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Bioengineering

एक विद्युत डीएनए के विकास के लिए एक Foodborne रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए सेंसर

Published: June 3, 2018 doi: 10.3791/56585
Automatic Translation
1, 2,3, 1, 4
1Laboratory of Food Safety and Food Integrity, Institute of Tropical Agriculture and Food Security, Universiti Putra Malaysia, 2Laboratory of Functional Device, Institute of Advanced Technology, Universiti Putra Malaysia, 3Department of Chemistry, Faculty of Science, Universiti Putra Malaysia, 4La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University

Summary

एक विद्युत डीएनए के विकास के लिए एक प्रोटोकॉल एक polylactic एसिड शामिल संवेदक स्थिर, सोने नैनोकणों संशोधित, स्क्रीन-मुद्रित कार्बन इलेक्ट्रोड का पता लगाने के लिए Vibrio parahaemolyticus प्रस्तुत किया जाता है ।

Abstract

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) एक आम foodborne रोगज़नक़ कि विश्व स्तर पर सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्याओं का एक बड़ा अनुपात में योगदान देता है, काफी मानव मृत्यु दर और रुग्णता की गति को प्रभावित । इस तरह के संस्कृति के रूप में V. parahaemolyticus का पता लगाने के लिए पारंपरिक तरीकों आधारित तरीकों, प्रतिरक्षा परख, और आणविक आधारित तरीकों जटिल नमूना हैंडलिंग की आवश्यकता होती है और समय लेने वाली, थकाऊ, और महंगा है । हाल ही में, एक होनहार और तेजी से पता लगाने, लागत प्रभावशीलता, और व्यावहारिकता के लाभ के साथ व्यापक जांच विधि होना साबित कर दिया है । यह शोध उच्च selectivity और संवेदनशीलता के साथ डीएनए संकरण के सिद्धांतों का उपयोग करके V. parahaemolyticus का पता लगाने की एक तेजी से विधि विकसित करने पर केंद्रित है । काम में, संश्लेषित polylactic एसिड के लक्षण-स्थिर गोल्ड नैनोकणों (पीएलए-AuNPs) एक्स-रे विवर्तन (XRD), पराबैंगनी दिखाई स्पेक्ट्रोस्कोपी (यूवी विज़), संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि), क्षेत्र उत्सर्जन का उपयोग कर प्राप्त किया गया था स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (FESEM), और चक्रीय Voltammetry (CV). हम भी स्थिरता, संवेदनशीलता के आगे परीक्षण किया, और पीएलए के reproducibility-AuNPs । हमने पाया है कि पीएलए-AuNPs जलीय समाधान में स्थिर नैनोकणों की एक ध्वनि संरचना का गठन किया । हम यह भी कहा कि संवेदनशीलता छोटे प्रभार हस्तांतरण प्रतिरोध (आरसीटी) मूल्य और सक्रिय सतह क्षेत्र की वृद्धि (०.४१ cm2) का एक परिणाम के रूप में सुधार हुआ है । हमारे डीएनए के विकास के एक स्क्रीन के संशोधन पर आधारित था कार्बन इलेक्ट्रोड (SPCE) पीएलए-AuNPs के साथ और redox संकेतक के रूप में methylene ब्लू (एमबी) का उपयोग कर । हम अंतर पल्स voltammetry (DPV) द्वारा स्थिरीकरण और संकरण घटनाओं का आकलन किया । हमने पाया है कि पूरक, गैर पूरक, और बेमेल oligonucleotides विशेष रूप से गढ़े हुए द्वारा प्रतिष्ठित थे । यह भी विभिंन खाद्य जनित रोगजनकों और ताजा cockles में V. parahaemolyticus की पहचान में के खिलाफ क्रॉस-जेट अध्ययनों में मज़बूती से संवेदनशील पहचान पता चला ।

Introduction

हाल के वर्षों में सार्वजनिक और वैज्ञानिक बहस का एक प्रमुख विषय, खाद्य विषाक्तता मुख्य रूप से 3 एजेंटों के साथ जुड़ा हुआ है: सूक्ष्मजीवों1, रसायन2, और3परजीवी । दूषित खाना मनुष्य में गंभीर स्वास्थ्य परिणाम, विशेष रूप से कमजोर प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ उन लोगों के उच्च जोखिम समूह में पैदा कर सकता है, बुजुर्ग, गर्भवती महिलाओं, शिशुओं, और युवा बच्चों को4। तीव्र दस्त के एक लाख से अधिक मामलों के साथ अफ्रीका, एशिया, और लैटिन अमेरिका में 5 साल की उंर के बच्चों में प्रतिवर्ष होने वाली, खाद्य विषाक्तता एक प्रमुख वैश्विक रोग है5,6 और विश्व स्वास्थ्य संगठन की स्थापना की है सबसे महत्वपूर्ण योगदानकर्ता7के रूप में सूक्ष्मजीवों । Vibrio parahaemolyticus सबसे व्यापक रूप से मांयता प्राप्त विषमय उपभेदों के बीच बाहर खड़ा है । आमतौर पर तटीय, estuarine, और समुद्री वातावरण8में पाया, यह एक ग्राम नकारात्मक जीवाणु है, जो उच्च नमक के वातावरण में सक्रिय हो जाता है, और गंभीर मानव आंत्रशोथ का कारण बनता है जब अपर्याप्त रूप से पकाया, हैंडल या कच्चे समुद्री में खाया उत्पाद9। इसके अतिरिक्त, कुछ लोगों में मौजूदा चिकित्सा शर्तों उंहें घाव संक्रमण, गलाघोंटू या कान V. parahaemolyticus10से उत्पंन संक्रमण से ग्रस्त हैं । V. parahaemolyticus hemolysins के डाह कारकों दो प्रकार जो रोग रोगजनन: thermostable प्रत्यक्ष hemolysin (TDH) TDH जीन द्वारा कोडित, और TDH hemolysin जीन11द्वारा कोडित trh से संबंधित में योगदान में विभाजित हैं । डाह मार्करों (tdh और trh जीन) के V. parahaemolyticus ज्यादातर नैदानिक नमूनों में बजाय पर्यावरण नमूनों में पाए जाते हैं ।

V. parahaemolyticus शर्तों का एक व्यापक रेंज के तहत जीवित रहने की क्षमता के पास, तेजी से पर्यावरण परिवर्तन12का जवाब । इसके प्रसार तंत्र सेल जन13के साथ समानांतर में अपनी विषाक्तता बढ़ जाती है के रूप में अपनी जोखिम क्षमता बढ़ता है । इससे भी बदतर, जलवायु परिवर्तन पर्याप्त शर्तों के साथ इन बैक्टीरिया प्रदान कर रहा है अपने सेल जनसंख्या वृद्धि14में तेजी लाने के । इसकी उच्च आवृत्ति के कारण, V. parahaemolyticus खाद्य आपूर्ति श्रृंखला के साथ निगरानी की जरूरत है, विशेष रूप से व्यापार और समुद्री भोजन के उत्पादन में उन उत्पादों रहे हैं, जहां वे भारी मात्रा में पाए जाते है15,16 दुनिया भर में । वर्तमान में बैक्टीरिया की पहचान की और जैव रासायनिक परीक्षण, संवर्धन और चुनिंदा मीडिया सहित तरीकों की एक सीमा का उपयोग कर पृथक कर रहे हैं17, एंजाइम से जुड़े immunomagnetic sorbent परख (एलिसा)18, पल्स फील्ड जेल ट्रो (PFGE) 19, लेटेक्स समूहन टेस्ट, और पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) टेस्ट20। इन पद्धतियों में आमतौर पर योग्य कार्मिकों, परिष्कृत साधनों और श्रमसाध्य तकनीकों की आवश्यकता होती है जो संदूषण के बारे में तुरंत जानकारी नहीं देते हैं. यह गंभीर रूप से हानिकारक संदूषण और ऑन-साइट अनुप्रयोगों का तुरंत पता लगाने की संभावना को सीमित करता है । रैपिड डिटेक्शन टूल एक उत्कृष्ट चुनौती बनकर रह गया है ।

foodborne रोगजनकों का पता लगाने के लिए एक होनहार विकल्प के रूप में उभर रहा है क्योंकि यह एक समय की बचत, लागत प्रभावी, व्यावहारिक और वास्तविक समय विश्लेषण प्रदान करता है विधि21,22,23,24 . हालांकि, हालांकि वहां कई analyte का पता लगाने के नमूनों और मानक जैव संवेदी का उपयोग कर समाधान में सकारात्मक परिणाम रहे हैं, वहां अभी भी असली नमूनों के लिए लागू अनुसंधान की कमी है या तो जलीय मिश्रण या कार्बनिक अर्क में25। हाल ही में, विद्युत प्रत्यक्ष और/या अप्रत्यक्ष deoxyribonucleic एसिड (डीएनए) का पता लगाने का उपयोग कर सेंसर वैज्ञानिकों के बीच वृद्धि का ध्यान प्राप्त हुआ है, एक संकरण घटना के माध्यम से पूरक लक्ष्य के अपने विशिष्ट पता लगाने के कारण26 , 27 , 28 , 29. इन अद्वितीय दृष्टिकोण एंजाइम आधारित miniaturization और व्यावसायीकरण के लिए एक होनहार प्रौद्योगिकी की पेशकश के साथ तुलना में अधिक स्थिर हैं । अध्ययन के लक्ष्य यहां रिपोर्ट एक तेजी से उपकरण है कि उच्च selectivity, संवेदनशीलता के साथ V. parahaemolyticus का पता लगाने कर सकते है निर्माण है, और व्यावहारिकता, संकरण के दौरान डीएनए अनुक्रम विशिष्टता के आधार पर । पहचान रणनीतियों polylactic एसिड स्थिर गोल्ड नैनोकणों (पीएलए-AuNPs)30 और संकरण संकेतक, methylene ब्लू (एमबी) की उपस्थिति में स्क्रीन मुद्रित कार्बन इलेक्ट्रोड (SPCEs) के संयोजन शामिल हैं । विकसित का पता लगाने के निर्माण की क्षमता आगे बैक्टीरिया डीएनए lysate और ताजा cockle नमूनों का उपयोग कर पता लगाया है.

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Protocol

नोट: सभी रासायनिक और जैव रासायनिक एजेंट विश्लेषणात्मक ग्रेड का होना चाहिए और आगे की शुद्धि के बिना इस्तेमाल किया जाना चाहिए । बाँझ जल का उपयोग कर सभी समाधान तैयार करें । आटोक्लेव सभी कांचियों नसबंदी से पहले ।

चेतावनी: इंजीनियरिंग नियंत्रण (धुएं हूड, glovebox) और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (सुरक्षा चश्मा, दस्ताने, लैब कोट, पूर्ण लंबाई पैंट, बंद पैर की अंगुली के उपयोग सहित प्रयोगशाला गतिविधियों प्रदर्शन जब सभी उचित सुरक्षा प्रथाओं का उपयोग करें जूते) ।

1. निर्माण और संशोधित इलेक्ट्रोड का लक्षण वर्णन पीएलए-AuNPs का उपयोग

  1. तैयारी और पीएलए-AuNPs के लक्षण वर्णन
    1. जल्दी से सोडियम साइट्रेट समाधान के 10 मिलीलीटर (३८.८ mm) उबलते जलीय chloroauric एसिड समाधान (1 मिमी) की १०० मिलीलीटर जोड़ने और परिवेश के तापमान के लिए यह शांत नीचे । तैयार AuNPs समाधान है जो पीले रंग के रूप में शुरू होता है, कालापन में परिवर्तन और अंत में डार्क रूबी लाल के रूप में समाप्त होता है में परिवर्तन का पालन करें ।
    2. पिघलने की प्रक्रिया के लिए एक स्टेनलेस स्टील मोल्ड में पीएलए छर्रों प्लेस और उंहें 10 मिनट के लिए १९० ° c के तापमान पर गरम करना । दबाने प्रक्रिया के साथ पालन करें: उंहें 1 मिनट के लिए २.२ MPa के एक दबाव के तहत पीएलए शीट तैयार करने के भाग के रूप में रखो । पीएलए शीट के बारे में 3 एच के लिए ठंडा करने के बाद उपयोग के लिए तैयार हो जाएगा ।
    3. जोरदार सरगर्मी, भंग ०.६८ कमरे के तापमान पर क्लोरोफॉर्म के 5 मिलीलीटर में पीएलए शीट्स की मिलीग्राम । पहले से तैयार AuNPs समाधान के 10 मिलीलीटर के साथ भंग पीएलए मिश्रण और homogeneously यह कमरे के तापमान पर हलचल । सजातीय मिश्रण तो पीएलए-AuNPs के रूप में चिह्नित जा सकता है और यूवी की तुलना, XRD, उनि, और EDX के साथ FESEM का उपयोग कर विशेषता ।
  2. तैयारी और संशोधित स्क्रीन-मुद्रित कार्बन इलेक्ट्रोड के लक्षण वर्णन
    नोट: इस अध्ययन में इस्तेमाल SPCE एक तीन इलेक्ट्रोड प्रणाली शामिल हैं: एक काउंटर इलेक्ट्रोड, एक कार्बन काम इलेक्ट्रोड, और एक एजी/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड.
    1. जल्दी पिपेट के 25 µ एल समरूप समाधान के पीएलए-AuNPs पर SPCE और फिर हवा इसे 24 के लिए शुष्क h उपयोग करने से पहले ।
    2. Electrochemically संशोधित इलेक्ट्रोड की विशेषता, SPCE/पीएलए-AuNPs, पोटेशियम एलॉय साइनाइड (K3[Fe (CN)6]3-/4-) सक्रिय सतह क्षेत्र को मापने के लिए, विद्युत प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी, दोहराव, reproducibility, और स्थिरता30।

2. विद्युत डीएनए का विकास

  1. जांच की तैयारी
    नोट: ssDNA जांच और पूरक डीएनए का जुगाड़ राष्ट्रीय जैव प्रौद्योगिकी सूचना (NCBI) डाटाबेस के लिए केंद्र से जानकारी के आधार पर चुना गया ।
    1. खरीद सिंथेटिक oligonucleotides (20-मेर ssDNA जांच, 20-मेर पूरक डीएनए, 20-मेर बेमेल डीएनए, और 21-मेर गैर-पूरक डीएनए) के रूप में वाणिज्यिक प्रयोगशालाओं से lyophilized पाउडर के रूप में निम्नलिखित अनुक्रम के आधार पर:
      thiolated ssDNA जांच: 5 ′-/5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG-3 ′
      पूरक डीएनए: 5 ′-CAGTGCTTCTGCATAATCCG-3 ′
      एक आधार बेमेल डीएनए: 5 ′-CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG-3 ′
      तीन आधार बेमेल डीएनए: 5 ′-CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG-3 ′
      गैर पूरक डीएनए: 5 '-CGCACAAGGCTCGACGGCTGA-3 ′
    2. विश्लेषणात्मक भागों में विभाजित सभी oligonucleotides (१०० µ एम) एक बाँझ ते समाधान (10 मिमी Tris-एचसीएल, 1 मिमी EDTA, पीएच ७.५) का उपयोग कर के स्टॉक समाधान तैयार करें । इस पर रखें-4 ° c और फिर उपयुक्त कमजोर पड़ने बस का उपयोग करने से पहले बनाते हैं ।
  2. स्थिरीकरण और संकरण का अनुकूलन
    नोट: एक SPCE के साथ संशोधित पीएलए-AuNPs, चिह्नित के रूप में SPCE/पीएलए-AuNPs, इस अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया था और एक बूंद कास्टिंग विधि डीएनए स्थिरीकरण और संकरण के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
    1. पहला, SPCE/पीएलए-AuNPs पर thiolated ssDNA जांच के 25 µ एल मैटीरियल और फिर हवा इसे 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सूखी, जिसके बाद यह चिह्नित/पीएलए-SPCE/AuNPs के रूप में अंत में ssDNA हो जाएगा । तीन कारकों का उपयोग करके स्थिरीकरण शर्त के अनुकूलन का निर्धारण: ssDNA की एकाग्रता (०.२ से १.४ µ मीटर तक), समय (30 से २१० मिनट से लेकर), और तापमान (25 से ७५ डिग्री सेल्सियस तक) ।
    2. पूरक डीएनए के पिपेट 25 µ l की सतह पर SPCE/पीएलए-AuNPs/ssDNA को बाहर ले जाने के लिए संकरण घटना जिसके बाद यह चिह्नित/पीएलए-SPCE/AuNPs के रूप में अंत में dsDNA जा सकता है । समय के दो कारकों (5 से 30 मिनट से लेकर) और तापमान (25 से ७५ डिग्री सेल्सियस) को लेकर के माध्यम से संकरण हालत का अनुकूलन निर्धारित करें ।
    3. 20 µ एम एमबी में मैटीरियल और संकरित इलेक्ट्रोड को 30 मिनट के लिए विसर्जित करें । ०.५ m ABS/20 mM NaCl (pH ४.५) के साथ धुलाई के द्वारा गैर-विशेष रूप से adsorbed डीएनए और अधिक MB निकालें और फिर जल के साथ कुल्ला । DPV तकनीक का उपयोग कर एमबी कमी की चोटी वर्तमान उपाय । ०.१ मीटर पंजाबियों (पीएच 7) कोई संकेतक युक्त का उपयोग कर DPV माप निष्पादित.
  3. गढ़े डीएनए के लक्षण वर्णन
    1. SPCE/पीएलए-AuNPs 20 µ एम एमबी में 30 मिनट के लिए विसर्जित, ०.५ m ABS/20 मिमी NaCl (पीएच ४.५) के साथ धो, और फिर को मापने से पहले पानी के साथ कुल्ला । जांच डीएनए, पूरक डीएनए, बेमेल डीएनए, और गैर पूरक डीएनए नमूने सहित सभी बातचीत के लिए एक समान प्रक्रिया का पालन करें ।
    2. विद्युत कमी को मापने ।
      नोट: हम DPV अंतरफलक सॉफ्टवेयर के साथ एक व्यावसायिक रूप से निर्मित Autolab का उपयोग कर मापा ।
      एमबी विद्युत कमी की DPV माप से लेकर क्षमता पर प्रदर्शन किया-०.५ v से ०.२५ v, ०.००५ v, ०.०५ v के मॉडुलन आयाम के एक कदम की क्षमता के साथ, और ७.७३ mVs-1 ०.१ एम पंजाबियों (पीएच 7) में एक स्कैन दर, कोई संकेतक युक्त । selectivity, संवेदनशीलता, reproducibility, और गढ़े डीएनए की गर्मी स्थिरता सेंसर आगे का अध्ययन किया गया । रिपोर्ट किए गए परिणाम के रूप में अर्थ मान माप तीन प्रतिकृति में प्रस्तुत किए गए थे ।

3. गढ़े डीएनए का सत्यापन असली नमूनों का उपयोग कर संवेदक

  1. बैक्टीरियल उपभेदों की तैयारी
    1. बैक्टीरियल नमूने के आधार पर समुद्री भोजन के अपने महत्वपूर्ण संदूषण31,३२ का चयन करें ।
      नोट: संदर्भ उपभेदों और 8 अंय जीवाणु उपभेदों के रूप में V. parahaemolyticus (कैम्पिलोबैक्टर jejuni, लिस्टिरिया monocytogenes, साल्मोनेला typhimurium, साल्मोनेला आंत्रशोथ, Klebsiella निमोनिया, ई कोलाई O157: H7, बैसिलस cereus, और आम Vibrio रोगज़नक़ के alginolyticus foodborne) इस अध्ययन में विद्युत डीएनए की मान्यता के लिए नियोजित किया गया.
    2. अपने व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए हर दो सप्ताह में अपने संबंधित आगार पर बैक्टीरियल उपभेदों की एक दिनचर्या उप संस्कृति आचरण, संस्कृति की स्थिति के लिए तालिका 1 देखें ।
    3. अपने संबंधित बढ़ते शोरबा में जीवाणु उपभेदों के लंबे समय तक संरक्षण बनाए रखने के 20% (v/v) ग्लिसरॉल-८० ° c के रूप में ग्लिसरॉल बर्फ क्रिस्टल है कि उंहें ठंड प्रक्रिया के दौरान नुकसान कर सकते है के गठन को रोकने के द्वारा बैक्टीरिया की रक्षा । अगले, inoculate ग्लिसरॉल शेयरों में संरक्षित बैक्टीरियल कोशिका संस्कृति के एक पाश संबंधित शोरबा में । उनके संबंधित विकास के समय और तापमान जब बैक्टीरिया को पुनर्जीवित करने की जरूरत के अनुसार शोरबा मशीन ।
    4. V. parahaemolyticus कोशिकाओं की मात्रा का निर्धारण एक प्रसार प्लेट तकनीक का उपयोग कर३३, एक मानक और एक अच्छी तरह से ज्ञात विधि के लिए कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला से व्युत्पंन सूक्ष्मजीवों की गणना के लिए ।
      1. Trypticase सोया शोरबा में संस्कृति V. parahaemolyticus (TSB + 3% NaCl) में ३७ ° c १४०-rpm मिलाते हुए हालत में । फिर, एक 10-1 कमजोर पड़ने कारक प्राप्त करने के लिए बैक्टीरिया सेल संस्कृति के 9 मिलीलीटर TSB + 3% NaCl में स्थानांतरण ।
    5. 10-10 कमजोर पड़ने वाले कारक की पूरी श्रृंखला पाने के लिए इस चरण को नौ बार दोहराएं । इसके बाद, प्रत्येक कमजोर पड़ने वाले कारक के ०.१ मिलीलीटर फैले (10-1 से 10-10) कॉलोनी की गिनती के लिए एक Vibrio चुनिंदा आगर प्लेट पर, क्रमशः । मशीन प्लेटें ३७ ° c में 24 घंटे के लिए मशीन ।
    6. एक कॉलोनी काउंटर का उपयोग करने के लिए व्यक्तिगत कालोनियों गिनती और फिर वापस गणना (CFU/pipetted राशि एक्स कमजोर पड़ने फैक्टर गिनती) milliliter घनत्व (CFU mL-1) के अनुसार एक कॉलोनी बनाने इकाई पाने के लिए । CFU एमएल-1 के अंशांकन भूखंड से बैक्टीरिया कोशिका निलंबन में कालोनी बनाने वाली इकाइयों (CFUs) की एकाग्रता को अवशोषित कर लेता है ।
  2. पीसीआर की तैयारी परख
    1. एक संशोधित उबला हुआ lysis प्रक्रिया३४निंनलिखित जीनोमिक डीएनए निकालें । सबसे पहले, आगर मीडिया पर एक व्यक्ति जीवाणु तनाव लकीर और शोरबा मीडिया में यह inoculate, इसके सापेक्ष विकास हालत, एक १४० आरपीएम मिलाते हुए हालत में यह मशीन द्वारा पीछा किया ।
    2. पिपेट एक सूक्ष्म केंद्रापसारक ट्यूब में शोरबा के 1 मिलीलीटर संस्कृति है । ४८३० x g पर इस केंद्रापसारक और 1 मिनट के लिए 4 ° c छर्रों प्राप्त करने के लिए । के बारे में ५०० µ का प्रयोग करें l बाँझ ते बफर के लिए फिर से गोली के साथ निलंबन. एक हीटिंग ब्लॉक में ९८ ± 2 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए परिणामी निलंबन पकड़ो और तुरंत इसे ठंडा-18 डिग्री सेल्सियस के लिए 10 मिनट के लिए कोशिकाओं लाइसे और डीएनए जारी ।
    3. ४८३० x g पर जीनोमिक डीएनए और 3 मिनट के लिए 4 ° c एक स्पष्ट निलंबन प्राप्त करने के लिए और अधिक उपयोग के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर supernatant रखना । २६० एनएम के एक तरंग दैर्ध्य में यूवी अवशोषण के साथ एक biophotometer माप का उपयोग करें (के रूप में न्यूक्लिक प्रकाश की तरंग दैर्ध्य को अवशोषित एसिड) और भी २८० एनएम के एक तरंग दैर्ध्य पर (के रूप में प्रोटीन प्रकाश की तरंग दैर्ध्य को अवशोषित) एकाग्रता और पवित्रता का निर्धारण करने के लिए निकाली जीनोमिक डीएनए और फिर मानक जैव रासायनिक परख३५ का उपयोग कर सभी उपभेदों की पहचान और उंहें 16S rRNA जीन अनुक्रमण३६द्वारा सत्यापित । अंत में, 2 मिनट के लिए ९२ ° c पर जीनोमिक डीएनए स्वभाव और यह तेजी से बर्फ के पानी में ठंडा करने से पहले के लिए आवेदन करने के लिए ।
    4. इसके अलावा उपस्थिति V. parahaemolyticus की पुष्टि के लिए पीसीआर का उपयोग कर toxR जीन लक्ष्य । एक प्राइमरी जोड़ी (5 '-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3 ' और 5 '-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3 ') का उपयोग कर एक thermocycler में इस प्रक्रिया को पूरा करें । 25 µ की कुल प्रतिक्रिया मात्रा में पीसीआर प्रवर्धन का अनुकूलन बाँझ पानी (१५.५ µ एल) से मिलकर l, बफर (5 µ एल), प्राइमर (1 µ एल, 10 µ एम), dNTP मिश्रण (1 µ एल), डीएनए टेम्पलेट (2 µ एल), और Taq डीएनए पोलीमरेज़ (०.२ µ एल, 10x).
    5. घटक अच्छी तरह से मिश्रण और प्रवर्धन के 30 चक्र के लिए क्रमादेशित एक thermocycler में लक्ष्य अनुक्रम की पीसीआर प्रवर्धन की व्यवस्था । हमारे अध्ययन में, प्रत्येक चक्र तीन कदम प्रतिक्रियाओं अर्थात्शामिल थे, प्रारंभिक विकार (९४ ° c, 3 min) विकार (९४ ° c, 1 min), एनीलिंग (६३ ° c, १.५ min) और विस्तार (७२ ° c, १.५ मिनट), अंतिम विस्तार (७२ ° c, 7 मिनट) के बाद के 30 चक्र द्वारा पीछा किया ।
    6. १.५% agarose जेल पर ट्रो के माध्यम से प्रवर्धित उत्पादों और उनके आकार का निर्धारण । एक व्यावसायिक रूप से उत्पादित जेल-प्रलेखन प्रणाली के साथ जेल छवियों पर कब्जा ।
  3. cockle के नमूने तैयार
    1. ताजा नमूने प्राप्त करें ।
      नोट: हमारे ताजा cockles (Anadara granosa) Serdang, Selangor में गीला बाजार से प्राप्त किया गया है, और जल्दी से विश्लेषण के लिए एक आइस कूलर बॉक्स में प्रयोगशाला के लिए लाया । 2 समूहों, अर्थात् इलाज और अनुपचारित समूह में नमूने विभाजित, यह सोचते है कि cockles फसल की शुरुआत से समान रूप से काटा गया था जब तक उंहें ठंडे भंडारण में रखने ।
    2. इलाज समूह में पूर्व उपचार cockles-20 ° c 24 एच के लिए, 20 ° c पर यूवी प्रकाश के लिए जोखिम के बाद 4 एच डीएनए निष्कर्षण करने से पहले के लिए भंडारण द्वारा ।
      नोट: ठंड तापमान और नियंत्रित समूह के लिए इस्तेमाल किया यूवी जोखिम मारता है या कम-से-cockles में स्वाभाविक रूप से जमते वी parahaemolyticus सीमा । इस अध्ययन में नियंत्रित स्थिति के उद्देश्य के रूप में ७० डिग्री सेल्सियस के एक उच्च pasteurization शासन लागू न करें ताजा cockles की वास्तविक स्थिति की नकल है । इस बीच, बिना किसी पूर्व उपचार के सीधे इलाज समूह से नमूनों का विश्लेषण करें जैसे ही वे प्रयोगशाला में पहुंचते हैं ।
    3. उपसंस्कृति एक तनाव के V. parahaemolyticus ATCC १७८०२ में TSB (3% NaCl) । सीए पर TSB (3% NaCl) के उपयुक्त कमजोर पड़ने की चढ़ाना के माध्यम से इनोक्युलम में व्यवहार्य कोशिकाओं के स्तर का निर्धारण V. CFUके 104 parahaemolyticus एमएल-1 के एक इनोक्युलम प्राप्त करने के लिए । आसुत जल में एक cockle धोने और यह गंदगी से मुक्त एक लामिना प्रवाह कैबिनेट में बाँझ संदंश का उपयोग करने के लिए खोल से ऊतकों को हटाने से पहले साफ़ ।
    4. Homogenize के बारे में 10 ग्राम cockle ऊतक के नमूनों में से एक homogenizer के साथ ९० मिलीलीटर बाँझ TSB (3% NaCl) के लिए ६० एस के लिए एक ज्ञात राशि जोड़ें V. parahaemolyticus homogenized नमूना शोरबा के 9 मिलीलीटर के लिए नुकीला नमूनों । एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में unspiked नमूनों का उपयोग करें । V. parahaemolyticus के सेल की गिनती का अनुमान cockle नमूनों पर सीए पर नमूनों की ०.१ मिलीलीटर चढ़ाना द्वारा नुकीला, और बाद में, pipetting नमूने के 1 मिलीलीटर डीएनए नमूना निष्कर्षण के लिए एक microcentrifuge ट्यूब में, के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए
    5. एक संशोधित उबला हुआ lysis प्रक्रिया३६के बाद नुकीला और unspiked नमूनों से V. parahaemolyticus के जीनोमिक डीएनए निकालें । अंत में, डीएनए एकाग्रता और शुद्धता का निर्धारण २६० एनएम के एक तरंग दैर्ध्य में यूवी अवशोषण के साथ एक जैव फोटोमीटर माप का उपयोग (के रूप में न्यूक्लिक प्रकाश की तरंग दैर्ध्य अवशोषित एसिड) और भी २८० एनएम के एक तरंग दैर्ध्य पर (के रूप में प्रोटीन प्रकाश की तरंग दैर्ध्य अवशोषित) ।

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Representative Results

AuNPs के गठन सोडियम साइट्रेट वर्तमान के साथ जलीय समाधान के रंग में परिवर्तन के माध्यम से पता चला था । इस कारण रंग हल्का पीला से बदल कर गहरे माणिक लाल के पास गया । पीएलए की पीढ़ी-AuNPs की पुष्टि यूवी विज़ स्पेक्ट्रा (चित्रा 1) से हुई जहां सतह plasmon अनुनाद (SPR) चोटी की वृद्धि लगभग ५४० एनएम पर पाई गई । गठन और पीएलए के अस्तित्व-AuNPs 500-600 एनएम तरंग दैर्ध्य पर्वतमाला पर संकेत दिया गया था, कण आकार के आधार पर३७। AuNPs और पीएलए-AuNPs के XRD पैटर्न चित्रा 2में दिखाए जाते हैं । सभी crystallite चोटियों ३१.७, ३८.२, ४४.४, ६४.७, और ७७.७ ° के 2θ में मनाया गया । वे (१००) (१११) (२००) (२२०), और (३११) घन-एफसीसी (चेहरा केंद्रित घन) स्वर्ण (धातु) nanostructures (JCPDS फ़ाइल no.-00-004-0783) के crystallographic विमानों को जिंमेदार ठहराया गया । पीएलए-AuNPs crystallite पीक तीव्रता भी ३१.७ डिग्री पर केंद्रित एक व्यापक विवर्तन शिखर के रूप में वृद्धि हुई, जिसका अर्थ है कि AuNPs पीएलए में एंबेडेड थे और polyphasic गोल्ड nanostructures के गठन का सुझाव३८। इसके अलावा, पीएलए पर दिखाए गए सभी AuNP विवर्तन चोटियों-AuNPs ने संकेत दिया कि AuNPs के पास एक स्थिर ढांचा था । पीएलए का मतलब आकार-AuNPs Scherrer के समीकरण (एल = kλ/βcosθ), (१००) डींग मारने की परछाई की चौड़ाई निर्धारित करने का उपयोग कर की गणना की गई थी । FWHM और डी रिक्ति (तालिका 2) से, पीएलए-AuNPs के crystallite आकार की गणना 27 एनएम के रूप में की गई थी ।

पीएलए के आयामों-AuNPs और इसकी आकृति विज्ञान आगे उनि का उपयोग कर जांच की गई । उनि कण वितरण वक्र और पीएलए-AuNPs की छवियों से, यह देखा गया कि सोने नैनोकणों आकार में लगभग गोलाकार थे (चित्र 3) । नैनोकणों के आकार के बारे में ३७ एनएम की सीमा में था, थोड़ा Scherrer सूत्र से प्राप्त की तुलना में बड़ा है, के रूप में-संश्लेषित नैनोकणों३९के एक polycrystalline प्रकृति का सुझाव । छोटे उनि के विपरीत में XRD से उत्पंन आकार भी पिछले अनुसंधान में देखा गया है, सबसे अधिक संभावना है क्योंकि कण संरचना प्रकृति में polycrystalline है क्योंकि crystallites की महत्वपूर्ण राशि है कि छोटे है (उप कणों)४० . चित्रा 4 SPCE पर के रूप में तैयार पीएलए-AuNPs की FESEM छवि से पता चलता है । यह FESEM छवियों और EDX स्पेक्ट्रा से स्पष्ट है कि SPCE/पीएलए-AuNPs सोने, सबसे बड़ा घनत्व का सबसे अधिक वजन प्रतिशत था, और nanoparticle कवरेज की सबसे बड़ी सतह । यह भी ध्यान दिया जा सकता है, विशेष रूप से, कि चित्रा 4(एक) एक नंगे SPCE की FESEM छवि से पता चलता है । चित्र 4(b) में FESEM छवि अच्छी तरह से वितरित पीएलए-AuNPs से पता चलता है । संश्लेषित पीएलए-' AuNPs रासायनिक संरचना वाणी करने के लिए, EDX के रूप में उत्पादित पीएलए-AuNPs की रासायनिक संरचना की जांच करने के लिए नियोजित किया गया था, चित्रा 4(ए)और 4(बी) के अनुसार । EDX स्पेक्ट्रम की पुष्टि की है कि के रूप में उत्पादित पीएलए-AuNPs स्वर्ण (Au) से बना रहे थे ही, और कार्बन (सी) और ऑक्सीजन (ओ) के लिए इसी चोटी को छोड़कर कोई अंय तत्व प्रदर्शित । सी पीक की उपस्थिति कार्बन इलेक्ट्रोड के लिए जिस पर नमूना ड्रॉप कास्ट किया गया था के कारण था ।

EDX स्पेक्ट्रम की मौजूदगी से भी पता चला हे संकेत है कि कार्बन इलेक्ट्रोड पर ऑक्सीजन adsorbed थी क्योंकि फिल्म में हवा आ गई थी. यह इस बात की पुष्टि करता है कि ऑक्सीजन कार्बन नैनोट्यूब पर adsorbed है तो वे लंबे समय तक४१तक हवा में नजर आ जाते हैं । यद्यपि वहां हवा में विभिंन गैस अणु हैं, ऑक्सीजन हवा पर मुख्य adsorbate कार्बन नैनोट्यूब४२, संभवतः अपनी तेजी से सोखना के कारण अंय अणुओं४३के साथ तुलना में उजागर माना जा रहा था । इस ऑक्सीजन नमूना तैयारी में रातोंरात हवा जोखिम के दौरान कार्बन इलेक्ट्रोड पर मुख्य adsorbate था और पीएलए की रासायनिक शुद्धता-AuNPs प्रबलित कि खोजने पर आधारित था । anodic और कैथोडिक पीक (ipa/ipc) का अनुपात लगभग 1 था, जिसने स्कैन दर को बढ़ाकर४४के रूप में निरंतर पीक क्षमता दी थी । इसके अलावा, anodic और कैथोडिक चोटी की क्षमता अलग स्कैन की दर४५ सुझाव है कि विद्युत प्रतिक्रिया प्रतिवर्ती पीक जुदाई (चित्रा 5) के आधार पर किया गया था पर लगातार थे । संशोधित इलेक्ट्रोड के सक्रिय सतह क्षेत्र Randles-Sevick समीकरण का उपयोग करते हुए परिकलित किया गया था (ipc = (7.3× 10 5) n3/2 AD1/2 Cv1/2। भूखंड की ढलान से मैंपीसी बनाम v1/2 में चित्रा 5(ए) और (बी), इलेक्ट्रोड की सतह क्षेत्र ०.२६ सेमी2 और ०.४१ सेमी2 के रूप में गणना की गई थी नंगे SPCE और पीएलए-AuNPs के लिए क्रमशः । इस परिणाम की पुष्टि की है कि सक्रिय सतह क्षेत्र पर पीएलए-AuNPs द्वारा वहन सुधार नंगे SPCE के साथ तुलना में अपेक्षाकृत अधिक था । व्युत्पंन परिणाम बहुलक के लिए तुलनीय था-एंबेडेड गोल्ड नैनोकणों (β-CD-EDAS (N-[3-(trimethoxysilyl) propyl] ईथीलीन-डायमाइन मैट्रिक्स समझाया गोल्ड नैनोकणों), जो कि एक उच्च सक्रिय सतह क्षेत्र की प्रक्रिया को बढ़ाया पता चला इलेक्ट्रॉन-हस्तांतरण और इसलिए बेहतर संवेदनशीलता के परिणामस्वरूप४६।

संशोधित SPCE विद्युत प्रतिक्रिया नियंत्रित प्रसार की एक प्रक्रिया में था, कश्मीर में कमी के द्वारा दिखाया गया3[Fe (CN)6]3-/4 पीक वर्तमान, जो बारी में स्कैन दर वर्ग रूट के वर्तमान पर भरोसा (v 1/2). संशोधित इलेक्ट्रोड गुणों का एक बेहतर दृश्य प्राप्त करने के लिए, CV माप के संदर्भ में प्रस्तुत संशोधित इलेक्ट्रोड के प्रदर्शन के साथ सहसंबंधी करने के लिए एक विद्युत प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी (EIS) अध्ययन किया गया था. उच्च आवृत्तियों पर देखा अर्धवृत्त खंड EIS में इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण की सीमित प्रक्रिया के साथ संबंधित । प्रभारी स्थानांतरण प्रतिरोध (आरसीटी) सीधे अर्धवृत्त के व्यास के रूप में मापा गया था । यह परिणाम नंगे SPCE, जो १९३२ ω था की आरसीटी के मूल्य के साथ मिलाया और जहां SPCE/पीएलए-AuNPs के संशोधन के १४४४ ω (चित्रा 6) में कमी आई । SPCE/पीएलए-AuNPs में Rct मान की कमी से स्थानीय अचालक स्थिरांक में कमी आई है और/या बिजली की डबल लेयर४७की मोटाई में वृद्धि हुई है, सुझाव है कि K3[Fe (CN)6]3- /4- धातु पर सोखना द्वारा समारोह/ इन outputs (चित्रा 7) CV के माप से व्युत्पंन लोगों के साथ अनुपालन. पीक धाराओं पीएलए का उपयोग कर SPCEs के संशोधन के साथ उत्तरोत्तर वृद्धि हुई-AuNPs, जो पता चला कि एक उच्च संवेदनशीलता कम आरसीटी४८के व्युत्क्रम था । इस प्रकार, की CV के मूल्य में वृद्धि संशोधित इलेक्ट्रोड और आरसीटी मूल्यों में कमी पानी के अणुओं के क्रमिक प्रतिस्थापन के कारण किया गया है हो सकता है (पानी के अणुओं की मात्रा २७.१९ Å3है) K3 के सोखना द्वारा [Fe (CN)6] 3-/4- धातु की सतह पर, विघटन प्रतिक्रिया४९की सीमा को कम ।

तालिका 3 संशोधित इलेक्ट्रोड की दोहराव और reproducibility के सापेक्ष मानक विचलन (RSD) को इंगित करता है । नित्य CV रिकॉर्डिंग K3[Fe (CN)6]3-/4- संशोधित इलेक्ट्रोड की पुनरावृत्ति की जांच करने के लिए लगातार छह सेट के लिए किया गया था । SPCE/पीएलए-AuNPs का RSD ४.२६% के रूप में प्राप्त किया गया था । पीएलए-AuNPs संशोधन के साथ इलेक्ट्रोड कई माप के बाद बेहतर RSD दिया. इसके अलावा, एक ही प्रक्रिया का उपयोग, छह संशोधित इलेक्ट्रोड स्वतंत्र रूप से गढ़े थे, जो SPCE/पीएलए-AuNPs के लिए ४.०५% की RSD मूल्यों दिया, पीएलए-AuNPs के लिए इलेक्ट्रोड निर्माण के बेहतर reproducibility का संकेत है । पीएलए-AuNPs के आधार पर संशोधित सब्सट्रेट को एक विस्तारित अवधि के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था । यह भी 20 चक्र के रिकॉर्ड और संकेत गुणवत्ता में 18% की कमी के लिए उपयोग किया गया था । आदेश में ssDNA एकाग्रता और संकरण के लिए मानदंडों के साथ साथ, एक साथ, स्थिरीकरण अवधि, तापमान, से अधिकतम उत्पादन प्राप्त करने के लिए जांच की गई । इन शर्तों को अनुकूलित करने की जरूरत है, क्योंकि वे DPV के शिखर वर्तमान प्रभाव । ssDNA एकाग्रता का अनुकूलन करने के लिए, SPCE/पीएलए-AuNPs अलग एकाग्रता के साथ pipetted था (०.२, ०.४, ०.६, ०.८, १.०, १.२ और १.४ µ एम) ssDNA के ६० मिनट के लिए इतना है कि ssDNA के इष्टतम एकाग्रता निर्धारित किया गया था । चित्रा 8के आधार पर, DPV पीक वर्तमान उच्च डीएनए सांद्रता के रूप में वृद्धि का इस्तेमाल किया गया । अध्ययन में यह भी पाया गया कि डीएनए के अनुकूलित एकाग्रता १.२ µ एम ssDNA था ।

SPCE/पीएलए-AuNPs में एकल-असहाय डीएनए को शामिल करने के लिए स्थिरीकरण अवधि का अनुकूलन करने के लिए, ssDNA (१.२ µ m) के 25 µ l का परीक्षण विभिन्न समयों (30, ६०, ९०, १२०, १५०, १८० और २१० मिनट) पर किया गया । चित्रा 9में, निष्कर्ष DPV पीक वर्तमान की निरंतर वृद्धि में जिसके परिणामस्वरूप स्थिरीकरण अवधि में वृद्धि दिखा । इस प्रकार, ssDNA का इष्टतम स्थिरीकरण समय १८० मिनट के रूप में चुना गया था । स्थिरीकरण तापमान का अनुकूलन करने के लिए, SPCE/पीएलए-AuNPs के साथ pipetted किया गया था ssDNA (१.२ µ m) विभिन्न तापमान में (७५, ६५, ५५, ४५, ३५, और 25 डिग्री सेल्सियस) १८० मिनट के लिए. हमने पाया है कि जब स्थिरीकरण के तापमान ५५ डिग्री सेल्सियस के लिए बढ़ गया था, DPV पीक वर्तमान शुरू में एक बाद मूल्यह्रास के बाद आगे बढ़ा (चित्र 10); इस प्रकार, ५५ ° c अनुकूलित स्थिरीकरण तापमान के रूप में बाद में प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा करने के लिए चुना गया था । ssDNA की जुदाई है कि इलेक्ट्रोड की सतहों से और संकरण अक्षमता वृद्धि हुई तापमान की वजह से किया गया है । समान परिणाम५०के साथ अंय रिपोर्ट्स की गई हैं । सोने की नैनोकणों की सतहों से तेजी से बंटवारे और डीएनए के अध कि उच्च तापमान५१पर हुई । अनुसंधान हाल ही में आयोजित की रिपोर्ट है कि सोने और thiol ऑक्सीकरण के बीच बांड जल्दी नीचा और बस एक स्थिति है कि परिवेश में है, उदाहरण के लिए जब पानी, हवा के संपर्क में है, और प्रकाश५२,५३,५४। इस अध्ययन में संकरण समय के प्रभाव की भी जांच की गई ।

गढ़े SPCE/पीएलए-AuNPs/ssDNA अलग संकरण टाइंस (5, 10, 15, 20, 25, और 30 मिनट) में लक्ष्य डीएनए (०.२ µ m) के समाधान के साथ ड्रॉप कास्ट था । DPV की प्रतिक्रिया स्पष्ट रूप से गुलाब, एक 5-मशीन के समय में ंयूनतम वृद्धि के साथ (5 से 10 मिनट) (चित्र 11) । एक बार इस मूल्य प्राप्त किया गया था, एक 10 से 30 मिनट नीचे पैटर्न तो संकरण के लिए वांछित समय 10 मिनट के रूप में चुना गया था मनाया गया था । संकरण की क्षमता 25 डिग्री सेल्सियस से ३५ डिग्री सेल्सियस (चित्रा 12) के तापमान में वृद्धि के साथ वृद्धि हुई है । उच्च वर्तमान धीरे से एक तापमान ३५ डिग्री सेल्सियस से अधिक कम करने के लिए देखा गया था । इस के लिए कारण का पता लगाने के संकेत को कम करने विकार सैंडविच संरचना के लिए जिंमेदार ठहराया गया था । इसलिए, इष्टतम संकरण तापमान चयनित ३५ ° c था । प्रक्रिया हम V. parahaemolyticus का पता लगाने में इस्तेमाल किया AuNPs काम इलेक्ट्रोड के सक्रिय सतह क्षेत्र को बढ़ाने के लिए, सतह संशोधन और redox परिसर, एमबी मध्यस्थता करने के लिए पीएलए, यह पौंड के लिए कम करने के लिए. इस ऑक्सीकरण प्रक्रिया के परिणाम ssDNA और एमबी५५के बीच एक बेहतर संबंध था । DPV वर्तमान अपने पूरक अनुक्रम के साथ ssDNA के संकरण के दौरान संलग्न एमबी अणुओं की कम संख्या के कारण कम हो गया था.

हमने विकसित किए गए उपसेंसरों के प्रदर्शन में आगे की जांच की । DPV परिणाम चित्रा 13 में पता चलता है कि यह चुन कर पाया गया जांच डीएनए, पूरक डीएनए, एक आधार बेमेल डीएनए, तीन आधार बेमेल डीएनए, और गैर पूरक डीएनए एमबी की उपस्थिति में खोज लेबल के रूप में भेद करने में सक्षम था५६, ५७. सबसे कम शिखर वर्तमान (०.७३ µA) पूरक डीएनए द्वारा प्रदर्शित किया गया था, जो धीरे से एक आधार बेमेल डीएनए (०.९४ µA), तीन कुर्सियां बेमेल डीएनए (१.०५ µA), गैर पूरक डीएनए (३.२५ µA), और जांच डीएनए (४.७९ µA) की वृद्धि हुई । लक्ष्य डीएनए वर्तमान oligonucleotide के सभी धाराओं के सबसे छोटे था हमारे oligonucleotide संवेदनशील और विशेष रूप से के अनुक्रम के बीच भेदभाव करने के लिए सेंसर की अनुमति अनुक्रम । एमबी एक बड़ी DPV पीक वर्तमान उत्पादन मैटीरियल जांच डीएनए के ssDNA के साथ दृढ़ता से बंधे । SPCE/पीएलए-AuNPs/गैर पूरक डीएनए कम मैटीरियल जांच डीएनए वर्तमान के रूप में केवल एमबी की एक छोटी राशि SPCE/पीएलए-AuNPs/dsDNA की सतह पर इकट्ठे के रूप में लगभग आधे से । यह एमबी और guanine ठिकानों के बीच दुर्गम बातचीत के कारण होने की संभावना है. डीएनए और एमबी के संपर्क मोड दृढ़ता से पीएच, तापमान, डीएनए एकाग्रता, ईओण ताकत, और बफर के प्रकार के रूप में ऐसी प्रयोगात्मक शर्तों पर निर्भर है५८,५९। एमबी आमतौर पर dsDNA के लिए लिंक नाली और intercalative मोड, dsDNA सतह पर एमबी संचय में जिसके परिणामस्वरूप६०। एक आधार बेमेल डीएनए और तीन आधार बेमेल डीएनए लगातार कम DPV पीक धाराओं और पूरक लक्ष्य डीएनए इस प्रवृत्ति को जारी रखा करने के लिए हमारे कब्जा जांच डीएनए के जोखिम । तालिका 4 MB पीक वर्तमान के लिए selectivity दर का प्रतिशत दिखाता है । हमारे समग्र खोज था कि निर्माण डीएनए के संकरण SPCE/पीएलए-AuNPs ' सतह पर मैटीरियल जांच डीएनए के माध्यम से उच्च चयनात्मक था ।

विकसित डीएनए की संवेदनशीलता के साथ-साथ पूरक लक्ष्य oligonucleotide की विभिन्न सांद्रता के साथ जांच की गई । चित्रा 14 SPCE/पीएलए-AuNPs पर एमबी के DPV पीक वर्तमान के क्रमिक कमी के रूप में पूरक डीएनए एकाग्रता में वृद्धि दर्शाया गया है । चित्र 15 एक रैखिक प्रतीपगमन गुणांक ०.९६ का जो लॉग कम MB पीक वर्तमान और लक्ष्य डीएनए (०.२ pM के लिए ०.०२ mM) के कई एकाग्रता के लॉग के बीच उत्पन्न किया गया था का प्रदर्शन । चोटी के वर्तमान परिवर्तन (ΔP) का ग्राफ 3σ/एम फार्मूला (σ रिक्त समाधान के मानक विचलन जा रहा है और मीटर रैखिक वक्र की ढलान जा रहा है) का उपयोग कर प्लॉट किया गया था६१,६२,६३। गढ़े डीएनए का पता लगाने की सीमा के लिए ४.४३ प्रधानमंत्री जो हमारे छोटे से वास्तव में मापा नमूना से अधिक था की गणना की गई थी । यह परिणाम इस तथ्य के साथ समझौते में था कि ΔP के लिए ०.२ बजे और 2 बजे (2.65 × 10-6 ए और 10 ×-6 के एक मानक विचलन के साथ 1.19 × 10-7 ए और 1.06 × 10-7 ए, क्रमशः छा.

गढ़े डीएनए के लिए LOQ की गणना करने के लिए, हम 10σ/एम फार्मूला जिसमें (σ खाली समाधान मानक विचलन और एम है रैखिक वक्र की ढलान है) का उपयोग किया और परिणाम के लिए १४.८ का लाभ हो पाया । दोहराया विकार पूरक डीएनए के अपने उत्थान की क्षमता के मामले में डीएनए के लिए का आकलन करने के लिए किया गया था । हम ०.२ µ एम पूरक डीएनए की मशीन द्वारा इस किया-गर्म पानी में संशोधित इलेक्ट्रोड 8 मिनट के लिए डबल-कतरा डीएनए स्वभाव के लिए, एक बर्फ स्नान में तेजी से ठंडा करने के लिए विकृत एकल असहाय डीएनए बनाए रखने के बाद६४।

संकरण गतिविधि (n = 5, RSD = ४.०५%)) पुनर्जनन के 8 प्रयासों के बाद अपनी प्रारंभिक प्रतिक्रिया के ९१% पर बनाए रखा गया था । SPCE/पीएलए-AuNPs पर डीएनए जांच स्थिरीकरण के लिए सैम विधि पर आधारित डीएनए उच्च स्थिर था, दोहराया विकार प्रक्रियाओं के बाद पूरक डीएनए का पता लगाने में एक अच्छी प्रतिक्रिया प्राप्त करने । हमारे डीएनए की स्थिरता गर्मी के संबंध में सेंसर आगे पता लगाया गया था । ऐसा करने के लिए, हमने पीएलए-AuNPs/SPCE/ssDNA इलेक्ट्रोड 4 ° c, 25 ° c, और ४५ ° c के तापमान पर संग्रहित किया है जो सिलिका जैल युक्त सील एल्यूमिनियम पाउच में है । 6 महीने के अंत में, हम पूरक डीएनए का आकलन किया और संकेत उत्पादन की वसूली का प्रतिशत का अनुमान । चित्रा 16 से पता चलता है कि जांच SPCE/पीएलए-AuNPs/ssDNA अपने प्रारंभिक संकेत के ८०% से अधिक के साथ अत्यधिक स्थिर था अभी भी 6 महीने के भंडारण के बाद वसूली । पीएलए-AuNPs और ssDNA के बीच मजबूत प्रतिक्रिया ४५ डिग्री सेल्सियस से नीचे के तापमान पर दीर्घकालिक स्थिरता के लिए पाई गई ।

जीवाणुओं की नौ विभिन्न प्रजातियों (बी. cereus, एल. monocytogenes, सी. jejuni, ई. कोलाई O157: H7, वि. alginolyticus, एस. typhimurium, एस. आंत्रशोथ, के. निमोनिया और वी. parahaemolyticus) से पीसीआर डिटेक्शन की जांच की गई । प्रजाति के लिए पीसीआर प्रवर्धन उत्पादों V. parahaemolyticus के जीवाणु संस्कृति से विशिष्ट पता लगाने के चित्र 17में दिखाए जाते हैं । वी. parahaemolyticus के toxR जीन को वी. parahaemolyticus की पहचान के लिए पीसीआर प्राइमरी के रूप में इस्तेमाल किया गया था जो रोगजनकों के अलग होने के कारण होता है । पीसीआर एनालिसिस से वी. parahaemolyticus ने toxR जीन की ओर वी. parahaemolyticusकी पीसीआर प्राइमरी की विशिष्टता के कारण सकारात्मक परिणाम दिखाया । अन्य जीवाणु उपभेदों से कोई पीसीआर उत्पादों का पता लगाया गया । DPV पीक वर्तमान में एक क्रॉस-जेट मूल्यांकन के बाद प्राप्त अंय जीवाणु प्रजातियों के साथ तुलना में V. parahaemolyticus का बहुत स्पष्ट पता चला, के रूप में 18 चित्रमें दर्शाया गया है । आधार जोड़े की संख्या के रूप में DPV संकेत में वृद्धि हुई, एमबी जांच करने के लिए बाध्य अणुओं की बड़ी राशि के कारण । V. parahaemolyticus स्पष्ट रूप से अंय foodborne रोगजनकों जो खाद्य नमूना के वातावरण में नकल उतार से भेदभाव किया जा करने में सक्षम थे ।

Cockles इस अध्ययन में डीएनए के लिए असली नमूनों के रूप में चुना गया था क्योंकि वे स्थानीय भोजन के कई प्रकार में लोकप्रिय तत्व हैं । यह सर्वविदित है कि कच्चे cockles अक्सर रोगजनक वी. parahaemolyticus ले और मनुष्यों के लिए इन बैक्टीरिया संचारित कर सकते हैं, खासकर यदि वे अपर्याप्त है भंडारण के दौरान प्रशीतित६५कटाई के बाद । cockle नमूनों का इलाज समूह 24 घंटे के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था, और हमारे पूर्व उपचार कदम के दौरान डीएनए निष्कर्षण करने से पहले 4 एच के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर यूवी प्रकाश से अवगत कराया । चित्रा 19 से पता चलता है कि पीसीआर विश्लेषण V. parahaemolyticus दोनों इलाज और अनुपचारित (नुकीला) नमूनों में पाया । इस लेन 7, 8, 9, 10, 11 में दिखाया गया है, और 12 correlating पिछले चर्चा में कॉलोनी गिनती के साथ । No V. parahaemolyticus इलाज और अनुपचारित (unspiked) नमूनों में दिखाई देता है, जैसा कि लेन 1, 2, 3, 4, 5 और 6 में पीसीआर परिणामों में दिखाया गया है, हालांकि कॉलोनी गिनती नमूनों में अपनी उपस्थिति का संकेत दिया । इस के लिए एक संभावित कारण इस तरह के निकाले डीएनए६६में प्रोटीन के रूप में दूषित चयापचयों की उपस्थिति है ।

चित्रा 20 का पता लगाने के परिणाम विकसित डीएनए, जो सफलतापूर्वक इलाज समूह में नुकीला और unspiked नमूनों से मिलकर में V. parahaemolyticus की उपस्थिति निर्धारित का उपयोग कर सारांश । ये परिणाम सकारात्मक पहले से चर्चा की पीसीआर परिणामों के साथ सहसंबंधी बनाना । पीसीआर का हर नमूना है कि सकारात्मक परिणाम दिखाया पीएलए का उपयोग कर की खोज की थी-स्थिर विद्युतीय सेंसर तकनीक है, जो AuNP आधारित है, और DPV पीक क्षेत्र स्पष्ट रूप से परिणामी पीसीआर तीव्रता बैंड के साथ मेल खाती है (चित्रा 19 और चित्र 20). इन परिणामों से संकेत मिलता है कि इस अध्ययन में सुझाए गए nanoparticle-आधारित विद्युत संवेदक ने असली नमूनों में सफलतापूर्वक वी. parahaemolyticus का पता लगाया, इस प्रकार यह साबित होता है कि यह परिणामों की प्रामाणिकता पर कोई प्रभाव नहीं के साथ पीसीआर से बेहतर है ।

Figure 1
चित्र 1 : पीएलए के अवशोषक-AuNPs कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : पीएलए-AuNPs का एक्स-रे विवर्तन स्पेक्ट्रम । ref. [30] से अनुमति के साथ अनुकूलित । कॉपीराइट (२०१६) Sociedade Brasileira de Química. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : उनि आवृत्ति व्यास वितरण और ५० एनएम के माप पैमाने पर पीएलए-AuNPs के चित्र । ref. [30] से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कॉपीराइट (२०१६) Sociedade Brasileira de Química. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : EDX स्पेक्ट्रा और FESEM की छवियां (क) नंगे SPCE और (ख) SPCE/पीएलए-AuNPs. ref. [30] से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कॉपीराइट (२०१६) Sociedade Brasileira de Química. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : स्कैन दर वर्ग रूट और चक्रीय voltammograms के खिलाफ पीक वर्तमान ऑक्सीकरण की साजिश: (a) नंगे SPCE और (b) SPCE/पीएलए-AuNPs में १.० mmol L-1 K3[Fe (CN)6] (pH 7). स्कैन की दरें ३००, २५०, २००, १५०, १००, और ५० एमवी एस−1. ref. [30] से अनुमति के साथ अनुकूलित । कॉपीराइट (२०१६) Sociedade Brasileira de Química. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : १.० mmol में संशोधित इलेक्ट्रोड के प्रतिबाधा स्पेक्ट्रा L-1 कश्मीर 3 [Fe (CN)6] (pH 7) । आयाम: 5 एमवी, और आवृत्ति रेंज: 0.1-105 हर्ट्ज. रेफरी से अनुमति के साथ अनुकूलित. [22] । Copyright (२०१६) Elsevier. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : १.० mmol में संशोधित इलेक्ट्रोड के Anodic पीक वर्तमान में L-1 कश्मीर 3 [Fe (CN)6] (pH 7) ०.१ V s की स्कैन दर -1 चक्रीय voltammetry मापन का उपयोग करना कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8 : SPCE/पीएलए पर ssDNA स्थिरीकरण के लिए एकाग्रता का प्रभाव-AuNPs में ०.१ मॉल एल-1 ०.१ वी एस के स्कैन दरों पर पंजाब (पीएच 7) -1 20 µ एम एमबी में 30 मिनट की मशीन के बाद अंतर पल्स voltammetry माप का उपयोग कर कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9 : SPCE/पीएलए-AuNPs में ०.१ के लिए ssDNA स्थिरीकरण समय का प्रभाव -1 पंजाब (पीएच 7) ०.१ वी एस की स्कैन दर पर -1 20 µ एम एमबी में 30 मिनट की मशीन के बाद अंतर पल्स voltammetry माप का उपयोग कर कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 10
चित्र 10 : SPCE/पीएलए-AuNPs पर ssDNA स्थिरीकरण तापमान का प्रभाव ०.१ वी एस की स्कैन दर पर -1 at ०.१ मॉल L -1 पंजाब (पीएच 7) के 20 µ एम में 30 मिनट की एक मशीन की अवधि के बाद एमबी अंतर पल्स voltammetry माप का उपयोग कर कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 11
चित्र 11 : SPCE/पीएलए-AuNPs/ssDNA पर संकरण समय का प्रभाव ०.१ मोल -1 पंजाब (पीएच 7) ०.१ वी एस की स्कैन दर पर -1 20 µ एम एमबी में 30 मिनट की मशीन के बाद अंतर पल्स voltammetry माप का उपयोग कर कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 12
चित्र 12 : SPCE/पीएलए-AuNPs/ssDNA में संकरण तापमान का प्रभाव ०.१ मोल -1 पंजाब (पीएच 7) ०.१ वी एस की स्कैन दर पर -1 20 µ एम एमबी में 30 मिनट की मशीन के बाद अंतर पल्स voltammetry माप का उपयोग कर । ref. [22] से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । Copyright (२०१६) Elsevier. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 13
चित्र 13 : एमबी कमी पीक वर्तमान के हिस्टोग्राम ०.१ में डीएनए के विभिन्न प्रकारों का उपयोग कर रहा है L -1 पंजाब (पीएच 7) ०.१ वी एस की स्कैन दर पर -1 20 µ एम एमबी में 30 मिनट की मशीन के बाद । इनसेट एक ही परिस्थितियों में अंतर पल्स voltammograms दिखाता है । ref. [22] से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । Copyright (२०१६) Elsevier. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 14
चित्र 14 : एमबी कमी पीक वर्तमान के हिस्टोग्राम ०.१ मॉल में अलग डीएनए एकाग्रता का उपयोग L -1 पंजाब (पीएच 7) ०.१ वी एस की स्कैन दर पर -1 20 µ एम एमबी में 30 मिनट की मशीन के बाद अंतर पल्स voltammetry माप का उपयोग कर । ref. [22] से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । Copyright (२०१६) Elsevier. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 15
चित्र 15 : एक रैखिक भूखंड की कमी पीक ०.१ में अलग डीएनए एकाग्रता के लॉग के खिलाफ एमबी की धारा वर्तमान L -1 पंजाब (पीएच 7) ०.१ वी एस की स्कैन दर पर -1 20 µ एम एमबी में 30 मिनट की मशीन के बाद अंतर पल्स voltammetry माप का उपयोग कर । ref. [22] से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । Copyright (२०१६) Elsevier. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 16
चित्र 16 : भंडारण अंतराल के 6 महीनों में SPCE/पीएलए-AuNPs/ssDNA पर विभिन्न संकरण तापमान का प्रभाव (n = 3) । माप ०.१ मॉल एल-1 पंजाब (पीएच 7) में ०.१ वी एस-1 के 20 µ एम एमबी में 30 मिनट की मशीन के बाद अंतर पल्स voltammetry माप का उपयोग कर के स्कैन दर में किए गए थे । ref. [22] से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । Copyright (२०१६) Elsevier. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 17
चित्र 17 : Agarose जेल ट्रो-पीसीआर प्रवर्धन बैक्टीरिया संस्कृति से चयनित बैक्टीरिया के 16S rRNA जीन अनुक्रमण उत्पादों का उपयोग कर । लेन एम: 1kb डीएनए सीढ़ी, लेन सी −: नकारात्मक नियंत्रण (बाँझ आसुत जल), लेन सी +: सकारात्मक नियंत्रण ( ई. कोलाई से निकाले डीएनए टेंपलेट के रूप में प्रयोग किया जाता है), लेन चुनाव आयोग: ई. कोलाई O157: H7, लेन मुख्य ंयायाधीश: सी. jejuni , लेन बीसी: B. cereus, लेन केपी: K. निमोनिया, लेन अनुसूचित जनजाति: एस. typhimurium, लेन LM: L. monocytogenes, लेन एसई: एस. आंत्रशोथ, लेन उपाध्यक्ष: वी. parahaemolyticus और लेन VV: V. alginolyticus इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 18
चित्र 18 : के हिस्टोग्राम एमबी कमी पीक वर्तमान के लिए पार-refoodborne के खिलाफ डीएनए के गैर-जेट अध्ययन में विभिंन रोगजनकों ०.१ मॉल एल -1 पंजाब (पीएच 7) ०.१ वी एस की स्कैन दर पर -1 20 µ एम एमबी में 30 मिनट की मशीन के बाद अंतर पल्स voltammetry माप का उपयोग कर । ref. [23] से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । Copyright (२०१७) स्प्रिंगर. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 19
चित्र 19 : Agarose जेल ट्रो-पीसीआर के प्रवर्धन उत्पादों ताजे cockle नमूनों से वी. parahaemolyticus . लेन एम: १०० बीपी डीएनए सीढ़ी के 2ul, लेन 1-3: अनुपचारित unspiked नमूने, लेन 4-6: इलाज unspiked नमूने, लेन 7-9: अनुपचारित spiked नमूने, लेन 10-12: इलाज नुकीला नमूने, लेन सी +: सकारात्मक नियंत्रण (V. parahaemolyticus ATCC १७८०२), लेन सी-: नकारात्मक नियंत्रण (बाँझ आसुत जल) । ref. [23] से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । Copyright (२०१७) स्प्रिंगर. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 20
चित्र 20 : का पता लगाने के लिए एमबी कमी पीक वर्तमान के हिस्टोग्राम V. parahaemolyticus ताजा cockle नमूने में ०.१ मॉल एल-1 पंजाबियों (पीएच 7) में ०.१ वी एस-1 की स्कैन दर 20 µ एम एमबी में अंतर पल्स voltammetry माप का उपयोग करने के बाद 30 मिनट की मशीन के साथ । ref. [23] से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । Copyright (२०१७) स्प्रिंगर. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

इलेक्ट्रोड संरचना मशीन समय (एच) तापमान (° c) विकास मीडिया
कैम्पिलोबैक्टर jejuni ४८ ४२ बा. बीबी/
लिस्टिरिया monocytogenes ४८ 30 TSA TSB/
साल्मोनेला typhimurium 24 ३७ TSA TSB/
साल्मोनेला enteritidis 24 ३७ TSA TSB/
Klebsiella निमोनिया 24 ३७ ईएमबीए/TSB
ई कोलाई O157: H7 24 ३७ एमए TSB/
बैसिलस cereus 24 ३७ MYPA/TSB
Vibrio alginolyticus 24 ३७ TSA + 3% NaCl/TSB + ३% NaCl
Vibrio parahaemolyticus 24 ३७ CA/TSA + 3% NaCl/TSB + 3% NaCl

तालिका 1: चयनित बैक्टीरिया की संस्कृति की स्थिति.

नमूना पॉस. [° 2Th.] FWHM [° 2Th.] d-रिक्ति [Å] Crystallite आकार (एनएम)
पीएलए-AuNPs ३१.६८२ ०.३१४९ २.८२४३ 27

तालिका 2: पीएलए का आकार-AuNP crystallites। ref. [30] से अनुमति के साथ अनुकूलित । कॉपीराइट (२०१६) Sociedade Brasileira de Química.

संशोधित इलेक्ट्रोड % RSD (n = 6) सिग्नल कमी (%) (n = 20)
Repeatability Reproducibility
SPCE/पीएलए-AuNPs ४.२६ ४.०५ 18

तालिका 3: संशोधित इलेक्ट्रोड के गुण K में AuNPs और पीएलए-AuNPs संशोधन से संबंधित 3 [Fe (CN)6] के साथ १.० mmol L -1 ०.१ वी एस की स्कैन दर पर एकाग्रता -1 . ref. [30] से अनुमति के साथ अनुकूलित । कॉपीराइट (२०१६) Sociedade Brasileira de Química.

इलेक्ट्रोड संरचना मैंपीए (µA) ईपीए Selectivity दर (%)
(n = 3) वी
SPCE/पीएलए-AuNP/जांच डीएनए ४.७९ ± ०.१० -०.४६ -
SPCE/पीएलए-AuNP/गैर पूरक डीएनए ३.२५ ± ०.१२ -०.४४ ६७.८५
SPCE/पीएलए-AuNP/3-कुर्सियां बेमेल डीएनए १.०५ ± ०.११ -०.४५ २१.९२
SPCE/पीएलए-AuNP/1-आधार बेमेल डीएनए ०.९४ ± ०.१२ -०.४६ १९.६२
SPCE/पीएलए-AuNP/पूरक डीएनए ०.७३ ± ०.१० -०.४५ १५.२४

तालिका 4: DPV selectivity MB पीक करेंट में ०.१ मॉल L -1 पंजाब (पीएच 7) ०.१ वी एस की स्कैन दर पर -1 20 µ एम एमबी में 30 मिनट की मशीन के बाद

इलेक्ट्रोड की संरचना डिटेक्शन विधि रैखिक रेंज (एम) जांच सीमा (M) संदर्भ
3d AuNPs DPV 1.5 × 10-6 -7.0 × 10-9 2.0 × 10-10 ६९
(+) AuNPs DPV 1.0 × 10-9 -1.5 × 10-12 2.6 × 10-12 ७०
AuNPs/जीआर DPV 1.3 × 10-9 -2.5 × 10-11 8.3 × 10-12 ७१
AuNPs-आढ-GSs DPV 5.0 × 10-8 -3.0 × 10-13  3.0 × 10-13 ७२
AuNPs-MPTS DPV 5.0 × 10-9 -1.0 × 10-11  5.0 × 10-11 ७३
AuNPs-जाओ DPV 1.0 × 10-9 -1.0 × 10-14 3.5 × 10-15 ७४
क्योंकि AuNPs/ DPV 1.0 × 10-9 -1.0 × 10-12 7.0 × 10-13 ७५
पीएलए-AuNPs DPV 2.0 × 10-8 -2.0 × 10-13 5.3 × 10-12 यह काम

तालिका 5: हाल ही में विकसित विद्युत डीएनए nanosensors में से कुछ की तुलना । ref. [22] से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । कॉपीराइट (२०१६) Elsevier ।

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Discussion

विद्युत जैव सेंसर के इस प्रकार के सफल विकास के लिए एक ढांचे में महत्वपूर्ण कदम transducer (न्यूक्लिक एसिड या डीएनए यहां) के लिए उपयुक्त जैविक मान्यता तत्वों का चयन कर रहे हैं; transducer की संवेदन परत के निर्माण के लिए रासायनिक दृष्टिकोण; transduction सामग्री; डीएनए स्थिरीकरण और संकरण का अनुकूलन; और विकसित की मांयता सेंसर असली नमूनों का उपयोग कर ।

एक संवेदनशील और चयनात्मक विद्युत डीएनए के सफल विकास के लिए कोर सेंसर, स्थिरीकरण और संकरण हालत का अनुकूलन है । इस काम में, हम एमबी redox परिसर के रूप में इस्तेमाल किया । वहां एमबी के विभिंन सिद्धांतों-डीएनए बातचीत कर रहे हैं: (i) इलेक्ट्रोस्टैटिक की बातचीत से एमबी cationic प्रभारी फॉस्फेट रीढ़ anionic दोनों ssDNA और dsDNA के प्रभारी के साथ; (ii) dsDNA में अदल G-C आधार जोड़े के बीच एमबी के सफल सम्मिलन के माध्यम से एमबी intercalation द्वारा; (iii) आबंध बांड द्वारा लक्ष्य ssDNA, जो एक कम लेबल घनत्व (डीएनए कतरा प्रति एक या दो एमबी अणुओं) का उत्पादन के अंत तक; और (iv) ssDNA में एक असीम guanine आधार के साथ एमबी बातचीत द्वारा । हम चौथे सिद्धांत है, जो सही बैक्टीरिया की पार जेट से और ताजा cockles में V. parahaemolyticus की पहचान लागू होता है । विशेष रुचि के ऑक्सीकरण के बाद, वहां एमबी और ssDNA के बीच एक मजबूत संबंध था । अपने पूरक अनुक्रम के साथ ssDNA के संकरण बंधुआ एमबी अणुओं की जगह है, और इस तरह संकेत कम कर देता है ।

इसके बाद के संस्करण प्रस्तुत प्रयोगात्मक परिणामों की श्रृंखला उच्च selectivity और डीएनए संकरण के सिद्धांतों का उपयोग संवेदनशीलता के साथ V. parahaemolyticus का पता लगाने की एक तेजी से विधि के विकास पर केंद्रित है । पहला कदम है polylactic एसिड के संश्लेषण और लक्षण वर्णन-स्थिर गोल्ड नैनोकणों (पीएलए-AuNPs) इलेक्ट्रोड के संशोधन के लिए (आंकड़े 1-6 और तालिका 2). गोल्ड नैनोकणों की गुणवत्ता पराबैंगनी दिखाई स्पेक्ट्रोस्कोपी (यूवी विज़), एक्स-रे विवर्तन (XRD), क्षेत्र उत्सर्जन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (FESEM), संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि), चक्रीय Voltammetry (CV) और का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया प्रतिबाधा विश्लेषण. विकास के दूसरे भाग के संशोधित इलेक्ट्रोड (आंकड़े 7-12 और तालिका 3-4) जो में नंगे इलेक्ट्रोड के सापेक्ष संशोधित इलेक्ट्रोड की सफल वृद्धि निर्धारित की एक विद्युत लक्षण वर्णन शामिल संकरण घटना का पता लगाने के मामले ।

डीएनए आधारित के तीसरे चरण का विकास संकरण घटना के प्रायोगिक शर्तों के अनुकूलन पर आधारित था और वास्तविक रोगज़नक़ (आंकड़े 13-20) का पता लगाने के लिए विकसित किया गया है... संकरण घटना है जो रोगज़नक़ का पता लगाने की सफलता का निर्धारण किया था अंतर पल्स voltammetry (DPV) का उपयोग कर मूल्यांकन । लक्षित रोगज़नक़ के सकारात्मक अस्तित्व की कमी के माध्यम से संकेत दिया गया था वर्तमान । विकसित की संवेदनशीलता एक अंशांकन भूखंड के निर्माण के माध्यम से मूल्यांकन किया गया था और लोद की गणना (चित्रा 15). गढ़े हुए एक विशेष रूप से अंय रोगजनकों से वर्तमान कमी के विभिंन स्तरों के आधार पर (17 आंकड़े और 18) V. parahaemolyticus भेद करने में सक्षम था । वास्तविक खाद्य नमूना में V. parahaemolyticus का पता लगाने के लिए विकसित की व्यवहार्यता के मूल्यांकन के आंकड़े 19 और 20 में प्रस्तुत किया है और लक्षित रोगज़नक़ के सकारात्मक अस्तित्व की कमी से संकेत दिया है वर्तमान . डीएनए आधारित संवेदीकरण का सफल विकास अत्यंत डीएनए जांच चयन पर निर्भर है, संशोधित इलेक्ट्रोड की वृद्धि के साथ-साथ प्रयोगात्मक स्थितियों का अनुकूलन । यहां डीएनए जांच Nakano६७के पिछले काम से अनुकूलित किया गया है । संशोधित इलेक्ट्रोड की वृद्धि nanosize के मानकीकरण को सक्षम करने के लिए polylactic एसिड के साथ स्थिर सोने नैनोकणों का उपयोग करके किया गया था. इलेक्ट्रो उत्प्रेरक सामग्री के रूप में स्वर्ण नैनोकणों समारोह६८ और इलेक्ट्रॉन की स्थानांतरण दर को बढ़ाने के लिए कार्य और भी एक सतह पर डीएनए जांच एंकर करने के लिए प्रदान करते हैं । प्रयोगात्मक मापदंडों के तापमान और गर्मी समय जो डीएनए के लिए द्वैध फार्म के लिए महत्वपूर्ण है के संदर्भ में अनुकूलित किया गया । संकरण तापमान गैर-विशिष्ट सोखना के बीच जुदाई को प्रभावित करता है और इससे सेंसर की selectivity बढ़ जाती है । संकरण की मशीन समय द्वैध गठन की संभावना बढ़ जाती है । स्थिरीकरण प्रक्रिया को यकीन है कि डीएनए जांच के लिए फार्म का द्वैध गठन के लिए उपयुक्त अभिविंयास में होगा बनाने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ।

तालिका 5 हाल ही में विकसित विद्युत डीएनए के एक नमूने की तुलना६९,७०,७१,७२,७३,७४,७५ ,. डीएनए आधारित संवेदन आणविक आधारित तकनीक की जगह के लिए एक आशाजनक तरीका है, हालांकि वहां कुछ सीमाएं है कि पहले विधि ऑनसाइट उपयोग के लिए पर्याप्त पोर्टेबल हो सकता है संबोधित किया जाना चाहिए रहे हैं । मुख्य सीमा के रूप में शुद्धता और डीएनए की मात्रा साइट पर निकाले के रूप में नमूना प्रसंस्करण डीएनए निष्कर्षण की संभावना है कि मानक प्रयोगशाला आधारित विधि द्वारा निकाली के रूप में के रूप में अच्छा होना नहीं है । यह है, तथापि, एक आशाजनक विकल्प अगर पीसीआर और जेल ट्रो microfluidic जैसे नमूना उपचार प्रणाली के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है ।

डीएनए आधारित जैव संवेदी संभावित चिकित्सा निदान, पर्यावरणीय निगरानी और भोजन की निगरानी सहित कई अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी होते हैं । इस तकनीक से गुणवत्ता नियंत्रण प्रक्रियाओं की ऑनलाइन मॉनिटरिंग के साथ-साथ मरीजों की प्वाइंट-केयर मॉनिटरिंग भी हो सकेगी । पूरी सेंसर प्रणाली की पोर्टेबिलिटी से उन नैदानिक प्रक्रियाओं का विकेंद्रीकरण हो सकेगा जहां उपभोक्ता अपने घर के आराम में जांच प्रणाली का इस्तेमाल कर सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक Universiti पुत्र मलेशिया के समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Merck 100056
Chloroform Merck 102445
Diaminoethane tetraacetic acid Promega E5134
Dibasic sodium phosphate  Sigma-Aldrich S9763
Disodium hydrogen phosphate Sigma-Aldrich 255793
Ethanol  Sigma-Aldrich 16368
Gold (III) chloride trihydrate Sigma-Aldrich 520918
Hydrochloric acid Merck 100317
Methylene blue Sigma-Aldrich M44907
Monobasic sodium phosphate, monohydrate Sigma-Aldrich S3522
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P5119
Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D NatureWorks 4042D
Potassium chloride R&M Chemicals 59435
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich P9791
Potassium hexacyanoferrate III R&M Chemicals 208019
Sodium acetate anhydrous salt Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
Trisodium citrate Sigma-Aldrich S1804
Tris(hydroxymethyl) aminomethane Fisher Scientific T395-100
Tris-Base Fisher Scientific BP152-500
2X PCR Master Mix with Dual-Dye Norgen Biotek 28240
Agarose gel Merck 101236
Bolton Agar Merck 100079
Bolton Broth Merck 100079
CHROMagar Vibrio CHROMagar VB910
dNTPs Promega U1511
Nuclease-free water Thermo Scientific R0581
Eosin methylene blue agar  Merck 101347
GelRed Biotium 41001
Glycerol Merck 104092
Go Taq Buffer Promega M7911
Loading dye 100 bp DNA ladder Promega G2101
Loading dye 1kb DNA ladder Promega G5711
Magnesium chloride Promega 91176
Mannitol egg yolk polymyxin agar Merck 105267
McConkey Agar Merck 105465
Nutrient Broth Merck 105443
Taq polymerase Merck 71003
Trypticase Soy Broth Merck 105459
Trypticase Soy Agar Merck 105458

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अभियांत्रिकी अंक १३६ Polylactic अम्ल-स्थिर गोल्ड नैनोकणों स्क्रीन-प्रिंटेड कार्बन इलेक्ट्रोड डीएनए Vibrio parahaemolyticus विद्युत सेंसर डीएनए संकरण
एक विद्युत डीएनए के विकास के लिए एक Foodborne रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए सेंसर
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Nordin, N., Yusof, N. A., Radu, S.,… More

Nordin, N., Yusof, N. A., Radu, S., Hushiarian, R. Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen. J. Vis. Exp. (136), e56585, doi:10.3791/56585 (2018).

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