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Bioengineering

Sviluppo di un biosensore elettrochimico del DNA per rilevare un patogeni di origine alimentare

Published: June 3, 2018 doi: 10.3791/56585
Automatic Translation
1, 2,3, 1, 4
1Laboratory of Food Safety and Food Integrity, Institute of Tropical Agriculture and Food Security, Universiti Putra Malaysia, 2Laboratory of Functional Device, Institute of Advanced Technology, Universiti Putra Malaysia, 3Department of Chemistry, Faculty of Science, Universiti Putra Malaysia, 4La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University

Summary

Un protocollo per lo sviluppo di un biosensore elettrochimico di DNA che comprende un elettrodo di carbonio nanoparticelle-modificato, serigrafata, acido-stabilizzato, oro polilattico per rilevare il vibrione paraemolitico è presentato.

Abstract

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemoliticus) è un agente patogeno comune di origine alimentare che contribuisce a gran parte dei problemi di salute pubblica a livello globale, significativamente che colpiscono il tasso di morbosità e di mortalità umana. I metodi convenzionali per il rilevamento di V. parahaemoliticus quali metodi basati su cultura, analisi immunologiche e metodi molecolari basati richiedono manipolazione complicate e sono che richiede tempo, noioso e costoso. Recentemente, biosensori hanno dimostrato di essere un promettente e completo metodo di rilevamento con i vantaggi di rilevamento rapido, economicità e praticità. Questa ricerca si concentra sullo sviluppo di un metodo rapido per rilevare V. parahaemoliticus con alta selettività e sensibilità utilizzando i principi di ibridazione del DNA. Nel lavoro, caratterizzazione di nanoparticelle d'oro stabilizzato in acido polilattico sintetizzato (PLA-AuNPs) è stata ottenuta utilizzando la diffrazione dei raggi x (XRD), spettroscopia ultravioletto-visibile (UV-Vis), microscopia elettronica in trasmissione (TEM), emissione di campo Microscopia elettronica a scansione (FESEM) e la voltammetria ciclica (CV). Inoltre abbiamo effettuato ulteriori test di stabilità, sensibilità e riproducibilità di PLA-AuNPs. Abbiamo trovato che il PLA-AuNPs formata una solida struttura di nanoparticelle stabilizzate in soluzione acquosa. Inoltre abbiamo osservato che la sensibilità migliorata grazie il più piccolo valore di resistenza (Rct) trasferimento carica ed un aumento della superficie attiva (0,41 cm2). Lo sviluppo del nostro biosensore di DNA si basava sulla modificazione di un elettrodo di carbonio serigrafato (SPCE) con PLA-AuNPs e utilizzando il blu di metilene (MB) come l'indicatore redox. Abbiamo valutato gli eventi immobilizzazione e ibridazione mediante voltammetria impulso differenziale (DPV). Abbiamo trovato che non-complementari, complementari e non corrispondenti oligonucleotidi specificamente si distinguevano per il biosensore fabbricato. Inoltre ha mostrato in modo affidabile sensibile rilevamento negli studi di reattività crociata contro vari agenti patogeni di origine alimentare e nell'identificazione di V. parahaemoliticus in vongole fresche.

Introduction

Un importante argomento di dibattito pubblico e scientifico negli ultimi anni, l'intossicazione alimentare è principalmente associata con 3 agenti: microrganismi1, prodotti chimici2e parassiti3. Alimenti contaminati possono causare conseguenze gravi per la salute negli esseri umani, soprattutto nel gruppo di rischio più elevato di quelli con un sistema immunitario debole, anziani, donne incinte, neonati e bambini piccoli4. Con più di 1 milione casi di diarrea acuta che accadono annualmente nei bambini sotto i 5 anni in Africa, Asia e America Latina, l'intossicazione alimentare è una malattia globale principale5,6 e l'organizzazione mondiale della sanità ha stabilito microrganismi come il più importante collaboratore7. Vibrio parahaemolyticus spicca i più ampiamente riconosciuti ceppi virulenti. Solitamente si trova in ambienti costieri, estuari e marino8, è un batterio gram-negativo, che diventa attiva in ambienti sale alti e provoca gravi gastroenteriti umana quando mangiato nella Marina non adeguatamente cotta, maltrattato o cruda prodotti9. Inoltre, condizioni mediche esistenti in alcune persone li rendono inclini a infezioni, setticemia o orecchio infezione derivante da V. parahaemolyticus10della ferita. I fattori di virulenza di V. parahaemoliticus emolisine sono divisi in due tipi che contribuiscono alla patogenesi della malattia: termostabile emolisina diretta (TDH) codificati da geni tdh ed emolisina TDH-correlati codificati da geni di trh11. I marcatori di virulenza (geni tdh e trh) di V. parahaemoliticus si trovano principalmente in campioni clinici piuttosto che in campioni ambientali.

V. parahaemoliticus possiede la capacità di sopravvivere in una vasta gamma di condizioni, rispondere rapidamente ai cambiamenti ambientali12. Il suo meccanismo di proliferazione intensifica il potenziale di rischio aumenta la sua tossicità in parallelo con cellula massa13. Peggio ancora, il cambiamento climatico sta fornendo questi batteri con ampio condizioni per accelerare la loro crescita di popolazione cellulare14. A causa della sua alta frequenza, V. parahaemoliticus deve essere monitorato lungo la catena di approvvigionamento alimentare, in particolare nel commercio e produzione di frutti di mare dal momento che tali prodotti sono dove si trovano in enormi quantità15,16 in tutto il mondo. Attualmente i batteri vengono identificati e isolati utilizzando una gamma di metodi tra cui prove biochimiche, arricchimento e selettivi17, enzima-collegata immunomagnetica sorbente assay (ELISA)18, elettroforesi del gel di impulso-campo (PFGE) 19, test di agglutinazione al lattice e della polimerasi reazione a catena (PCR) test20. Solitamente, questi metodi richiedono personale qualificato, sofisticati strumenti e tecniche laboriose che non forniscono informazioni sulla contaminazione immediatamente. Questo limita fortemente la probabilità di rilevare prontamente contaminazione nociva e applicazioni in loco. Strumenti di rilevazione rapida rimangono una sfida eccezionale.

Biosensoristica sta emergendo come un'opzione di promessa per la rilevazione di patogeni di origine alimentare, perché offre un risparmio di tempo, conveniente, pratico e in tempo reale analisi metodo21,22,23,24 . Tuttavia, anche se ci sono stati molti risultati positivi di rilevazione di analita in campioni arricchiti e soluzione standard utilizzando biosensori, c'è ancora una mancanza di ricerca applicata a campioni reali in miscele acquose o estratti organici25. Recentemente, biosensori elettrochimici tramite rilevazione diretta e/o indiretta dell'acido deossiribonucleico (DNA) hanno ricevuto maggiore attenzione tra gli scienziati, a causa della loro specifica per la rilevazione di complementare di destinazione tramite un evento di ibridazione26 , 27 , 28 , 29. questi approcci unici sono più stabili rispetto ai biosensori basati su enzima, offrendo così una tecnologia promettente per la miniaturizzazione e la commercializzazione. L'obiettivo dello studio segnalato qui è quello di costruire uno strumento veloce che può rilevare V. parahaemoliticus con alta selettività, sensibilità e praticità, basata sulla specificità di sequenza di DNA durante l'ibridazione. Strategie di identificazione comportano la combinazione di polilattico acido-stabilizzato di nanoparticelle d'oro (PLA-AuNPs)30 ed elettrodi di carbonio serigrafato (SPCEs) in presenza di indicatore di ibridazione, blu di metilene (MB). Il potenziale del costrutto rilevamento sviluppati è ulteriormente esplorato utilizzando campioni di batteri DNA cockle lisato e fresco.

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Protocol

Nota: Tutti i reagenti chimici e biochimici per essere utilizzati devono essere di purezza analitica e utilizzato senza ulteriore purificazione. Preparare tutte le soluzioni utilizzando acqua deionizzata sterile. Autoclave tutti i bicchieri prima della sterilizzazione.

Attenzione: Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate quando si eseguono attività di laboratorio, compreso l'uso di controlli (cappa, glovebox) tecnici e dispositivi di protezione individuale (occhiali di sicurezza, guanti, camice, pantaloni di lunghezza completa, chiuse scarpe).

1. fabbricazione e caratterizzazione di elettrodo per volta utilizzando PLA-AuNPs

  1. Preparazione e caratterizzazione di PLA-AuNPs
    1. Aggiungere 10 mL di soluzione di citrato di sodio (38,8 mM) a 100 mL di soluzione di acido cloroaurico acquosa (1 mM) di ebollizione rapidamente e raffreddare fino a temperatura ambiente. Osservare i cambiamenti nel colore nella soluzione preparata AuNPs che inizia come giallo, modifiche a nerastro e infine termina come rosso rubino scuro.
    2. Posizionare i pellet PLA in uno stampo di acciaio inox per il processo di fusione e li preriscaldare a una temperatura di 190 ° C per 10 min. Segui la procedura di pressatura: metterli sotto una pressione di 2,2 MPa per 1 min come parte della preparazione foglio PLA. Il foglio PLA sarà pronto per l'uso dopo il raffreddamento per circa 3 ore.
    3. Mescolando energicamente, sciogliere 0,68 mg dei fogli PLA in 5 mL di cloroformio a temperatura ambiente. Mescolare il PLA disciolto con 10 mL di soluzione AuNPs precedentemente preparata e mescolate in modo omogeneo a temperatura ambiente. Le miscele omogenee possono quindi essere denotate come PLA-AuNPs e caratterizzato usando UV-Vis, XRD, TEM e FESEM con EDX.
  2. Preparazione e caratterizzazione di elettrodi di carbonio serigrafato modificate
    Nota: Il SPCE utilizzato in questo studio comprende un sistema di tre elettrodi: un elettrodo contatore, un elettrodo di lavoro di carbonio e un elettrodo di riferimento Ag/AgCl.
    1. Dispensare 25 µ l della soluzione omogenea di PLA-AuNPs sul SPCE e quindi aria asciugare rapidamente per 24 h prima dell'uso.
    2. Elettrochimicamente caratterizzano gli elettrodi modificati, SPCE/PLA-AuNPs-ferro cianuro del potassio (K3[Fe(CN)6]3 -/4 -) per misurare la superficie attiva, spettroscopia di impedenza elettrochimica, ripetibilità, riproducibilità e stabilità30.

2. sviluppo del biosensore elettrochimico del DNA

  1. Preparazione della sonda
    Nota: Le sequenze del DNA complementare e ssDNA sonda sono stati scelti sulla base delle informazioni dal centro nazionale per database Biotechnology Information (NCBI).
    1. Acquisto di oligonucleotidi sintetici (20-mer ssDNA sonda, DNA complementare 20-mer, 20-mer malassortiti DNA e DNA non-complementare 21-mer) come polvere liofilizzata da laboratori commerciali, basato su sequenze seguenti:
      chitosani ssDNA sonda: 5 ′ - / 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3 '
      DNA complementare: 3 ′ 5 ′ - CAGTGCTTCTGCATAATCCG -
      DNA non corrispondente uno-base: 3 ′ 5 ′ - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG -
      tre basi DNA non corrispondente: 3 ′ 5 ′ - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG -
      DNA non complementari: 3 ′ 5 ′ - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA -
    2. Preparare soluzioni di riserva di tutti gli oligonucleotidi (100 µM) utilizzando una soluzione TE sterile (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5), suddivisa in porzioni analitiche. Tenere questo a-4 ° C e quindi apportare le appropriate diluizioni appena prima dell'uso.
  2. Ottimizzazione di immobilizzazione e ibridazione
    Nota: Un SPCE modificato con PLA-AuNPs, denotato come SPCE/PLA-AuNPs, è stato utilizzato per questo studio e un metodo di fusione di goccia è stato utilizzato per l'immobilizzazione del DNA e l'ibridazione.
    1. In primo luogo, immobilizzare 25 µ l di sonda ssDNA chitosani su SPCE/PLA-AuNPs e poi aria la asciugare per 24 ore a temperatura ambiente, dopo di che essa verrà infine indicata come SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA. Determinare l'ottimizzazione della condizione immobilizzazione utilizzando tre fattori: la concentrazione di ssDNA (che vanno da 0,2 a 1,4 µM), tempo (variabile da 30 a 210 min) e temperatura (che vanno da 25 a 75 ° C).
    2. Pipettare 25 µ l di DNA complementare sopra alla superficie di SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA di svolgere l'evento di ibridazione dopo di che può essere infine indicata come SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA. Determinare l'ottimizzazione della condizione ibridazione tramite i due fattori di tempo (da 5 a 30 min) e temperatura (che vanno da 25 a 75 ° C).
    3. Immergere l'immobilizzato e ibridati elettrodi in µM 20 MB per 30 min. rimuovere il DNA non specifico adsorbito e MB in eccesso mediante lavaggio con 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4,5) e poi risciacquo con acqua deionizzata. Misurare la corrente di picco del MB riduzione usando tecnica DPV. Eseguire la misura di DPV con 0.1 M PBS (pH 7) non contenente nessun indicatore.
  3. Caratterizzazione del biosensore DNA fabbricato
    1. Immergere il SPCE/PLA-AuNPs in µM 20 MB per 30 min, lavare con 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4,5) e poi risciacquare con acqua deionizzata prima della misura. Seguire una procedura simile per tutte le interazioni tra cui la sonda DNA, DNA complementare, DNA non corrispondente e non complementari campioni di DNA.
    2. Misurare la riduzione elettrochimica.
      Nota: Abbiamo misurato DPV utilizzando un Autolab commercialmente manufactured con software di interfaccia.
      Le misurazioni di DPV della riduzione elettrochimica MB eseguita presso un potenziale che vanno da -0.5 V a 0,25 V, con un passo di potenziale di 0.005 V, ampiezza di modulazione di 0.05 V e una velocità di scansione di 7,73 mVs-1 in 0.1 M PBS (pH 7), non contenente nessun indicatore. La selettività, sensibilità, riproducibilità e stabilità al calore del biosensore DNA fabbricato più ulteriormente sono stati studiati. Risultati riferiti sono stati presentati come media valore misurazioni in tre repliche.

3. convalida del biosensore fabbricato del DNA utilizzando campioni reali

  1. Preparazione dei ceppi batterici
    1. Selezionare batterici campioni basati sulla loro significativa contaminazione dei frutti di mare31,32 .
      Nota: V. parahaemoliticus come ceppi di riferimento e 8 altri ceppi batterici (Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, polmonite da Klebsiella Escherichia coli O157: H7, Bacillus cereuse alginolyticus del vibrione) delle epidemie alimentari comuni patogeni sono stati impiegati per la validazione di biosensori elettrochimica del DNA in questo studio.
    2. Condurre una routine sub-cultura di ceppi batterici su loro rispettivi agar ogni due settimane per mantenere la loro vitalità, consultare la tabella 1 per le condizioni di coltura.
    3. Mantenere la conservazione a lungo termine dei ceppi batterici nei loro rispettivi brodi crescenti contenente 20% (v/v) glicerolo a-80 ° C come glicerolo protegge i batteri impedendo la formazione di cristalli di ghiaccio che possono danneggiarli durante il processo di congelamento. Successivamente, inoculare un ciclo della cultura di cellula batterica conservati negli stock di glicerolo nei rispettivi brodi. Incubare i brodi secondo le loro rispettive crescita tempo e temperatura quando il bisogno di far rivivere i batteri.
    4. Determinare la quantità di V. parahaemoliticus celle utilizzando una piastra di diffusione tecnica33, standard e un metodo ben noto per l'enumerazione dei microrganismi derivate da una serie di diluizioni.
      1. Cultura V. parahaemoliticus in brodo di soia Trypticase (TSB + 3% NaCl) a 37 ° C in una condizione di agitazione 140 giri/min. Quindi, trasferire 1 mL di coltura delle cellule di batteri in 9 mL di TSB + 3% NaCl per ottenere un fattore di diluizione 10-1 .
    5. Ripetere questo passaggio nove volte per ottenere una serie completa di fattore di diluizione fino a 10-10 . Successivamente, si sono diffuse 0,1 mL di ciascun fattore di diluizione (a partire da 10-1 a 10-10) sulla piastra di agar selettivo di un Vibrio per Colonia contando, rispettivamente. Incubare le piastre incubate a 37 ° C per 24 h.
    6. Utilizzare un contatore per contare diverse colonie e poi retro-calcolare (conteggio la quantità CFU/pipettato x fattore di diluizione) per ottenere un'unità formanti colonie per millilitro densità (CFU mL-1). Derivare la concentrazione della Colonia formando unità (CFUs) in sospensioni di cellule di batteri dalla trama di calibrazione di CFU mL-1 assorbanza.
  2. Preparazione del test PCR
    1. Estrarre DNA genomic seguendo un modificato bollito Lisi procedura34. Primo, streak un batterica individuale ceppo agarizzati e inoculare in media di brodo, seguita da incubazione e alla sua condizione di crescita relativa, un 140 giri/min agitazione condizione.
    2. Dispensare una cultura di 1 mL di brodo in una provetta da centrifuga micro. Questo Centrifugare a 4830 x g e a 4 ° C per 1 min ottenere pellet. Utilizzare circa 500 µ l di tampone sterile TE per risospensione con il pellet. Tenere la sospensione risultante per 10 min a 98 ± 2 ° C in un blocco di riscaldamento e raffreddare immediatamente a-18 ° C per 10 min lisare le cellule e liberare il DNA.
    3. Centrifugare il DNA genomico a 4830 x g e a 4 ° C per 3 minuti ottenere una sospensione di chiara e tenere il supernatante a-20 ° C per un ulteriore uso. Utilizzare una misurazione biofotometro con assorbimento UV a lunghezza d'onda di 260 nm (come acidi nucleici assorbire la lunghezza d'onda della luce) e anche ad una lunghezza d'onda di 280 nm (come le proteine assorbe la lunghezza d'onda della luce) per determinare la concentrazione e la purezza dell'Estratto il DNA genomico e quindi identificare tutti i ceppi utilizzando saggi biochimici standard35 e loro verifica tramite 16S rRNA gene sequenziamento36. Infine, denaturare il DNA genomico a 92 ° C per 2 min e raffreddarlo rapidamente in acqua di ghiaccio prima dell'applicazione per il biosensore.
    4. Confermare ulteriormente la presenza V. parahaemoliticus usando la PCR per il gene toxR di destinazione. Eseguire questa procedura in un termociclatore utilizzando una coppia di primer (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' e 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3'). Ottimizzare l'amplificazione di PCR in un volume di reazione totale di 25 µ l composto da acqua sterile (15,5 µ l), buffer (5 µ l), primer (1 µ l, 10 µM), miscela del dNTP (1 µ l), mascherina del DNA (2 µ l) e la Taq DNA polimerasi (0,2 µ l, 10 x).
    5. Mescolare bene i componenti e organizzare l'amplificazione di PCR della sequenza dell'obiettivo in un termociclatore programmato per 30 cicli di amplificazione. Nel nostro studio, ogni ciclo consisteva di tre fasi reazioni i. e., denaturazione iniziale (94 ° C, min 3) seguita da 30 cicli di denaturazione (94 ° C, 1 min), ricottura (63 ° C, min 1,5) ed estensione (72 ° C, min 1,5), seguito dall'estensione finale (72 ° C, min 7).
    6. Determinare i prodotti amplificati e le loro dimensioni tramite elettroforesi su gel di agarosio 1.5%. Catturare le immagini di gel con un sistema gel-documentazione prodotta commercialmente.
  3. Preparazione dei campioni di cockle
    1. Ottenere campioni freschi.
      Nota: Il nostro freschi vongole (Anadara granosa) erano ottenuti dal mercato bagnato in Serdang, Selangor e rapidamente portati al laboratorio in una scatola più fredda del ghiaccio per l'analisi. Dividere i campioni in 2 gruppi, vale a dire il gruppo trattato e non trattato, supponendo che le vongole sono state raccolte in modo uniforme dall'inizio della vendemmia fino alla loro immissione in cella frigorifera.
    2. Pretrattare le vongole nel gruppo curato memorizzandole a-20 ° C per 24 h, seguita dall'esposizione alla luce UV a 20 ° C per 4 h prima dell'estrazione del DNA.
      Nota: La temperatura di congelamento e l'esposizione UV utilizzato per la controllata gruppo uccide o almeno limita il naturalmente ad accumulare V. parahaemoliticus nelle vongole. Non applicare un regime di pastorizzazione più alto di 70 ° C come l'obiettivo della condizione controllata in questo studio è quello di imitare la situazione reale dei cardi freschi. Nel frattempo, analizzare campioni direttamente al gruppo non trattato senza alcun pre-trattamento, non appena arrivano in laboratorio.
    3. Sottocultura un ceppo di V. parahaemoliticus ATCC 17802 in TSB (3% NaCl). Determinare il livello di cellule vitali nell'inoculo tramite placcatura di appropriate diluizioni della TSB (3% NaCl) su CA al fine di ottenere un inoculo di 104 CFU mL-1 di V. parahaemoliticus. Lavare ogni cockle in acqua distillata e lo scrub privo di sporco prima di utilizzare pinze sterili in un'unità a flusso laminare per rimuovere i tessuti dalla shell.
    4. Circa 10 g di campioni di tessuto di cockle di omogeneizzare con un omogeneizzatore in 90 mL di TSB sterile (3% NaCl) per 60 s. Aggiungi una quantità nota di V. parahaemoliticus a 9 mL di brodo campione omogeneizzato per i campioni arricchiti. Utilizzare gli esempi sono come controllo negativo. Stimare i conteggi delle cellule di V. parahaemoliticus a spillo per i campioni di cockle da 0,1 mL dei campioni su CA di placcatura, e successivamente, Pipettare 1 mL di campioni in una microcentrifuga per DNA campione estrazione, da utilizzarsi nel biosensore e analisi di PCR.
    5. Estrarre il DNA genomico del V. parahaemoliticus dai campioni a spillo e sono seguito modificato bollito Lisi procedura36. Infine, determinare la concentrazione di DNA e la purezza tramite una misurazione di Fotometro bio con assorbimento UV a lunghezza d'onda di 260 nm (come acidi nucleici assorbire la lunghezza d'onda della luce) e anche ad una lunghezza d'onda di 280 nm (come le proteine assorbe la lunghezza d'onda della luce).

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Representative Results

Formazione di AuNPs è stato rivelato attraverso il cambiamento di colore della soluzione acquosa con citrato di sodio presente. Ciò ha causato il colore da modificare da giallo chiaro a un colore rosso rubino intenso. La generazione di PLA-AuNPs è stata confermata dagli spettri UV-vis (Figura 1) dove la crescita del picco surface plasmon resonance (SPR) è stata trovata a circa 540 nm. La formazione e l'esistenza di PLA-AuNPs è stato indicato alle gamme di lunghezza d'onda 500-600 nm, a seconda delle particelle taglia37. I pattern XRD di AuNPs e PLA-AuNPs sono mostrati nella Figura 2. Tutti i picchi di cristalliti sono stati osservati presso il 2 θ di 31,7, 38.2, 44,4, 64,7 e 77,7 °. Essi sono stati attribuiti a (100) (111) (200) (220), e (311) piani cristallografici d'oro cubico-FCC (cubico a facce centrate) (metallo) nanostrutture (JCPDS il file n.-00-004-0783). Le intensità di picco di PLA-AuNPs cristalliti anche aumentata come un picco di diffrazione più ampio centrato a 31,7 °, implicando che il AuNPs sono stati incorporati nel PLA e suggerendo la formazione di polifasico nanostrutture oro38. Inoltre, tutti i picchi di diffrazione AuNP sulla PLA-AuNPs indicato che il AuNPs aveva una struttura stabile. La dimensione media di PLA-AuNPs è stata calcolata utilizzando l'equazione di Scherrer (L = kλ/βcosθ), determinando la larghezza della riflessione di Bragg (100). Dalla FWHM e d-spaziatura (tabella 2), la dimensione dei cristalliti di PLA-AuNPs è stata calcolata come 27 nm.

Le dimensioni di PLA-AuNPs e la sua morfologia più ulteriormente sono state studiate usando TEM. Dalla curva di distribuzione delle particelle TEM e immagini di PLA-AuNPs, si è visto che le nanoparticelle d'oro erano quasi sferiche in forma (Figura 3). Le dimensioni delle nanoparticelle era nella gamma di circa 37 nm, leggermente più grande di quanto ottenuto dalla formula di Scherrer, suggerendo una natura policristallina del come-sintetizzato nanoparticelle39. Dimensioni più piccole derivanti da XRD in contrasto con TEM sono stato osservato anche nella ricerca precedente, probabilmente perché la struttura delle particelle è policristallino in natura a causa della notevole quantità di cristalliti sono più piccole (sub-particelle)40 . La figura 4 Mostra l'immagine FESEM del preparato come PLA-AuNPs su SPCE. È evidente dalle FESEM immagini e spettri EDX che SPCE/PLA-AuNPs aveva la più alta percentuale di peso di oro, la più grande densità e la più grande superficie di copertura delle nanoparticelle. Inoltre si può notare, in particolare, che nella figura 4(a) Mostra l'immagine FESEM di una SPCE nuda. L'immagine FESEM in Figura 4(b) Mostra ben distribuita PLA-AuNPs. Per affermare la composizione chimica del sintetizzato PLA AuNPs, EDX è stata impiegata per studiare la composizione chimica del prodotto come PLA-AuNPs, come da Figura 4(a)e 4(b). Lo spettro EDX ha confermato che il prodotto come PLA-AuNPs erano composte da solo oro (Au) e non visualizzato nessun altro elemento ad eccezione del picco corrispondente al carbonio (C) e ossigeno (O). La presenza del picco C era dovuto l'elettrodo di carbone sulla quale il campione è stato la goccia cast.

Lo spettro EDX inoltre ha mostrato la presenza di O che indica che l'ossigeno è stato adsorbito sull'elettrodo di carbonio perché il film è stato esposto all'aria. Questo conferma che ossigeno è adsorbito su nanotubi di carbonio, se sono esposti all'aria per un lungo periodo di tempo41. Anche se esistono varie molecole di gas in aria, ossigeno credeva di essere il principale adsorbato sulla esposti aria carbonio nanotubes42, probabilmente a causa di suo adsorbimento più veloce rispetto ad altre molecole43. Questo era basato sulla ricerca che l'ossigeno è stato il principale adsorbato sull'elettrodo di carbonio durante l'esposizione di aria durante la notte in preparazione del campione e rinforzato la purezza chimica di PLA-AuNPs. Il rapporto del picco anodica e catodica (hopa/ipc) era quasi 1, che ha dato costante picco potenziale come la scansione tasso aumentato44. Inoltre, i potenziali anodici e catodici picco erano coerenti alle analisi diversi tassi45 suggerendo che la reazione elettrochimica era reversibile basato sulla separazione dei picchi (Figura 5). La superficie attiva dell'elettrodo modificato è stata calcolata usando l'equazione di Randles-Sevick (hopc = (2.69 × 105) n3/2 AD1/2 Cv1/2. Dal versante della trama hopc rispetto a v1/2 in Figura 5(a) e (b), la superficie degli elettrodi è stata calcolata come 0,26 cm2 e cm 0,412 per il nudo SPCE e PLA-AuNPs, rispettivamente. Questo risultato ha confermato che il miglioramento offerto dal PLA-AuNPs sulla superficie attiva era relativamente più alto rispetto con SPCE nuda. Il risultato derivato era paragonabile a quella del polimero incorporato oro nanoparticelle (β-CD-EDAS(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylene-diamine matrice incapsulato nanoparticelle d'oro), che ha rivelato che un'elevata superficie attiva migliorato il processo di trasferimento di elettroni e quindi provocato la migliore sensibilità46.

La reazione elettrochimica di SPCE modificata era in un processo di diffusione controllata, indicato da una riduzione del K3[Fe(CN)6]3 -/4 - corrente di picco, che a sua volta invocata la corrente tra la radice quadrata tasso di scansione (v 1/2). Per ottenere una vista migliore delle proprietà modificate dell'elettrodo, è stato effettuato uno studio (EIS) la spettroscopia di impedenza elettrochimica per correlare con le prestazioni dell'elettrodo modificato presentato in termini di misure di CV. La sezione di semicerchio vista alle alte frequenze ha correlate con il processo di limitazione del trasferimento dell'elettrone nel sie. Resistenza al trasferimento di carica (Rct) è stata misurata direttamente come il diametro del semicerchio. Questo risultato è coinciso con il valore di Rct del SPCE nuda, che era 1932 Ω e dove la modifica di SPCE/PLA-AuNPs è diminuito a 1444 Ω (Figura 6). La diminuzione di valore dict R SPCE/PLA-AuNPs può derivare da una diminuzione costante dielettrica locale e/o un aumento dello spessore del elettrico doppio strato47, suggerendo che K3[Fe(CN)6]3 - /4 - funzione di adsorbimento all'interfaccia metallo/soluzione. Queste uscite rispettate quelle derivate dalle misurazioni del CV (Figura 7). Le correnti di picco è aumentato progressivamente con la modifica di SPCEs utilizzando PLA-AuNPs, che ha mostrato che una maggiore sensibilità era l'inverso del inferiore Rct48. Così, l'aumento nel valore di CV degli elettrodi modificati e la diminuzione nei valori dict R potrebbe essere stato dovuto il rimontaggio graduale di molecole di acqua (il volume delle molecole d'acqua è 27.19 Å3) per l'adsorbimento del K3 [Fe(CN)6] 3 -/4 - sulla superficie del metallo, diminuendo l'entità della reazione dissoluzione49.

La tabella 3 indica la deviazione standard relativa (RSD) della ripetibilità e la riproducibilità dell'elettrodo modificato. Routine registrazione CV del K3[Fe(CN)6]3 -/4- è stato fatto per sei set consecutivi indagare la ripetibilità degli elettrodi modificati. La RSD di SPCE/PLA-AuNPs derivava come 4,26%. L'elettrodo con PLA-AuNPs modifica ha dato migliore RSD dopo diverse misurazioni. Inoltre, utilizzando la stessa procedura, sei elettrodi modificati erano indipendentemente fabbricati, che ha dato valori RSD di 4,05% per SPCE/PLA-AuNPs, indicando la migliore riproducibilità della fabbricazione dell'elettrodo per PLA-AuNPs. Il substrato modificato a seconda della PLA-AuNPs è stato mantenuto a 37 ° C per una durata estesa. È stata utilizzata anche per il record di 20 cicli e una diminuzione del 18% nella qualità del segnale. Al fine di raggiungere il massimo di uscita dal biosensore, periodo di immobilizzazione, temperatura, insieme con concentrazione di ssDNA e criteri per l'ibridazione sono stati esaminati. Queste condizioni necessarie per essere ottimizzato, come essi influenzano la corrente di picco di DPV. Per ottimizzare la concentrazione di ssDNA, SPCE/PLA-AuNPs è stato dispensato con concentrazione differente (0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 e 1.4 µM) di ssDNA per 60 min affinché la concentrazione ottimale di ssDNA è stata determinata. Basato su Figura 8, la corrente di picco DPV aumentato come le più alte concentrazioni di DNA sono state usate. Lo studio inoltre ha trovato che la concentrazione ottimizzata del DNA era 1,2 µM ssDNA.

Per ottimizzare il periodo di immobilizzazione che coinvolgono il DNA single-stranded in SPCE/PLA-AuNPs, 25 µ l di ssDNA (1,2 µM) sono stati testati su tempi diversi (30, 60, 90, 120, 150, 180 e 210 min). Nella Figura 9, i risultati mostrano un aumento nel periodo di immobilizzazione conseguente il continuo aumento della corrente di picco DPV. Così, il tempo di immobilizzazione ottimale del ssDNA è stato selezionato come 180 min. Per ottimizzare la temperatura di immobilizzazione, SPCE/PLA-AuNPs è stato dispensato con ssDNA (1,2 µM) a varie temperature (75, 65, 55, 45, 35 e 25 ° C) per 180 min. Abbiamo trovato che quando la temperatura di immobilizzazione è stata aumentata a 55 ° C, la corrente di picco DPV inizialmente escalation seguita da un successivo deprezzamento (Figura 10); così, 55 ° C è stato selezionato come la temperatura di immobilizzazione ottimizzato per essere utilizzato in esperimenti successivi. Separazione di ssDNA che è immobile da superfici dell'inabilità dell'elettrodo e l'ibridazione è stata causata da aumento delle temperature. Ci sono stati altri rapporti con simili risultati50. Più veloce spaccare e degenerazione del DNA dalle superfici di nanoparticelle di oro si è verificato alle superiore temperature51. La ricerca condotta recentemente segnalato che il legame tra oro e tiolo si ossida degrada rapidamente e semplicemente in una situazione che è ambiente, ad esempio quando esposti ad acqua, aria e luce52,53,54. L'effetto del tempo di ibridazione è stato anche studiato in questo studio.

Il fabbricato SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA era goccia-cast con una soluzione di DNA bersaglio (0,2 µM) presso l'ibridazione diversa volte (5, 10, 15, 20, 25 e 30 min). La risposta del DPV rosa ovviamente, con un aumento di 5 min in tempo di incubazione (da 5 a 10 min) (Figura 11). Una volta che questo valore è stato ottenuto, un modello verso il basso di 10 a 30 min è stato osservato così il tempo desiderato per l'ibridazione è stato scelto come 10 min. L'efficienza dell'ibridazione è aumentato con l'aumento della temperatura da 25 ° C a 35 ° C (Figura 12). L'alta corrente è stato visto a diminuire lentamente ad una temperatura superiore a 35 ° C. La ragione di questo è stata attribuita alla denaturazione struttura sandwich riducendo il segnale di rilevamento. Quindi, la temperatura di ibridazione ottimale selezionata era 35 ° C. Il processo che abbiamo usato nella rilevazione di che v. parahaemoliticus comprendeva AuNPs per migliorare la superficie attiva dell'elettrodo di lavoro, PLA per mediare la modificazione superficiale e il redox complesso, MB, a ridotta a LB. Il risultato di questo processo di ossidazione era una migliore affinità tra ssDNA e MB55. Il DPV corrente è stata diminuita a causa del numero inferiore di annesso MB molecole durante l'ibridazione di ssDNA con la sua sequenza complementare.

Abbiamo condotto ulteriori indagini le prestazioni del biosensore sviluppato. I risultati DPV nella Figura 13 mostrano che era in grado di distinguere in modo selettivo sonda DNA, DNA complementare, uno-base DNA non corrispondente, tre basi DNA non corrispondente e non complementare DNA in presenza di MB come il rilevamento etichetta56, 57. la corrente di picco più basso (0,73 µA) è stata esibita dal DNA complementare, che sono aumentate lentamente uno-base DNA non corrispondente (0.94 µA), tre-basi errate del DNA (1,05 µA), DNA non complementare (3,25 µA) e la sonda di DNA (4,79 µA). Il DNA dell'obiettivo corrente era la più piccola di tutte le correnti delle sequenze di oligonucleotidi permettendo la nostra biosensore discriminare tra le sequenze di oligonucleotidi con sensibilità e in particolare. MB associato fortemente con ssDNA immobilizzato sonda DNA producendo una grande corrente di picco DPV. SPCE/PLA-AuNPs/non-DNA complementare ridotto il DNA immobilizzato sonda corrente di quasi la metà come solo una piccola quantità di MB montato sulla superficie di SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA. Questo è probabile essere dovuto inaccessibile interazioni tra MB e guanina basi. Le modalità di interazione del DNA e MB sono fortemente dipendenti tali condizioni sperimentali come pH, temperatura, concentrazione di DNA, forza ionica e tipo di buffer58,59. MB collega comunemente a dsDNA da groove e modalità di intercalazione, con conseguente accumulo di MB il dsDNA superficie60. L'esposizione della nostra sonda di cattura del DNA al DNA non corrispondente uno-base e tre basi DNA non corrispondente costantemente ridotte correnti di picco DPV e il DNA dell'obiettivo complementare ha continuato questa tendenza. La tabella 4 Mostra la percentuale del tasso di selettività per MB picco corrente. La nostra individuazione generale era che l'ibridazione del biosensore DNA costruito era altamente selettivo tramite DNA sonda immobilizzati sulla superficie del SPCE/PLA-AuNPs.

La sensibilità del biosensore DNA sviluppato ulteriormente è stata studiata con varie concentrazioni di oligonucleotidi complementari destinazione. Figura 14 raffigura il progressivo esaurimento della corrente di picco DPV MB su SPCE/PLA-AuNPs come la concentrazione di DNA complementare aumentato. Figura 15 presenta un coefficiente di regressione lineare di 0,96 generato tra il registro di ridotta corrente di picco di MB e il log di diversi concentrazione del target DNA (12:02 a 0,02 mM). Un grafico delle variazioni di corrente di picco (ΔP) è stato tracciato utilizzando la formula 3 σ/m (σ è la deviazione standard della soluzione vuota e m è la pendenza della curva lineare)61,62,63. Il limite di rilevamento del fabbricato biosensore del DNA è stato calcolato essere 16:43 che era maggiore di nostro più piccolo effettivamente misurata del campione. Questo risultato era in accordo con il fatto che ΔP per 12:02 e 14 (2,65 × 10-6 A e 2,81 × 10-6 A) con una deviazione standard di 1.19 × 10-7 A e 1.06 × 10-7 A, rispettivamente, sovrapposti.

Per calcolare il LOQ per il fabbricato biosensore di DNA, abbiamo usato la formula di 10σ/m in cui (σ è la deviazione standard di soluzione vuota e m è la pendenza della curva lineare) e trovato il risultato di essere un guadagno di 14:08. Ripetute denaturazione del DNA complementare è stata effettuata per valutare il biosensore di DNA in termini di capacità di rigenerazione. Abbiamo fatto questo elettrodo di DNA modificato complementari di 0,2 µM in acqua calda a 86 ° C per 8 min in incubazione per denaturare il DNA double-stranded, seguito da un rapido raffreddamento in un bagno di ghiaccio per mantenere il denaturato single-stranded DNA64.

L'attività di ibridazione è stata mantenuta al 91% della sua risposta iniziale dopo 8 tentativi di rigenerazione (n = 5, RSD = 4,05%). Il biosensore di DNA basato sul metodo di SAM per l'immobilizzazione di sonda di DNA a SPCE/PLA-AuNPs era altamente stabile, ottenendo una buona risposta nella rilevazione del DNA complementare dopo processi di denaturazione ripetute. La stabilità del nostro biosensore di DNA per quanto riguarda il calore è stato ulteriormente esplorata. Per fare questo, abbiamo memorizzato l'elettrodo di PLA-AuNPs/SPCE/ssDNA a temperature comprese tra 4 ° C, 25 ° C e 45 ° C in un sacchetto di alluminio sigillato contenente gel di silice. Al termine di 6 mesi, abbiamo valutato il DNA complementare e stima la percentuale di recupero della produzione del segnale. La figura 16 Mostra che la sonda SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA era altamente stabile con più di 80% del suo segnale iniziale ancora recuperabili dopo di immagazzinaggio 6 mesi. La forte reazione tra PLA-AuNPs e ssDNA è stata trovata per avere stabilità a lungo termine ad una temperatura inferiore a 45 ° C.

Nove diverse specie di batteri (b. cereus, L. monocytogenes, C. jejuni, e. coli O157: H7, V. alginolyticus, S. typhimurium, S. enterite, polmonite di K. e V. parahaemolyticus) sono stati selezionati tramite rilevazione di PCR. I prodotti di amplificazione di PCR per il rilevamento di specie-di V. parahaemoliticus dalla coltura di batteri sono mostrati in Figura 17. Il gene toxR di V. parahaemoliticus è stato utilizzato come primer PCR per l'identificazione di V. parahaemoliticus grazie alla sua presenza in isolati patogeni. Dall'analisi di PCR, V. parahaemoliticus ha mostrato risultati positivi a causa della specificità del primer PCR del gene di toxR verso V. parahaemoliticus. Nessun prodotto PCR da altri ceppi batterici sono stato rilevato. Il picco DPV corrente ottenuto dopo una valutazione di reattività crociata ha mostrato molto chiaro rilevamento di V. parahaemoliticus rispetto alle altre specie di batteri, come raffigurato nella Figura 18. Il segnale DPV aumentato il numero delle coppie di basi è diminuito, a causa della maggiore quantità di molecole MB associato a sonde. V. parahaemoliticus erano chiaramente in grado di essere discriminati da altri patogeni di origine alimentare che ha imitato l'ambiente del campione alimentare.

Vongole sono stati selezionati come campioni reali per la validazione di biosensori di DNA in questo studio, dal momento che sono ingredienti popolari in diversi tipi di cibo locale. È noto che vongole crude spesso portano patogeni V. parahaemolyticus e può trasmettere questi batteri agli esseri umani, soprattutto se essi sono adeguatamente refrigerati durante la conservazione dopo la raccolta65. Il gruppo curato di campioni di cockle era conservato a-20 ° C per 24 h ed esposti a luce UV a 20 ° C per 4 h prima dell'estrazione del DNA durante la nostra fase di pre-trattamento. Figura 19 indica che l'analisi PCR trovato V. parahaemoliticus in entrambi i campioni trattati e non trattati (a spillo). Questo è mostrato in Lane 7, 8, 9, 10, 11 e 12 che correlano con la Colonia contare nella discussione precedente. Non V. parahaemolyticus appare nei campioni trattati e non trattati (sono), come mostrato in Lane 1, 2, 3, 4, 5 e 6 nei risultati della PCR, anche se il conteggio delle colonie ha indicato la sua presenza nei campioni. Un motivo possibile per questo è la presenza di contaminanti metaboliti quali proteina il DNA estratti da66.

Figura 20 riassume i risultati di rilevamento utilizzando il biosensore DNA sviluppato, che correttamente determinato la presenza di V. parahaemoliticus nel gruppo curato costituita a spillo e sono campioni. Questi risultati correlano positivamente con i risultati PCR discussi in precedenza. Ogni campione di PCR che ha mostrato risultati positivi è stato scoperto utilizzando la tecnica del biosensore elettrochimico PLA-stabilizzato, che è basato su AuNP, e l'area dei picchi DPV chiaramente corrispondeva con le bande di intensità PCR risultante (Figura 19 e Figura 20). Questi risultati indicano che il sensore elettrochimico basato su nanoparticelle suggerito in questo studio rilevato V. parahaemoliticus correttamente in campioni reali, dimostrando così che risulta superiore al PCR con nessun effetto sull'autenticità dei risultati.

Figure 1
Figura 1 : Assorbanza di PLA-AuNPs Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Lo spettro di diffrazione dei raggi x di PLA-AuNPs. Adattato con permesso da Ref. [30]. Copyright (2016) Sociedade Brasileira de Química. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Distribuzione di diametro di frequenza TEM e immagini di PLA-AuNPs ad una misurazione in scala di 50 nm. Ristampato con il permesso da Ref. [30]. Copyright (2016) Sociedade Brasileira de Química. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : EDX spettri e FESEM immagini di (a) nudo SPCE e (b) SPCE/PLA-AuNPs. Ristampato con il permesso da Ref. [30]. Copyright (2016) Sociedade Brasileira de Química. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : La trama di ossidazione corrente di picco contro la radice quadrata di scansione tasso e voltammograms ciclico: (a) nudo SPCE e (b) SPCE/PLA-AuNPs in 1,0 mmol L-1 K3[Fe(CN)6] (pH 7). Le tariffe di scansione sono stati 300, 250, 200, 150, 100 e 50 mV s−1. Adattato con permesso da Ref. [30]. Copyright (2016) Sociedade Brasileira de Química. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 : Spettri di impedenza degli elettrodi modificati in 1,0 mmol L-1 K 3 [Fe(CN)6] (pH 7). Ampiezza: 5 mV e della gamma di frequenza: 0,1-105 Hz. adattato con permesso da Ref. [22]. Copyright Elsevier (2016). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7 : Corrente di picco anodico di per volta elettrodi in 1,0 mmol L-1 K 3 [Fe(CN)6] (pH 7) a una velocità di scansione di 0,1 V s -1 utilizzando la misura di voltammetria ciclica Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8 : Effetto di concentrazione per l'immobilizzazione di ssDNA su SPCE/PLA-AuNPs in 0.1 mol L-1 PBS (pH 7) alle frequenze di scansione di 0,1 V s -1 dopo un'incubazione di 30 min a 20 µM MB utilizzando unità di misura di impulso differenziale voltammetria Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9 : Effetto del tempo di immobilizzazione di ssDNA su SPCE/PLA-AuNPs a 0.1 mol L -1 PBS (pH 7) a una velocità di scansione di 0,1 V s -1 dopo un'incubazione di 30 min a 20 µM MB utilizzando unità di misura di impulso differenziale voltammetria Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 10
Figura 10 : Effetto della temperatura di immobilizzazione di ssDNA SPCE/PLA-AuNPs a una velocità di scansione di 0,1 V s -1 a 0.1 mol L -1 PBS (pH 7) dopo un periodo di incubazione di 30 min a 20 µM di MB utilizzando unità di misura di impulso differenziale voltammetria Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 11
Figura 11 : Effetto del tempo di ibridazione su SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA a 0.1 mol L -1 PBS (pH 7) a una velocità di scansione di 0,1 V s -1 dopo un'incubazione di 30 min a 20 µM MB utilizzando unità di misura di impulso differenziale voltammetria Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 12
Figura 12 : Effetto della temperatura di ibridazione su SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA a 0.1 mol L -1 PBS (pH 7) a una velocità di scansione di 0,1 V s -1 dopo un'incubazione di 30 min a 20 µM MB utilizzando unità di misura di impulso differenziale voltammetria. Ristampato con il permesso da Ref. [22]. Copyright Elsevier (2016). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 13
Figura 13 : Istogramma MB riduzione corrente di picco utilizzando diversi tipi di DNA a 0.1 mol L –1 PBS (pH 7) a una velocità di scansione di 0,1 V s -1 dopo un'incubazione di 30 min a 20 µM MB. L'inserto viene illustrato voltammograms impulso differenziale nelle stesse condizioni. Ristampato con il permesso da Ref. [22]. Copyright Elsevier (2016). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 14
Figura 14 : Istogramma MB riduzione corrente di picco con differenti concentrazioni di DNA a 0.1 mol L –1 PBS (pH 7) a una velocità di scansione di 0,1 V s -1 dopo un'incubazione di 30 min a 20 µM MB utilizzando unità di misura di impulso differenziale voltammetria. Ristampato con il permesso da Ref. [22]. Copyright Elsevier (2016). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 15
Figura 15 : Una trama lineare della riduzione di picco corrente di MB contro il logaritmo della concentrazione di DNA differente a 0.1 mol L -1 PBS (pH 7) a una velocità di scansione di 0,1 V s -1 dopo un'incubazione di 30 min a 20 µM MB utilizzando unità di misura di impulso differenziale voltammetria. Ristampato con il permesso da Ref. [22]. Copyright Elsevier (2016). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 16
Figura 16 : Effetto di temperature diverse ibridazione su SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA a 6 mesi di intervallo di memorizzazione (n = 3). Misure sono state effettuate a 0.1 mol L-1 PBS (pH 7) a una velocità di scansione di 0,1 V s-1 dopo un'incubazione di 30 min a 20 µM MB utilizzando unità di misura di impulso differenziale voltammetria. Ristampato con il permesso da Ref. [22]. Copyright Elsevier (2016). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 17
Figura 17 : Amplificazione di agarosio gel elettroforesi-PCR utilizzando prodotti di sequenziamento del gene del rRNA 16S di batteri selezionati da coltura batterica. M: Lane 1kb DNA ladder, Lane C−: controllo (acqua distillata sterile), corsia c + negativo: controllo positivo (il DNA Estratto da Escherichia coli viene utilizzato come modello), Lane CE: e. coli O157: H7, Lane CJ: c. jejuni , Lane BC: B. cereus, KP Lane: polmonite K., Lane ST: S. typhimurium, Lane LM: L. monocytogenes, Lane SE: enterite S., VP di Lane: V. parahaemolyticus e Lane VV: V. alginolyticus Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 18
Figura 18 : Istogramma MB riduzione corrente di picco per studio di reattività crociata del biosensore DNA contro vari patogeni di origine alimentare a 0.1 mol L -1 PBS (pH 7) a una velocità di scansione di 0,1 V s -1 dopo un'incubazione di 30 min a 20 µM MB utilizzando unità di misura di impulso differenziale voltammetria. Ristampato con il permesso da Ref. [23]. Copyright (2017) Springer. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 19
Figura 19 : Prodotti di amplificazione di agarosio gel elettroforesi-PCR di V. parahaemoliticus dai campioni di cockle fresco. M: Lane 2ul di 100 bp DNA ladder, vicolo 1-3: non trattata sono campioni, Lane 4-6: trattati sono campioni, Lane 7-9: non trattata campioni arricchiti, Lane 10-12: trattati campioni arricchiti, corsia c +: controllo positivo (V. parahaemoliticus ATCC 17802), Corsia C-: controllo (acqua distillata sterile) negativo. Ristampato con il permesso da Ref. [23]. Copyright (2017) Springer. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 20
Figura 20 : Istogramma MB riduzione corrente di picco per il rilevamento di V. parahaemoliticus in campioni freschi cockle utilizzando il biosensore DNA a 0.1 mol L-1 di PBS (pH 7) a una velocità di scansione di 0,1 V s-1 dopo un'incubazione di 30 min a 20 µM MB utilizzando unità di misura di impulso differenziale voltammetria. Ristampato con il permesso da Ref. [23]. Copyright (2017) Springer. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Composizione dell'elettrodo Tempo di incubazione (h) Temperatura (° C) Crescita media
Campylobacter jejuni 48 42 BA / BB
Listeria monocytogenes 48 30 TSA / TSB
Salmonella typhimurium 24 37 TSA / TSB
Salmonella enteritidis 24 37 TSA / TSB
Polmonite della klebsiella 24 37 EMBA / TSB
Escherichia coli O157: H7 24 37 MA / TSB
Bacillo saguaro 24 37 MYPA / TSB
Alginolyticus del vibrione 24 37 TSA + 3% NaCl/TSB+3% NaCl
Vibrio parahaemolyticus 24 37 CA/TSA+3% NaCl/TSB+3% NaCl

Tabella 1: Cultura condizioni di batteri selezionati.

Campione Pos. [° 2Th.] FWHM [° 2TH.] d-spaziatura [Å] Dimensione del cristallite (nm)
PLA-AuNPs 31.682 0.3149 2.8243 27

Tabella 2: La dimensione dei cristalliti PLA-AuNP. Adattato con permesso da Ref. [30]. Copyright (2016) Sociedade Brasileira de Química.

Elettrodo modificato % RSD (n = 6) Riduzione di segnale (%) (n = 20)
Ripetibilità Riproducibilità
SPCE/PLA-AuNPs 4,26 4,05 18

Tabella 3: proprietà di elettrodi modificati per modifica AuNPs e PLA-AuNPs in K 3 [Fe(CN)6] con 1,0 mmol L -1 concentrazione a una velocità di scansione di 0,1 V s -1 . Adattato con permesso da Ref. [30]. Copyright (2016) Sociedade Brasileira de Química.

Composizione dell'elettrodo Hopa (µA) Epa Tasso di selettività (%)
(n = 3) (V)
SPCE/PLA-AuNP/sonda DNA 4.79 ± 0,10 -0,46 -
SPCE/PLA-AuNP/non-DNA complementare 3,25 ± 0,12 -0,44 67.85
DNA non corrispondente SPCE/PLA-AuNP/3-basi 1.05 ± 0,11 -0,45 21,92
DNA non corrispondente SPCE/PLA-AuNP/1-base 0.94 ± 0,12 -0,46 19,62
DNA SPCE/PLA-AuNP/complementare 0.73 ± 0,10 -0,45 15,24

Tabella 4: selettività DPV di MB picco corrente a 0.1 mol L -1 PBS (pH 7) a una velocità di scansione di 0,1 V s -1 dopo un'incubazione di 30 min a 20 µM MB

Composizione degli elettrodi Metodo di rilevazione Range di linearità (M) Limite di rilevazione (M) Riferimenti
AuNPs 3D DPV 1,5 × 10-6 - 7.0 × 10-9 2.0 × 10-10 69
(+) AuNPs DPV 1,0 × 10-9 - 1.5 × 10-12 2.6 × 10-12 70
AuNPs/GR DPV 1.3 × 10-9 - 2,5 × 10-11 8,3 × 10-12 71
AuNPs-ADH-GSs DPV 5.0 × 10-8 - 3.0 × 10-13  3.0 × 10-13 72
AuNPs-MPTS DPV 5.0 × 10-9 - 1,0 × 10-11  5.0 × 10-11 73
AuNPs – GO DPV 1,0 × 10-9 - 1,0 × 10-14 3.5 × 10-15 74
CoS / AuNPs DPV 1,0 × 10-9 - 1,0 × 10-12 7.0 × 10-13 75
PLA-AuNPs DPV 2.0 × 10-8 - 2.0 × 10-13 5.3 × 10-12 Quest'opera

Tabella 5: Confronto tra alcune del nanosensori di DNA elettrochimica sviluppata di recente. Ristampato con il permesso da Ref. [22]. Copyright Elsevier (2016).

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Discussion

I passaggi critici in un quadro di sviluppo positivo di questo tipo di biosensore elettrochimico sono selezione di elementi di riconoscimento biologico appropriato per il trasduttore (acido nucleico o DNA qui); approccio chimico per la costruzione di strato sensibile del trasduttore; materiale di trasduzione; ottimizzazione di immobilizzazione del DNA ed ibridazione; e convalida del biosensore sviluppato utilizzando campioni reali.

Core per il corretto sviluppo di un biosensore elettrochimico sensibile e selettivo di DNA, è l'ottimizzazione della condizione immobilizzazione e l'ibridazione. In questo lavoro, abbiamo usato MB come il complesso di redox. Ci sono vari principi delle interazioni MB-DNA: (i) di interazione elettrostatica della carica cationica MB con la carica anionica del backbone di fosfato di ssDNA e dsDNA; (ii) di intercalazione MB attraverso esito positivo inserimento di MB tra alternando coppie di basi G-C a dsDNA; (iii) con legame covalente alla fine del ssDNA di destinazione, che produce una densità bassa etichetta (uno o due MB molecole al filo del DNA); e (iv) dalle interazioni MB con una base a ssDNA di guanina non associata. Abbiamo applicato il quarto principio, che identifica con precisione V. parahaemoliticus da cross reattività di batteri e vongole fresche. Dopo ossidazione di particolare interesse, c'era una forte affinità tra MB e ssDNA. L'ibridazione di ssDNA con la sua sequenza complementare sostituisce le molecole bonded di MB e così riduce il segnale.

La serie di risultati sperimentali presentati sopra si concentra sullo sviluppo di un metodo rapido per rilevare V. parahaemoliticus con alta selettività e sensibilità utilizzando i principi di ibridazione del DNA. Il primo passo è la sintesi e la caratterizzazione polilattico acido-stabilizzato di nanoparticelle di oro (PLA-AuNPs) per la modifica dell'elettrodo (figure 1-6 e tabella 2). La qualità delle nanoparticelle d'oro è stata valutata mediante diffrazione di raggi x (XRD), microscopia elettronica di scansione di emissione di campo (FESEM), microscopia elettronica in trasmissione (TEM), spettroscopia ultravioletto-visibile (UV-Vis), voltammetria ciclica (CV) e Analisi di impedenza. La seconda parte dello sviluppo coinvolti una caratterizzazione elettrochimica dell'elettrodo modificato (figure 7-12 e tabella 3-4) che ha determinato il successo potenziamento dell'elettrodo modificato rispetto l'elettrodo nuda in termini di rilevare l'evento di ibridazione.

La terza fase dello sviluppo di biosensori basati DNA si basava sull'ottimizzazione delle condizioni sperimentali dell'evento di ibridazione e l'applicazione del biosensore sviluppato per la rilevazione dell'agente patogeno effettivo (figure 13-20). L'evento di ibridazione che hanno determinato il successo della rilevazione dell'agente patogeno è stata valutata utilizzando impulso differenziale voltammetria (DPV). Attraverso la riduzione della corrente è stata indicata l'esistenza positiva dell'agente patogeno mirato. La sensibilità del biosensore sviluppato è stata valutata attraverso la costruzione di una trama di calibrazione e il calcolo di LOD (Figura 15). Il fabbricato biosensore è stato in grado di distinguere in particolare V. parahaemoliticus da altri agenti patogeni sulla base dei diversi livelli di riduzione di corrente (figure 17 e 18). La valutazione della fattibilità del biosensore sviluppato per il rilevamento di V. parahaemoliticus in campione di cibo effettivo è presentata in figure 19 e 20 e l'esistenza positiva dell'agente patogeno mirato è indicato dalla riduzione della corrente . Il positivo sviluppo di biosensori basati sul DNA è fortemente dipendente dalla selezione sonda DNA, potenziamento dell'elettrodo modificato, nonché l'ottimizzazione delle condizioni sperimentali. La sonda di DNA qui è stata adattata dal precedente lavoro di Nakano67. Valorizzazione degli elettrodi modificati è stato effettuato utilizzando nanoparticelle d'oro stabilizzate con acido polilattico per attivare la standardizzazione della nanosize. La funzione di nanoparticelle d'oro come materiale catalitico di electro68 e atto per aumentare la velocità di trasferimento dell'elettrone e forniscono anche una superficie su cui ancorare la sonda di DNA. I parametri sperimentali sono stati ottimizzati in termini di temperatura e incubazione del tempo che è fondamentale per DNA di modulo fronte/retro. La temperatura di ibridazione interessa la separazione tra l'adsorbimento non specifico e questo aumenta la selettività del sensore. Tempo di incubazione dell'ibridazione aumenta le probabilità della formazione duplex. La procedura di immobilizzazione deve essere ottimizzata al fine di assicurarsi che la sonda di DNA sarà in orientamento adatto per la formazione di duplex al form.

Tabella 5 confronta un campione di recentemente sviluppato elettrochimico DNA biosensori69,70,71,72,73,74,75 ,. Biosensori basati sul DNA sono un metodo promettente per la sostituzione di tecniche molecolari di base anche se ci sono alcune limitazioni che devono essere affrontate prima che il metodo può essere abbastanza portatile per l'utilizzo in loco. Il limite principale è l'estrazione di DNA di elaborazione del campione come la purezza e la quantità di DNA estratto sul sito non è probabile che sia buono come che estratte con il metodo di base di laboratorio standard. È, tuttavia, una promettente alternativa se la PCR ed elettroforesi su gel può essere sostituito con sistema di pretrattamento del campione come microfluidica.

Biosensori basati sul DNA sono potenzialmente utili per molte applicazioni tra cui diagnostica medica, monitoraggio ambientale e controllo di prodotti alimentari. Questa tecnica consentirà il monitoraggio on-line dei processi di controllo qualità, nonché di point-of-care monitoraggio dei pazienti. La portabilità del sistema intero sensore consentirà il decentramento dei processi diagnostici dove il consumatore può utilizzare il sistema di rilevamento nel comfort della propria casa.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori vorrebbero riconoscere il sostegno di Universiti Putra Malaysia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Merck 100056
Chloroform Merck 102445
Diaminoethane tetraacetic acid Promega E5134
Dibasic sodium phosphate  Sigma-Aldrich S9763
Disodium hydrogen phosphate Sigma-Aldrich 255793
Ethanol  Sigma-Aldrich 16368
Gold (III) chloride trihydrate Sigma-Aldrich 520918
Hydrochloric acid Merck 100317
Methylene blue Sigma-Aldrich M44907
Monobasic sodium phosphate, monohydrate Sigma-Aldrich S3522
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P5119
Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D NatureWorks 4042D
Potassium chloride R&M Chemicals 59435
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich P9791
Potassium hexacyanoferrate III R&M Chemicals 208019
Sodium acetate anhydrous salt Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
Trisodium citrate Sigma-Aldrich S1804
Tris(hydroxymethyl) aminomethane Fisher Scientific T395-100
Tris-Base Fisher Scientific BP152-500
2X PCR Master Mix with Dual-Dye Norgen Biotek 28240
Agarose gel Merck 101236
Bolton Agar Merck 100079
Bolton Broth Merck 100079
CHROMagar Vibrio CHROMagar VB910
dNTPs Promega U1511
Nuclease-free water Thermo Scientific R0581
Eosin methylene blue agar  Merck 101347
GelRed Biotium 41001
Glycerol Merck 104092
Go Taq Buffer Promega M7911
Loading dye 100 bp DNA ladder Promega G2101
Loading dye 1kb DNA ladder Promega G5711
Magnesium chloride Promega 91176
Mannitol egg yolk polymyxin agar Merck 105267
McConkey Agar Merck 105465
Nutrient Broth Merck 105443
Taq polymerase Merck 71003
Trypticase Soy Broth Merck 105459
Trypticase Soy Agar Merck 105458

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