Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Ontwikkeling van een elektrochemische DNA Biosensor te detecteren een Foodborne Pathogen

Published: June 3, 2018 doi: 10.3791/56585
Automatic Translation
1, 2,3, 1, 4
1Laboratory of Food Safety and Food Integrity, Institute of Tropical Agriculture and Food Security, Universiti Putra Malaysia, 2Laboratory of Functional Device, Institute of Advanced Technology, Universiti Putra Malaysia, 3Department of Chemistry, Faculty of Science, Universiti Putra Malaysia, 4La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University

Summary

Een protocol voor de ontwikkeling van een elektrochemische DNA biosensor bestaat uit een polylactic acid-gestabiliseerde, gouden nanodeeltjes gemodificeerde, gezeefdrukt koolstof elektrode voor het detecteren van Vibrio parahaemolyticus wordt gepresenteerd.

Abstract

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is een gemeenschappelijk foodborne ziekteverwekker die aan een groot aantal problemen voor de volksgezondheid wereldwijd bijdraagt, aanzienlijke invloed zijn op het tempo van de menselijke mortaliteit en morbiditeit. Conventionele methodes voor het opsporen van V. parahaemolyticus zoals cultuur gebaseerde methoden, immunologische testen en moleculaire gebaseerde methoden vereisen ingewikkeld monster behandeling en zijn duur, tijdrovend en vervelend. Onlangs, biosensoren hebben bewezen een veelbelovende en uitgebreide detectiemethode met de voordelen van snelle detectie, kosteneffectiviteit en bruikbaarheid. Dit onderzoek richt zich op het ontwikkelen van een snelle methode voor het opsporen van V. parahaemolyticus met hoge selectiviteit en gevoeligheid op basis van de beginselen van DNA hybridisatie. In het werk, werd karakterisering van gesynthetiseerde polylactic acid-gestabiliseerde gouden nanodeeltjes (PLA-AuNPs) bereikt met behulp van röntgendiffractie (XRD), UV-zichtbaar-spectroscopie (UV-Vis), transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), veld-emissie Scanning elektronen microscopie (FESEM), en cyclische voltammetrie (CV). Ook voerden we verder testen van stabiliteit, gevoeligheid en reproduceerbaarheid van de PLA-AuNPs. We vonden dat de PLA-AuNPs een degelijke structuur van gestabiliseerde nanodeeltjes in waterige oplossing gevormd. We hebben ook vastgesteld dat de gevoeligheid verbeterd als gevolg van de kleinere gratis overdracht (Rct) weerstandswaarde en een toename van actieve oppervlakte (0.41 cm2). De ontwikkeling van onze DNA biosensor was gebaseerd op de wijziging van een gezeefdrukt koolstof-elektrode (SPCE) met PLA-AuNPs en het gebruik van methyleenblauw (MB) als de redox-indicator. Wij beoordeeld vinden de gebeurtenissen immobilisatie en kruising door differential pulse voltammetrie (DPV). Vonden we dat aanvullende, niet-complementaire en niet-overeenkomende oligonucleotides werden specifiek onderscheiden door de verzonnen biosensor. Het bleek ook betrouwbaar gevoelige detectie in Kruisallergie studies tegen verschillende voedsel overgedragen ziekteverwekkers en de identificatie van de V. parahaemolyticus in verse kokkels.

Introduction

Een belangrijk onderwerp van openbare en wetenschappelijke debat in de afgelopen jaren, voedselvergiftiging is vooral geassocieerd met 3 agenten: micro-organismen1, chemische stoffen2en3van de parasieten. Besmet voedsel kan ernstige gezondheidsproblemen veroorzaken bij de mens, vooral in de hogere risicogroep voor mensen met een zwak immuunsysteem, ouderen, zwangere vrouwen, baby's en jonge kinderen4. Met meer dan een miljoen gevallen van acute diarree zich jaarlijks bij kinderen jonger dan 5 jaar in Afrika, Azië en Latijns-Amerika, voedselvergiftiging is een belangrijke wereldwijde ziekte5,6 en de World Health Organization heeft vastgesteld micro-organismen als de belangrijkste contribuant7. Vibrio parahaemolyticus onderscheidt zich onder de meest bekende virulente stammen. Meestal gevonden in kustgebieden, estuariene en mariene omgevingen8, is het een gram-negatieve bacterie, die actief zijn in hoge zout omgevingen wordt, en veroorzaakt ernstige menselijke gastro-enteritis toen gegeten in onvoldoende gekookt, onjuist afgehandelde of rauw marine producten-9. Zorg bovendien voor bestaande medische aandoeningen bij sommige mensen hen vatbaar voor infectie, sepsis of oor infecties die voortvloeien uit de V. parahaemolyticus10wond. De virulentiefactoren van V. parahaemolyticus hemolysine zijn onderverdeeld in twee soorten die tot de pathogenese van de ziekte bijdragen: thermostable directe hemolysine (TDH) gecodeerd door tdh genen en TDH-gerelateerde hemolysine gecodeerd door trh genen11. De markers (tdh en trh genen) van de virulentie van de V. parahaemolyticus zijn voornamelijk gevonden in klinische monsters in plaats van milieu exemplaren.

V. parahaemolyticus bezit het vermogen om te overleven onder een brede waaier van voorwaarden, snel reageren op veranderingen in het milieu12. Het mechanisme voor proliferatie escaleert zijn potentieel gevaar naarmate de toxiciteit in parallel met cel massa13toeneemt. Erger nog, klimaatverandering is het verstrekken van deze bacteriën met voldoende voorwaarden om te versnellen hun cel bevolking groei14. Als gevolg van de hoge frequentie moet V. parahaemolyticus worden gecontroleerd langs de levensmiddelenketen, met name in de handels- en productie van zeevruchten omdat deze producten waar ze worden aangetroffen in enorme hoeveelheden15,16 over de hele wereld. Op dit moment de bacteriën worden geïdentificeerd en geïsoleerd met behulp van een aantal methoden, met inbegrip van biochemische tests, verrijking en selectieve media17, enzyme-linked immunomagnetic sorptiemiddel assay (ELISA)18, pulse-field gelelektroforese (PFGE) 19, latex agglutinatietests en polymerase kettingreactie (PCR) tests20. Deze methoden vereisen meestal gekwalificeerd personeel, geavanceerde instrumenten en moeizame technieken die geen informatie over verontreiniging onmiddellijk geven. Dit beperkt ernstig de kans op schadelijke verontreiniging en on-site toepassingen onmiddellijk te detecteren. Snelle detectieprogramma's blijven een belangrijke uitdaging is.

Biosensing is in opkomst als een veelbelovende optie voor de detectie van door voedsel overgedragen ziekteverwekkers omdat het biedt u een tijdbesparende, rendabele, praktische en real-time analyse methode21,22,23,24 . Al zijn er veel positieve resultaten voor de detectie van de analyt in verrijkte monsters en standaardoplossing met behulp van biosensoren, is er echter nog steeds een gebrek aan onderzoek toegepast op echte monsters in waterige mengsels of organische extracten25. Onlangs, elektrochemische biosensoren met behulp van directe en/of indirecte deoxyribonucleic acid (DNA) detectie verhoogde aandacht onder wetenschappers, als gevolg van hun specifieke detectie van de complementaire doelstelling via een kruising gebeurtenis26 hebben gekregen , 27 , 28 , 29. deze unieke benaderingen zijn stabieler in vergelijking met enzym gebaseerde biosensoren, waardoor een veelbelovende technologie voor miniaturisatie en commercialisering. Het doel van de studie gemeld hier is voor de bouw van een snel hulpmiddel dat V. parahaemolyticus met hoge selectiviteit, gevoeligheid en bruikbaarheid detecteren kan, gebaseerd op de DNA sequentie specificiteit tijdens hybridisatie. Identificatie strategieën betrekking hebben op de combinatie van polylactic acid-gestabiliseerde gouden nanodeeltjes (PLA-AuNPs)30 en gezeefdrukt Koolelektroden (SPCEs) in aanwezigheid van de kruising indicator, methyleenblauw (MB). Het potentieel van de ontwikkelde detectie constructie wordt verder onderzocht met behulp van bacteriën DNA lysate en verse kokkel monsters.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: Alle chemische en biochemische reagentia moeten worden gebruikt moeten worden van p.a. en gebruikt zonder verdere zuivering. Alle oplossingen met behulp van steriel gedeïoniseerd water voor te bereiden. Autoclaaf alle glaswerk vóór sterilisatie.

Let op: Gebruik alle passende veiligheidspraktijken bij het uitvoeren van laboratoriumactiviteiten met inbegrip van het gebruik van technische controles (zuurkast ' glovebox ') en persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, volledige lengte broek, gesloten-teen schoenen).

1. fabricage en karakterisering van bewerkt elektrode met behulp van PLA-AuNPs

  1. Bereiding en karakterisatie van PLA-AuNPs
    1. Snel toevoegen van 10 mL Natriumcitraat oplossing (38.8 mM) tot 100 mL kokend waterige chloroauric zure oplossing (1 mM) en afkoelen tot omgevingstemperatuur. Observeer de veranderingen in kleur in de bereide oplossing van de AuNPs die als geel, wijzigingen in zwartachtig begint en eindigt uiteindelijk als donker Robijnrood.
    2. Plaats de PLA-pellets in een mal van roestvrij staal voor het smeltproces en verwarm ze bij een temperatuur van 190 ° C gedurende 10 minuten volgen met de dringende procedure: leg ze onder een druk van 2,2 MPa voor 1 min als onderdeel van de voorbereiding van PLA blad. Het PLA blad zal zijn klaar voor gebruik na afkoelen voor ongeveer 3 h.
    3. Krachtig roeren, Los 0.68 mg PLA bladen in 5 mL chloroform bij kamertemperatuur. Meng de opgeloste PLA met 10 mL van de oplossing AuNPs eerder bereid en roer het homogeen bij kamertemperatuur. De homogene mengsels kunnen vervolgens worden aangeduid als PLA-AuNPs en gekenmerkt met behulp van UV-Vis, XRD, TEM en FESEM met EDX.
  2. Bereiding en karakterisatie van gemodificeerde gezeefdrukt koolstof elektrode
    Opmerking: Het SPCE gebruikt in deze studie omvat een drie-elektrode-systeem: een teller-elektrode, een koolstof werken elektrode en een Ag/AgCl-elektrode.
    1. Pipetteer 25 µL van de homogene oplossing van PLA-AuNPs op de SPCE en vervolgens de lucht droog het snel voor 24 h vóór gebruik.
    2. Elektrochemisch karakteriseren de gemodificeerde elektroden, SPCE/PLA-AuNPs, in ferro kaliumcyanide (K3[Fe(CN)6]3 -/4 -) voor het meten van de werkzame oppervlakte, elektrochemische impedantie spectroscopie, herhaalbaarheid, reproduceerbaarheid, en stabiliteit30.

2. ontwikkeling van de elektrochemische DNA Biosensor

  1. Sonde voorbereiding
    Opmerking: De sequenties van de ssDNA sonde en cDNA werden gekozen op basis van informatie van het National Center for biotechnologie informatie (NCBI) database.
    1. Aankoop synthetische oligonucleotides (20-mer ssDNA sonde, 20-mer cDNA 20-mer mismatched DNA en 21-mer niet-cDNA) als gelyofiliseerd poeder uit commerciële laboratoria, op basis van de volgende reeks:
      thiolated ssDNA sonde: 5 ' - / 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3 '
      cDNA: 5 ' - CAGTGCTTCTGCATAATCCG - 3 '
      één-base niet-overeenkomende DNA: 5 ' - CAGTGCTTCTGC-ṪTAATCCG - 3 '
      drie-base niet-overeenkomende DNA: 5 ' - CAGTGCTTCT-Ċ-ṪṪTAATCCG - 3 '
      niet-cDNA: 5 ' - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA - 3 '
    2. Bereiden van stamoplossingen van alle oligonucleotides (100 µM) met behulp van een steriele TE oplossing (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) in analytische gedeelten is gesplitst. Houd dit in-4 ° C en breng de juiste verdunningen enkel voorafgaand aan het gebruiken.
  2. Optimalisatie van immobilisatie en kruising
    Opmerking: Een SPCE gewijzigd met PLA-AuNPs, aangeduid als SPCE/PLA-AuNPs, werd gebruikt voor deze studie en een druppel gieten methode werd gebruikt voor de DNA immobilisatie en kruising.
    1. Ten eerste het immobiliseren van 25 µL van thiolated sonde van de ssDNA op de SPCE/PLA-AuNPs en dan lucht droog het gedurende 24 uur bij kamertemperatuur, waarna het zal worden ten slotte aangeduid als SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA. Optimalisatie van de immobilisatie conditie bepalen met behulp van drie factoren: de concentratie van ssDNA (variërend van 0.2 tot 1.4 µM), tijd (variërend van 30 tot 210 min.) en temperatuur (variërend van 25 tot 75 ° C).
    2. Pipetteer 25 µL van het cDNA op het oppervlak van SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA voor het uitvoeren van de kruising gebeurtenis, waarna het kan worden ten slotte aangeduid als SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA. Optimalisatie van de conditie van de kruising via de twee factoren van tijd (variërend van 5 tot 30 min) en temperatuur (variërend van 25 tot 75 ° C) te bepalen.
    3. Dompel de geïmmobiliseerdet en gehybridiseerde elektroden in 20 µM MB voor 30 min. het niet-specifiek geadsorbeerde DNA en overtollige MB verwijderen door te wassen met 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4.5) en dan spoelen met gedeïoniseerd water. Maatregel de huidige piek van MB reductie met behulp van DPV techniek. Uitvoeren van de meting van de DPV met 0,1 M PBS (pH 7) met geen indicator.
  3. Karakterisering van de gefabriceerde DNA biosensor
    1. Dompel de SPCE/PLA-AuNPs in 20 µM MB voor 30 min, wassen met 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4.5) en spoel na met gedeïoniseerd water voorafgaand aan meten. Volg een soortgelijke procedure voor alle interacties met inbegrip van de sonde DNA, cDNA niet-overeenkomende DNA en niet-complementaire DNA-monsters.
    2. Meet de elektrochemische vermindering.
      Opmerking: We gemeten met behulp van een commercieel vervaardigde Autolab met interfacesoftware DPV.
      De DPV metingen van de MB elektrochemische vermindering uitgevoerd op een potentieel variërend van -0,5 V tot 0,25 V, met een mogelijke stap van 0.005 V, modulatie amplitude van 0,05 V, en een scanfrequentie van 7.73 mVs-1 in 0,1 M PBS (pH 7), waarin geen indicator. De selectiviteit, de gevoeligheid, de reproduceerbaarheid, en de stabiliteit van de warmte van de gefabriceerde DNA biosensor werden verder bestudeerd. Gerapporteerde resultaten werden gepresenteerd als gemiddelde waarde metingen in drie wordt gerepliceerd.

3. bevestiging van de gefabriceerde DNA Biosensor met behulp van echte monsters

  1. Voorbereiding van de bacteriestammen
    1. Selecteer bacteriële monsters op basis van hun significante besmetting van zeevruchten31,32 .
      Opmerking: V. parahaemolyticus als referentie spanningen en 8 andere bacteriestammen (Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella longontsteking, Escherichia coli O157:H7, Bacillus cereus, en Vibrio alginolyticus) van de gemeenschappelijke foodborne pathogen werkten voor de elektrochemische DNA biosensor validatie in deze studie.
    2. Voeren een routine subcultuur van bacteriestammen op hun respectieve agar elke twee weken te handhaven hun levensvatbaarheid, Zie tabel 1 voor cultuuromstandigheden.
    3. Behoud op lange termijn van de bacteriestammen in hun respectieve groeiende bouillon met 20% (v/v) glycerol bij-80 ° C als glycerol bacteriën beschermt door te voorkomen dat de vorming van ijskristallen die hen tijdens het vriesproces beschadigen kunnen handhaven. Inoculeer vervolgens een lus van bewaarde bacteriële celcultuur in glycerol voorraden in de respectieve Bouillon. Incubeer de Bouillon volgens hun respectieve groei tijd- en temperatuurdisplays wanneer nodig te doen herleven van de bacteriën.
    4. Bepaalt de hoeveelheid V. parahaemolyticus cellen met behulp van een verspreiding plaat techniek33, een standaard en een bekende methode voor het opsommen van micro-organismen afkomstig van een reeks verdunningen.
      1. Cultuur V. parahaemolyticus in Trypticase soja Bouillon (TSB + 3% NaCl) bij 37 ° C in een 140-rpm schudden voorwaarde. Breng vervolgens 1 mL van de cultuur van de cel van de bacteriën in 9 mL TSB + 3% NaCl te verkrijgen van de verdunningsfactor van een 10-1 .
    5. Herhaal deze stap negen keer om een volledige serie van maximaal 10-10 verdunningsfactor. Vervolgens verspreid 0,1 mL van elk verdunningsfactor (vanaf 10-1 tot 10-10) op een Vibrio van selectieve agarplaat kolonie tellen, respectievelijk. Incubeer de platen geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 24 uur.
    6. Gebruik een Kolonieteller tellen van afzonderlijke kolonies en vervolgens terug-Bereken (graaf het CFU/afgepipetteerde bedrag x verdunningsfactor) om een kolonie-vormende eenheid per milliliter dichtheid (CFU mL-1). De concentratie van de kolonievormende eenheden (CFUs) in de cel suspensies van de bacteriën uit de plot van de kalibratie van CFU mL-1 tegen extinctie ontlenen.
  2. Voorbereiding van de PCR-test
    1. Uittreksel genomic DNA na een gewijzigde lysis procedure34gekookt. Eerste, streep een individuele bacteriële stam op agarmedia en het enten in Bouillon media, gevolgd door het aan het broeden op de relatieve groei voorwaarde, een 140 rpm schudden voorwaarde.
    2. Pipetteer een cultuur van 1 mL Bouillon in een micro centrifugebuis. Centrifugeer dit bij 4830 x g- en 4 ° C voor 1 min te verkrijgen van de pellets. Ongeveer 500 µL van steriele buffer TE gebruiken voor resuspensie met de pellet. Houd de resulterende schorsing gedurende 10 minuten bij 98 ± 2 ° C in een blok van de verwarming en onmiddellijk het koelen bij-18 ° C gedurende 10 min te lyse de cellen en de vrijgave van het DNA.
    3. Centrifugeer het genomic DNA bij 4830 x g- en 4 ° C gedurende 3 minuten aan een duidelijke schorsing verkrijgen en houden van het supernatant bij-20 ° C voor verder gebruik. Gebruik een biophotometer meting met UV-absorptie bij een golflengte van 260 nm (zoals nucleïnezuren absorberen van de golflengte van het licht) en ook bij een golflengte van 280 nm (als de eiwitten het absorberen van de golflengte van het licht) om te bepalen van de concentratie en zuiverheid van de geëxtraheerde genomic DNA en vervolgens identificeren alle stammen met behulp van standaard biochemische tests35 en controleren door 16S rRNA gen sequencing36. Ten slotte, denatureren van de genomic DNA op 92 ° C gedurende 2 minuten en snel afkoelen in ijswater alvorens tot de biosensor.
    4. Verder bevestigen de aanwezigheid V. parahaemolyticus met behulp van PCR te richten op het toxR-gen. Deze procedure uitvoeren in een thermocycler met behulp van een primer (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' en 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3'). Optimaliseren van de PCR versterking in een volume van de totale reactie van 25 µL bestaande uit steriel water (15,5 µL), buffer (5 µL) primer (1 µL, 10 µM), dNTP mix (1 µL), DNA sjabloon (2 µL) en polymerase van DNA Taq (0.2 µL, 10 x).
    5. Goed mengen van de componenten en de PCR versterking voor de doel-sequence in een thermocycler geprogrammeerd voor 30 cycli van versterking te regelen. In onze studie, bestond elke cyclus van drie-stap reacties dwz., eerste denaturatie (94 ° C, 3 min) gevolgd door 30 cycli van denaturatie (94 ° C, 1 min.), gloeien (63 ° C, 1.5 min) en extensie (72 ° C, 1.5 min), gevolgd door definitieve extensie (72 ° C, 7 min).
    6. Bepaal de versterkte producten en hun grootte via elektroforese op 1,5% agarose gel. Het vastleggen van de beelden van de gel met een commercieel geproduceerde gel-documentatie systeem.
  3. Bereiding van de monsters van de kokkel
    1. Verse monsters krijgen.
      Opmerking: Onze verse kokkels (Anadara granosa) werden verkregen uit de natte markt Serdang, Selangor, en snel gebracht naar het laboratorium in een koelere koelbox voor analyse. Verdeel de monsters in 2 groepen, namelijk de behandelde en onbehandelde groep, ervan uitgaande dat de kokkels gelijkmatig zijn geoogst vanaf het begin van de oogst tot het plaatsen van hen in koude opslag.
    2. Pre-Treat kokkels in de behandelde groep door deze te slaan bij-20 ° C gedurende 24 uur, gevolgd door de blootstelling aan UV-licht bij 20 ° C gedurende 4 uur voorafgaand aan DNA-extractie.
      Opmerking: De vriestemperatuur en UV-blootstelling gebruikt voor de gecontroleerde groep doodt of op zijn minst beperkt de natuurlijk accumuleren V. parahaemolyticus in de kokkels. Niet van toepassing een hogere regime van pasteurisatie van 70 ° C, aangezien het doel van de gecontroleerde voorwaarde in deze studie is om na te bootsen de werkelijke situatie van de verse kokkels. Ondertussen, analyseren monsters rechtstreeks vanuit de onbehandelde groep zonder enige voorbehandeling zodra ze in het laboratorium aankomen.
    3. Subcultuur een stam van V. parahaemolyticus ATCC 17802 in TSB (3% NaCl). Bepalen van het aantal levensvatbare cellen in het entmateriaal via beplating van passende verdunningen van TSB (3% NaCl) op Certificeringsinstantie om het verkrijgen van een entmateriaal van 104 CFU mL-1 van V. parahaemolyticus. Elke kokkel in gedistilleerd water wassen en schrobben het vrij zijn van vuil voordat u steriel pincet in een laminaire flow kabinet om de weefsels van de shell.
    4. Meng ongeveer 10 g kokkel weefselsteekproeven met een homogenizer in 90 mL steriele TSB (3% NaCl) voor 60 s. toevoegen een bekende hoeveelheid V. parahaemolyticus tot 9 mL van de Bouillon gehomogeniseerde monster voor de verrijkte monsters. Gebruik de unspiked monsters als een negatieve controle. Schatten van de graven van de cel van de V. parahaemolyticus spiked op de kokkel monsters door plating 0,1 mL van de monsters op CA, en vervolgens 1 mL van de monsters in een microcentrifuge buis voor DNA pipetteren proef extractie, moeten worden gebruikt voor de biosensor en PCR assay.
    5. Pak de genomic DNA van de V. parahaemolyticus uit de monsters van het puntige en unspiked na een gewijzigde lysis procedure36gekookt. Tot slot, het bepalen van de DNA-concentratie en zuiverheid een bio fotometer meting met UV-absorptie bij een golflengte van 260 nm (zoals nucleïnezuren absorberen van de golflengte van het licht) en ook bij een golflengte van 280 nm (als de eiwitten het absorberen van de golflengte van het licht).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vorming van AuNPs werd geopenbaard door de verandering in de kleur van de waterige oplossing met Natriumcitraat aanwezig. Dit veroorzaakt de kleur overstappen van licht geel op een diep Robijnrood. De generatie van PLA-AuNPs werd bevestigd van de UV-vis-spectra (Figuur 1), waar de groei van de oppervlakte plasmon resonantie (SPR) piek werd aangetroffen bij ongeveer 540 nm. De oprichting en het bestaan van PLA-AuNPs werd aangegeven op de 500-600 nm golflengte varieert, afhankelijk van het deeltje grootte37. De XRD patronen van AuNPs en PLA-AuNPs zijn afgebeeld in Figuur 2. Alle crystallite pieken werden waargenomen bij de 2θ van 31,7, 38,2 44,4, 64,7 en 77.7°. Ze werden toegeschreven aan de (100) (111) (200) (220), en (311) kristallografische vliegtuigen van cubic-FCC (gezicht-gecentreerde cubic) goud (metaal) nanostructuren (JCPDS bestand no.-00-004-0783). De PLA-AuNPs crystallite piek intensiteiten wordt ook verhoogd als een bredere diffractie piek gecentreerd op 31.7°, hetgeen impliceert dat de AuNPs werden ingesloten in de PLA en de vorming van polyfasische gouden nanostructuren38suggereren. Bovendien, alle AuNP diffractie pieken getoond op de PLA-AuNPs aangegeven dat de AuNPs had een stabiele structuur. De gemiddelde omvang van PLA-AuNPs werd berekend met behulp van Scherrer vergelijking (L = kλ/βcosθ), door het bepalen van de breedte van de (100) Bragg reflectie. Van de FWHM en d-spacing (tabel 2), de grootte van de crystallite van PLA-AuNPs werd berekend door 27 nm.

De afmetingen van de PLA-AuNPs en zijn morfologie werden verder onderzocht met behulp van TEM. Van de TEM deeltje verdelingskromme en beelden van PLA-AuNPs, werd het gezien dat gouden nanodeeltjes bijna sferisch in vorm (Figuur 3 waren). De grootte van de nanodeeltjes was in het bereik van ongeveer 37 nm, iets groter dan Scherrer de formule, suggereren een polykristallijne aard van de als-gesynthetiseerd nanodeeltjes39verkregen. Kleiner als gevolg van XRD in tegenstelling tot TEM is ook waargenomen in eerder onderzoek, waarschijnlijk omdat de structuur van het deeltje is polykristallijne karakter vanwege de aanzienlijke hoeveelheid kristalaggregaten die zijn van kleinere (sub deeltjes)40 . Figuur 4 toont het FESEM beeld van PLA-AuNPs als voorbereid op SPCE. Het blijkt uit de FESEM beelden en EDX spectra dat de SPCE/PLA-AuNPs had het hoogste percentage van het gewicht van goud, grootste dichtheid, en grootste oppervlak van nanoparticle dekking. Ook kunnen opgemerkt worden, met name, dat Figuur 4(een) het FESEM beeld van een naakte SPCE toont. De afbeelding van de FESEM in Figuur 4(b) toont goed gedistribueerde PLA-AuNPs. Om te bevestigen de gesynthetiseerde PLA-AuNPs chemische samenstelling, EDX werkte te onderzoeken van de chemische samenstelling van de als-geproduceerde PLA-AuNPs, zoals in Figuur 4(een)en 4(b). De EDX-spectrum bevestigd dat de als-geproduceerde PLA-AuNPs samengesteld uit goud (Au) slechts waren, en geen ander element behalve de piek overeenkomt met koolstof (C) en zuurstof (O) weergegeven. De aanwezigheid van de C-piek was het gevolg van de koolstof-elektrode waarop de steekproef daling van de cast was.

De EDX-spectrum bleek ook de aanwezigheid van O die aangeeft dat de zuurstof op de koolstof-elektrode was geadsorbeerd, omdat de film was blootgesteld aan lucht. Dit bevestigt dat er zuurstof aan koolstof nanotubes is geadsorbeerde als ze worden blootgesteld aan de lucht voor een lange tijd-41. Hoewel er verschillende gasmoleculen in de lucht, werd zuurstof verondersteld te zijn van de belangrijkste adsorbate op de lucht-blootgesteld koolstof nanotubes42, mogelijk als gevolg van de snellere adsorptie in vergelijking met andere moleculen43. Dit was gebaseerd op het vinden van dat zuurstof de belangrijkste adsorbate op de koolstof-elektrode werd tijdens de nachtelijke lucht blootstelling in de bereiding van de monsters en de chemische zuiverheid van het PLA-AuNPs versterkt. De verhouding van anodic en kathodische piek (ikpa/ipc) was bijna 1, waardoor constante piek potentieel zoals de scan stem verhoogde44. Bovendien, de anodic en kathodische piek mogelijkheden waren consistent bij andere scan tarieven45 wat suggereert dat de elektrochemische reactie omkeerbare gebaseerd op piek scheiding (Figuur 5 was). De werkzame oppervlakte van de gemodificeerde elektrode werd berekend aan de hand van de vergelijking van Akureyri-Sevick (ikpc = (2,69 × 105) n3/2 AD1/2 Cv1/2. Van de helling van het perceel ikpc versus v1/2 in Figuur 5(een) en (),b), de oppervlakte van de elektroden werd berekend door 0,26 cm2 en 0,41 cm2 voor de kale SPCE en PLA-AuNPs, respectievelijk. Dit resultaat bevestigd dat de verbetering die worden geboden door PLA-AuNPs op de actieve oppervlakte relatief hoger werd vergeleken met kale SPCE. De afgeleide resultaat was vergelijkbaar met die van het polymeer-embedded goud nanodeeltjes (β-CD-EDAS(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylene-diamine matrix ingekapseld gouden nanodeeltjes), waaruit bleek dat een hoge actieve oppervlakte het proces van versterkt elektron-overdracht en daarom heeft geleid tot betere gevoeligheid46.

De gewijzigde SPCE elektrochemische reactie was in een proces van gecontroleerde diffusie, weergegeven door een vermindering van de K3[Fe(CN)6]3 -/4 - piekstroom, die op hun beurt vertrouwden op de stroom van de vierkantswortel van de scan rate (v 1/2). Als u een beter overzicht van de eigenschappen van het gemodificeerde elektrode, werd een elektrochemische impedantie spectroscopie (EIS) studie uitgevoerd om te correleren met de prestaties van de gemodificeerde elektrode gepresenteerd in termen van metingen van de CV. De sectie van de halve cirkel gezien bij hoge frequenties gecorreleerd met het beperkende proces van de overdracht van het elektron in de EIS. De gratis overdracht weerstand (Rct) werd gemeten direct als de diameter van de halve cirkel. Dit resultaat overeenkomt met de waarde van Rct van de kale SPCE, die Ω 1932 was en waar de wijziging van de SPCE/PLA-AuNPs gedaald tot 1444 Ω (Figuur 6). De daling van de waarde van Rct in SPCE/PLA-AuNPs gevolg kan zijn van een afname van de lokale diëlektrische constante en/of een toename van de dikte van de elektrische double layer47, suggereren dat K3[Fe(CN)6]3 - /4 - functie door adsorptie op het grensvlak van metaal/oplossing. Deze uitgangen voldaan aan degene die zijn afgeleid van de metingen van CV (Figuur 7). De piek stromingen met de wijziging van de SPCEs met behulp van PLA-AuNPs, waaruit bleek dat een hogere gevoeligheid de inverse van de lagere Rct48 wasgeleidelijk verhoogd. Dus, de toename van de waarde van CV van de gemodificeerde elektroden en de afname van de R-waarden voorct kunnen zijn als gevolg van de geleidelijke vervanging van watermoleculen (het volume van de watermoleculen is 27.19 Å3) door de adsorptie van de K-3 [Fe(CN)6] 3 -/4 - op het metaaloppervlak, verminderen van de omvang van de ontbinding reactie49.

Tabel 3 geeft de relatieve standaardafwijking (RSD) van de herhaalbaarheid en de reproduceerbaarheid van de gemodificeerde elektrode. Routine CV opname van K3[Fe(CN)6]3 -/4 - werd gemaakt voor zes opeenvolgende sets te onderzoeken van de herhaalbaarheid van de gemodificeerde elektroden. De RSD SPCE/PLA-AuNPs was afgeleid als 4,26%. De elektrode met PLA-AuNPs wijziging gaf beter RSD na verschillende metingen. Bovendien, met de hierboven beschreven procedure, zes gemodificeerde elektroden waren onafhankelijk gefabriceerd, die gaf RSD waarden van 4,05% voor SPCE/PLA-AuNPs, met vermelding van betere reproduceerbaarheid van de fabricage van de elektrode voor PLA-AuNPs. Het gewijzigde substraat afhankelijk van PLA-AuNPs bleef bij 37 ° C voor een verlenging van de duur. Het werd ook gebruikt voor de record van 20 cycli en een daling van 18% in de signaalkwaliteit. Met het oog op de maximale output van de biosensor, de immobilisatie-periode, de temperatuur, samen met werden ssDNA concentratie en criteria voor hybridisatie onderzocht. Deze voorwaarden moest worden geoptimaliseerd, zoals zij invloed uitoefenen op de piek stroom van DPV. Voor het optimaliseren van de concentratie van ssDNA, SPCE/PLA-AuNPs was afgepipetteerde met verschillende concentratie (0.2 met 0,4, 0,6, 0.8, 1.0, 1.2 en 1.4 µM) van ssDNA voor 60 min zodat de optimale concentratie van ssDNA werd bepaald. Gebaseerd op Figuur 8, het DPV piekstroom verhoogd zoals hogere concentraties van DNA werden gebruikt. De studie vond ook dat de geoptimaliseerde concentratie van DNA 1,2 µM ssDNA was.

Voor het optimaliseren van de immobilisatie-periode waarbij het single-stranded DNA in SPCE/PLA-AuNPs, 25 µL van ssDNA (1,2 µM) werden getest op verschillende tijden (30, 60, 90, 120, 150, 180 en 210 min). In Figuur 9blijkt uit de bevindingen een toename van de immobilisatie-periode resulterend in de continue stijging van de piekstroom DPV. Dus, de tijd van de optimale immobilisatie van de ssDNA werd geselecteerd als 180 min. Voor het optimaliseren van de immobilisatie-temperatuur, de SPCE/PLA-AuNPs was afgepipetteerde met ssDNA (1,2 µM) in verschillende temperaturen (75, 65 55, 45, 35 en 25 ° C) voor 180 min. We vonden dat wanneer de temperatuur van immobilisatie werd verhoogd tot 55 ° C, de huidige DPV piek aanvankelijk escaleerde gevolgd door een latere afschrijvingen (Figuur 10); Dus, 55 ° C werd geselecteerd als de geoptimaliseerde immobilisatie temperatuur moet worden gebruikt in latere experimenten. Scheiding van ssDNA dat immobiel van oppervlakken van de elektrode en de kruising invaliditeit werd veroorzaakt door verhoogde temperaturen. Er zijn andere rapporten met soortgelijke resultaten50. Sneller splitsen en degeneratie van DNA van de oppervlakken van nanodeeltjes goud vond plaats in hogere temperaturen51. Onderzoek onlangs gemeld dat de binding tussen goud en thiol oxideert snel degradeert en gewoon in een situatie die is ambient, bijvoorbeeld wanneer blootgesteld aan water, lucht en licht52,53,,54. Het effect van hybridisatie tijd werd ook onderzocht in deze studie.

De gefabriceerde SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA was drop-cast met een oplossing van doelDNA (0,2 µM) op de kruising van de verschillende tijden (5, 10, 15, 20, 25 en 30 min). De reactie van de DPV roos natuurlijk, met een toename van de tijd van incubatie (van 5 tot 10 min) met 5-min (Figuur 11). Als u deze waarde werd verkregen, werd een neerwaartse patroon van 10 tot 30 min waargenomen, zodat het gewenste tijdstip voor hybridisatie werd gekozen als 10 min. De efficiëntie van hybridisatie verhoogd met een stijging van de temperatuur van 25 ° C tot 35 ° C (Figuur 12). De hoge stroom werd gezien langzaam afnemen bij een temperatuur hoger dan 35 ° C. De reden hiervoor was toegeschreven aan sandwich structuur denaturatie vermindering van het signaal detectie. Vandaar, de temperatuur van de optimale hybridisatie geselecteerd was 35 ° C. Het proces dat wij gebruikt voor het opsporen van de V. parahaemolyticus bestond uit AuNPs ter verbetering van het actieve oppervlak van de elektrode van de werken, PLA te bemiddelen de oppervlakte modificatie en de complexe, redox MB, aan verminderd het aan LB. Het resultaat van deze oxidatieproces was een betere affiniteit tussen ssDNA en MB55. De huidige DPV werd verlaagd als gevolg van het lagere aantal bijgevoegde MB moleculen tijdens de kruising van ssDNA met zijn bijkomende opeenvolging.

We voerde verder onderzoek naar de prestaties van de ontwikkelde biosensor. De resultaten van de DPV in Figuur 13 blijkt dat het kon selectief onderscheiden sonde DNA, cDNA één-base niet-overeenkomende DNA, drie-base niet-overeenkomende DNA en niet-cDNA in aanwezigheid van MB als de detectie label56, 57. de laagste piekstroom (0.73 µA) werd tentoongesteld door bijkomende DNA, die langzaam verhoogd door een-base niet-overeenkomende DNA (0.94 µA), drie-bases mismatched DNA (1.05 µA), niet-cDNA (3.25 µA), en sonde DNA (4.79 µA). Het huidige target-DNA was de kleinste van alle de stromingen van oligonucleotide sequenties zodat onze biosensor te discrimineren tussen de sequenties van oligonucleotide gevoelig en specifiek. MB gebonden sterk met ssDNA van de geïmmobiliseerdet sonde DNA produceren een grote DPV piekstroom. De huidige geïmmobiliseerdet sonde-DNA verminderd SPCE/PLA-AuNPs/niet-cDNA met bijna de helft als slechts een kleine hoeveelheid MB gemonteerd op het oppervlak van SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA. Dit is waarschijnlijk te wijten aan ontoegankelijk interacties tussen MB en guanine honken. De modi van de interactie van DNA en MB zijn sterk afhankelijk van dergelijke experimentele omstandigheden als pH, temperatuur, DNA concentratie, Ionische sterkte en soort buffer58,59. MB links vaak naar dsDNA door groove en intercalative modi, resulterend in MB accumulatie op dsDNA oppervlakte60. De blootstelling van onze vangst sonde DNA aan één-base niet-overeenkomende DNA en drie-base niet-overeenkomende DNA consequent verminderd DPV piek stromingen en de complementaire doelstelling DNA bleef deze trend. Tabel 4 toont het percentage van selectiviteit tarief voor MB piek huidige. Onze algemene bevinding was dat kruising van de geconstrueerde DNA biosensor zeer selectief via geïmmobiliseerdet sonde DNA op de SPCE/PLA-AuNPs oppervlak.

De gevoeligheid van de ontwikkelde DNA biosensor werd verder onderzocht met verschillende concentraties van complementaire doelgroep oligonucleotide. Figuur 14 toont de geleidelijke uitputting van DPV piek stroom van MB op de SPCE/PLA-AuNPs als de complementaire DNA-concentratie toegenomen. Figuur 15 vertoont een lineaire regressie-coëfficiënt van 0.96 die werd gegenereerd tussen de log van verminderde MB piekstroom en het logboek van verschillende concentratie van doelDNA (0. twee pM tot 0,02 mM). Een grafiek van de piek huidige wijzigingen (ΔP) werd uitgezet met behulp van de formule 3σ/m (σ de standaarddeviatie van de blanco-oplossing en m wordt de helling van de lineaire curve wordt)61,62,,63. De detectiegrens van de gefabriceerde DNA biosensor werd berekend als 16 12.43: die groter dan onze kleinste eigenlijk was gemeten monster. Dit resultaat werd in overleg met het feit dat ΔP voor 0. twee pM en 2 pM (2.65 × 10-6 A en 2.81 × 10-6 A) met een standaarddeviatie van 1.19 × 10-7 A en 1.06 × 10-7 A, respectievelijk, overlapt.

Om te berekenen van de kwantificering van de gefabriceerde DNA biosensor, we gebruikten de formule 10σ/m waarin (σ de standaarddeviatie van de blanco-oplossing is en m is de helling van de lineaire curve) en vond het resultaat te zijn van een winst van 14.8 pM. Herhaalde denaturatie van de complementaire DNA werd uitgevoerd voor de beoordeling van de DNA-biosensor in termen van de regeneratiecapaciteit. We deden dit door broeden 0,2 µM complementaire DNA gemodificeerde elektrode in warm water bij 86 ° C gedurende 8 minuten om te denatureren van de double-stranded DNA, gevolgd door snelle afkoeling in een ijsbad te handhaven de gedenatureerde single-stranded DNA64.

De kruising activiteit is gehandhaafd op 91% van haar eerste reactie na 8 inspanningen van regeneratie (n = 5, RSD = 4,05%). De DNA-biosensor gebaseerd op SAM methode voor DNA sonde immobilisatie op SPCE/PLA-AuNPs was zeer stabiel, het bereiken van een goede respons voor het opsporen van cDNA na herhaalde denaturatie processen. De stabiliteit van onze DNA biosensor met betrekking tot de warmte werd verder geëxploreerd. Om dit te doen, we de PLA-AuNPs/SPCE/ssDNA-elektrode bij temperaturen van 4 ° C, 25 ° C en 45 ° C opgeslagen in een verzegelde aluminium etui met silica gels. Aan het einde van 6 maanden, we de cDNA beoordeeld en naar schatting van het percentage van de terugvordering van signaal productie. Figuur 16 toont aan dat de sonde SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA zeer stabiel met meer dan 80% van zijn oorspronkelijke signaal nog te herstellen na 6 maanden opslag was. De sterke reactie tussen PLA-AuNPs en ssDNA bleek te hebben op lange termijn stabiliteit bij een temperatuur onder 45 ° C.

Negen verschillende soorten bacteriën (B. cereus, L. monocytogenes, C. jejuni, E. coli-O157:H7, V. alginolyticus, S. typhimurium, S. enteritis, K. longontsteking en V. parahaemolyticus) werden gescreend door PCR detectie. De PCR versterking producten voor soortspecifieke detectie van V. parahaemolyticus uit de cultuur van de bacteriën worden weergegeven in Figuur 17. Het toxR gen van de V. parahaemolyticus werd gebruikt als PCR primer voor V. parahaemolyticus identificatie als gevolg van haar aanwezigheid in pathogene isolaten. Bleek uit de analyse van PCR, V. parahaemolyticus positieve resultaten als gevolg van de specificiteit van de primer van de PCR van het gen toxR naar V. parahaemolyticus. Geen PCR producten uit andere bacteriestammen werden ontdekt. De DPV piekstroom verkregen na een Kruisallergie beoordeling bleek zeer duidelijk detectie van V. parahaemolyticus in vergelijking met andere soorten bacteriën, zoals afgebeeld in Figuur 18. Het signaal van de DPV verhoogd naarmate het aantal basenparen afgenomen, als gevolg van de grotere hoeveelheid MB moleculen gebonden aan de sondes. V. parahaemolyticus konden duidelijk worden onderscheiden van de andere door voedsel overgedragen ziekteverwekkers die deed het milieu van het monster voedsel.

Kokkels zijn geselecteerd als echte monsters voor de validatie van de biosensor DNA in deze studie, omdat ze populaire ingrediënten in verschillende soorten gerechten. Het is algemeen bekend dat rauwe kokkels vaak pathogene V dragen. parahaemolyticus en kan overbrengen deze bacteriën voor de mens, vooral als ze zijn onvoldoende gekoeld tijdens de opslag na de oogst65. De testgroep van monsters van de kokkel was opgeslagen bij-20 ° C gedurende 24 uur, en blootgesteld aan UV-licht bij 20 ° C gedurende 4 uur voorafgaand aan DNA-extractie tijdens onze voorbehandeling stap. Figuur 19 laat zien dat de analyse van PCR V. parahaemolyticus in zowel de behandeld en onbehandeld (puntige) monsters gevonden. Dit wordt weergegeven in Lane 7, 8, 9, 10, 11 en 12 die correleren met de kolonie tellen in de eerdere discussie. Geen V. parahaemolyticus zoals in Lane 1, 2, 3, 4, 5 en 6 in de PCR-resultaten hoewel de Telling kolonies bij het wijzen van haar aanwezigheid in de monsters in de behandelde en onbehandelde (unspiked) monsters, wordt weergegeven. Een mogelijke reden hiervoor is de aanwezigheid van metabolieten zoals eiwitten in het geëxtraheerde DNA66besmetten.

Figuur 20 wordt een overzicht gegeven van de resultaten van de detectie met behulp van de ontwikkelde DNA biosensor, die met succes de aanwezigheid van V. parahaemolyticus in de behandelde groep bestaande uit gepunt en unspiked monsters bepaald. Deze resultaten correleren positief met de eerder besproken PCR-resultaten. Elke sample van de PCR die positieve resultaten toonde werd ontdekt met behulp van de elektrochemische biosensor PLA-gestabiliseerde-techniek, die AuNP-gebaseerd is, en het DPV piekoppervlakte duidelijk correspondeerde met de resulterende PCR intensiteit bands (Figuur 19 en Figuur 20). Deze resultaten wijzen erop dat de voorgestelde nanoparticle gebaseerde elektrochemische sensor worden voorzien in deze studie gedetecteerd V. parahaemolyticus met succes in de echte monsters, waaruit dus blijkt dat het is superieur aan PCR met geen effect op de authenticiteit van de resultaten.

Figure 1
Figuur 1 : Absorptie van PLA-AuNPs Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Röntgendiffractie spectrum van PLA-AuNPs. Aangepast met toestemming van ref. [30]. Copyright (2016) Sociedade Brasileira de Química. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : TEM diameter frequentieverdeling en beelden van PLA-AuNPs bij een meting schaal van 50 nm. Overgenomen met toestemming van ref. [30]. Copyright (2016) Sociedade Brasileira de Química. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : EDX spectra en beelden van de FESEM van (a) de kale SPCE en (b) SPCE/PLA-AuNPs. Overgenomen met toestemming van ref. [30]. Copyright (2016) Sociedade Brasileira de Química. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : De plot van de huidige oxidatie piek tegen de vierkantswortel van scan rate en cyclische voltammograms: (a) de kale SPCE en (b) SPCE/PLA-AuNPs in 1,0 mmol L-1 K3[Fe(CN)6] (pH 7). De scan-tarieven waren 300, 250, 200, 150, 100 en 50 mV s−1. Aangepast met toestemming van ref. [30]. Copyright (2016) Sociedade Brasileira de Química. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 : Impedantie spectra van gemodificeerde elektroden in 1,0 mmol L-1 K 3 [Fe(CN)6] (pH 7). Amplitude: 5 mV, en frequentiebereik: 0.1-105 Hz. aangepast met toestemming van ref. [22]. Copyright (2016) Elsevier. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7 : Anodic piek stroom van bewerkt elektroden in 1,0 mmol L-1 K 3 [Fe(CN)6] (pH 7) met een scansnelheid van 0,1 V s -1 gebruik van cyclische voltammetrie meting Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8 : Effect van de concentratie voor immobilisatie van het ssDNA op SPCE/PLA-AuNPs in 0,1 mol L-1 PBS (pH 7) tegen het tarief van de scan van 0,1 V s -1 na een incubatieperiode van het 30 min in 20 µM MB differentiële voltammetrie polsmeting met Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 9
Figuur 9 : Effect van ssDNA immobilisatie tijd op SPCE/PLA-AuNPs in 0,1 mol L -1 PBS (pH 7) met een scansnelheid van 0,1 V s -1 na een incubatieperiode van het 30 min in 20 µM MB differentiële voltammetrie polsmeting met Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 10
Figuur 10 : Effect van ssDNA immobilisatie temperatuur op SPCE/PLA-AuNPs met een scansnelheid van 0,1 V s -1 op 0,1 mol L -1 PBS (pH 7) na een incubatieperiode van 30 min in 20 µM van MB met differentiële polsmeting voltammetrie Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 11
Figuur 11 : Effect van hybridisatie tijd op SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA in 0,1 mol L -1 PBS (pH 7) met een scansnelheid van 0,1 V s -1 na een incubatieperiode van het 30 min in 20 µM MB differentiële voltammetrie polsmeting met Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 12
Figuur 12 : Effect van hybridisatie temperatuur op SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA in 0,1 mol L -1 PBS (pH 7) met een scansnelheid van 0,1 V s -1 na een incubatieperiode van het 30 min in 20 µM MB met differentiële voltammetrie polsmeting. Overgenomen met toestemming van ref. [22]. Copyright (2016) Elsevier. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 13
Figuur 13 : Histogram van de MB vermindering piekstroom met behulp van verschillende types van DNA in 0,1 mol L -1 PBS (pH 7) met een scansnelheid van 0,1 V s -1 na een incubatieperiode van het 30 min in 20 µM MB. De inzet toont differential pulse voltammograms onder dezelfde omstandigheden. Overgenomen met toestemming van ref. [22]. Copyright (2016) Elsevier. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 14
Figuur 14 : Histogram van de MB vermindering piekstroom met behulp van verschillende DNA-concentratie in 0,1 mol L -1 PBS (pH 7) met een scansnelheid van 0,1 V s -1 na een incubatieperiode van het 30 min in 20 µM MB met differentiële voltammetrie polsmeting. Overgenomen met toestemming van ref. [22]. Copyright (2016) Elsevier. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 15
Figuur 15 : Een lineaire plot van de vermindering van de piek stroom van MB tegen het logboek van verschillende DNA-concentratie in 0,1 mol L -1 PBS (pH 7) met een scansnelheid van 0,1 V s -1 na een incubatieperiode van het 30 min in 20 µM MB met differentiële voltammetrie polsmeting. Overgenomen met toestemming van ref. [22]. Copyright (2016) Elsevier. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 16
Figuur 16 : Effect van verschillende hybridisatie temperaturen op SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA op 6 maanden opslag interval (n = 3). Metingen in 0,1 mol L-1 PBS (pH 7) met een scansnelheid van 0,1 V s-1 na een incubatieperiode van het 30 min in 20 µM MB met differentiële voltammetrie polsmeting. Overgenomen met toestemming van ref. [22]. Copyright (2016) Elsevier. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 17
Figuur 17 : Agarose gel elektroforese-PCR versterking met behulp van 16S rRNA gen sequencing producten van geselecteerde bacteriën uit bacteriën cultuur. Lane M: 1kb DNA ladder, Lane C−: negatieve controle (steriel gedistilleerd water), Lane C+: positieve controle (DNA geëxtraheerd uit E. coli wordt gebruikt als sjabloon), Lane EG: E. coli O157:H7, Lane CJ: C. jejuni , Lane BC: B. cereus, Lane KP: K. longontsteking, Lane ST: S. typhimurium, Lane LM: L. monocytogenes, Lane SE: S. enteritis, Lane VP: V. parahaemolyticus en Lane VV: V. alginolyticus Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 18
Figuur 18 : Histogram van de MB vermindering piekstroom voor Kruisallergie studie van de DNA-biosensor tegen verschillende foodborne ziekteverwekkers in 0,1 mol L -1 PBS (pH 7) met een scansnelheid van 0,1 V s -1 na een incubatieperiode van het 30 min in 20 µM MB met differentiële voltammetrie polsmeting. Overgenomen met toestemming van ref. [23]. Copyright Springer (2017). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 19
Figuur 19 : Agarose gel elektroforese-PCR versterking producten van V. parahaemolyticus van verse kokkel monsters. Lane M: 2ul van 100 bp DNA ladder, Lane 1-3: onbehandeld unspiked monsters, Lane 4-6: behandeld unspiked monsters, Lane 7-9: onbehandeld verrijkte monsters, Lane 10-12: behandeld van verrijkte monsters, Lane C+: positieve controle (V. parahaemolyticus ATCC 17802), Lane C-: negatieve controle (steriel gedistilleerd water). Overgenomen met toestemming van ref. [23]. Copyright Springer (2017). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 20
Figuur 20 : Histogram van de MB vermindering piekstroom voor detectie van V. parahaemolyticus in verse kokkel monsters met behulp van de DNA-biosensor in 0,1 mol L-1 PBS (pH 7) met een scansnelheid van 0,1 V s-1 na een incubatieperiode van het 30 min in 20 µM MB met differentiële voltammetrie polsmeting. Overgenomen met toestemming van ref. [23]. Copyright Springer (2017). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Samenstelling van de elektrode Incubatietijd (h) Temperatuur (° C) Groei media
Campylobacter jejuni 48 42 BA / BB
Listeria monocytogenes 48 30 TSA / TSB
Salmonella typhimurium 24 37 TSA / TSB
Salmonella enteritidis 24 37 TSA / TSB
Klebsiella longontsteking 24 37 EMBA / TSB
Escherichia coli O157:H7 24 37 MA / TSB
Bacillus cereus 24 37 HISTORIE / TSB
Vibrio alginolyticus 24 37 TSA + 3% NaCl/TSB+3% NaCl
Vibrio parahaemolyticus 24 37 CA/TSA+3% NaCl/TSB+3% NaCl

Tabel 1: Cultuur voorwaarden van geselecteerde bacteriën.

Monster POS. [° 2Th.] FWHM [° 2TH.] d-afstand [Å] Crystallite grootte (nm)
PLA-AuNPs 31.682 0.3149 2.8243 27

Tabel 2: De grootte van de PLA-AuNP-kristalaggregaten. Aangepast met toestemming van ref. [30]. Copyright (2016) Sociedade Brasileira de Química.

Gemodificeerde elektrode RSD % (n = 6) Vermindering van het signaal (%) (n = 20)
Herhaalbaarheid Reproduceerbaarheid
SPCE/PLA-AuNPs 4.26 4.05 18

Tabel 3: eigenschappen van gemodificeerde elektroden met betrekking tot AuNPs en PLA-AuNPs wijziging in K 3 [Fe(CN)6] met 1,0 mmol L -1 concentratie op een scanfrequentie van 0,1 V s -1 . Aangepast met toestemming van ref. [30]. Copyright (2016) Sociedade Brasileira de Química.

Samenstelling van de elektrode Ikpa (µA) Epa Selectiviteit percentage (%)
(n = 3) (V)
SPCE/PLA-AuNP/sonde DNA 4.79 ± 0,10 -0.46 -
SPCE/PLA-AuNP/niet-cDNA 3.25 ± 0.12 -0.44 67.85
SPCE/PLA-AuNP/3-bases niet-overeenkomende DNA 1.05 ± 0.11 -0.45 21.92
Niet-overeenkomende DNA SPCE/PLA-AuNP/1-base 0.94 ± 0.12 -0.46 19.62
SPCE/PLA-AuNP/cDNA 0.73 ± 0,10 -0.45 15,24

Tabel 4: DPV selectiviteit van MB piekstroom in 0,1 mol L -1 PBS (pH 7) met een scansnelheid van 0,1 V s -1 na een incubatieperiode van het 30 min in 20 µM MB

Samenstelling van de elektroden Detectiemethode Lineaire afstand (M) Detectiegrens (M) Verwijzingen
3D AuNPs DPV 1,5 × 10-6 - 7.0 × 10-9 2.0 × 10-10 69
(+) AuNPs DPV 1.0 × 10-9 - 1,5 × 10-12 2.6 × 10-12 70
AuNPs/GR DPV 1.3 × 10-9 - 2,5 × 10-11 8.3 × 10-12 71
AuNPs-ADH-GSs DPV 5.0 × 10-8 - 3.0 × 10-13  3.0 × 10-13 72
AuNPs-MPTS DPV 5.0 × 10-9 - 1.0 × 10-11  5.0 × 10-11 73
AuNPs-Ga DPV 1.0 × 10-9 - 1.0 × 10-14 3.5 × 10-15 74
CoS / AuNPs DPV 1.0 × 10-9 - 1.0 × 10-12 7.0 × 10-13 75
PLA-AuNPs DPV 2.0 × 10-8 - 2.0 × 10-13 5.3 × 10-12 Dit werk

Tabel 5: Vergelijking van enkele van de onlangs ontwikkelde elektrochemische DNA-nanosensors. Overgenomen met toestemming van ref. [22]. Auteursrecht (2016) Elsevier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De kritische stappen in een kader voor de succesvolle ontwikkeling van dit soort elektrochemische biosensor zijn selectie van passende biologische erkenning elementen voor de transducer (nucleïnezuur of DNA hier); chemische aanpak voor de bouw van de sensing laag van de transducer; transductie materiaal; optimalisatie van DNA immobilisatie en kruising; en validatie van de ontwikkelde biosensor met behulp van echte monsters.

Core aan de succesvolle ontwikkeling van een gevoelige en selectieve elektrochemische DNA biosensor, is de optimalisatie van de immobilisatie en kruising conditie. In dit werk, we gebruikten MB als de redox complex. Er zijn verschillende principes van MB-DNA interacties: (i) door elektrostatische interactie kosteloos de MB kationische met fosfaat ruggegraat anionogene beschuldiging van zowel ssDNA als dsDNA; (ii) door MB bekomt door succesvolle invoeging van MB tussen afwisselend G-C-basenparen in dsDNA; (iii) door covalente binding aan het einde van de target ssDNA produceert die een label low bevolkingsdichtheid (één of twee MB moleculen per bundel van DNA); en (iv) door MB interacties met een niet-afhankelijke guanine basis in ssDNA. We passen het vierde beginsel, waarmee nauwkeurig V. parahaemolyticus van grensoverschrijdende reactiviteit van bacteriën en in verse kokkels. Na de oxidatie van bijzonder belang was er een sterkere affiniteit tussen MB en ssDNA. Kruising van ssDNA met zijn bijkomende opeenvolging vervangt de gekleefde MB moleculen en beperkt zo het signaal.

De reeks van experimentele resultaten bovenstaande richt zich op de ontwikkeling van een snelle methode voor het opsporen van V. parahaemolyticus met hoge selectiviteit en gevoeligheid op basis van de beginselen van DNA hybridisatie. De eerste stap is de synthese en de karakterisering van polylactic acid-gestabiliseerde gouden nanodeeltjes (PLA-AuNPs) voor wijziging van de elektrode (cijfers 1-6 en tabel 2). De kwaliteit van de gouden nanodeeltjes werd geëvalueerd aan de hand van de UV-zichtbaar-spectroscopie (UV-Vis) met röntgendiffractie (XRD), veld-emissie Scanning elektronenmicroscopie (FESEM), transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), cyclische voltammetrie (CV) en Impedantie-analyse. Het tweede deel van de ontwikkeling betrokken een elektrochemische karakterisering van de gemodificeerde elektrode (figuren 7-12 en tabel 3-4) die de succesvolle verbetering van de gemodificeerde elektrode ten opzichte van de kale elektrode in bepaald voorwaarden voor het detecteren van de gebeurtenis van hybridisatie.

De derde stap van de DNA gebaseerd biosensor ontwikkeling was gebaseerd op de optimalisatie van de experimentele omstandigheden van de kruising gebeurtenis en de toepassing van de ontwikkelde biosensor op de opsporing van de werkelijke pathogen (figuren 13-20). De kruising gebeurtenis waardoor het succes van het opsporen van het pathogene agens evalueerden met differential pulse voltammetrie (DPV). Het positieve bestaan voor de gerichte pathogen werd aangegeven door middel van vermindering van de huidige. De gevoeligheid van de ontwikkelde biosensor werd beoordeeld door middel van de bouw van een complot van de kalibratie en de berekening van LOD (Figuur 15). De verzonnen biosensor was in staat om specifiek V. parahaemolyticus te onderscheiden van andere ziekteverwekkers op basis van de verschillende niveaus van huidige vermindering (cijfers 17 en 18). De evaluatie van de haalbaarheid van de ontwikkelde biosensor voor detectie van V. parahaemolyticus in werkelijke voedsel monster wordt weergegeven in de figuren 19 en 20 en de positieve bestaan voor de gerichte pathogen wordt aangegeven door vermindering van de huidige . De succesvolle ontwikkeling van biosensoren DNA gebaseerde is sterk afhankelijk van DNA sonde selectie, verbetering van de gemodificeerde elektrode, alsmede de optimalisatie van de experimentele omstandigheden. De DNA-sonde hier is aangepast van het eerdere werk van Nakano67zijn. Verbetering van de gemodificeerde elektroden werd uitgevoerd met behulp van gouden nanodeeltjes gestabiliseerd met polylactic acid om de standaardisatie van de nanosize. De gouden nanodeeltjes functie als electro katalytische materiële68 en act te verhogen van de transfer rate van het elektron en bieden ook een oppervlak waarop te verankeren van de DNA-sonde. De experimentele parameters werden geoptimaliseerd op het gebied van temperatuur en incubatie tijd die is van cruciaal belang voor DNA aan formulier dubbelzijdig. De temperatuur van de kruising is van invloed op de scheiding tussen de aspecifieke adsorptie en dit verhoogt de selectiviteit van de sensor. Incubatietijd van de kruising verhoogt de kans op de vorming van dubbelzijdig afdrukken. De immobilisatie-procedure moet worden geoptimaliseerd om ervoor te zorgen dat de DNA-sonde zal worden geschikt afdrukstand voor het dubbelzijdig vorming te vormen.

Tabel 5 vergelijkt een steekproef van recent ontwikkelde elektrochemische DNA biosensoren69,70,71,72,73,74,75 ,. Op basis van DNA biosensing is een veelbelovende methode ter vervanging van moleculaire basis technieken, hoewel er een paar beperkingen die moeten worden aangepakt voordat de methode draagbare genoeg voor on-site gebruik kunnen. De belangrijkste beperking is monster verwerking DNA-extractie als de zuiverheid en de hoeveelheid DNA geëxtraheerd op site is niet waarschijnlijk zo goed zoals dat geëxtraheerd door de standaard lab gebaseerde methode. Het is echter een veelbelovend alternatief als de PCR en gel elektroforese kan worden vervangen door de voorbehandeling systeem monster zoals microfluidic.

DNA gebaseerde biosensoren zijn potentieel nuttig voor veel toepassingen, waaronder medische diagnostiek, milieumonitoring en toezicht op voedsel. Deze techniek kan online monitoring van kwaliteitscontroles, alsmede het point-of-care toezicht op patiënten. De overdraagbaarheid van de hele sensorsysteem kan de decentralisatie van de diagnostische processen waar de consument het detectiesysteem in het comfort van hun huis kunt gebruiken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs wil erkentelijk voor de steun van Universiti Putra Maleisië.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Merck 100056
Chloroform Merck 102445
Diaminoethane tetraacetic acid Promega E5134
Dibasic sodium phosphate  Sigma-Aldrich S9763
Disodium hydrogen phosphate Sigma-Aldrich 255793
Ethanol  Sigma-Aldrich 16368
Gold (III) chloride trihydrate Sigma-Aldrich 520918
Hydrochloric acid Merck 100317
Methylene blue Sigma-Aldrich M44907
Monobasic sodium phosphate, monohydrate Sigma-Aldrich S3522
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P5119
Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D NatureWorks 4042D
Potassium chloride R&M Chemicals 59435
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich P9791
Potassium hexacyanoferrate III R&M Chemicals 208019
Sodium acetate anhydrous salt Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
Trisodium citrate Sigma-Aldrich S1804
Tris(hydroxymethyl) aminomethane Fisher Scientific T395-100
Tris-Base Fisher Scientific BP152-500
2X PCR Master Mix with Dual-Dye Norgen Biotek 28240
Agarose gel Merck 101236
Bolton Agar Merck 100079
Bolton Broth Merck 100079
CHROMagar Vibrio CHROMagar VB910
dNTPs Promega U1511
Nuclease-free water Thermo Scientific R0581
Eosin methylene blue agar  Merck 101347
GelRed Biotium 41001
Glycerol Merck 104092
Go Taq Buffer Promega M7911
Loading dye 100 bp DNA ladder Promega G2101
Loading dye 1kb DNA ladder Promega G5711
Magnesium chloride Promega 91176
Mannitol egg yolk polymyxin agar Merck 105267
McConkey Agar Merck 105465
Nutrient Broth Merck 105443
Taq polymerase Merck 71003
Trypticase Soy Broth Merck 105459
Trypticase Soy Agar Merck 105458

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gould, L. H., Rosenblum, I., Nicholas, D., Phan, Q., Jones, T. F. Contributing factors in restaurant-associated foodborne disease outbreaks, FoodNet sites, 2006 and 2007. Journal of Food Protection. 76, 1824-1828 (2013).
  2. Arvanitoyannis, I. S., Kotsanopoulos, K. V., Papadopoulou, A. Rapid detection of chemical hazards (toxins, dioxins, and PCBs) in seafood. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 54, 1473-1528 (2014).
  3. Robertson, L. J., Sprong, H., Ortega, Y. R., van der Giessen, J. W. B., Fayer, R. Impacts of globalisation on foodborne parasites. Trends in Parasitology. 30, 37-52 (2014).
  4. Sandilands, E. A., Bateman, D. N. The epidemiology of poisoning. Medicine. 44, 76-79 (2016).
  5. Boschi-Pinto, C., Velebit, L., Shibuya, K. Estimating child mortality due to diarrhoea in developing countries. Bulletin of the World Health Organization. 86, 710-717 (2008).
  6. Farthing, M. J. G. Diarrhoea: A Significant Worldwide Problem. International Journal of Antimicrobial Agents. 14, 65-69 (2000).
  7. World Health Organization. WHO estimates of the global burden of foodborne diseases: foodborne disease burden epidemiology reference group 2007-2015. , 1-255 (2015).
  8. Yeung, M., Boor, K. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathogens and Disease. 1, 74-88 (2004).
  9. Sakazaki, R. Foodborne Diseases. Cliver, D. O., Riemann, H. P. , Academic Press. 127-136 (2002).
  10. Grochowsky, J., Odom, S. R., Akuthota, P., Stead, W. Primary Septicemia and Abdominal Compartment Syndrome From Vibrio parahaemolyticus Infection in a 40-Year-Old Patient With No Known Immunocompromise. Infectious Disease in Clinical Practice. 22, (2013).
  11. Raghunath, P. Roles of thermostable direct hemolysin (TDH) and TDH-related hemolysin (TRH) in Vibrio parahaemolyticus. Frontiers in Microbiology. 5, 805 (2014).
  12. Kalburge, S. S., Whitaker, W. B., Boyd, E. F. High-Salt Preadaptation of Vibrio parahaemolyticus Enhances Survival in Response to Lethal Environmental Stresses. Journal of Food Protection. 77, 246-253 (2014).
  13. Esteves, K., Hervio-Heath, D., Mosser, T., Rodier, C., Tournoud, M. G., Jumas-Bilak, E., Colwell, R. R., Monfort, P. Rapid proliferation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, and Vibrio cholerae during freshwater flash floods in French Mediterranean Coastal lagoons. Applied and Environmental Microbiology. 81, 7600-7609 (2015).
  14. Khandeparker, L., Anil, A. C., Naik, S. D., Gaonkar, C. C. Daily variations in pathogenic bacterial populations in a monsoon influenced tropical environment. Marine Pollution Bulletin. 96, 337-343 (2015).
  15. Caburlotto, G., Suffredini, E., Toson, M., Fasolato, L., Antonetti, P., Zambon, M., Manfrin, A. Occurrence and molecular characterization of Vibrio parahaemolyticus in crustaceans commercialised in Venice area, Italy. International Journal of Food Microbiology. 220, 39-49 (2016).
  16. Wong, H. C., Chen, M. C., Liu, S. H., Liu, D. P. Incidence of highly genetically diversified Vibrio parahaemolyticus in seafood imported from Asian countries. International Journal of Food Microbiology. 52, 181-188 (1999).
  17. Rosec, J. P., Causse, V., Cruz, B., Rauzier, J., Carnat, L. The international standard ISO/TS 21872-1 to study the occurence of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae in seafood: ITS improvement by use of a chromogenic medium and PCR. International Journal of Food Microbiology. 157, 189-194 (2012).
  18. Maniyankode, R. A., Kingston, J. J., Murali, H. S., Batra, H. V. Specific identification of vibrio parahaemolyticus employing monoclonal antibody based immunoassay. International Journal of Pharmacy and Biological Sciences. 4 (2), B156-B164 (2013).
  19. Suffredini, E., Lopez-Joven, C., Maddalena, L., Croci, L., Roque, A. Pulsed-field gel electrophoresis and PCR characterization of environmental Vibrio parahaemolyticus strains of different origins. Applied and Environmental Microbiology. 77, 6301-6304 (2011).
  20. Bhattacharyya, N., Hou, A. A pentaplex PCR assay for detection and characterization of Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolyticus isolates. Letters in Applied Microbiology. 57, 233-240 (2013).
  21. da Silva, E. T. S. G., et al. Electrochemical Biosensors in Point-of-Care Devices: Recent Advances and Future Trends. ChemElectroChem. 4 (4), 778-794 (2017).
  22. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. Sensitive detection of multiple pathogens using a single DNA probe. Biosensors and Bioelectronics. 86, 398-405 (2016).
  23. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. A simple, portable, electrochemical biosensor to screen shellfish for Vibrio parahaemolyticus. AMB Express. 7 (1), 41 (2017).
  24. Zhang, J., Li, Z., Zhang, H., Wang, J., Liu, Y., Chen, G. Rapid detection of several foodborne pathogens by F0F1-ATPase molecular motor biosensor. Journal of Microbiological Methods. 93, 37-41 (2013).
  25. Barsan, M. M., Ghica, E. M., Brett, C. M. A. Portable biosensing of food toxicants and environmental pollutants. Nikolelis, D. P., Varzakas , T., Erdem, A., Nikoleli, G. P. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Boca Raton. 33-69 (2014).
  26. Kwun, J., Yun, S., Park, L., Lee, J. H. Development of 1,1'-oxalyldiimidazole chemiluminescent biosensor using the combination of graphene oxide and hairpin aptamer and its application. Talanta. 119, 262-267 (2014).
  27. Thavanathan, J., Huang, N. M., Thong, K. L. Colorimetric biosensing of targeted gene sequence using dual nanoparticle platforms. International Journal of Nanomedicine. 10, 2711-2722 (2015).
  28. Hushiarian, R., Yusof, N. A., Abdullah, A. H., Ahmad, S. A. A., Dutse, S. W. Facilitating the indirect detection of genomic DNA in an electrochemical DNA biosensor using magnetic nanoparticles and DNA ligase. Analytical Chemistry Research. 6, 17-25 (2015).
  29. Dutse, S. W., Yusof, N. A., Ahmad, H., Hussein, M. Z., Zainal, Z., Hushiarian, R., Hajian, R. An Electrochemical Biosensor for the Determination of Ganoderma boninense Pathogen Based on a Novel Modified Gold Nanocomposite Film Electrode. Analytical Letters. 47 (5), 819-832 (2014).
  30. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hajian, R. Characterization of Polylactide-Stabilized Gold Nanoparticles and Its Application in the Fabrication of Electrochemical DNA Biosensors. Journal of the Brazilian Chemical Society. 27 (9), 1679-1686 (2016).
  31. Vongkamjan, K., Wang, S., Moreno Switt, A. I. Rapid detection of foodborne bacterial pathogens in seafood. Handbook of Seafood: Quality and Safety Maintenance and Applications. , 247-257 (2016).
  32. Wang, F., Jiang, L., Yang, Q., Han, F., Chen, S., Pu, S., Vance, A., Ge, B. Prevalence and antimicrobial susceptibility of major foodborne pathogens in imported seafood. Journal of Food Protection. 74 (9), 1451-1461 (2011).
  33. Szermer-Olearnik, B., Sochocka, M., Zwolinska, K., Ciekot, J., Czarny, A., Szydzik, J., Kowalski, K., Boratynski, J. Comparison of microbiological and physicochemical methods for enumeration of microorganisms. Postepy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej. 68, 1392-1396 (2014).
  34. Ivanov, I. G., Bachvarov, D. R. Determination of plasmid copy number by the "boiling" method. Analytical Biochemistry. 165 (1), 137-141 (1987).
  35. Gopireddy, V. R. Biochemical tests for the identification of bacteria. International Journal of Pharmacy and Technology. 3 (4), 1536-1555 (2011).
  36. Böhme, K., Fernández-No, I. C., Pazos, M., Gallardo, J. M., Barros-Velázquez, J., Cañas, B., Calo-Mata, P. Identification and classification of seafood-borne pathogenic and spoilage bacteria: 16S rRNA sequencing versus MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 34 (6), 877-887 (2013).
  37. Seoudi, R., Fouda, A. A., Elmenshawy, D. A. Synthesis, characterization and vibrational spectroscopic studies of different particle size of gold nanoparticle capped with polyvinylpyrrolidone. Physica B: Condensed Matter. 405, 906-911 (2010).
  38. Mishra, A., Harper, S., Yun, S. I. Interaction of biosynthesized gold nanoparticles with genomic DNA isolated from E. coli and S. aureus. Nanotechnology (IEEE-NANO). , 1745-1750 (2011).
  39. Sugimoto, T. Formation of modoispersed nano- and micro-particles controlled in size, shape, and internal structure. Chemical Engineering and Technology. 26, 313-321 (2003).
  40. Rath, C., Sahu, K. K., Kulkarni, S. D., Anand, S., Date, S. K., Das, R. P., Mishra, N. C. Microstructure-dependent coercivity in monodispersed hematite particles. Applied Physics Letters. 75, 4171-4173 (1999).
  41. Abbas, M., Wu, Z. Y., Zhong, J., Ibrahim, K., Fiori, A., Orlanducci, S., Sessa, V., Terranova, M. L., Davoli, I. X-ray absorption and photoelectron spectroscopy studies on graphite and single-walled carbon nanotubes: Oxygen effect. Applied Physics Letters. 87 (5), 051923 (2005).
  42. Lim, S. C., Choi, Y. C., Jeong, H. J., Shin, Y. M., An, K. H., Bae, D. J., Lee, Y. H., Lee, N. S., Kim, J. M. Effect of gas exposure on field emission properties of carbon nanotubes arrays. Advanced Materials. 13, 1563-1567 (2001).
  43. Kim, B. H., Kim, B. R., Seo, Y. G. A study on adsorption equilibrium for oxygen and nitrogen into carbon nanotubes. Adsorption. 11, 207-212 (2005).
  44. Bard, A. J., Faulkner, L. R. Electrochemical methods: Fundamentals and applications. , John Wiley & Sons Inc. (2000).
  45. Tan, Q., Wang, L., Ma, L., Yu, H., Ding, J., Liu, Q., Xiao, A., Ren, G. Study on anion electrochemical recognition based on a novel ferrocenyl compound with multiple binding sites. Journal of Physical Chemistry B. 112, 11171-11176 (2008).
  46. Manivannan, S., Ramaraj, R. Polymer-embedded gold and gold/silver nanoparticle-modified electrodes and their applications in catalysis and sensors. Pure and Applied Chemistry. 83, 2041-2053 (2011).
  47. Benali, O., Larabi, L., Traisnel, M., Gengembre, L., Hareka, Y. Electrochemical, theoretical and XPS studies of 2-mercapto-1-methylimidazole adsorption on carbon steel in 1 M HClO4. Applied Surface Science. 253, 6130-6139 (2007).
  48. Shi, Y., Wen, L., Li, F., Cheng, H. M. Nanosized Li4Ti5O12/graphene hybrid materials with low polarization for high rate lithium ion batteries. Journal of Power Sources. 196, 8610-8617 (2011).
  49. Bentiss, F., Traisnel, M., Lagrenee, M. The substituted 1,3,4-oxadiazoles: a new class of corrosion inhibitors of mild steel in acidic media. Corrosion Science. 42, 127-146 (2000).
  50. Wang, M., Gong, W., Meng, Q., Zhang, Y. Electrochemical DNA impedance biosensor for the detection of DNA hybridization with polymeric film, single walled carbon nanotubes modified glassy carbon electrode. Russian Journal of Electrochemistry. 47, 1368-1373 (2011).
  51. Herdt, A. R., Drawz, S. M., Kang, Y., Taton, T. A. DNA dissociation and degradation at gold nanoparticle surfaces. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 51 (2), 130-139 (2006).
  52. Bhatt, N., Huang, P. J. J., Dave, N., Liu, J. Dissociation and degradation of thiol-modified DNA on gold nanoparticles in aqueous and organic solvents. Langmuir. 27, 6132-6137 (2011).
  53. Liu, X., Jang, C. H., Zheng, F., Jürgensen, A., Denlinger, J. D., Dickson, K. A., Raines, R. T., Abbott, N. L., Himpsel, F. J. Characterization of protein immobilisation at silver surfaces by near edge X-ray absorption fine structure spectroscopy. Langmuir. 22, 7719-7725 (2006).
  54. Willey, T. M., Andrew, L., Vance, T., Buuren, V., Bostedt, C., Terminello, L. J., Fadley, C. S. Rapid degradation of alkanethiol-based self-assembled monolayers on gold in ambient laboratory conditions. Surface Science. 576 (1), 188-196 (2005).
  55. Farjami, E., Clima, L., Gothelf, K., Ferapontova, E. E. DNA interactions with a Methylene Blue redox indicator depend on the DNA length and are sequence specific. Analyst. 135, 1443-1448 (2010).
  56. Lin, X., Ni, Y., Kokot, S. An electrochemical DNA-sensor developed with the use of methylene blue as a redox indicator for the detection of DNA damage induced by endocrine-disrupting compounds. Analytica Chimica Acta. 867, 29-37 (2015).
  57. Zhang, F. T., Nie, J., Zhang, D. W., Chen, J. T., Zhou, Y. L., Zhang, X. X. Methylene Blue as a G-Quadruplex Binding Probe for Label-Free Homogeneous Electrochemical Biosensing. Analytical Chemistry. 86, 9489-9495 (2014).
  58. Ning, L., Li, X., Yang, D., Miao, P., Ye, Z., Li, G. Measurement of Intracellular pH Changes Based on DNA-Templated Capsid Protein Nanotubes. Analytical Chemistry. 86, 8042-8047 (2014).
  59. Sani, N. D. M., Heng, L. Y., Surif, S., Lazim, A. M., et al. AIP Conference Proceedings. Murad, A., et al. 1571, 636-640 (2013).
  60. Xu, P., Wang, J., Xu, Y., Chu, H., Shen, H., Zhang, D., Zhao, M., Liu, J., Li, G. Binding modes and interaction mechanism between different base pairs and methylene blue trihydrate: a quantum mechanics study. Advances in Experimental Medicine and Biology. 827, 187-203 (2015).
  61. Guo, Y., Chen, J., Chen, G. A label-free electrochemical biosensor for detection of HIV related gene based on interaction between DNA and protein. Sensors & Actuators, B: Chemical. 184, 113-117 (2013).
  62. Huang, K. J., Liu, Y. J., Wang, H. B., Wang, Y. Y., Liu, Y. M. Sub-femtomolar DNA detection based on layered molybdenum disulfide/multi-walled carbon nanotube composites, au nanoparticle and enzyme multiple signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 55, 195-202 (2014).
  63. Kong, R. M., Song, Z. L., Meng, H. M., Zhang, X. B., Shen, G. L., Yu, R. Q. A label-free electrochemical biosensor for highly sensitive and selective detection of DNA via a dual-amplified strategy. Biosensors and Bioelectronics. 54, 442-447 (2014).
  64. Rashid, J. I. A., Yusof, N. A., Abdullah, J., Hashim, U., Hajian, R. Novel Disposable Biosensor Based on SiNWs/AuNPs Modified-Screen Printed Electrode for Dengue Virus DNA Oligomer Detection. IEEE Sensors Journal. 15, 4420-4421 (2015).
  65. Yingkajorn, M., Sermwitayawong, N., Palittapongarnpimp, P., Nishibuchi, M., Robins, W. P., Mekalanos, J. J., Vuddhakul, V. Vibrio parahaemolyticus and its specific bacteriophages as an indicator in cockles (Anadara granosa) for the risk of V. parahaemolyticus infection in Southern Thailand. Microbial Ecology. 67, 849-856 (2014).
  66. Ahmad Ganaie, H., Ali, M. N. Short term protocol for the isolation and purification of DNA for molecular analysis. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research. 24, 266-270 (2014).
  67. Nakano, K., Kimura, T., Kitamura, Y., Ihara, T., Ishimatsu, R., Imato, T. Potentiometric DNA sensing platform using redox-active DNA probe pair for sandwich-type dual hybridization at indicator electrode surface. Journal of Electroanalytical Chemistry. 720-721, 71-75 (2014).
  68. Yang, J., Jim Yang, L., Heng-Phon, T., Gan-Moog, C. Inhibition of DNA hybridization by small metal nanoparticles. Biophysical Chemistry. 120, 87-95 (2006).
  69. Niu, L. M., Liu, F., Wang, W., Lian, K. Q., Ma, L., Shi, H. M., Kang, W. J. Electrochemical Behavior of Paraquat on a Highly Ordered Biosensor Based on an Unmodified DNA-3D Gold Nanoparticle Composite and Its Application. Electrochimica Acta. 153, 190-199 (2015).
  70. Li, Z., Miao, X., Xing, K., Zhu, A., Ling, L. Enhanced electrochemical recognition of double-stranded DNA by using hybridization chain reaction and positively charged gold nanoparticles. Biosensors and Bioelectronics. 74, 687-690 (2015).
  71. Niu, S., Sun, J., Nan, C., Lin, J. Sensitive DNA biosensor improved by 1,10-phenanthroline cobalt complex as indicator based on the electrode modified by gold nanoparticles and graphene. Sensors and Actuators B: Chemical. 176, 58-63 (2013).
  72. Yi, H., Xu, W., Yuan, Y., Bai, L., Wu, Y., Chai, Y., Yuan, R. A pseudo triple-enzyme cascade amplified aptasensor for thrombin detection based on hemin/G-quadruplex as signal label. Biosensors and Bioelectronics. 54, 415-420 (2014).
  73. Das, R., Sharma, M. K., Rao, V. K., Bhattacharya, B. K., Garg, I., Venkatesh, V., Upadhyay, S. An electrochemical genosensor for Salmonella typhi on gold nanoparticles-mercaptosilane modified screen printed electrode. Journal of Biotechnology. 188, 9-16 (2014).
  74. Han, X., Fang, X., Shi, A., Wang, J., Zhang, Y. An electrochemical DNA biosensor based on gold nanorods decorated graphene oxide sheets for sensing platform. Analytical Biochemistry. 443 (2), 117-123 (2013).
  75. Huang, K. J., Liu, Y. J., Zhang, J. Z., Cao, J. T., Liu, Y. M. Aptamer/Au nanoparticles/cobalt sulfide nanosheets biosensor for 17β-estradiol detection using a guanine-rich complementary DNA sequence for signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 67, 184-191 (2015).

Tags

Bioengineering kwestie 136 Polylactic acid-gestabiliseerde gouden nanodeeltjes gezeefdrukt koolstof elektrode DNA biosensor Vibrio parahaemolyticus elektrochemische sensor worden voorzien DNA hybridisatie
Ontwikkeling van een elektrochemische DNA Biosensor te detecteren een Foodborne Pathogen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nordin, N., Yusof, N. A., Radu, S.,… More

Nordin, N., Yusof, N. A., Radu, S., Hushiarian, R. Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen. J. Vis. Exp. (136), e56585, doi:10.3791/56585 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter