Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Udvikling af en elektrokemisk DNA Biosensor at opdage en fødevarebårne patogenet

Published: June 3, 2018 doi: 10.3791/56585
Automatic Translation
1, 2,3, 1, 4
1Laboratory of Food Safety and Food Integrity, Institute of Tropical Agriculture and Food Security, Universiti Putra Malaysia, 2Laboratory of Functional Device, Institute of Advanced Technology, Universiti Putra Malaysia, 3Department of Chemistry, Faculty of Science, Universiti Putra Malaysia, 4La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University

Summary

En protokol til udviklingen af en elektrokemisk DNA biosensor bestående af en polylactic syre-stabiliseret, guld nanopartikler-modificeret, skærm-trykt carbon elektrode ægprodukters Vibrio parahaemolyticus præsenteres.

Abstract

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) er en fælles fødevarebårne patogen, der bidrager til en stor del af folkesundhedsproblemer globalt, væsentligt påvirker hastigheden af menneskelige dødelighed og sygelighed. Konventionelle metoder til påvisning af V. parahaemolyticus som kultur-baserede metoder, immunologiske assays og molekylær-baserede metoder kræver kompliceret eksempel håndtering og er tidskrævende, besværligt og dyrt. For nylig, biosensorer har vist sig for at være en lovende og omfattende påvisningsmetode med fordelene ved hurtig påvisning, omkostningseffektivitet og praktisk gennemførlighed. Denne forskning fokuserer på at udvikle en hurtig metode til påvisning af V. parahaemolyticus med høj selektivitet og følsomhed ved hjælp af principperne om DNA hybridisering. I arbejdet, blev karakterisering af syntetiserede polylactic syre-stabiliseret guld nanopartikler (PLA-AuNPs) opnået ved hjælp af røntgen diffraktion (XRD), Ultraviolet-synlige spektroskopi (UV-Vis), transmissions elektronmikroskopi (TEM), felt-emission Scanning Elektron Mikroskopi (FESEM) og cyklisk Voltammetry (CV). Vi vil også foretages yderligere afprøvning af stabilitet, følsomhed og reproducerbarhed af PLA-AuNPs. Vi fandt, at PLA-AuNPs dannet en god struktur af stabiliseret nanopartikler i vandig opløsning. Vi bemærkede også, at følsomheden forbedret som følge af den mindre afgift overførsel modstand (Rct) værdi og en stigning af aktive areal (0,41 cm2). Udvikling af vores DNA biosensor var baseret på ændring af en skærm-trykt carbon elektrode (SPCE) med PLA-AuNPs og ved hjælp af methylenblåt (MB) som redox indikator. Vi vurderede hændelserne immobilisering og hybridisering af differential pulse voltammetry (DPV). Vi fandt, at supplerende, ikke-komplementære, og forkerte oligonukleotider var specifikt udmærker sig ved den opdigtede biosensor. Det viste også pålideligt følsomme påvisning i krydsreaktivitet undersøgelser mod forskellige levnedsmiddelbårne patogener og identifikation af V. parahaemolyticus i friske hjertemuslinger.

Introduction

Et større emne af offentlige og videnskabelige debat i de seneste år, madforgiftning er primært knyttet til 3 agenser: mikroorganismer1, kemikalier2og parasitter3. Forurenede fødevarer kan forårsage alvorlige helbredsmæssige konsekvenser hos mennesker, især i den højere risikogruppe af personer med svage immunsystemer, ældre, gravide kvinder, babyer og småbørn4. Med mere end en million tilfælde af akut diaré opstår årligt hos børn under 5 år i Afrika, Asien og Latinamerika, madforgiftning er en stor global sygdom5,6 og Verdenssundhedsorganisationen har etableret mikroorganismer som den vigtigste bidragyder7. Vibrio parahaemolyticus skiller sig ud blandt de mest almindeligt anerkendte virulente stammer. Normalt findes i kystområder, flodmundinger og marine miljøer8, er det en Gram-negative bakterie, som bliver aktiv i høje salt miljøer, og forårsager alvorlige menneskelige gastroenteritis når der spises i kogt, fejlhåndtering eller rå marine produkter9. Derudover gør eksisterende medicinske tilstande i nogle mennesker dem tilbøjelige til sår infektion, sepsis eller øre infektion som følge af V. parahaemolyticus10. Virulens faktorer af V. Vibrio hemolysins er opdelt i to typer, som bidrager til sygdom patogenese: termostabil direkte hemolysin (TDH) kodet af tdh gener og TDH-relaterede hemolysin kodet af trh gener11. Virulens markører (tdh og trh gener) af V. parahaemolyticus findes mest i kliniske prøver og ikke i miljømæssige prøver.

V. parahaemolyticus besidder evnen til at overleve under en bred vifte af forhold, hurtigt reagerer på miljømæssige ændringer12. Dens spredning mekanisme eskalerer sin risiko potentiale som dets toksicitet stiger parallelt med celle masse13. Endnu værre, klimaændringerne stiller disse bakterier med rigelig betingelser til at fremskynde deres celle befolkning vækst14. På grund af sin høje frekvens skal V. parahaemolyticus overvåges langs fødevareforsyningskæden, navnlig handel og produktion af fisk og skaldyr, da disse produkter er, hvor de findes i enorme mængder15,16 i hele verden. I øjeblikket bakterier er identificeret og isoleret ved hjælp af en vifte af metoder, herunder biokemiske tests, berigelse og selektiv media17, enzym-forbundet immunomagnetic sorptionsmiddel assay (ELISA)18, puls-field gelelektroforese (PFGE) 19, latex agglutinationstests og polymerase kædereaktion (PCR) test20. Disse metoder kræver normalt kvalificeret personale, avancerede instrumenter og besværlige teknikker, som ikke giver oplysninger om forurening straks. Dette begrænser i høj grad sandsynligheden for hurtigt afsløre skadelige forurening og on-site applikationer. Hurtig påvisning værktøjer forbliver en enestående udfordring.

Biosensing fremstår som en lovende mulighed for påvisning af fødevarebårne patogener, fordi det giver en tidsbesparende, omkostningseffektiv, praktiske og real-time analyse metode21,22,23,24 . Men selv om der har været mange positive resultater af analysand påvisning i spidse prøver og standard løsning ved hjælp af biosensorer, der er stadig en mangel på forskning anvendes til egentlige prøver enten i vandig blandinger eller økologiske ekstrakter25. For nylig, elektrokemiske biosensorer ved hjælp af direkte og/eller indirekte deoxyribonukleinsyre (DNA) påvisning har fået øget opmærksomhed blandt videnskabsfolk, på grund af deres specifikke påvisning af de komplementære mål via en hybridisering begivenhed26 , 27 , 28 , 29. disse unikke tilgange er mere stabil i forhold til enzym-baserede biosensorer, således tilbyde et lovende teknologi for miniaturisering og kommercialisering. Målet for undersøgelsen rapporterede her er at konstruere et hurtigt værktøj, der kan registrere V. parahaemolyticus med høj selektivitet, sensitivitet og praktiske, baseret på DNA sekvens specificitet under hybridisering. Identifikation strategier inddrage kombination af polylactic syre-stabiliseret guld nanopartikler (PLA-AuNPs)30 og skærm-trykt Kulelektroder (SPCEs) i nærværelse af indikatoren hybridisering, methylenblåt (MB). Potentialet i udviklede påvisning konstruktion er yderligere undersøgt ved hjælp af bakterier DNA lysate og friske hjertemuslinger prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Alle de kemiske og biokemiske reagenser skal bruges skal være af analysekvalitet og bruges uden yderligere rensning. Forberede alle løsninger ved hjælp af steril deioniseret vand. Autoklave alle glasvarer før sterilisation.

Forsigtig: Brug venligst alle relevante sikkerhedspraksis, når du udfører laboratorieaktiviteter herunder brugen af tekniske kontrol (stinkskab, handskerum) og personlige værnemidler (sikkerhedsbriller, handsker, laboratoriekittel, fuld længde bukser, lukket tå sko).

1. fremstilling og karakterisering af modificerede elektrode ved hjælp af PLA-AuNPs

  1. Forberedelse og karakterisering af PLA-AuNPs
    1. Hurtigt tilføje 10 mL natriumcitratopløsning (38,8 mM) til 100 mL kogende vandige chloroauric syre (1 mM) og køle det ned til stuetemperatur. Observere ændringer i farve i de forberedte AuNPs løsning, som starter som gul, ændringer i sortbrune og endelig slutter som mørk rubinrød.
    2. Placer PLA pellets i en rustfrit stål mug for smeltende processen og forvarme dem ved en temperatur på 190 ° C i 10 min. Følg med presserende procedure: læg dem under et tryk på 2.2 MPa for 1 min som en del af PLA ark forberedelse. Arket PLA vil være klar til brug efter afkøling for omkring 3 timer.
    3. Omrøring energisk, opløse 0,68 mg PLA ark i 5 mL chloroform ved stuetemperatur. Bland den opløste PLA med 10 mL af den tidligere fremstillet AuNPs opløsning og administrationsprocedurerne rør det ved stuetemperatur. De homogene blandinger kan betegnes som PLA-AuNPs og karakteriseret ved hjælp af UV-Vis, XRD, TEM og FESEM med EDX.
  2. Forberedelse og karakterisering af modificerede skærm-trykt carbon elektrode
    Bemærk: SPCE anvendes i denne undersøgelse består af en tre-elektrode system: en counter elektrode, en carbon arbejder elektrode og en Ag/AgCl referenceelektrode.
    1. Hurtigt pipette 25 µL af den homogene løsning af PLA-AuNPs ind på SPCE og derefter luft tørre det i 24 timer inden brug.
    2. Elektrokemisk karakterisere de modificerede elektroder, PLA-SPCE-AuNPs, i kalium ferro cyanid (K3[Fe(CN)6]3 -/4 -) til at måle aktive areal, elektrokemiske impedans spektroskopi, repeterbarhed, reproducerbarhed og stabilitet30.

2. udvikling af elektrokemiske DNA Biosensor

  1. Sonden forberedelse
    Bemærk: Sekvenser af ssDNA sonde og supplerende DNA blev valgt på grundlag af oplysninger fra det nationale Center for bioteknologi oplysninger (NCBI) database.
    1. Køb syntetiske oligonukleotider (20-mer ssDNA sonde, 20-mer supplerende DNA, 20-mer uoverensstemmende DNA og 21-mer ikke-supplerende DNA) som frysetørret pulver fra kommercielle laboratorier, baseret på de følgende sekvenser:
      thiolated ssDNA sonde: 5 ' - / 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3 '
      supplerende DNA: 5 ' - CAGTGCTTCTGCATAATCCG - 3 '
      One-base uoverensstemmende DNA: 5 ' - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG - 3 '
      tre-base uoverensstemmende DNA: 5 ' - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG - 3 '
      ikke-supplerende DNA: 5 ' - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA - 3 '
    2. Forberede stamopløsninger af alle oligonukleotider (100 µM) ved hjælp af en steril TE opløsning (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5), opdelt i analytiske dele. Holde dette på-4 ° C og derefter foretage de passende fortyndinger lige før anvendelsen.
  2. Optimering af immobilisering og hybridisering
    Bemærk: En SPCE ændret med PLA-AuNPs, betegnet som SPCE/PLA-AuNPs, blev brugt til denne undersøgelse og en dråbe støbning metode blev brugt til DNA immobilisering og hybridisering.
    1. Først, immobilisere 25 µL af thiolated ssDNA sonde på SPCE/PLA-AuNPs og derefter air tørre i 24 timer ved stuetemperatur, hvorefter det vil blive endelig betegnet som SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA. Fastslå optimering af immobilisering tilstand ved hjælp af tre faktorer: koncentrationen af ssDNA (lige fra 0,2 til 1,4 µM), tid (spænder fra 30 til 210 min) og temperatur (lige fra 25 til 75 ° C).
    2. Der afpipetteres 25 µL af den supplerende DNA på overfladen af SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA til at udføre hændelsen hybridisering, hvorefter det kan være endelig betegnet som SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA. Bestemme optimering af hybridisering tilstand via de to faktorer tid (lige fra 5 til 30 min) og temperatur (lige fra 25 til 75 ° C).
    3. Fordybe den immobiliserede og hybridiserede elektroder i 20 µM MB til 30 min. Fjern ikke-specifikt adsorberet DNA og overskydende MB ved at vaske med 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4.5) og derefter skylle med deioniseret vand. Foranstaltning spidsværdien af strømmen af MB reduktion ved hjælp af DPV teknik. Udføre DPV måling ved hjælp af 0,1 M PBS (pH 7) indeholder ingen indikator.
  3. Karakterisering af den opdigtede DNA biosensor
    1. Fordyb SPCE/PLA-AuNPs i 20 µM MB i 30 min., vask med 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4.5) og skyl derefter med deioniseret vand inden måling. Følge en lignende procedure for alle interaktioner herunder sonde DNA, supplerende DNA, uoverensstemmelse mellem DNA og ikke-supplerende DNA-prøver.
    2. Måle en elektrokemisk reduktion.
      Bemærk: Vi målte DPV ved hjælp af en kommercielt fremstillede Autolab med interface software.
      DPV målinger af MB elektrokemisk reduktion udføres på et potentiale, lige fra -0,5 V til 0,25 V, med en potentiel trin 0.005 V, graduering amplitude på 0,05 V samt en scanning af 7.73 mVs-1 i 0,1 M PBS (pH 7), der indeholder ingen indikator. Selektivitet, sensitivitet, reproducerbarhed og varmen stabilitet af de fabrikerede DNA biosensor blev yderligere undersøgt. Rapporterede resultater blev præsenteret som gennemsnitlig værdi målinger i tre replikater.

3. validering af opdigtede DNA Biosensor ved hjælp af virkelige prøver

  1. Forberedelse af bakteriestammer
    1. Bakteriel udtage baseret på deres betydelig kontaminering af skaldyr31,32 .
      Bemærk: V. parahaemolyticus som reference stammer og 8 andre bakterielle stammer (Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella lungebetændelse, Escherichia coli O157: H7, Bacillus cereusog Vibrio alginolyticus) af den fælles fødevarebårne patogenet var ansat til den elektrokemiske DNA biosensor validering i denne undersøgelse.
    2. Gennemføre en rutinemæssig subkultur af bakteriestammer på deres respektive agar hver to uger til at bevare deres levedygtighed, se tabel 1 for kultur betingelser.
    3. Vedligeholde langsigtet bevaring af bakteriestammer i deres respektive voksende bouillon med 20% (v/v) glycerol ved-80 ° C som glycerol beskytter bakterier ved at forhindre dannelsen af iskrystaller, der kan skade dem under frysning processen. Næste, podes en løkke af bevarede bakteriel cellekultur i glycerol bestande i de respektive bouillon. Inkuber bouillon efter deres respektive vækst tid og temperatur, når skulle genoplive bakterier.
    4. Bestemme mængden af V. parahaemolyticus celler ved hjælp af en spredning plade teknik33, en standard og en velkendt metode for optælling af mikroorganismer afledt fra en serie af fortyndinger.
      1. Kultur V. parahaemolyticus i Trypticase soja bouillon (TSB + 3% NaCl) ved 37 ° C i en 140-rpm ryster tilstand. Derefter overføres 1 mL af cellekultur bakterier til 9 mL TSB + 3% NaCl til at få en 10-1 fortyndingsfaktoren.
    5. Gentag dette trin ni gange for at få en komplet serie af op til 10-10 fortyndingsfaktoren. Næste, sprede 0,1 mL af hver fortyndingsfaktor (start fra 10-1 til 10-10) på en Vibrio selektiv agar plade for kolonien tælle, henholdsvis. Inkuber Pladerne inkuberes ved 37 ° C i 24 timer.
    6. Brug en koloni tæller til at tælle enkelte kolonier og derefter tilbage-Beregn (Tæl beløbet CFU/pipetted x fortyndingsfaktoren) for at få en kolonidannende enhed pr. milliliter tæthed (CFU mL-1). Udlede koncentration af kolonidannende enheder (CFUs) i bakterier celle suspensioner fra kalibrering plot af CFU mL-1 mod absorbans.
  2. Forberedelse af PCR assay
    1. Uddrag genomisk DNA efter en modificeret kogt lysis procedure34. Første, streak en individuel bakteriel stamme på agar medier og podes det i bouillon medier, efterfulgt af inkubere det på sin relative vækst tilstand, en 140 rpm ryster tilstand.
    2. Der afpipetteres 1 mL kultur i bouillon i en micro-centrifugerør. Der centrifugeres dette på 4830 x g og 4 ° C i 1 min. at få pellets. Bruge omkring 500 µL sterilt TE buffer til resuspension med pellet. Hold de resulterende suspension i 10 min på 98 ± 2 ° C i en varme blok og straks chill det ved – 18 ° C i 10 min til lyse celler og frigive DNA.
    3. Der centrifugeres genomisk DNA på 4830 x g og 4 ° C i 3 min til at opnå en klar suspension og holde supernatanten ved-20 ° C til yderligere brug. Bruge en biophotometer måling med UV absorption ved en bølgelængde på 260 nm (som nukleinsyrer absorberende bølgelængde af lys) og også med en bølgelængde på 280 nm (som proteiner absorberende bølgelængde af lys) til at bestemme koncentrationen og renheden af det udtrukne genomisk DNA og derefter identificere alle stammer ved hjælp af standard biokemiske assays35 og kontrollere dem af 16S rRNA gen sekventering36. Endelig denaturere genomisk DNA på 92 ° C i 2 min. og afkøles det hurtigt i isvand før ansøgningen til biosensor.
    4. Yderligere bekræfte tilstedeværelsen V. parahaemolyticus ved hjælp af PCR til at målrette toxR genet. Udføre denne procedure i en thermocycler ved hjælp af en primer par (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3 og 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3'). Optimere PCR-amplifikation i et samlede reaktion volumen på 25 µL består af sterilt vand (15,5 µL), buffer (5 µL), primer (1 µL, 10 µM), dNTP mix (1 µL), DNA skabelon (2 µL) og Taq DNA polymerase (0.2 µL, 10 x).
    5. Blande komponenterne godt og arrangere PCR-amplifikation af target sekvens i en thermocycler programmeret til 30 cyklusser af forstærkning. I vores undersøgelse, hver cyklus bestod af tre-trins reaktioner dvs., indledende denaturering (94 ° C, 3 min) efterfulgt af 30 cyklusser af denaturering (94 ° C, 1 min), udglødning (63 ° C, 1,5 min) og filtypenavn (72 ° C, 1,5 min), efterfulgt af afsluttende forlængelse (72 ° C, 7 min).
    6. Bestemme de forstærkede produkter og deres størrelser via elektroforese på 1,5% agarosegel. Fange gel billeder med en kommercielt produceret gel-dokumentationssystem.
  3. Forberedelse af Hjertemuslingefiskeri prøver
    1. Få friske prøver.
      Bemærk: Vores friske hjertemuslinger (Anadara granosa) blev fremstillet fra det våde marked i Serdang, Selangor, og hurtigt bragt til laboratoriet i en is køler box til analyse. Opdele prøverne i 2 grupper, nemlig de behandlede og ubehandlede gruppe, forudsat at hjertemuslinger blev høstet ensartet fra begyndelsen af høsten indtil placere dem i kølerum.
    2. Pre-omgås hjertemuslinger i den behandlede gruppe ved at gemme dem på-20 ° C i 24 timer, efterfulgt af udsættelse for UV-lys ved 20 ° C i 4 timer før DNA-ekstraktion.
      Bemærk: Indefrysning temperatur og UV-stråling anvendes til de kontrollerede gruppen dræber eller i det mindste begrænser det naturligvis akkumulere V. parahaemolyticus i hjertemuslinger. Anvend ikke en højere pasteurisering ordning på 70 ° C, da formålet med den kontrollerede betingelse i denne undersøgelse er at efterligne de friske hjertemuslinger faktiske situation. I mellemtiden, analysere prøver direkte fra den ubehandlede gruppe uden nogen forbehandling, så snart de ankommer til laboratoriet.
    3. Subkultur en stamme af V. parahaemolyticus ATCC 17802 i TSB (3% NaCl). Bestemme niveauet af levedygtige celler i inokulum via plating af passende fortyndinger af TSB (3% NaCl) på CA for at opnå et inokulum af 104 CFU mL-1 i V. parahaemolyticus. Vask hver hjertemuslinger i destilleret vand og krat det fri for snavs før brug steril pincet i en laminar flow kabinet til at fjerne væv fra skallen.
    4. Homogeniseres omkring 10 g af Hjertemuslingefiskeri vævsprøver med en homogeniseringsapparat i 90 mL sterilt TSB (3% NaCl) for 60 s. Tilføj en kendt mængde af V. parahaemolyticus til 9 mL af den homogeniserede prøve bouillon spidse prøverne. Brug de unspiked prøver som en negativ kontrol. Anslå celletal af V. parahaemolyticus spidse på Hjertemuslingefiskeri prøver af plating 0,1 mL af prøver på CA, og efterfølgende, når der afpipetteres 1 mL af prøver i et microcentrifuge rør til DNA prøve udvinding, der skal bruges i biosensor og PCR assay.
    5. Uddrag genomisk DNA af V. parahaemolyticus fra de spidse og unspiked prøver efter en modificeret kogt lysis procedure36. Endelig bestemmer DNA koncentration og renhed ved hjælp af en bio fotometer måling med UV absorption ved en bølgelængde på 260 nm (som nukleinsyrer absorberende bølgelængde af lys) og også med en bølgelængde på 280 nm (som proteiner absorberende bølgelængde af lys).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dannelsen af AuNPs blev åbenbaret gennem ændring i farve af den vandige opløsning med natrium citrat stede. Dette forårsagede farven til at ændre fra lys gul til en dyb rubinrød. Generation af PLA-AuNPs blev bekræftet fra UV-vis spektre (figur 1) hvor væksten af overflade plasmon resonans (SPR) peak blev fundet på omkring 540 nm. Dannelsen og eksistensen af PLA-AuNPs var angivet på 500-600 nm bølgelængde intervaller, afhængigt af partikel størrelse37. XRD mønstre af AuNPs og PLA-AuNPs er vist i figur 2. Alle crystallite toppe blev observeret på 2θ af 31,7, 38.2, 44,4, 64.7 og 77,7 °. De blev tilskrevet (100) (111) (200) (220), og (311) krystallografiske fly af cubic-FCC (ansigt-centreret cubic) guld (metal) nanostrukturer (JCPDS fil nummer-00-004-0783). PLA-AuNPs crystallite peak intensiteter steg også som en bredere diffraktion peak centreret på 31.7°, hvilket indebærer, at AuNPs var indlejret i PLA og tyder på dannelsen af polyfasisk guld nanostrukturer38. Desuden, alle AuNP diffraktion toppe vist på PLA-AuNPs viste, at AuNPs havde en stabil struktur. Den gennemsnitlige størrelse af PLA-AuNPs blev beregnet ved hjælp af Scherrers ligning (L = kλ/βcosθ), ved at bestemme bredden af den (100) Bragg refleksion. Fra FWHM og d-afstand (tabel 2), crystallite størrelsen af PLA-AuNPs blev beregnet som 27 nm.

Dimensioner af PLA-AuNPs og dets morfologi blev yderligere undersøgt ved hjælp af TEM. Fra TEM partikel fordeling curve og billeder af PLA-AuNPs, blev det set, at guld nanopartikler var næsten kugleformet i form (figur 3). Størrelsen af nanopartikler var i området omkring 37 nm, lidt større end fremstillet af Scherrers formel, tyder på en polykrystallinske karakter som syntetiseret nanopartikler39. Mindre størrelse som følge af XRD i modsætning til TEM er også blevet observeret i tidligere forskning, sandsynligvis fordi strukturen partikel er polykrystallinske i naturen på grund af den betydelige mængde af crystallites, der er mindre (sub partikler)40 . Figur 4 viser FESEM image som forberedt PLA-AuNPs på SPCE. Det fremgår tydeligt af FESEM billeder og EDX spektre, SPCE/PLA-AuNPs havde den højeste vægt procentdel af guld, største tæthed og største overflade af nanopartikel dækning. Det kan også bemærkes især, at figur 4(en) viser FESEM billede af en nøgen SPCE. FESEM billedet i figur 4(b) viser godt distribueret PLA-AuNPs. For at bekræfte den syntetiserede PLA-AuNPs' kemiske sammensætning, var EDX ansat til at undersøge den kemiske sammensætning af den som produceret PLA-AuNPs, som figur 4(en)og 4(b). EDX spektrum bekræftet, at de som produceret PLA-AuNPs bestod af guld (Au) kun, og vises ingen andre element undtagen den top, der svarer til carbon (C) og ilt (O). Tilstedeværelsen af C peak skyldtes carbon elektrode til som prøven var drop stemmer.

EDX spektrum viste også tilstedeværelsen af O angiver, at ilt var adsorberet på kul elektrode, fordi filmen var udsat for luft. Dette bekræfter, at ilt er adsorberet på kulstof-nanorør, hvis de udsættes for luft for en lang tid41. Selv om der er forskellige gas molekyler i luften, var ilt menes at være den vigtigste adsorbate på den luft-eksponerede kulstof nanorør42, muligvis på grund af dens hurtigere adsorption sammenlignet med andre molekyler43. Dette var baseret på at finde at ilt var den vigtigste adsorbate på carbon elektrode under overnatning air eksponering i forberedelse af prøver og forstærket de kemiske renhed af PLA-AuNPs. Forholdet mellem anodisk og katodisk peak (jegpa/ipc) blev næsten 1, som gav konstant peak potentiale som scanningen Vurder øget44. Desuden var anodisk og katodisk peak potentialer konsekvent på forskellige scanning satser45 tyder på, at den elektrokemiske reaktion var reversible baseret på peak adskillelse (figur 5). Den aktive areal af den modificerede elektrode blev beregnet ved hjælp af Randles-Sevick ligning (jegpc = (2,69 × 105) n3/2 AD1/2 Cv1/2. Fra hældningen af plottet jegpc versus v1/2 i figur 5(en) og (b), areal af elektroderne var beregnet som 0,26 cm2 og 0,41 cm2 for den nøgne SPCE og PLA-AuNPs, henholdsvis. Dette resultat bekræftet, at forbedring af PLA-AuNPs på den aktive overflade område var relativt højere sammenlignet med nøgne SPCE. Det afledte resultatet var sammenlignelig med polymer-embedded guld nanopartikler (β-CD-EDAS(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylene-diamine matrix indkapslet guld nanopartikler), som afslørede, at en høj aktiv areal forbedret processen med elektron-overførsel og derfor resulterede i bedre følsomhed46.

Den modificerede SPCE elektrokemiske reaktion var i en kontrolleret diffusion, vist ved en reduktion i K3[Fe(CN)6]3 -/4 - spidsværdien af strømmen, som igen har påberåbt sig aktuelt af scan rate kvadratroden (v 1/2). For at få et bedre overblik over de modificerede elektrode egenskaber, blev en elektrokemisk impedans spektroskopi (EIS) undersøgelse udført for at korrelere med udførelsen af den modificerede elektrode præsenteret i form af CV målinger. Afsnittet halvcirkel set ved høje frekvenser korreleret med de begrænsende proces af elektron overførsel i EIS. Gratis overførsel modstand (Rct) blev målt direkte som diameteren af halvcirkel. Dette resultat optalte med værdien af Rct af den nøgne SPCE, som var 1932 Ω og hvor ændringen af SPCE/PLA-AuNPs faldt til 1444 ohm (figur 6). Fald af Rct værdi i SPCE/PLA-AuNPs kan have haft et fald i lokale dielektrisk konstant og/eller en forøgelse af tykkelsen af den elektriske dobbelt lag47, tyder på, at K3[Fe(CN)6]3 - /4 - funktion af adsorption på grænsefladen metal/løsning. Disse udgange overholdt dem ud fra målinger af CV (figur 7). Peak strøm øges gradvis med ændring af SPCEs ved hjælp af PLA-AuNPs, som viste, at en højere følsomhed var inverse af de nederste Rct48. Således er kan stigningen i værdien af CV af de modificerede elektroder og faldet i Rct værdier have været på grund af den gradvise udskiftning af vandmolekyler (mængden af vandmolekyler er 27.19 Å3) af adsorptionen af K3 [Fe(CN)6] 3 -/4 - på metaloverflade, mindske omfanget af opløsning reaktion49.

Tabel 3 angiver den relative standardafvigelse (RSD) for repeterbarhed og reproducerbarhed af den modificerede elektrode. Rutinemæssig CV optagelse af K3[Fe(CN)6]3 -/4 - foregik i seks på hinanden følgende sæt for at undersøge repeterbarhed af de modificerede elektroder. RSD SPCE/PLA-AuNPs stammer som 4,26%. Elektrode med PLA-AuNPs ændring gav bedre RSD efter flere målinger. Derudover var bruger den samme procedure, seks ændrede elektroderne uafhængigt opdigtet, som gav RSD værdier på 4.05% for SPCE/PLA-AuNPs, der angiver bedre reproducerbarhed af elektrode fabrikation for PLA-AuNPs. Den modificerede substrat afhængigt af PLA-AuNPs blev holdt ved 37 ° C for en længere varighed. Det blev også brugt til registrering af 20 cykler og et fald på 18% i signalkvalitet. For at opnå maksimal ydelse fra biosensor, immobilisering periode, temperatur, sammen med blev ssDNA koncentration og kriterier for hybridisering undersøgt. Disse betingelser skal optimeres, så de påvirker spidsværdien af strømmen af DPV. For at optimere ssDNA koncentration, SPCE/PLA-AuNPs blev pipetted med forskellige koncentration (0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2 og 1,4 µM) af ssDNA for 60 min. så at den optimale koncentration af ssDNA blev fastsat. Baseret på figur 8, DPV spidsværdien af strømmen steg som højere DNA koncentrationer blev brugt. Undersøgelsen fandt også, at den optimerede koncentration af DNA var 1,2 µM ssDNA.

For at optimere immobilisering periode involverer enkeltstrenget DNA i SPCE/PLA-AuNPs, 25 µL af ssDNA (1,2 µM) blev testet over forskellige tidspunkter (30, 60, 90, 120, 150, 180 og 210 min). I figur 9viser resultaterne en stigning i immobilisering periode resulterer i den fortsatte stigning af DPV spidsværdien af strømmen. Således blev optimal immobilisering tidspunktet for ssDNA valgt som 180 min. For at optimere immobilisering temperatur, SPCE/PLA-AuNPs blev pipetted med ssDNA (1,2 µM) i forskellige temperaturer (75, 65, 55, 45, 35 og 25 ° C) til 180 min. Vi fandt, at når temperaturen af immobilisering var steget til 55 ° C, DPV spidsværdien af strømmen i første omgang eskalerede efterfulgt af en efterfølgende afskrivning (figur 10); således blev 55 ° C valgt som den optimerede immobilisering temperatur skal bruges i efterfølgende forsøg. Adskillelse af ssDNA, der er immobile fra overflader af elektrode og hybridisering kraftudtaget var forårsaget af øgede temperaturer. Der har været andre rapporter med lignende resultater50. Hurtigere opdeling og degeneration af DNA fra overflader af nanopartikler af guld opstod ved højere temperaturer51. Forskning udført for nylig rapporteret at bond mellem guld og thiol oxiderer nedbrydes hurtigt og simpelthen i en situation, der er omgivende, for eksempel når det udsættes for vand, luft og lys52,53,54. Effekten af hybridisering tid blev også undersøgt i denne undersøgelse.

Den fabrikerede SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA blev drop-støbt med en opløsning af target-DNA (0,2 µM) på forskellige hybridisering gange (5, 10, 15, 20, 25 og 30 min). Svar af DPV steg naturligvis, med en 5-min forøgelse af fordøjelsesprocessen (fra 5 til 10 min) (Figur 11). Når denne værdi blev opnået, konstateredes en 10 til 30 min nedadgående mønster, så den ønskede tid for hybridisering blev valgt som 10 min. Effektiviteten af hybridisering steg med en stigning i temperaturen fra 25 ° C til 35 ° C (figur 12). Den høje nuværende blev set at langsomt falde ved en temperatur højere end 35 ° C. Grunden til dette var tilskrevet sandwich struktur denaturering at reducere afsløring signal. Dermed var optimal hybridisering temperaturen vælges 35 ° C. Den proces, vi anvendte til at opdage V. parahaemolyticus bestod af AuNPs for at forbedre arbejdende elektrode, PLA at mægle overflade ændringen og redox komplekse, MB, aktive areal til reducerede det til LB. Resultatet af denne oxidation proces var en bedre affinitet mellem ssDNA og MB55. Den nuværende DPV var faldt på grund af det lavere antal vedhæftede MB molekyler i hybridisering af ssDNA med dens komplementære sekvens.

Vi foretaget yderligere undersøgelser i udførelsen af den udviklede biosensor. DPV resultaterne i Figur 13 viser, at det var i stand til selektivt skelne sonde DNA, supplerende DNA, one-base uoverensstemmelse mellem DNA, tre-base uoverensstemmelse mellem DNA og ikke-supplerende DNA i overværelse af MB registrering etiket56, 57. den laveste spidsværdien af strømmen (0,73 µA) blev udstillet af supplerende DNA, som langsomt steg med one-base uoverensstemmende DNA (0,94 µA), tre-baser uoverensstemmende DNA (1,05 µA), ikke-supplerende DNA (3.25 µA), og sonde DNA (4,79 µA). Target DNA aktuelle var den mindste af alle strømme af oligonukleotid sekvenser at lade vores biosensor at diskriminere mellem sekvenser af oligonukleotid nænsomt og specifikt. MB bundet kraftigt med ssDNA af immobiliserede sonde DNA producerer en stor DPV spidsværdien af strømmen. SPCE/PLA-AuNPs/ikke-supplerende DNA reduceret immobiliseret sonde DNA aktuelle med næsten halvt så kun en lille mængde af MB samles på overfladen af SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA. Dette er sandsynligvis at være utilgængelige interaktioner mellem MB og guanin baser. Interaktion tilstande af DNA og MB er stærkt afhængige af sådanne forsøgsbetingelser som pH, temperatur, DNA-koncentration, ionisk styrke og type af buffer58,59. MB links almindeligt til dsDNA af groove og intercalative tilstande, hvilket resulterer i MB ophobning på dsDNA overflade60. Vores opsamling sonde DNA eksponering for one-base uoverensstemmelse mellem DNA og tre-base uoverensstemmende DNA reduceret konsekvent DPV peak strømninger og komplementære mål DNA fortsatte denne tendens. Tabel 4 viser procentdelen af selektivitet sats for MB peak aktuelle. Vores overordnede konklusion var, at hybridisering af den beregnede DNA biosensor var yderst selektiv via immobiliseret sonde DNA på den SPCE/PLA-AuNPs' overflade.

Følsomheden af de udviklede DNA biosensor blev yderligere undersøgt med forskellige koncentrationer af komplementære mål oligonukleotid. Figur 14 skildrer den gradvise udtømning af DPV spidsværdien af strømmen af MB på SPCE/PLA-AuNPs som supplerende DNA koncentrationen øget. Figur 15 udstiller en lineær regression koefficient på 0,96, som blev skabt mellem log af reduceret MB spidsværdien af strømmen og log af flere koncentration af target-DNA (0.2 pM til 0,02 mM). Et diagram over top aktuelle ændringer (Δp) blev afbildet ved hjælp af formlen 3σ/m (σ er standardafvigelsen af blindprøven og m er hældningen af den lineære kurve)61,62,63. Detektionsgrænsen for den opdigtede DNA biosensor blev beregnet til at være 4:43 pM som var større end vores mindste faktisk målte prøve. Dette resultat var i overensstemmelse med faktum at Δp for 0.2 pM og 02: 00 (2,65 × 10-6 A og 2,81 × 10-6 A) med en standardafvigelse på 1.19 × 10-7 A og 1,06 × 10-7 A, henholdsvis overlappede.

For at beregne LOQ for den opdigtede DNA biosensor, vi brugte formlen 10σ/m hvor (σ er blindprøve standardafvigelse og m er hældningen af den lineære kurve) og fandt resultatet at være en gevinst af 14.8 pM. Gentagne denaturering af supplerende DNA blev udført for at vurdere DNA biosensor kapacitetsmæssigt sin regenerering. Vi gjorde det ved at inkubere 0,2 µM supplerende DNA-modificerede elektrode i varmt vand på 86 ° C til 8 min til at denaturere dobbelt-strenget DNA, efterfulgt af hurtig nedkøling i isbad at opretholde den denaturerede enkeltstrenget DNA64.

Hybridisering aktivitet blev opretholdt på 91% af dens første reaktion efter 8 indsats af regenerering (n = 5, RSD = 4.05%). DNA biosensor baseret på SAM metode for DNA sonde immobilisering på SPCE/PLA-AuNPs var meget stabil, at opnå en god respons til at opdage supplerende DNA efter gentagne denaturering processer. Stabiliteten i vores DNA biosensor vedrørende varme blev yderligere udforsket. For at gøre dette, gemt vi PLA-AuNPs/SPCE/ssDNA elektrode ved temperaturer på 25 ° C og 4 ° C og 45 ° C i en forseglet aluminium pose indeholdende silica gel. I slutningen af 6 måneder, vi vurderet den supplerende DNA og anslåede procentdel af inddrivelse af signal produktion. Figur 16 viser, at sonden SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA var meget stabil med mere end 80% af sin oprindelige signalet stadig erstattes efter 6 måneders opbevaring. Den kraftige reaktion mellem PLA-AuNPs og ssDNA blev anset for at have langsigtede stabilitet ved en temperatur på under 45 ° C.

Ni forskellige arter af bakterier (B. cereus, L. monocytogenes, C. jejuni, E. coli O157: H7, V. alginolyticus, S. typhimurium, S. enteritis, K. lungebetændelse og V. Vibrio) blev screenet ved PCR påvisning. PCR forstærkning produkter for artsspecifikke påvisning af V. parahaemolyticus fra bakterier kultur er vist i Figur 17. ToxR gen af V. parahaemolyticus blev udnyttet som PCR primer for V. parahaemolyticus identifikation på grund af sin tilstedeværelse i patogene isolater. Fra PCR analyse, V. parahaemolyticus viste positive resultater på grund af specificiteten af PCR primer af toxR gen mod V. parahaemolyticus. Ingen PCR produkter fra andre bakteriestammer blev ikke fundet. DPV spidsværdien af strømmen fremstillet efter en krydsreaktivitet vurdering viste meget klart påvisning af V. parahaemolyticus i forhold til andre bakterier arter, som afbilledet i figur 18. DPV signalet steget som antallet basepar faldt på grund af den større mængde af MB molekyler er bundet til sonderne. V. parahaemolyticus kunne klart blive udsat for fra andre fødevarebårne patogener, som efterlignede miljø i eksemplet mad.

Hjertemuslinger blev valgt som virkelige prøver til DNA biosensor validering i denne undersøgelse, da de er populære ingredienser i flere typer af lokale fødevarer. Det er velkendt, at rå hjertemuslinger ofte bære patogene V. Vibrio og kan overføre disse bakterier til mennesker, især hvis de er tilstrækkeligt nedkølet under opbevaring efter høst65. Den behandlede gruppe af Hjertemuslingefiskeri prøver var opbevares ved-20 ° C i 24 timer og udsat for UV-lys ved 20 ° C i 4 timer før DNA-ekstraktion under vores forbehandling trin. Figur 19 viser, at PCR-analyse fundet V. parahaemolyticus i både behandlede og ubehandlede (AKS) prøver. Dette er vist i Lane 7, 8, 9, 10, 11 og 12 korrelerede med kolonien tælle i den tidligere diskussion. Ingen V. Vibrio vises i de behandlede og ubehandlede (unspiked) prøver, som vist i Lane 1, 2, 3, 4, 5 og 6 i PCR-resultater, selv om kimtal angav sin tilstedeværelse i prøverne. En mulig årsag til dette er tilstedeværelsen af kontaminerende metabolitter såsom protein i den ekstraherede DNA66.

Figur 20 opsummerer påvisning resultater ved hjælp af den udviklede DNA biosensor, der med held bestemt tilstedeværelsen af V. parahaemolyticus i den behandlede gruppe bestående af spidse og unspiked prøver. Disse resultater korrelere positivt med de tidligere omtalte PCR-resultater. Hver prøve af PCR, der viste positive resultater blev opdaget ved hjælp af PLA-stabiliseret elektrokemiske biosensor teknik, som er baseret på AuNP, og DPV topareal klart svarede med de deraf følgende PCR intensitet bands (figur 19 og Figur 20). Disse resultater viser, at den foreslåede nanopartikel-baserede elektrokemisk sensor i denne undersøgelse fundet V. parahaemolyticus med succes i de virkelige prøver, således bevise, at det er overlegen i forhold til PCR med ingen effekt på ægtheden af resultaterne.

Figure 1
Figur 1 : Absorbans af PLA-AuNPs Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Røntgen diffraktion spektrum af PLA-AuNPs. Tilpasset med tilladelse fra ref. [30]. Copyright (2016) Sociedade Brasileira de Química. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : TEM frekvens diameter distribution og billeder af PLA-AuNPs på en måling skala af 50 nm. Genoptrykt med tilladelse fra ref. [30]. Copyright (2016) Sociedade Brasileira de Química. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : EDX spectra og FESEM billeder af a nøgne SPCE og (b) SPCE/PLA-AuNPs. Genoptrykt med tilladelse fra ref. [30]. Copyright (2016) Sociedade Brasileira de Química. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Plot af peak nuværende oxidation mod scan rate kvadratroden og cyklisk voltammograms: a nøgne SPCE og (b) SPCE/PLA-AuNPs i 1,0 mmol L-1 K3[Fe(CN)6] (pH 7). Scanning satser var 300, 250, 200, 150, 100 og 50 mV s−1. Tilpasset med tilladelse fra ref. [30]. Copyright (2016) Sociedade Brasileira de Química. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Impedans spektre af modificerede elektroder i 1,0 mmol L-1 K 3 [Fe(CN)6] (pH 7). Amplitude: 5 mV, og frekvensområde: 0,1-105 Hz. Adapted med tilladelse fra ref. [22]. Copyright (2016) Elsevier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 : Anodisk spidsværdien af strømmen af modificerede elektroder i 1,0 mmol L-1 K 3 [Fe(CN)6] (pH 7) med en scanning hastighed på 0,1 V s -1 ved hjælp af cyklisk voltammetry måling Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8 : Effekt af koncentration for ssDNA immobilisering på SPCE/PLA-AuNPs i 0,1 mol L-1 PBS (pH 7) til scanning priser på 0,1 V s -1 efter 30 min inkubation i 20 µM MB bruger differential pulse voltammetry måling Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9 : Effekt af ssDNA immobilisering tid på SPCE/PLA-AuNPs i 0,1 mol L -1 PBS (pH 7) med en scanning hastighed på 0,1 V s -1 efter 30 min inkubation i 20 µM MB bruger differential pulse voltammetry måling Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 10
Figur 10 : Effekt af ssDNA immobilisering temperatur på SPCE/PLA-AuNPs med en scanning hastighed på 0,1 V s -1 på 0,1 mol L -1 PBS (pH 7) efter en inkubationstid på 30 min i 20 µM MB bruger differential pulse voltammetry måling Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 11
Figur 11 : Effekt af hybridisering tid på SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA i 0,1 mol L -1 PBS (pH 7) med en scanning hastighed på 0,1 V s -1 efter 30 min inkubation i 20 µM MB bruger differential pulse voltammetry måling Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 12
Figur 12 : Effekt af hybridisering temperatur på SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA i 0,1 mol L -1 PBS (pH 7) med en scanning hastighed på 0,1 V s -1 efter 30 min inkubation i 20 µM MB bruger differential pulse voltammetry måling. Genoptrykt med tilladelse fra ref. [22]. Copyright (2016) Elsevier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 13
Figur 13 : Histogram af MB reduktion spidsværdien af strømmen ved hjælp af forskellige typer af DNA i 0,1 mol L -1 PBS (pH 7) med en scanning hastighed på 0,1 V s -1 efter 30 min inkubation i 20 µM MB. Indsatsen illustrerer differential pulse voltammograms i de samme betingelser. Genoptrykt med tilladelse fra ref. [22]. Copyright (2016) Elsevier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 14
Figur 14 : Histogram af MB reduktion spidsværdien af strømmen ved hjælp af forskellige DNA koncentration i 0,1 mol L -1 PBS (pH 7) med en scanning hastighed på 0,1 V s -1 efter 30 min inkubation i 20 µM MB bruger differential pulse voltammetry måling. Genoptrykt med tilladelse fra ref. [22]. Copyright (2016) Elsevier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 15
Figur 15 : En lineær plot af nedsættelsen toppe nuværende MB mod log af forskellige DNA koncentration i 0,1 mol L -1 PBS (pH 7) med en scanning hastighed på 0,1 V s -1 efter 30 min inkubation i 20 µM MB bruger differential pulse voltammetry måling. Genoptrykt med tilladelse fra ref. [22]. Copyright (2016) Elsevier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 16
Figur 16 : Effekt af forskellige hybridisering temperaturer på SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA på 6 måneder af opbevaring interval (n = 3). Målingerne er foretaget i 0,1 mol L-1 PBS (pH 7) med en scanning hastighed på 0,1 V s-1 efter 30 min inkubation i 20 µM MB bruger differential pulse voltammetry måling. Genoptrykt med tilladelse fra ref. [22]. Copyright (2016) Elsevier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 17
Figur 17 : Agarosen gel elektroforese-PCR-amplifikation med 16S rRNA gen sekventering produkter af valgte bakterier fra bakterier kultur. Lane M: 1kb DNA ladder, Lane C−: negativ kontrol (sterilt destilleret vand), Lane C+: positiv kontrol (DNA ekstraheret fra E. coli bruges som skabelon), Lane EF: E. coli O157: H7, Lane CJ: C. jejuni , Lane f.kr.: B. cereus, Lane KP: K. lungebetændelse, Lane ST: S. typhimurium, Lane LM: L. monocytogenes, Lane SE: S. enteritis, Lane VP: V. Vibrio og Lane VV: V. alginolyticus venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 18
Figur 18 : Histogram af MB reduktion spidsværdien af strømmen til krydsreaktivitet undersøgelse af DNA biosensor mod forskellige fødevarebårne patogener i 0,1 mol L -1 PBS (pH 7) med en scanning hastighed på 0,1 V s -1 efter 30 min inkubation i 20 µM MB bruger differential pulse voltammetry måling. Genoptrykt med tilladelse fra ref. [23]. Copyright (2017) Springer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 19
Figur 19 : Agarosen gel elektroforese-PCR forstærkning produkter af V. Vibrio fra friske hjertemuslinger prøver. Lane M: 2ul af 100 bp DNA ladder, Lane 1-3: ubehandlet unspiked prøver, Lane 4-6: behandlet unspiked prøver, Lane 7-9: ubehandlet spidse prøver, Lane 10-12: behandlet spidse prøver, Lane C+: positiv kontrol (V. Vibrio ATCC 17802), Lane C-: negativ kontrol (sterilt destilleret vand). Genoptrykt med tilladelse fra ref. [23]. Copyright (2017) Springer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 20
Figur 20 : Histogram af MB reduktion spidsværdien af strømmen til påvisning af V. parahaemolyticus i friske hjertemuslinger prøver ved hjælp af DNA biosensor i 0,1 mol L-1 PBS (pH 7) med en scanning hastighed på 0,1 V s-1 efter 30 min inkubation i 20 µM MB bruger differential pulse voltammetry måling. Genoptrykt med tilladelse fra ref. [23]. Copyright (2017) Springer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Elektrode sammensætning Inkubationstiden (h) Temperaturen (° C) Vækst medier
Campylobacter jejuni 48 42 BA / BB
Listeria monocytogenes 48 30 TSA / TSB
Salmonella typhimurium 24 37 TSA / TSB
Salmonella enteritidis 24 37 TSA / TSB
Klebsiella lungebetændelse 24 37 EMBA / TSB
Escherichia coli O157: H7 24 37 MA / TSB
Bacillus cereus 24 37 MYPA / TSB
Vibrio alginolyticus 24 37 TSA + 3% NaCl/TSB+3% NaCl
Vibrio parahaemolyticus 24 37 CA/TSA+3% NaCl/TSB+3% NaCl

Tabel 1: Kultur betingelser af valgte bakterier.

Stikprøve Pos. [° 2.] FWHM [° 2.] d-mellemrum [Å] Crystallite størrelse (nm)
PLA-AuNPs 31.682 0.3149 2.8243 27

Tabel 2: Størrelsen af PLA-AuNP crystallites. Adapted med tilladelse fra ref. [30]. Copyright (2016) Sociedade Brasileira de Química.

Modificerede elektrode % RSD (n = 6) Signal reduktion (%) (n = 20)
Repeterbarhed Reproducerbarhed
SPCE/PLA-AuNPs 4,26 4.05 18

Tabel 3: egenskaber af modificerede elektroder vedrørende AuNPs og PLA-AuNPs ændring i K 3 [Fe(CN)6] med 1,0 mmol L -1 koncentration ved en scanning på 0,1 V s -1 . Tilpasset med tilladelse fra ref. [30]. Copyright (2016) Sociedade Brasileira de Química.

Elektrode sammensætning Jegpa (µA) Epa Selektivitet sats (%)
(n = 3) (V)
SPCE/PLA-AuNP/sonde DNA 4,79 ± 0,10 -0.46 -
SPCE/PLA-AuNP/ikke-supplerende DNA 3.25 ± 0,12 -0.44 67.85
SPCE/PLA-AuNP/3-baser uoverensstemmende DNA 1,05 ± 0,11 -0.45 21.92
SPCE/PLA-AuNP/1-base uoverensstemmende DNA 0,94 ± 0,12 -0.46 19.62
SPCE/PLA-AuNP/supplerende DNA 0,73 ± 0,10 -0.45 15,24

Tabel 4: DPV selektivitet MB spidsværdien af strømmen i 0,1 mol L -1 PBS (pH 7) med en scanning hastighed på 0,1 V s -1 efter 30 min inkubation i 20 µM MB

Sammensætning af elektroderne Metode til påvisning Lineære område (M) Detektionsgrænsen (M) Referencer
3D AuNPs DPV 1,5 × 10-6 - 7,0 × 10-9 2.0 × 10-10 69
(+) AuNPs DPV 1,0 × 10-9 - 1,5 × 10-12 2.6 × 10-12 70
AuNPs/GR DPV 1,3 × 10-9 - 2,5 × 10-11 8.3 × 10-12 71
AuNPs-ADH-GSs DPV 5.0 × 10-8 - 3.0 × 10-13  3.0 × 10-13 72
AuNPs-MPTS DPV 5.0 × 10-9 - 1,0 × 10-11  5.0 × 10-11 73
AuNPs – gå DPV 1,0 × 10-9 - 1,0 × 10-14 3,5 × 10-15 74
CoS / AuNPs DPV 1,0 × 10-9 - 1,0 × 10-12 7.0 × 10-13 75
PLA-AuNPs DPV 2.0 × 10-8 - 2.0 × 10-13 5.3 × 10-12 Dette arbejde

Tabel 5: Sammenligning af nogle af de nyligt udviklede elektrokemiske DNA sensorer. Genoptrykt med tilladelse fra ref. [22]. Ophavsret (2016) Elsevier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De kritiske trin i en ramme for en vellykket udvikling af denne type af elektrokemiske biosensor er udvælgelsen af relevante biologiske anerkendelse elementer for transducer (nukleinsyre eller DNA her); kemiske tilgang til at konstruere det sensing lag af transducer; transduktion materiale; optimering af DNA immobilisering og hybridisering; og validering af den udviklede biosensor ved hjælp af rigtige prøver.

Core til en vellykket udvikling af en følsom og selektiv elektrokemiske DNA biosensor, er optimering af immobilisering og hybridisering tilstand. I dette arbejde brugte vi MB som redox komplekse. Der er forskellige principper for MB-DNA interaktioner: (i) af elektrostatiske interaktion MB kationiske beregning med fosfat rygraden anioniske beregning af både ssDNA og dsDNA; (ii) af MB intercalation gennem vellykkede indsættelse af MB mellem skiftevis G-C basepar i dsDNA; (iii) ved kovalente bånd til slutningen af mål-ssDNA, som producerer en lav etiket tæthed (én eller to MB molekyler per DNA strand); og (iv) af MB interaktioner med en ubundet guanin base i ssDNA. Vi anvendte den fjerde princip, som præcist identificerer V. parahaemolyticus fra cross reaktivitet af bakterier og i friske hjertemuslinger. Efter oxidation af særlig interesse var der en stærkere affinitet mellem MB og ssDNA. Hybridisering af ssDNA med dens komplementære sekvens erstatter de agglomererede MB molekyler, og dermed reducerer signalet.

Rækken af eksperimentelle resultater præsenteret ovenfor fokuserer på udvikling af en hurtig metode til påvisning af V. parahaemolyticus med høj selektivitet og følsomhed ved hjælp af principperne om DNA hybridisering. Det første skridt er syntese og karakterisering af polylactic syre-stabiliseret guld nanopartikler (PLA-AuNPs) for ændring af elektrode (tallene 1-6 og tabel 2). Kvaliteten af det guld nanopartikler blev evalueret ved hjælp af Ultraviolet-synlige spektroskopi (UV-Vis), røntgen diffraktion (XRD), felt-emission Scanning elektronmikroskopi (FESEM), transmissions elektronmikroskopi (TEM), cyklisk Voltammetry (CV) og Impedans analyse. Den anden del af udviklingen der er involveret en elektrokemisk Karakteristik af den modificerede elektrode (tal 7-12 og tabel 3-4), som bestemmes en vellykket forbedring af den modificerede elektrode i forhold til den nøgne elektrode i Hvad angår påvisning af hændelsen hybridisering.

Det tredje trin i DNA baseret biosensor udvikling var baseret på optimering af de eksperimentelle betingelser af hændelsen hybridisering og anvendelsen af det udviklede biosensor til påvisning af den faktiske patogen (tal 13-20). Hændelsen hybridisering, som bestemmes påvisning af patogenet succes blev vurderet ved hjælp af differential pulse voltammetry (DPV). Den positive eksistensen af målrettede patogenet var angivet gennem reduktion af nuværende. Følsomheden af de udviklede biosensor blev evalueret gennem opførelse af en kalibrering plot og beregningen af LOD (Figur 15). Den opdigtede biosensor var købedygtig specifikt skelne V. parahaemolyticus fra andre patogener, baseret på de forskellige niveauer af aktuelle reduktion (tal 17 og 18). Evaluering af gennemførligheden af den udviklede biosensor for påvisning af V. parahaemolyticus i faktiske mad prøve præsenteres i tal 19 og 20 og positive eksistensen af den målrettede patogen er indiceret ved reduktion af nuværende . En vellykket udvikling af DNA-baserede biosensorer er stærkt afhængige af DNA sonde udvælgelse, styrkelse af den modificerede elektrode og optimering af de eksperimentelle betingelser. DNA-sonder her er blevet tilpasset fra den tidligere arbejde i Nakano67. Forbedring af modificerede elektroderne var udføres ved hjælp af guld nanopartikler stabiliseret med polylactic syre hen til muliggøre standardiseringen af nanosize. Funktionen guld nanopartikler som electro katalytisk materielle68 og lov til at øge overførselshastigheden af elektronen og også giver en overflade at forankre DNA-sonder. De eksperimentelle parametre var optimeret med hensyn til temperatur og inkubering tid, som er afgørende for DNA til at danne duplex. Hybridisering temperatur påvirker adskillelse mellem uspecifikke adsorption og dette øger selektiviteten af sensoren. Inkubationstiden for hybridisering øger chancerne for duplex dannelsen. Immobilisering procedure skal optimeres for at sørge for DNA-sonder vil være i passende orientering for duplex dannelse til form.

Tabel 5 sammenligner en stikprøve af nyligt udviklede elektrokemiske DNA biosensorer69,70,71,72,73,74,75 ,. DNA-baserede biosensing er en lovende metode til at erstatte Molekylær baseret teknikker, selv om der er et par begrænsninger, der skal løses før metoden kan være transportabel nok for onsite skik. Den største begrænsning er prøve behandling DNA-ekstraktion som renhed og mængden af DNA ekstraheret på webstedet er ikke sandsynligt, at være så god som der udvindes af standard lab-baseret metode. Det er imidlertid en lovende alternativ hvis PCR og gel elektroforese kan erstattes med prøven forbehandling system som mikrofluid.

DNA-baserede biosensorer er potentielt nyttig for mange applikationer, herunder medicinsk diagnostik, miljøovervågning og levnedsmiddelkontrollen. Denne teknik gør det muligt online overvågning af kvalitetskontrol processer samt punkt af pleje overvågning af patienter. Portabilitet af hele sensorsystem vil gøre det muligt for decentraliseringen af diagnostiske processer hvor forbrugeren kan bruge detektionssystemets i komfort i deres hjem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende støtten af Universiti Putra Malaysia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Merck 100056
Chloroform Merck 102445
Diaminoethane tetraacetic acid Promega E5134
Dibasic sodium phosphate  Sigma-Aldrich S9763
Disodium hydrogen phosphate Sigma-Aldrich 255793
Ethanol  Sigma-Aldrich 16368
Gold (III) chloride trihydrate Sigma-Aldrich 520918
Hydrochloric acid Merck 100317
Methylene blue Sigma-Aldrich M44907
Monobasic sodium phosphate, monohydrate Sigma-Aldrich S3522
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P5119
Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D NatureWorks 4042D
Potassium chloride R&M Chemicals 59435
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich P9791
Potassium hexacyanoferrate III R&M Chemicals 208019
Sodium acetate anhydrous salt Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
Trisodium citrate Sigma-Aldrich S1804
Tris(hydroxymethyl) aminomethane Fisher Scientific T395-100
Tris-Base Fisher Scientific BP152-500
2X PCR Master Mix with Dual-Dye Norgen Biotek 28240
Agarose gel Merck 101236
Bolton Agar Merck 100079
Bolton Broth Merck 100079
CHROMagar Vibrio CHROMagar VB910
dNTPs Promega U1511
Nuclease-free water Thermo Scientific R0581
Eosin methylene blue agar  Merck 101347
GelRed Biotium 41001
Glycerol Merck 104092
Go Taq Buffer Promega M7911
Loading dye 100 bp DNA ladder Promega G2101
Loading dye 1kb DNA ladder Promega G5711
Magnesium chloride Promega 91176
Mannitol egg yolk polymyxin agar Merck 105267
McConkey Agar Merck 105465
Nutrient Broth Merck 105443
Taq polymerase Merck 71003
Trypticase Soy Broth Merck 105459
Trypticase Soy Agar Merck 105458

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gould, L. H., Rosenblum, I., Nicholas, D., Phan, Q., Jones, T. F. Contributing factors in restaurant-associated foodborne disease outbreaks, FoodNet sites, 2006 and 2007. Journal of Food Protection. 76, 1824-1828 (2013).
  2. Arvanitoyannis, I. S., Kotsanopoulos, K. V., Papadopoulou, A. Rapid detection of chemical hazards (toxins, dioxins, and PCBs) in seafood. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 54, 1473-1528 (2014).
  3. Robertson, L. J., Sprong, H., Ortega, Y. R., van der Giessen, J. W. B., Fayer, R. Impacts of globalisation on foodborne parasites. Trends in Parasitology. 30, 37-52 (2014).
  4. Sandilands, E. A., Bateman, D. N. The epidemiology of poisoning. Medicine. 44, 76-79 (2016).
  5. Boschi-Pinto, C., Velebit, L., Shibuya, K. Estimating child mortality due to diarrhoea in developing countries. Bulletin of the World Health Organization. 86, 710-717 (2008).
  6. Farthing, M. J. G. Diarrhoea: A Significant Worldwide Problem. International Journal of Antimicrobial Agents. 14, 65-69 (2000).
  7. World Health Organization. WHO estimates of the global burden of foodborne diseases: foodborne disease burden epidemiology reference group 2007-2015. , 1-255 (2015).
  8. Yeung, M., Boor, K. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathogens and Disease. 1, 74-88 (2004).
  9. Sakazaki, R. Foodborne Diseases. Cliver, D. O., Riemann, H. P. , Academic Press. 127-136 (2002).
  10. Grochowsky, J., Odom, S. R., Akuthota, P., Stead, W. Primary Septicemia and Abdominal Compartment Syndrome From Vibrio parahaemolyticus Infection in a 40-Year-Old Patient With No Known Immunocompromise. Infectious Disease in Clinical Practice. 22, (2013).
  11. Raghunath, P. Roles of thermostable direct hemolysin (TDH) and TDH-related hemolysin (TRH) in Vibrio parahaemolyticus. Frontiers in Microbiology. 5, 805 (2014).
  12. Kalburge, S. S., Whitaker, W. B., Boyd, E. F. High-Salt Preadaptation of Vibrio parahaemolyticus Enhances Survival in Response to Lethal Environmental Stresses. Journal of Food Protection. 77, 246-253 (2014).
  13. Esteves, K., Hervio-Heath, D., Mosser, T., Rodier, C., Tournoud, M. G., Jumas-Bilak, E., Colwell, R. R., Monfort, P. Rapid proliferation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, and Vibrio cholerae during freshwater flash floods in French Mediterranean Coastal lagoons. Applied and Environmental Microbiology. 81, 7600-7609 (2015).
  14. Khandeparker, L., Anil, A. C., Naik, S. D., Gaonkar, C. C. Daily variations in pathogenic bacterial populations in a monsoon influenced tropical environment. Marine Pollution Bulletin. 96, 337-343 (2015).
  15. Caburlotto, G., Suffredini, E., Toson, M., Fasolato, L., Antonetti, P., Zambon, M., Manfrin, A. Occurrence and molecular characterization of Vibrio parahaemolyticus in crustaceans commercialised in Venice area, Italy. International Journal of Food Microbiology. 220, 39-49 (2016).
  16. Wong, H. C., Chen, M. C., Liu, S. H., Liu, D. P. Incidence of highly genetically diversified Vibrio parahaemolyticus in seafood imported from Asian countries. International Journal of Food Microbiology. 52, 181-188 (1999).
  17. Rosec, J. P., Causse, V., Cruz, B., Rauzier, J., Carnat, L. The international standard ISO/TS 21872-1 to study the occurence of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae in seafood: ITS improvement by use of a chromogenic medium and PCR. International Journal of Food Microbiology. 157, 189-194 (2012).
  18. Maniyankode, R. A., Kingston, J. J., Murali, H. S., Batra, H. V. Specific identification of vibrio parahaemolyticus employing monoclonal antibody based immunoassay. International Journal of Pharmacy and Biological Sciences. 4 (2), B156-B164 (2013).
  19. Suffredini, E., Lopez-Joven, C., Maddalena, L., Croci, L., Roque, A. Pulsed-field gel electrophoresis and PCR characterization of environmental Vibrio parahaemolyticus strains of different origins. Applied and Environmental Microbiology. 77, 6301-6304 (2011).
  20. Bhattacharyya, N., Hou, A. A pentaplex PCR assay for detection and characterization of Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolyticus isolates. Letters in Applied Microbiology. 57, 233-240 (2013).
  21. da Silva, E. T. S. G., et al. Electrochemical Biosensors in Point-of-Care Devices: Recent Advances and Future Trends. ChemElectroChem. 4 (4), 778-794 (2017).
  22. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. Sensitive detection of multiple pathogens using a single DNA probe. Biosensors and Bioelectronics. 86, 398-405 (2016).
  23. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. A simple, portable, electrochemical biosensor to screen shellfish for Vibrio parahaemolyticus. AMB Express. 7 (1), 41 (2017).
  24. Zhang, J., Li, Z., Zhang, H., Wang, J., Liu, Y., Chen, G. Rapid detection of several foodborne pathogens by F0F1-ATPase molecular motor biosensor. Journal of Microbiological Methods. 93, 37-41 (2013).
  25. Barsan, M. M., Ghica, E. M., Brett, C. M. A. Portable biosensing of food toxicants and environmental pollutants. Nikolelis, D. P., Varzakas , T., Erdem, A., Nikoleli, G. P. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Boca Raton. 33-69 (2014).
  26. Kwun, J., Yun, S., Park, L., Lee, J. H. Development of 1,1'-oxalyldiimidazole chemiluminescent biosensor using the combination of graphene oxide and hairpin aptamer and its application. Talanta. 119, 262-267 (2014).
  27. Thavanathan, J., Huang, N. M., Thong, K. L. Colorimetric biosensing of targeted gene sequence using dual nanoparticle platforms. International Journal of Nanomedicine. 10, 2711-2722 (2015).
  28. Hushiarian, R., Yusof, N. A., Abdullah, A. H., Ahmad, S. A. A., Dutse, S. W. Facilitating the indirect detection of genomic DNA in an electrochemical DNA biosensor using magnetic nanoparticles and DNA ligase. Analytical Chemistry Research. 6, 17-25 (2015).
  29. Dutse, S. W., Yusof, N. A., Ahmad, H., Hussein, M. Z., Zainal, Z., Hushiarian, R., Hajian, R. An Electrochemical Biosensor for the Determination of Ganoderma boninense Pathogen Based on a Novel Modified Gold Nanocomposite Film Electrode. Analytical Letters. 47 (5), 819-832 (2014).
  30. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hajian, R. Characterization of Polylactide-Stabilized Gold Nanoparticles and Its Application in the Fabrication of Electrochemical DNA Biosensors. Journal of the Brazilian Chemical Society. 27 (9), 1679-1686 (2016).
  31. Vongkamjan, K., Wang, S., Moreno Switt, A. I. Rapid detection of foodborne bacterial pathogens in seafood. Handbook of Seafood: Quality and Safety Maintenance and Applications. , 247-257 (2016).
  32. Wang, F., Jiang, L., Yang, Q., Han, F., Chen, S., Pu, S., Vance, A., Ge, B. Prevalence and antimicrobial susceptibility of major foodborne pathogens in imported seafood. Journal of Food Protection. 74 (9), 1451-1461 (2011).
  33. Szermer-Olearnik, B., Sochocka, M., Zwolinska, K., Ciekot, J., Czarny, A., Szydzik, J., Kowalski, K., Boratynski, J. Comparison of microbiological and physicochemical methods for enumeration of microorganisms. Postepy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej. 68, 1392-1396 (2014).
  34. Ivanov, I. G., Bachvarov, D. R. Determination of plasmid copy number by the "boiling" method. Analytical Biochemistry. 165 (1), 137-141 (1987).
  35. Gopireddy, V. R. Biochemical tests for the identification of bacteria. International Journal of Pharmacy and Technology. 3 (4), 1536-1555 (2011).
  36. Böhme, K., Fernández-No, I. C., Pazos, M., Gallardo, J. M., Barros-Velázquez, J., Cañas, B., Calo-Mata, P. Identification and classification of seafood-borne pathogenic and spoilage bacteria: 16S rRNA sequencing versus MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 34 (6), 877-887 (2013).
  37. Seoudi, R., Fouda, A. A., Elmenshawy, D. A. Synthesis, characterization and vibrational spectroscopic studies of different particle size of gold nanoparticle capped with polyvinylpyrrolidone. Physica B: Condensed Matter. 405, 906-911 (2010).
  38. Mishra, A., Harper, S., Yun, S. I. Interaction of biosynthesized gold nanoparticles with genomic DNA isolated from E. coli and S. aureus. Nanotechnology (IEEE-NANO). , 1745-1750 (2011).
  39. Sugimoto, T. Formation of modoispersed nano- and micro-particles controlled in size, shape, and internal structure. Chemical Engineering and Technology. 26, 313-321 (2003).
  40. Rath, C., Sahu, K. K., Kulkarni, S. D., Anand, S., Date, S. K., Das, R. P., Mishra, N. C. Microstructure-dependent coercivity in monodispersed hematite particles. Applied Physics Letters. 75, 4171-4173 (1999).
  41. Abbas, M., Wu, Z. Y., Zhong, J., Ibrahim, K., Fiori, A., Orlanducci, S., Sessa, V., Terranova, M. L., Davoli, I. X-ray absorption and photoelectron spectroscopy studies on graphite and single-walled carbon nanotubes: Oxygen effect. Applied Physics Letters. 87 (5), 051923 (2005).
  42. Lim, S. C., Choi, Y. C., Jeong, H. J., Shin, Y. M., An, K. H., Bae, D. J., Lee, Y. H., Lee, N. S., Kim, J. M. Effect of gas exposure on field emission properties of carbon nanotubes arrays. Advanced Materials. 13, 1563-1567 (2001).
  43. Kim, B. H., Kim, B. R., Seo, Y. G. A study on adsorption equilibrium for oxygen and nitrogen into carbon nanotubes. Adsorption. 11, 207-212 (2005).
  44. Bard, A. J., Faulkner, L. R. Electrochemical methods: Fundamentals and applications. , John Wiley & Sons Inc. (2000).
  45. Tan, Q., Wang, L., Ma, L., Yu, H., Ding, J., Liu, Q., Xiao, A., Ren, G. Study on anion electrochemical recognition based on a novel ferrocenyl compound with multiple binding sites. Journal of Physical Chemistry B. 112, 11171-11176 (2008).
  46. Manivannan, S., Ramaraj, R. Polymer-embedded gold and gold/silver nanoparticle-modified electrodes and their applications in catalysis and sensors. Pure and Applied Chemistry. 83, 2041-2053 (2011).
  47. Benali, O., Larabi, L., Traisnel, M., Gengembre, L., Hareka, Y. Electrochemical, theoretical and XPS studies of 2-mercapto-1-methylimidazole adsorption on carbon steel in 1 M HClO4. Applied Surface Science. 253, 6130-6139 (2007).
  48. Shi, Y., Wen, L., Li, F., Cheng, H. M. Nanosized Li4Ti5O12/graphene hybrid materials with low polarization for high rate lithium ion batteries. Journal of Power Sources. 196, 8610-8617 (2011).
  49. Bentiss, F., Traisnel, M., Lagrenee, M. The substituted 1,3,4-oxadiazoles: a new class of corrosion inhibitors of mild steel in acidic media. Corrosion Science. 42, 127-146 (2000).
  50. Wang, M., Gong, W., Meng, Q., Zhang, Y. Electrochemical DNA impedance biosensor for the detection of DNA hybridization with polymeric film, single walled carbon nanotubes modified glassy carbon electrode. Russian Journal of Electrochemistry. 47, 1368-1373 (2011).
  51. Herdt, A. R., Drawz, S. M., Kang, Y., Taton, T. A. DNA dissociation and degradation at gold nanoparticle surfaces. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 51 (2), 130-139 (2006).
  52. Bhatt, N., Huang, P. J. J., Dave, N., Liu, J. Dissociation and degradation of thiol-modified DNA on gold nanoparticles in aqueous and organic solvents. Langmuir. 27, 6132-6137 (2011).
  53. Liu, X., Jang, C. H., Zheng, F., Jürgensen, A., Denlinger, J. D., Dickson, K. A., Raines, R. T., Abbott, N. L., Himpsel, F. J. Characterization of protein immobilisation at silver surfaces by near edge X-ray absorption fine structure spectroscopy. Langmuir. 22, 7719-7725 (2006).
  54. Willey, T. M., Andrew, L., Vance, T., Buuren, V., Bostedt, C., Terminello, L. J., Fadley, C. S. Rapid degradation of alkanethiol-based self-assembled monolayers on gold in ambient laboratory conditions. Surface Science. 576 (1), 188-196 (2005).
  55. Farjami, E., Clima, L., Gothelf, K., Ferapontova, E. E. DNA interactions with a Methylene Blue redox indicator depend on the DNA length and are sequence specific. Analyst. 135, 1443-1448 (2010).
  56. Lin, X., Ni, Y., Kokot, S. An electrochemical DNA-sensor developed with the use of methylene blue as a redox indicator for the detection of DNA damage induced by endocrine-disrupting compounds. Analytica Chimica Acta. 867, 29-37 (2015).
  57. Zhang, F. T., Nie, J., Zhang, D. W., Chen, J. T., Zhou, Y. L., Zhang, X. X. Methylene Blue as a G-Quadruplex Binding Probe for Label-Free Homogeneous Electrochemical Biosensing. Analytical Chemistry. 86, 9489-9495 (2014).
  58. Ning, L., Li, X., Yang, D., Miao, P., Ye, Z., Li, G. Measurement of Intracellular pH Changes Based on DNA-Templated Capsid Protein Nanotubes. Analytical Chemistry. 86, 8042-8047 (2014).
  59. Sani, N. D. M., Heng, L. Y., Surif, S., Lazim, A. M., et al. AIP Conference Proceedings. Murad, A., et al. 1571, 636-640 (2013).
  60. Xu, P., Wang, J., Xu, Y., Chu, H., Shen, H., Zhang, D., Zhao, M., Liu, J., Li, G. Binding modes and interaction mechanism between different base pairs and methylene blue trihydrate: a quantum mechanics study. Advances in Experimental Medicine and Biology. 827, 187-203 (2015).
  61. Guo, Y., Chen, J., Chen, G. A label-free electrochemical biosensor for detection of HIV related gene based on interaction between DNA and protein. Sensors & Actuators, B: Chemical. 184, 113-117 (2013).
  62. Huang, K. J., Liu, Y. J., Wang, H. B., Wang, Y. Y., Liu, Y. M. Sub-femtomolar DNA detection based on layered molybdenum disulfide/multi-walled carbon nanotube composites, au nanoparticle and enzyme multiple signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 55, 195-202 (2014).
  63. Kong, R. M., Song, Z. L., Meng, H. M., Zhang, X. B., Shen, G. L., Yu, R. Q. A label-free electrochemical biosensor for highly sensitive and selective detection of DNA via a dual-amplified strategy. Biosensors and Bioelectronics. 54, 442-447 (2014).
  64. Rashid, J. I. A., Yusof, N. A., Abdullah, J., Hashim, U., Hajian, R. Novel Disposable Biosensor Based on SiNWs/AuNPs Modified-Screen Printed Electrode for Dengue Virus DNA Oligomer Detection. IEEE Sensors Journal. 15, 4420-4421 (2015).
  65. Yingkajorn, M., Sermwitayawong, N., Palittapongarnpimp, P., Nishibuchi, M., Robins, W. P., Mekalanos, J. J., Vuddhakul, V. Vibrio parahaemolyticus and its specific bacteriophages as an indicator in cockles (Anadara granosa) for the risk of V. parahaemolyticus infection in Southern Thailand. Microbial Ecology. 67, 849-856 (2014).
  66. Ahmad Ganaie, H., Ali, M. N. Short term protocol for the isolation and purification of DNA for molecular analysis. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research. 24, 266-270 (2014).
  67. Nakano, K., Kimura, T., Kitamura, Y., Ihara, T., Ishimatsu, R., Imato, T. Potentiometric DNA sensing platform using redox-active DNA probe pair for sandwich-type dual hybridization at indicator electrode surface. Journal of Electroanalytical Chemistry. 720-721, 71-75 (2014).
  68. Yang, J., Jim Yang, L., Heng-Phon, T., Gan-Moog, C. Inhibition of DNA hybridization by small metal nanoparticles. Biophysical Chemistry. 120, 87-95 (2006).
  69. Niu, L. M., Liu, F., Wang, W., Lian, K. Q., Ma, L., Shi, H. M., Kang, W. J. Electrochemical Behavior of Paraquat on a Highly Ordered Biosensor Based on an Unmodified DNA-3D Gold Nanoparticle Composite and Its Application. Electrochimica Acta. 153, 190-199 (2015).
  70. Li, Z., Miao, X., Xing, K., Zhu, A., Ling, L. Enhanced electrochemical recognition of double-stranded DNA by using hybridization chain reaction and positively charged gold nanoparticles. Biosensors and Bioelectronics. 74, 687-690 (2015).
  71. Niu, S., Sun, J., Nan, C., Lin, J. Sensitive DNA biosensor improved by 1,10-phenanthroline cobalt complex as indicator based on the electrode modified by gold nanoparticles and graphene. Sensors and Actuators B: Chemical. 176, 58-63 (2013).
  72. Yi, H., Xu, W., Yuan, Y., Bai, L., Wu, Y., Chai, Y., Yuan, R. A pseudo triple-enzyme cascade amplified aptasensor for thrombin detection based on hemin/G-quadruplex as signal label. Biosensors and Bioelectronics. 54, 415-420 (2014).
  73. Das, R., Sharma, M. K., Rao, V. K., Bhattacharya, B. K., Garg, I., Venkatesh, V., Upadhyay, S. An electrochemical genosensor for Salmonella typhi on gold nanoparticles-mercaptosilane modified screen printed electrode. Journal of Biotechnology. 188, 9-16 (2014).
  74. Han, X., Fang, X., Shi, A., Wang, J., Zhang, Y. An electrochemical DNA biosensor based on gold nanorods decorated graphene oxide sheets for sensing platform. Analytical Biochemistry. 443 (2), 117-123 (2013).
  75. Huang, K. J., Liu, Y. J., Zhang, J. Z., Cao, J. T., Liu, Y. M. Aptamer/Au nanoparticles/cobalt sulfide nanosheets biosensor for 17β-estradiol detection using a guanine-rich complementary DNA sequence for signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 67, 184-191 (2015).

Tags

Bioteknologi sag 136 Polylactic syre-stabiliseret guld nanopartikler skærm-trykt carbon elektrode DNA biosensor Vibrio parahaemolyticus elektrokemisk sensor DNA hybridisering
Udvikling af en elektrokemisk DNA Biosensor at opdage en fødevarebårne patogenet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nordin, N., Yusof, N. A., Radu, S.,… More

Nordin, N., Yusof, N. A., Radu, S., Hushiarian, R. Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen. J. Vis. Exp. (136), e56585, doi:10.3791/56585 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter