميجابايت باستخدام قياس النبض تفاضلي فولتاميتري الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 10
الرقم 10 : تأثير درجة حرارة التثبيت ssDNA على SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس بمعدل 0.1 V s مسح -1 في 0.1 mol L -1 برنامج تلفزيوني (pH 7) بعد فترة حضانة من 30 دقيقة في ميكرومتر 20 ميغا بايت باستخدام القياس فولتاميتري نبض تفاضلي الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 11
الرقم 11 : تأثير التهجين الوقت على SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس/سدنى في 0.1 mol L -1 برنامج تلفزيوني (pH 7) بمعدل 0.1 V s المسح الضوئي -1 بعد 30 دقيقة حضانة في 20 ميكرومتر ميجابايت باستخدام قياس النبض تفاضلي فولتاميتري الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 12
الرقم 12 : تأثير درجة الحرارة التهجين في SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس/سدنى في 0.1 mol L -1 برنامج تلفزيوني (pH 7) بمعدل 0.1 V s المسح الضوئي -1 بعد 30 دقيقة حضانة في 20 ميكرومتر ميجابايت باستخدام القياس فولتاميتري نبض تفاضلي. طبع بإذن من الرقم [22]. حقوق التأليف والنشر (2016) السفير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 13
الرقم 13 : الرسم البياني لذروة ميغابايت الحد الحالي باستخدام أنواع مختلفة من الحمض النووي في 0.1 mol L –1 برنامج تلفزيوني (pH 7) بمعدل 0.1 V s المسح الضوئي -1 بعد الاحتضان 30 دقيقة في ميكرومتر 20 ميغابايت. ويوضح اقحم فولتاموجرامس نبض تفاضلي في نفس الظروف. طبع بإذن من الرقم [22]. حقوق التأليف والنشر (2016) السفير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 14
الرقم 14 : الرسم البياني لذروة ميغابايت الحد الحالي باستخدام مختلف الحمض النووي تركز في 0.1 mol L –1 برنامج تلفزيوني (pH 7) بمعدل 0.1 V s المسح الضوئي -1 بعد 30 دقيقة حضانة في 20 ميكرومتر ميجابايت باستخدام القياس فولتاميتري نبض تفاضلي. طبع بإذن من الرقم [22]. حقوق التأليف والنشر (2016) السفير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 15
الرقم 15 : قطعة خطية الحد من ذروة الحالي ميغابايت ضد السجل في تركيز الحمض النووي مختلفة في 0.1 mol L -1 برنامج تلفزيوني (pH 7) بمعدل 0.1 V s المسح الضوئي -1 بعد 30 دقيقة حضانة في 20 ميكرومتر ميجابايت باستخدام القياس فولتاميتري نبض تفاضلي. طبع بإذن من الرقم [22]. حقوق التأليف والنشر (2016) السفير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 16
الرقم 16 : تأثير درجات حرارة مختلفة التهجين على SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس/سدنى في 6 أشهر من الفاصل الزمني للتخزين (ن = 3). وقد أجريت قياسات في 0.1 mol L-1 برنامج تلفزيوني (pH 7) بفحص معدل 0.1 V s-1 بعد 30 دقيقة حضانة في 20 ميكرومتر ميجابايت باستخدام القياس فولتاميتري نبض تفاضلي. طبع بإذن من الرقم [22]. حقوق التأليف والنشر (2016) السفير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 17
الرقم 17 : [اغروس] هلام التفريد-[بكر] تضخيم استخدام 16S الرنا الريباسي الجين تسلسل منتجات البكتيريا مختارة من الثقافة البكتيريا. لين م: 1 كيلو بايت الحمض النووي سلم، C− لين: السلبية السيطرة (الماء المقطر المعقم)، C+ لين: مراقبة إيجابية (الحمض النووي المستخرج من كولاي يستخدم كقالب)، "لين الجماعة الأوروبية": كولاي O157:H7، CJ لين: جيم الصائمية ، لين قبل الميلاد: الشمعية، KP لين: الالتهاب الرئوي ك.، "ش لين": تيفيموريوم س.، LM لين: الليستريه ل.، "سي لين": الأمعاء س.، "لين نائب رئيس": V. باراهايموليتيكوس و "لين ت ت": ف الجينوليتيكوس الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 18
الرقم 18 : الرسم البياني لذروة ميغابايت الحد الحالي لدراسة ه بيوسينسور الحمض النووي ضد مختلف مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية في 0.1 mol L -1 برنامج تلفزيوني (pH 7) بمعدل 0.1 V s المسح الضوئي -1 بعد 30 دقيقة حضانة في 20 ميكرومتر ميجابايت باستخدام القياس فولتاميتري نبض تفاضلي. طبع بإذن من الرقم [23]. حقوق الطبع والنشر سبرينغر (2017). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 19
الرقم 19 : [اغروس] هلام التفريد-PCR منتجات التضخيم من V. parahaemolyticus من عينات القواقع الطازجة. لين م: 2ul 100 شركة بريتيش بتروليوم سلم الحمض النووي، لين 1-3: دون علاج أونسبيكيد العينات، لين 4-6: معاملة عينات أونسبيكيد، ولين 7-9: دون علاج ارتفعت عينات، لين 10-12: تعامل ارتفعت العينات، C+ لين: مراقبة إيجابية (V. parahaemolyticus ATCC 17802)، لين ج-: سلبية التحكم (ماء مقطر معقم). طبع بإذن من الرقم [23]. حقوق الطبع والنشر سبرينغر (2017). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 20
الرقم 20 : الرسم البياني لذروة ميغابايت الحد الحالي للكشف عن V. parahaemolyticus في عينات القواقع الطازجة باستخدام بيوسينسور الحمض النووي في 0.1 mol L-1 برنامج تلفزيوني (pH 7) بفحص معدل 0.1 V s-1 بعد 30 دقيقة حضانة في 20 ميكرومتر ميجابايت باستخدام القياس فولتاميتري نبض تفاضلي. طبع بإذن من الرقم [23]. حقوق الطبع والنشر سبرينغر (2017). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تشكيل قطب كهربائي وقت الحضانة (ح) درجة الحرارة (درجة مئوية) وسائط النمو
العطيفة الصائمية 48 42 با/BB
الليستريه المستوحدة 48 30 حساب السياحة الفرعي/TSB
Typhimurium السالمونيلا 24 37 حساب السياحة الفرعي/TSB
السالمونيلا الملهبة 24 37 حساب السياحة الفرعي/TSB
الكلبسيله الالتهاب الرئوي 24 37 برنامج الماجستير التنفيذي/TSB
الإشريكيّة القولونية O157:H7 24 37 ماجستير/TSB
العصوية الشمعية 24 37 مولوكوسكي/TSB
الجينوليتيكوس الضمة 24 37 حساب السياحة الفرعي + 3% NaCl/TSB+3% كلوريد الصوديوم
Vibrio parahaemolyticus 24 37 كلوريد الصوديوم NaCl/TSB+3% CA/TSA+3%

الجدول 1: الثقافة الشروط المحددة البكتيريا.

عينة Pos. [° 2Th.] فوم [° 2TH.] د-تباعد [Å] حجم كريستاليتي (نيو مكسيكو)
جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس 31.682 0.3149 2.8243 27

الجدول 2: حجم بذر بلوري أونب جيش التحرير الشعبي الصيني. مواءمة مع إذن من الرقم [30]. حقوق التأليف والنشر (2016) شركة Brasileira de Química-

معدلة قطب كهربائي % تحديد مركز اللاجئ (n = 6) إشارة الحد (%) (n = 20)
التكرار إمكانية تكرار نتائج
SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس 4.26 4.05 18

الجدول 3: خصائص أقطاب المعدلة المتعلقة بتعديل أونبس وجيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس في ك 3 [Fe(CN)6] مع 1.0 مليمول لتر -1 تركيز 0.1 V s بمعدل المسح الضوئي -1 . تكييف بإذن من الرقم [30]. حقوق التأليف والنشر (2016) شركة Brasileira de Química-

تشكيل قطب كهربائي أناالسلطة الفلسطينية (µA) هالسلطة الفلسطينية معدل الانتقائية (%)
(n = 3) (ت)
SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونب/مسبار الحمض النووي 4.79 ± 0.10 -0.46 -
الحمض النووي SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونب/غير-التكميلية 3.25 ± 0.12 -0.44 67.85
SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونب/3-قواعد الحمض النووي غير متطابقة 1.05 ± 0.11 -0.45 21.92
SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونب/1-قاعدة عدم تطابق الحمض النووي 0.94 ± 0.12 -0.46 19.62
الحمض النووي SPCE/جيش التحرير الشعبي الصيني-أونب/مكملة 0.73 ± 0.10 -0.45 15.24

الجدول 4: دبف الانتقائية في ذروة ميغابايت الحالية في 0.1 mol L -1 برنامج تلفزيوني (pH 7) بمعدل 0.1 V s المسح الضوئي -1 وبعد الاحتضان 30 دقيقة في ميكرومتر 20 ميغابايت

تكوين أقطاب كهربائية طريقة الكشف مجموعة الخطي (M) حد الكشف (M) مراجع
أونبس ثلاثي الأبعاد دبف 1.5 × 10-6 -7.0 × 10-9 2.0 × 10-10 69
(+) أونبس دبف 1.0 × 10-9 -1.5 × 10-12 2.6 × 10-12 70
أونبس/GR دبف 1.3 × 10-9 -2.5 × 10-11 8.3 × 10-12 71
أونبس-ADH-جهاز الأمن العام دبف 5.0 × 10-8 -3، 0 × 10-13  3.0 × 10-13 72
أونبس-MPTS دبف 5.0 × 10-9 -1.0 × 10-11  5.0 × 10-11 73
أونبس-اذهب دبف 1.0 × 10-9 -1.0 × 10-14 3.5 × 10-15 74
كوس/أونبس دبف 1.0 × 10-9 -1.0 × 10-12 7.0 × 10-13 75
جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس دبف 2.0 × 10-8 -2.0 × 10-13 5.3 × 10-12 هذا العمل

الجدول 5: مقارنة بعض nanosensors الحمض النووي الكهروكيميائية وضعت مؤخرا. طبع بإذن من الرقم [22]. حقوق التأليف والنشر (2016) السفير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخطوات الحاسمة في إطار للتنمية الناجحة لهذا النوع من بيوسينسور الكهروكيميائية اختيار العناصر الاعتراف البيولوجية المناسبة لمحول (الحمض النووي أو الحمض النووي هنا)؛ نهج الكيميائية لبناء طبقة الاستشعار من محول؛ توصيل المواد؛ الأمثل لتجميد الحمض النووي والتهجين؛ والتحقق بيوسينسور المتقدمة باستخدام عينات حقيقية.

الأساسية للتنمية الناجحة ل biosensor الحمض النووي الكهروكيميائية الحساسة وانتقائية، هي الأمثل لشرط التثبيت والتهجين. في هذا العمل، استخدمنا ميغابايت الأكسدة المعقدة. هناك المبادئ المختلفة من التفاعلات ميغابايت--الحمض النووي: (ط) بالتفاعل الالكتروستاتيكي التهمة الموجبة ميغابايت مع الفوسفات العمود الفقري أنيونى تهمة ssDNA ودسدنا؛ (ثانيا) من الالكترود ميغابايت من خلال الإدراج الناجح ميغابايت بين التناوب جيم ز قاعدة أزواج في دسدنا؛ (ثالثا) بسندات تساهمية إلى نهاية ssDNA المستهدفة، التي تنتج بكثافة منخفضة تسمية (واحد أو اثنين ميغابايت الجزيئات الواحدة حبلا الحمض النووي)؛ و (رابعا) من التفاعلات ميجابايت مع جوانين غير منضم قاعدة في سدنى. قمنا بتطبيق المبدأ الرابع، الذي يعرف بدقة V. parahaemolyticus من الصليب مفاعليه من البكتيريا وفي الأصداف البحرية الطازجة. بعد أكسدة ذات أهمية خاصة، وكان هناك ارتباط أقوى بين ميغا بايت وسدنى. التهجين ssDNA مع تسلسل مكملة لها محل جزيئات MB المستعبدين، ومما يقلل من الإشارة.

سلسلة النتائج التجريبية المعروضة أعلاه تركز على تطوير أسلوب سريع لكشف V. parahaemolyticus بانتقائية عالية وحساسية باستخدام مبادئ التهجين الحمض النووي. الخطوة الأولى هي عملية التوليف وتوصيف polylactic حمض استقر الذهب جسيمات نانوية (جيش التحرير الشعبي الصيني-أونبس) لتعديل القطب (الأرقام 1-6 و الجدول 2). تم تقييم نوعية جسيمات نانوية الذهب باستخدام مطيافية الأشعة فوق البنفسجية-المرئية (تجاه الأشعة فوق البنفسجية)، "حيود الأشعة السينية" (XRD)، والمجهر الإلكتروني المسح الميداني-الانبعاثات (فسيم)، وانتقال الميكروسكوب الإلكتروني (TEM)، فولتاميتري دوري (CV) و تحليل مقاومة. الجزء الثاني للتنمية تنطوي توصيف الكهروكيميائية القطب المعدلة (أرقام 7-12 و الجدول 3-4) الذي قرر تعزيز نجاح القطب معدلة بالنسبة إلى مسرى العارية في شروط الكشف عن الحدث التهجين.

الخطوة الثالثة من تطوير بيوسينسور الحمض النووي على أساس يستند إلى تحسين ظروف الحدث التهجين التجريبية وتطبيق بيوسينسور المتقدمة للكشف عن مسببات المرض الفعلي (أرقام 13-20). تم تقييم هذا الحدث التهجين الذي يحدد نجاح الكشف عن مسببات المرض استخدام فولتاميتري نبض تفاضلي (دبف). وذكر إيجابية وجود مسببات الأمراض المستهدفة من خلال الحد الحالي. وتم تقييم حساسية biosensor المتقدمة من خلال بناء قطعة أرض في المعايرة وحساب اللد (الشكل 15). بيوسينسور ملفقة كان قادراً على تمييز التحديد V. parahaemolyticus من مسببات الأمراض الأخرى استناداً إلى مستويات مختلفة من الحد الحالي (أرقام 17 و 18). يشار إلى وجود إيجابية من مسببات الأمراض المستهدفة بالحد الحالي ويرد تقييم جدوى biosensor المتقدمة للكشف عن V. parahaemolyticus في العينة الغذائية الفعلية في الأرقام 19 و 20 . النجاح في تطوير أجهزة استشعار العوامل البيولوجية على أساس الحمض النووي يعتمد اعتماداً كبيرا على اختيار مسبار الحمض النووي، وتعزيز مسرى معدلة، فضلا عن الاستغلال الأمثل للظروف التجريبية. وكان مسبار الحمض النووي هنا مقتبسة من الأعمال السابقة التي ناكانو67. تعزيز أقطاب تعديل أجرى باستخدام جسيمات نانوية الذهب استقرت مع حمض اللبنيك لتمكين توحيد نانوسيزي. دالة جسيمات نانوية الذهب كقانون لزيادة معدل نقل الإلكترون وأيضا توفير سطح الذي تريد الربط مسبار الحمض النووي و المواد الحفازة الكهربائية68 . كانت الأمثل المعلمات التجريبية من حيث الوقت درجة الحرارة والحضانة هو أمر حاسم للحمض النووي لنموذج الطباعة على الوجهين. درجة حرارة التهجين يؤثر على الفصل بين الامتزاز غير محددة، وهذه الزيادات الانتقائية من أجهزة الاستشعار. وقت الحضانة من التهجين يزيد من فرص تشكيل الطباعة على الوجهين. يجب أن يكون الأمثل إجراء التثبيت من أجل التأكد من مسبار الحمض النووي سيكون في اتجاه مناسب لتشكيل المزدوجة للنموذج.

يقارن الجدول 5 عينة من وضعها مؤخرا الكهروكيميائية الحمض النووي أجهزة استشعار العوامل البيولوجية69،،من7071،،من7273،74،75 ,. بيوسينسينج على أساس الحمض النووي هو وسيلة واعدة لاستبدال التقنيات الجزيئية أساس على الرغم من أن هناك عدد قليل من القيود التي يتعين معالجتها قبل أن يمكن أن يكون الأسلوب المحمولة ما يكفي للاستخدام في الموقع. أن القيد الرئيسي استخراج الحمض النووي تجهيز العينة كالنقاء وكمية الحمض النووي المستخرج في الموقع من غير المحتمل أن تكون جيدة كما أن يستخرج بالطريقة القياسية المستندة إلى مختبر. أنها، مع ذلك، بديلاً واعداً إذا التفريد بكر وهلام يمكن الاستعاضة عن نظام المعالجة المسبقة عينة مثل موائع جزيئية.

أجهزة استشعار العوامل البيولوجية على أساس الحمض النووي التي يمكن أن تكون مفيدة للعديد من التطبيقات بما في ذلك التشخيص الطبي، والرصد البيئي ورصد الأغذية. سوف تمكن هذه التقنية على الإنترنت رصد عمليات مراقبة الجودة، فضلا عن رصد نقطة من الرعاية للمرضى. قابلية نظام استشعار كله سيمكن تطبيق اللامركزية على العمليات التشخيصية حيث يمكن للمستهلك استخدام نظام الكشف في راحة وطنهم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

يود المؤلفون أن نعترف بالدعم من جامعة بوترا ماليزيا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Merck 100056
Chloroform Merck 102445
Diaminoethane tetraacetic acid Promega E5134
Dibasic sodium phosphate  Sigma-Aldrich S9763
Disodium hydrogen phosphate Sigma-Aldrich 255793
Ethanol  Sigma-Aldrich 16368
Gold (III) chloride trihydrate Sigma-Aldrich 520918
Hydrochloric acid Merck 100317
Methylene blue Sigma-Aldrich M44907
Monobasic sodium phosphate, monohydrate Sigma-Aldrich S3522
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P5119
Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D NatureWorks 4042D
Potassium chloride R&M Chemicals 59435
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich P9791
Potassium hexacyanoferrate III R&M Chemicals 208019
Sodium acetate anhydrous salt Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
Trisodium citrate Sigma-Aldrich S1804
Tris(hydroxymethyl) aminomethane Fisher Scientific T395-100
Tris-Base Fisher Scientific BP152-500
2X PCR Master Mix with Dual-Dye Norgen Biotek 28240
Agarose gel Merck 101236
Bolton Agar Merck 100079
Bolton Broth Merck 100079
CHROMagar Vibrio CHROMagar VB910
dNTPs Promega U1511
Nuclease-free water Thermo Scientific R0581
Eosin methylene blue agar  Merck 101347
GelRed Biotium 41001
Glycerol Merck 104092
Go Taq Buffer Promega M7911
Loading dye 100 bp DNA ladder Promega G2101
Loading dye 1kb DNA ladder Promega G5711
Magnesium chloride Promega 91176
Mannitol egg yolk polymyxin agar Merck 105267
McConkey Agar Merck 105465
Nutrient Broth Merck 105443
Taq polymerase Merck 71003
Trypticase Soy Broth Merck 105459
Trypticase Soy Agar Merck 105458

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gould, L. H., Rosenblum, I., Nicholas, D., Phan, Q., Jones, T. F. Contributing factors in restaurant-associated foodborne disease outbreaks, FoodNet sites, 2006 and 2007. Journal of Food Protection. 76, 1824-1828 (2013).
  2. Arvanitoyannis, I. S., Kotsanopoulos, K. V., Papadopoulou, A. Rapid detection of chemical hazards (toxins, dioxins, and PCBs) in seafood. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 54, 1473-1528 (2014).
  3. Robertson, L. J., Sprong, H., Ortega, Y. R., van der Giessen, J. W. B., Fayer, R. Impacts of globalisation on foodborne parasites. Trends in Parasitology. 30, 37-52 (2014).
  4. Sandilands, E. A., Bateman, D. N. The epidemiology of poisoning. Medicine. 44, 76-79 (2016).
  5. Boschi-Pinto, C., Velebit, L., Shibuya, K. Estimating child mortality due to diarrhoea in developing countries. Bulletin of the World Health Organization. 86, 710-717 (2008).
  6. Farthing, M. J. G. Diarrhoea: A Significant Worldwide Problem. International Journal of Antimicrobial Agents. 14, 65-69 (2000).
  7. World Health Organization. WHO estimates of the global burden of foodborne diseases: foodborne disease burden epidemiology reference group 2007-2015. , 1-255 (2015).
  8. Yeung, M., Boor, K. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathogens and Disease. 1, 74-88 (2004).
  9. Sakazaki, R. Foodborne Diseases. Cliver, D. O., Riemann, H. P. , Academic Press. 127-136 (2002).
  10. Grochowsky, J., Odom, S. R., Akuthota, P., Stead, W. Primary Septicemia and Abdominal Compartment Syndrome From Vibrio parahaemolyticus Infection in a 40-Year-Old Patient With No Known Immunocompromise. Infectious Disease in Clinical Practice. 22, (2013).
  11. Raghunath, P. Roles of thermostable direct hemolysin (TDH) and TDH-related hemolysin (TRH) in Vibrio parahaemolyticus. Frontiers in Microbiology. 5, 805 (2014).
  12. Kalburge, S. S., Whitaker, W. B., Boyd, E. F. High-Salt Preadaptation of Vibrio parahaemolyticus Enhances Survival in Response to Lethal Environmental Stresses. Journal of Food Protection. 77, 246-253 (2014).
  13. Esteves, K., Hervio-Heath, D., Mosser, T., Rodier, C., Tournoud, M. G., Jumas-Bilak, E., Colwell, R. R., Monfort, P. Rapid proliferation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, and Vibrio cholerae during freshwater flash floods in French Mediterranean Coastal lagoons. Applied and Environmental Microbiology. 81, 7600-7609 (2015).
  14. Khandeparker, L., Anil, A. C., Naik, S. D., Gaonkar, C. C. Daily variations in pathogenic bacterial populations in a monsoon influenced tropical environment. Marine Pollution Bulletin. 96, 337-343 (2015).
  15. Caburlotto, G., Suffredini, E., Toson, M., Fasolato, L., Antonetti, P., Zambon, M., Manfrin, A. Occurrence and molecular characterization of Vibrio parahaemolyticus in crustaceans commercialised in Venice area, Italy. International Journal of Food Microbiology. 220, 39-49 (2016).
  16. Wong, H. C., Chen, M. C., Liu, S. H., Liu, D. P. Incidence of highly genetically diversified Vibrio parahaemolyticus in seafood imported from Asian countries. International Journal of Food Microbiology. 52, 181-188 (1999).
  17. Rosec, J. P., Causse, V., Cruz, B., Rauzier, J., Carnat, L. The international standard ISO/TS 21872-1 to study the occurence of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae in seafood: ITS improvement by use of a chromogenic medium and PCR. International Journal of Food Microbiology. 157, 189-194 (2012).
  18. Maniyankode, R. A., Kingston, J. J., Murali, H. S., Batra, H. V. Specific identification of vibrio parahaemolyticus employing monoclonal antibody based immunoassay. International Journal of Pharmacy and Biological Sciences. 4 (2), B156-B164 (2013).
  19. Suffredini, E., Lopez-Joven, C., Maddalena, L., Croci, L., Roque, A. Pulsed-field gel electrophoresis and PCR characterization of environmental Vibrio parahaemolyticus strains of different origins. Applied and Environmental Microbiology. 77, 6301-6304 (2011).
  20. Bhattacharyya, N., Hou, A. A pentaplex PCR assay for detection and characterization of Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolyticus isolates. Letters in Applied Microbiology. 57, 233-240 (2013).
  21. da Silva, E. T. S. G., et al. Electrochemical Biosensors in Point-of-Care Devices: Recent Advances and Future Trends. ChemElectroChem. 4 (4), 778-794 (2017).
  22. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. Sensitive detection of multiple pathogens using a single DNA probe. Biosensors and Bioelectronics. 86, 398-405 (2016).
  23. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. A simple, portable, electrochemical biosensor to screen shellfish for Vibrio parahaemolyticus. AMB Express. 7 (1), 41 (2017).
  24. Zhang, J., Li, Z., Zhang, H., Wang, J., Liu, Y., Chen, G. Rapid detection of several foodborne pathogens by F0F1-ATPase molecular motor biosensor. Journal of Microbiological Methods. 93, 37-41 (2013).
  25. Barsan, M. M., Ghica, E. M., Brett, C. M. A. Portable biosensing of food toxicants and environmental pollutants. Nikolelis, D. P., Varzakas , T., Erdem, A., Nikoleli, G. P. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Boca Raton. 33-69 (2014).
  26. Kwun, J., Yun, S., Park, L., Lee, J. H. Development of 1,1'-oxalyldiimidazole chemiluminescent biosensor using the combination of graphene oxide and hairpin aptamer and its application. Talanta. 119, 262-267 (2014).
  27. Thavanathan, J., Huang, N. M., Thong, K. L. Colorimetric biosensing of targeted gene sequence using dual nanoparticle platforms. International Journal of Nanomedicine. 10, 2711-2722 (2015).
  28. Hushiarian, R., Yusof, N. A., Abdullah, A. H., Ahmad, S. A. A., Dutse, S. W. Facilitating the indirect detection of genomic DNA in an electrochemical DNA biosensor using magnetic nanoparticles and DNA ligase. Analytical Chemistry Research. 6, 17-25 (2015).
  29. Dutse, S. W., Yusof, N. A., Ahmad, H., Hussein, M. Z., Zainal, Z., Hushiarian, R., Hajian, R. An Electrochemical Biosensor for the Determination of Ganoderma boninense Pathogen Based on a Novel Modified Gold Nanocomposite Film Electrode. Analytical Letters. 47 (5), 819-832 (2014).
  30. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hajian, R. Characterization of Polylactide-Stabilized Gold Nanoparticles and Its Application in the Fabrication of Electrochemical DNA Biosensors. Journal of the Brazilian Chemical Society. 27 (9), 1679-1686 (2016).
  31. Vongkamjan, K., Wang, S., Moreno Switt, A. I. Rapid detection of foodborne bacterial pathogens in seafood. Handbook of Seafood: Quality and Safety Maintenance and Applications. , 247-257 (2016).
  32. Wang, F., Jiang, L., Yang, Q., Han, F., Chen, S., Pu, S., Vance, A., Ge, B. Prevalence and antimicrobial susceptibility of major foodborne pathogens in imported seafood. Journal of Food Protection. 74 (9), 1451-1461 (2011).
  33. Szermer-Olearnik, B., Sochocka, M., Zwolinska, K., Ciekot, J., Czarny, A., Szydzik, J., Kowalski, K., Boratynski, J. Comparison of microbiological and physicochemical methods for enumeration of microorganisms. Postepy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej. 68, 1392-1396 (2014).
  34. Ivanov, I. G., Bachvarov, D. R. Determination of plasmid copy number by the "boiling" method. Analytical Biochemistry. 165 (1), 137-141 (1987).
  35. Gopireddy, V. R. Biochemical tests for the identification of bacteria. International Journal of Pharmacy and Technology. 3 (4), 1536-1555 (2011).
  36. Böhme, K., Fernández-No, I. C., Pazos, M., Gallardo, J. M., Barros-Velázquez, J., Cañas, B., Calo-Mata, P. Identification and classification of seafood-borne pathogenic and spoilage bacteria: 16S rRNA sequencing versus MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 34 (6), 877-887 (2013).
  37. Seoudi, R., Fouda, A. A., Elmenshawy, D. A. Synthesis, characterization and vibrational spectroscopic studies of different particle size of gold nanoparticle capped with polyvinylpyrrolidone. Physica B: Condensed Matter. 405, 906-911 (2010).
  38. Mishra, A., Harper, S., Yun, S. I. Interaction of biosynthesized gold nanoparticles with genomic DNA isolated from E. coli and S. aureus. Nanotechnology (IEEE-NANO). , 1745-1750 (2011).
  39. Sugimoto, T. Formation of modoispersed nano- and micro-particles controlled in size, shape, and internal structure. Chemical Engineering and Technology. 26, 313-321 (2003).
  40. Rath, C., Sahu, K. K., Kulkarni, S. D., Anand, S., Date, S. K., Das, R. P., Mishra, N. C. Microstructure-dependent coercivity in monodispersed hematite particles. Applied Physics Letters. 75, 4171-4173 (1999).
  41. Abbas, M., Wu, Z. Y., Zhong, J., Ibrahim, K., Fiori, A., Orlanducci, S., Sessa, V., Terranova, M. L., Davoli, I. X-ray absorption and photoelectron spectroscopy studies on graphite and single-walled carbon nanotubes: Oxygen effect. Applied Physics Letters. 87 (5), 051923 (2005).
  42. Lim, S. C., Choi, Y. C., Jeong, H. J., Shin, Y. M., An, K. H., Bae, D. J., Lee, Y. H., Lee, N. S., Kim, J. M. Effect of gas exposure on field emission properties of carbon nanotubes arrays. Advanced Materials. 13, 1563-1567 (2001).
  43. Kim, B. H., Kim, B. R., Seo, Y. G. A study on adsorption equilibrium for oxygen and nitrogen into carbon nanotubes. Adsorption. 11, 207-212 (2005).
  44. Bard, A. J., Faulkner, L. R. Electrochemical methods: Fundamentals and applications. , John Wiley & Sons Inc. (2000).
  45. Tan, Q., Wang, L., Ma, L., Yu, H., Ding, J., Liu, Q., Xiao, A., Ren, G. Study on anion electrochemical recognition based on a novel ferrocenyl compound with multiple binding sites. Journal of Physical Chemistry B. 112, 11171-11176 (2008).
  46. Manivannan, S., Ramaraj, R. Polymer-embedded gold and gold/silver nanoparticle-modified electrodes and their applications in catalysis and sensors. Pure and Applied Chemistry. 83, 2041-2053 (2011).
  47. Benali, O., Larabi, L., Traisnel, M., Gengembre, L., Hareka, Y. Electrochemical, theoretical and XPS studies of 2-mercapto-1-methylimidazole adsorption on carbon steel in 1 M HClO4. Applied Surface Science. 253, 6130-6139 (2007).
  48. Shi, Y., Wen, L., Li, F., Cheng, H. M. Nanosized Li4Ti5O12/graphene hybrid materials with low polarization for high rate lithium ion batteries. Journal of Power Sources. 196, 8610-8617 (2011).
  49. Bentiss, F., Traisnel, M., Lagrenee, M. The substituted 1,3,4-oxadiazoles: a new class of corrosion inhibitors of mild steel in acidic media. Corrosion Science. 42, 127-146 (2000).
  50. Wang, M., Gong, W., Meng, Q., Zhang, Y. Electrochemical DNA impedance biosensor for the detection of DNA hybridization with polymeric film, single walled carbon nanotubes modified glassy carbon electrode. Russian Journal of Electrochemistry. 47, 1368-1373 (2011).
  51. Herdt, A. R., Drawz, S. M., Kang, Y., Taton, T. A. DNA dissociation and degradation at gold nanoparticle surfaces. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 51 (2), 130-139 (2006).
  52. Bhatt, N., Huang, P. J. J., Dave, N., Liu, J. Dissociation and degradation of thiol-modified DNA on gold nanoparticles in aqueous and organic solvents. Langmuir. 27, 6132-6137 (2011).
  53. Liu, X., Jang, C. H., Zheng, F., Jürgensen, A., Denlinger, J. D., Dickson, K. A., Raines, R. T., Abbott, N. L., Himpsel, F. J. Characterization of protein immobilisation at silver surfaces by near edge X-ray absorption fine structure spectroscopy. Langmuir. 22, 7719-7725 (2006).
  54. Willey, T. M., Andrew, L., Vance, T., Buuren, V., Bostedt, C., Terminello, L. J., Fadley, C. S. Rapid degradation of alkanethiol-based self-assembled monolayers on gold in ambient laboratory conditions. Surface Science. 576 (1), 188-196 (2005).
  55. Farjami, E., Clima, L., Gothelf, K., Ferapontova, E. E. DNA interactions with a Methylene Blue redox indicator depend on the DNA length and are sequence specific. Analyst. 135, 1443-1448 (2010).
  56. Lin, X., Ni, Y., Kokot, S. An electrochemical DNA-sensor developed with the use of methylene blue as a redox indicator for the detection of DNA damage induced by endocrine-disrupting compounds. Analytica Chimica Acta. 867, 29-37 (2015).
  57. Zhang, F. T., Nie, J., Zhang, D. W., Chen, J. T., Zhou, Y. L., Zhang, X. X. Methylene Blue as a G-Quadruplex Binding Probe for Label-Free Homogeneous Electrochemical Biosensing. Analytical Chemistry. 86, 9489-9495 (2014).
  58. Ning, L., Li, X., Yang, D., Miao, P., Ye, Z., Li, G. Measurement of Intracellular pH Changes Based on DNA-Templated Capsid Protein Nanotubes. Analytical Chemistry. 86, 8042-8047 (2014).
  59. Sani, N. D. M., Heng, L. Y., Surif, S., Lazim, A. M., et al. AIP Conference Proceedings. Murad, A., et al. 1571, 636-640 (2013).
  60. Xu, P., Wang, J., Xu, Y., Chu, H., Shen, H., Zhang, D., Zhao, M., Liu, J., Li, G. Binding modes and interaction mechanism between different base pairs and methylene blue trihydrate: a quantum mechanics study. Advances in Experimental Medicine and Biology. 827, 187-203 (2015).
  61. Guo, Y., Chen, J., Chen, G. A label-free electrochemical biosensor for detection of HIV related gene based on interaction between DNA and protein. Sensors & Actuators, B: Chemical. 184, 113-117 (2013).
  62. Huang, K. J., Liu, Y. J., Wang, H. B., Wang, Y. Y., Liu, Y. M. Sub-femtomolar DNA detection based on layered molybdenum disulfide/multi-walled carbon nanotube composites, au nanoparticle and enzyme multiple signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 55, 195-202 (2014).
  63. Kong, R. M., Song, Z. L., Meng, H. M., Zhang, X. B., Shen, G. L., Yu, R. Q. A label-free electrochemical biosensor for highly sensitive and selective detection of DNA via a dual-amplified strategy. Biosensors and Bioelectronics. 54, 442-447 (2014).
  64. Rashid, J. I. A., Yusof, N. A., Abdullah, J., Hashim, U., Hajian, R. Novel Disposable Biosensor Based on SiNWs/AuNPs Modified-Screen Printed Electrode for Dengue Virus DNA Oligomer Detection. IEEE Sensors Journal. 15, 4420-4421 (2015).
  65. Yingkajorn, M., Sermwitayawong, N., Palittapongarnpimp, P., Nishibuchi, M., Robins, W. P., Mekalanos, J. J., Vuddhakul, V. Vibrio parahaemolyticus and its specific bacteriophages as an indicator in cockles (Anadara granosa) for the risk of V. parahaemolyticus infection in Southern Thailand. Microbial Ecology. 67, 849-856 (2014).
  66. Ahmad Ganaie, H., Ali, M. N. Short term protocol for the isolation and purification of DNA for molecular analysis. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research. 24, 266-270 (2014).
  67. Nakano, K., Kimura, T., Kitamura, Y., Ihara, T., Ishimatsu, R., Imato, T. Potentiometric DNA sensing platform using redox-active DNA probe pair for sandwich-type dual hybridization at indicator electrode surface. Journal of Electroanalytical Chemistry. 720-721, 71-75 (2014).
  68. Yang, J., Jim Yang, L., Heng-Phon, T., Gan-Moog, C. Inhibition of DNA hybridization by small metal nanoparticles. Biophysical Chemistry. 120, 87-95 (2006).
  69. Niu, L. M., Liu, F., Wang, W., Lian, K. Q., Ma, L., Shi, H. M., Kang, W. J. Electrochemical Behavior of Paraquat on a Highly Ordered Biosensor Based on an Unmodified DNA-3D Gold Nanoparticle Composite and Its Application. Electrochimica Acta. 153, 190-199 (2015).
  70. Li, Z., Miao, X., Xing, K., Zhu, A., Ling, L. Enhanced electrochemical recognition of double-stranded DNA by using hybridization chain reaction and positively charged gold nanoparticles. Biosensors and Bioelectronics. 74, 687-690 (2015).
  71. Niu, S., Sun, J., Nan, C., Lin, J. Sensitive DNA biosensor improved by 1,10-phenanthroline cobalt complex as indicator based on the electrode modified by gold nanoparticles and graphene. Sensors and Actuators B: Chemical. 176, 58-63 (2013).
  72. Yi, H., Xu, W., Yuan, Y., Bai, L., Wu, Y., Chai, Y., Yuan, R. A pseudo triple-enzyme cascade amplified aptasensor for thrombin detection based on hemin/G-quadruplex as signal label. Biosensors and Bioelectronics. 54, 415-420 (2014).
  73. Das, R., Sharma, M. K., Rao, V. K., Bhattacharya, B. K., Garg, I., Venkatesh, V., Upadhyay, S. An electrochemical genosensor for Salmonella typhi on gold nanoparticles-mercaptosilane modified screen printed electrode. Journal of Biotechnology. 188, 9-16 (2014).
  74. Han, X., Fang, X., Shi, A., Wang, J., Zhang, Y. An electrochemical DNA biosensor based on gold nanorods decorated graphene oxide sheets for sensing platform. Analytical Biochemistry. 443 (2), 117-123 (2013).
  75. Huang, K. J., Liu, Y. J., Zhang, J. Z., Cao, J. T., Liu, Y. M. Aptamer/Au nanoparticles/cobalt sulfide nanosheets biosensor for 17β-estradiol detection using a guanine-rich complementary DNA sequence for signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 67, 184-191 (2015).

Tags

الهندسة الحيوية، المسألة 136، Polylactic حمض استقر الذهب جسيمات نانوية، قطب الكربون موضع، بيوسينسور الحمض النووي، Vibrio parahaemolyticus، الاستشعار الكهروكيميائية، التهجين الحمض النووي
تطوير Biosensor الكهروكيميائية الحمض النووي للكشف عن مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nordin, N., Yusof, N. A., Radu, S.,… More

Nordin, N., Yusof, N. A., Radu, S., Hushiarian, R. Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen. J. Vis. Exp. (136), e56585, doi:10.3791/56585 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter