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Bioengineering

Desenvolvimento de um Biosensor eletroquímico do DNA para detectar um patógeno de origem alimentar

Published: June 3, 2018 doi: 10.3791/56585
Automatic Translation
1, 2,3, 1, 4
1Laboratory of Food Safety and Food Integrity, Institute of Tropical Agriculture and Food Security, Universiti Putra Malaysia, 2Laboratory of Functional Device, Institute of Advanced Technology, Universiti Putra Malaysia, 3Department of Chemistry, Faculty of Science, Universiti Putra Malaysia, 4La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University

Summary

Um protocolo para o desenvolvimento de um biosensor eletroquímico de DNA composta por um eletrodo de carbono ácido-estável, ouro de nanopartículas-modificado, serigrafado polilático para detectar o Vibrio parahaemolyticus é apresentado.

Abstract

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) é um patógeno comum de intoxicação alimentar que contribui para uma grande parte dos problemas de saúde pública no mundo, afetando significativamente a taxa de morbidade e mortalidade humana. Métodos convencionais para a detecção de V. parahaemolyticus como métodos baseados em cultura, testes imunológicos e moleculares com base em métodos requerem manipulação de amostra complicado e são caro, demorado e tedioso. Recentemente, biosensores tem provado para ser um método de deteção promissora e abrangente com as vantagens da detecção rápida, custo-efetividade e praticidade. Esta pesquisa se concentra no desenvolvimento de um método rápido de detectar V. parahaemolyticus com alta seletividade e sensibilidade usando os princípios de hibridização de DNA. No trabalho, caracterização de nanopartículas ouro sintetizado polilático ácido-estabilizado (PLA-AuNPs) foi conseguida usando a difração de raios x (XRD), espectroscopia de ultravioleta-visível (UV-Vis), microscopia eletrônica de transmissão (TEM), de emissão de campo Microscopia eletrônica (FESEM) e voltametria cíclica (CV). Também realizamos ensaios de estabilidade, sensibilidade e reprodutibilidade do PLA-AuNPs. Nós achamos que o PLA-AuNPs formou uma estrutura sólida de nanopartículas estabilizadas em solução aquosa. Observou-se também que a sensibilidade melhorada como resultado o valor de resistência (Rct) de transferência de carga menor e um aumento da área de superfície ativa (0,41 cm2). O desenvolvimento da nossa biosensor DNA baseou-se na modificação de um eletrodo de carbono serigrafado (SPCE) com PLA-AuNPs e usando azul de metileno (MB) como indicador redox. Foram avaliados os eventos de imobilização e hibridação por voltametria de pulso diferencial (DPV). Descobrimos que complementar, não-complementares, e oligonucleotides incompatíveis especificamente foram distinguidos pelo biosensor fabricado. Também mostrou que confiantemente sensível deteção em estudos de reatividade cruzada contra vários patógenos de origem alimentar e na identificação de V. parahaemolyticus em berbigões frescos.

Introduction

Um importante tópico de debate público e científico nos últimos anos, a intoxicação alimentar é principalmente associada com 3 agentes: microorganismos1, produtos químicos2e parasitas3. Alimentos contaminados podem causar consequências graves para a saúde nos seres humanos, especialmente no grupo de risco mais elevado das pessoas com fraco sistema imunológico, a mulheres grávidas, idosas, bebês e crianças pequenas4. Com mais de 1 milhão de casos de diarreia aguda, ocorrendo anualmente em crianças menores de 5 anos de idade na África, Ásia e América Latina, a intoxicação alimentar é das principais doenças global5,6 e estabeleceu-se a Organização Mundial da saúde microorganismos como o mais importante contribuinte7. Vibrio parahaemolyticus destaca-se entre as cepas virulentas mais amplamente reconhecidas. Geralmente encontrado em ambientes costeiros, estuarinos e marinhos8, é uma bactéria Gram-negativa, que se torna ativo em ambientes de sal elevados e provoca grave gastroenterite humana quando comidos em marine inadequadamente cozida, maltratado ou cru produtos9. Além disso, condições médicas existentes em algumas pessoas tornem propenso a ferida infecção, septicemia ou orelha infecção decorrentes de V. parahaemolyticus10. Os fatores de virulência de V. parahaemolyticus hemolisinas são divididos em dois tipos, que contribuem para a patogênese da doença: thermostable hemolisina directa (TDH) codificadas por genes tdh e hemolisina TDH-relacionados, codificadas por genes de trh11. Os marcadores de virulência (genes tdh e trh) de V. parahaemolyticus são normalmente encontrados em amostras clínicas em vez de amostras ambientais.

V. parahaemolyticus possui a habilidade de sobreviver em uma ampla gama de condições, responder rapidamente às mudanças ambientais12. Seu mecanismo de proliferação se agrava seu potencial de risco à medida que sua toxicidade aumenta em paralelo com a célula em massa13. Pior ainda, mudança climática está fornecendo estas bactérias com amplas condições para acelerar sua de crescimento de população celular14. Devido à sua alta frequência, V. parahaemolyticus necessita de ser acompanhada ao longo da cadeia de abastecimento alimentar, particularmente no comércio e na produção de frutos do mar, desde que esses produtos sejam onde eles são encontrados em quantidades enormes de15,16 em todo o mundo. Atualmente, as bactérias são identificadas e isolados, usando uma variedade de métodos, incluindo testes bioquímicos, enriquecimento e meios selectivos17, enzima-lig Fima adsorvente do ensaio (ELISA)18, eletroforese em gel de pulso-campo (PFGE) 19, testes de aglutinação de látex e de testes de reação em cadeia (PCR) polimerase20. Esses métodos normalmente requerem pessoal qualificado, instrumentos sofisticados e técnicas laboriosas que não fornecem informações sobre contaminação imediatamente. Isto limita severamente a probabilidade de detectar prontamente contaminação prejudicial e aplicações no local. Ferramentas de detecção rápida permanecem um desafio excepcional.

Biosensing está emergindo como uma opção promissora para a detecção de agentes patogénicos de origem alimentar, porque oferece uma economia de tempo, econômico, prático e em tempo real de análise método21,22,23,24 . No entanto, embora tenha havido muitos resultados positivos de detecção de analito em amostras cravadas e solução padrão usando biosensores, ainda há uma falta de pesquisa aplicada a amostras reais em misturas aquosas ou extractos orgânicos25. Recentemente, biosensores eletroquímicos detecção direta ou indireta de Ácido desoxirribonucleico (DNA) têm recebido atenção crescente entre os cientistas, devido a sua detecção específica do alvo complementar através de uma hibridização evento26 , 27 , 28 , 29. essas abordagens únicas são mais estáveis em comparação com biossensores enzimáticos, oferecendo assim uma tecnologia promissora para a miniaturização e comercialização. O alvo do estudo relatado aqui é construir uma ferramenta rápida que pode detectar V. parahaemolyticus com alta seletividade, sensibilidade e praticidade, baseada-se a especificidade de sequência de DNA durante a hibridação. Estratégias de identificação envolvem a combinação de polilático nanopartículas de ouro ácido-estabilizado (PLA-AuNPs)30 e os elétrodos do carbono serigrafado (SPCEs) na presença do indicador de hibridação, azul de metileno (MB). O potencial de construção de deteção desenvolvidos é mais explorado usando amostras de berbigão fresco e lisado de DNA de bactérias.

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Protocol

Nota: Todos os reagentes químicos e bioquímicos para ser usado devem ser de qualidade analítica e usado sem mais purificação. Prepare todas as soluções usando água deionizada estéril. Autoclave todos os produtos vidreiros antes da esterilização.

Atenção: Por favor, use todas as práticas de segurança adequadas ao realizar atividades de laboratório, incluindo o uso de controles (coifa, porta-luvas) de engenharia e equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco, calça comprida, fechados sapatos).

1. fabricação e caracterização de modificado eletrodo usando PLA-AuNPs

  1. Preparação e caracterização de PLA-AuNPs
    1. Rapidamente, adicionar 10 mL de solução de citrato de sódio (38,8 mM) para 100 mL de solução de Ácido cloroáurico aquosa (1 mM) a ferver e esfriar até a temperatura ambiente. Observe as alterações na cor da solução de AuNPs preparado, que começa como amarelo, alterações enegrecido e finalmente termina como vermelho rubi escuro.
    2. Coloque as bolinhas PLA em um molde de aço inoxidável para o processo de fusão e pré-aqueça-os a uma temperatura de 190 ° C por 10 min. siga com o procedimento de prensagem: colocá-los sob uma pressão de 2,2 MPa para 1 min como parte da preparação de folha PLA. A folha PLA estará pronta para uso após arrefecimento para cerca de 3 h.
    3. Mexendo vigorosamente, dissolva 0,68 mg das folhas de PLA em 5 mL de clorofórmio à temperatura ambiente. Misture o PLA dissolvido com 10 mL da solução de AuNPs previamente preparada e homogênea, misture-o à temperatura ambiente. As misturas homogéneas podem então ser denotadas como PLA-AuNPs e caracteriza-se usando o UV-Vis, XRD, temperatura e FESEM com EDX.
  2. Preparação e caracterização de eletrodos modificados carbono serigrafado
    Nota: A SPCE utilizado neste estudo é composto por um sistema do três-elétrodo: um contador elétrodo, um carbono trabalho e um eletrodo de referência Ag/AgCl.
    1. Rapidamente, Pipetar 25 µ l da solução homogênea de PLA-AuNPs para a SPCE e, em seguida, ar secá-la por 24 h antes da utilização.
    2. Eletroquimicamente caracterizam os eletrodos modificados, SPCE/PLA-AuNPs, em cianeto de potássio ferro (K3[Fe(CN)6]-3/4 -) para medir a área de superfície ativa, espectroscopia de impedância eletroquímica, repetibilidade, reprodutibilidade e estabilidade30.

2. desenvolvimento do Biosensor eletroquímico DNA

  1. Preparação de sonda
    Nota: As sequências do DNA complementar e ssDNA sonda foram escolhidas com base na informação do centro nacional para o banco de dados Biotechnology Information (NCBI).
    1. Compra oligonucleotides sintéticos (20-mer ssDNA sonda, DNA complementar mer-20, 20-mer incompatível DNA e DNA não-complementar 21-mer) como pó liofilizado de laboratórios comerciais, com base na seguintes sequências:
      thiolated ssDNA sonda: 5 ' - / 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3 '
      DNA complementar: 3 ' 5 ' - CAGTGCTTCTGCATAATCCG -
      um-base DNA incompatível: 3 ' 5 ' - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG -
      três bases DNA incompatível: 3 ' 5 ' - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG -
      DNA não-complementar: 3 ' 5 ' - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA -
    2. Prepare as soluções de todos os oligonucleotides (100 µM) usando uma solução estéril e TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5), dividida em parcelas analíticas. Manter a-4 ° C e então fazer as diluições apropriadas apenas antes de usar.
  2. Otimização de imobilização e hibridação
    Nota: Um SPCE modificado com PLA-AuNPs, denotado como SPCE/PLA-AuNPs, foi usado para este estudo e um método de fundição gota foi usado para a imobilização de DNA e a hibridação.
    1. Primeiro, imobilizar 25 µ l de thiolated ssDNA sonda sobre a SPCE/PLA-AuNPs e então ar secar por 24 horas à temperatura ambiente, depois que ele vai ser finalmente denotado como SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA. Determinar a otimização da condição imobilização por meio de três fatores: a concentração do ssDNA (variando de 0,2 a 1,4 µM), tempo (variando de 30 a 210 min) e temperatura (variando de 25 a 75 ° C).
    2. Pipete 25 µ l do DNA complementar sobre a superfície da SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA para realizar o evento de hibridação, após o qual pode ser finalmente denotada como SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA. Determine a otimização da condição da hibridação através de dois fatores de tempo (variando de 5 a 30 min) e temperatura (variando de 25 a 75 ° C).
    3. Mergulhe o imobilizado e eletrodos hibridizados em 20 µM MB por 30 min. remover o DNA não-especificamente adsorvido e excesso MB por lavagem com 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4.5) e em seguida enxaguar com água desionizada. Medida da corrente de pico de redução MB usando a técnica DPV. Executar a medição de DPV usando PBS 0,1 M (pH 7) não contendo nenhum indicador.
  3. Caracterização do biosensor DNA fabricado
    1. Mergulhe a SPCE/PLA-AuNPs em µM de 20 MB por 30 min, lavar com 0,5 M de ABS/20 mM NaCl (pH 4.5) e em seguida enxaguar com água desionizada antes da medição. Segui um procedimento semelhante para todas as interações, incluindo a sonda DNA, DNA complementar, DNA incompatível e amostras de DNA não-complementares.
    2. Medir a redução eletroquímica.
      Nota: Nós medimos DPV usando um Autolab comercialmente fabricado com software de interface.
      As medições de DPV da redução eletroquímica MB realizada em um potencial que varia de -0,5 V a 0,25 V, com um potencial de passo de 0.005 V, amplitude de modulação de 0,05 V e uma taxa de varredura de 7,73 mVs-1 em PBS 0,1 M (pH 7), não contendo nenhum indicador. A seletividade, sensibilidade, reprodutibilidade e estabilidade térmica do biosensor DNA fabricado foram mais estudados. Resultados relatados foram apresentados como média de valor de medições em três repetições.

3. validação do Biosensor DNA fabricado usando amostras reais

  1. Preparação de cepas bacterianas
    1. Selecione amostras bacterianas baseadas sua contaminação significativa de frutos do mar31,32 .
      Nota: V. parahaemolyticus como cepas de referência e 8 outras estirpes bacterianas (Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, enterite de Salmonella, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli O157: H7, Bacillus cereuse Vibrio alginolyticus) da origem alimentar comum patógeno foram empregados para a validação de biosensor eletroquímica do DNA neste estudo.
    2. Realizar uma rotina sub-cultura de estirpes bacterianas em seu respectivo agar quinzenalmente para manter a sua viabilidade, consulte a tabela 1 para condições de cultura.
    3. Manter a preservação a longo prazo das cepas bacterianas em seus respectivos caldos crescentes contendo 20% (v/v) glicerol a-80 ° C, como glicerol protege bactérias, impedindo a formação de cristais de gelo que podem danificá-los durante o processo de congelamento. Em seguida, inocule um loop da cultura de pilha bacteriana conservados em estoque de glicerol para os respectivos caldos. Incube os caldos de acordo com seu respectivo crescimento tempo e temperatura, quando precisar de reviver as bactérias.
    4. Determine a quantidade de V. parahaemolyticus células usando uma placa de expansão técnica33, um padrão e um método conhecido para enumerar derivados de uma série de diluições de microorganismos.
      1. Cultura V. parahaemolyticus trypcase soja caldo (TSB + 3% NaCl) a 37 ° C, num estado de agitação 140-rpm. Em seguida, transferir 1 mL de cultura de células de bactérias para 9ml de TSB + 3% NaCl para obter um fator de diluição 10-1 .
    5. Repita essa etapa nove vezes para obter uma série completa de factor de diluição até 10-10 . Em seguida, espalhe 0,1 mL de cada fator de diluição (a partir de 10-1 a 10-10) na placa de ágar seletivo do Vibrio uma colônia contando, respectivamente. Incube as placas incubadas a 37 ° C por 24 h.
    6. Use um contador de colônia para contagem das colónias individuais e depois volta-calcular (contagem a quantidade CFU/pipetado x fator de diluição) para obter uma unidade formadoras de colônia por mililitro densidade (CFU mL-1). Derive a concentração da colônia formando unidades (CFUs) nas suspensões celulares de bactérias do terreno de calibração do UFC mL-1 contra absorvância.
  2. Preparação do ensaio do PCR
    1. Extrair DNA genômico seguindo uma modificada fervido lise procedimento34. Primeira, raia uma bacterianas individuais Coe em meios de ágar e inoculá-lo na mídia de caldo, seguida por incubando-lo em sua condição de crescimento relativo, um 140 rpm tremendo condição.
    2. Pipete uma cultura de 1 mL de caldo de carne para um tubo de centrífuga de micro. Centrifugar-isto a 4830 x g e 4 ° C, durante 1 min obter Pelotas. Use cerca de 500 µ l de tampão estéril de TE para re-suspensão com a pelota. Segure a suspensão resultante durante 10 minutos no 98 ± 2 ° C em um bloco de aquecimento e chill-lo imediatamente a-18 ° C por 10 min lisar as células e liberar o DNA.
    3. Centrifugar o DNA genômico a 4830 x g e 4 ° C por 3 min obter uma suspensão clara e manter o sobrenadante a-20 ° C para utilização posterior. Use uma medida de biophotometer com absorção de UV no comprimento de onda de 260 nm (como os ácidos nucleicos absorver comprimento de onda de luz) e também no comprimento de onda de 280 nm (como as proteínas de absorção de luz de comprimento de onda) para determinar a concentração e pureza do extraído DNA genômico e então identificar todas as estirpes utilizando ensaios bioquímicos padrão35 e verificá-los por 16S rRNA gene sequenciamento36. Finalmente, desnaturar o DNA genômico a 92 ° C por 2 min e resfriá-lo rapidamente em água gelada antes da aplicação para o biosensor.
    4. Confirmar a presença de V. parahaemolyticus usando PCR para o gene toxR-alvo. Execute esse procedimento em um thermocycler usando um par de primer (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' e 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3'). Otimize a amplificação por PCR em um volume total de reação de 25 μL, consistindo de água esterilizada (15,5 µ l), tampão (5 µ l), primeira demão (1 µ l, 10 µM), dNTP mix (1 µ l), modelo de DNA (2 µ l) e Taq DNA polimerase (0,2 µ l, 10x).
    5. Misture os componentes bem e organizar a amplificação por PCR da sequência de destino em um thermocycler programado para 30 ciclos de amplificação. Em nosso estudo, cada ciclo consistiu em três etapas de reações , ou seja,., desnaturação inicial (94 ° C, 3 min), seguido de 30 ciclos de desnaturação (94 ° C, 1 min), recozimento (63 ° C, 1,5 min) e extensão (72 ° C, 1,5 min), seguido pela extensão final (72 ° C, 7 min).
    6. Determine os produtos amplificados e seus tamanhos através de electroforese em gel de agarose 1,5%. Capture as imagens de gel com um sistema de gel-documentação produzidos comercialmente.
  3. Preparação de amostras de berbigão
    1. Obter amostras frescas.
      Nota: Nosso berbigão fresco (Anadara granosa) foram obtido a partir do mercado molhado em Serdang, Selangor e rapidamente trazido para o laboratório em uma caixa de gelo mais fresca para análise. Divida as amostras em 2 grupos, ou seja, o grupo tratado e não tratado, assumindo que o berbigão foram colhida uniformemente desde o início da safra até colocá-los em armazenamento frio.
    2. Pré-tratamento berbigão no grupo tratado, armazenando-os em-20 ° C por 24 h, seguido de exposição à luz UV, a 20 ° C, por 4h antes da extração de DNA.
      Nota: A temperatura de congelamento e exposição aos raios UV, usado para a controlada grupo mata ou pelo menos limita a naturalmente acumular V. parahaemolyticus nas amêijoas. Não aplica um regime mais elevado de pasteurização de 70 ° C como o objetivo da condição controlada neste estudo é imitar a situação real das amêijoas frescas. Entretanto, analise amostras diretamente do grupo não tratado sem qualquer tratamento prévio, assim que eles chegam no laboratório.
    3. Subcultura de uma estirpe de V. parahaemolyticus ATCC 17802 em TSB (3% NaCl). Determinar o nível de células viáveis em inóculo através de chapeamento de diluições apropriadas de TSB (3% NaCl) na CA a fim de obter um inóculo de 104 UFC mL-1 de V. parahaemolyticus. Lavar cada berbigão em água destilada e esfrega-lo livre de sujeira antes de usar a pinça estéril em um fluxo laminar para remover os tecidos da casca.
    4. Homogeneizar a cerca de 10 g de amostras de tecido de berbigão com um homogeneizador em 90 mL de TSB estéril (3% NaCl) por 60 s. adicionar uma quantidade conhecida de V. parahaemolyticus para 9 mL do caldo para as amostras cravados de amostra homogeneizada. Use as amostras bilirrrubina como controlo negativo. Estimar a contagem de células de V. parahaemolyticus cravado para as amostras de berbigão por chapeamento 0,1 mL das amostras na CA, e posteriormente, Pipetar 1 mL de amostras em um tubo de microcentrifugadora de DNA da amostra extração, para ser usado na biosensor e ensaio PCR.
    5. Extrai o DNA genômico do V. parahaemolyticus das amostras cravadas e bilirrrubina seguindo um modificado de fervido lise procedimento36. Finalmente, determinar a concentração de DNA e pureza, usando uma medição do Fotômetro de bio com absorção UV no comprimento de onda de 260 nm (como os ácidos nucleicos absorver comprimento de onda de luz) e também no comprimento de onda de 280 nm (como as comprimento de onda de absorção de proteínas).

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Representative Results

Formação de AuNPs foi revelada através da mudança na cor da solução aquosa com citrato de sódio presente. Isto causou a cor mudar de amarelo claro para um vermelho rubi profundo. A geração de PLA-AuNPs foi confirmada de espectros de UV-vis (Figura 1), onde o crescimento do pico de ressonância (SPR) do plasmon de superfície foi encontrado a cerca de 540 nm. A formação e a existência de PLA-AuNPs foi indicado em intervalos de comprimento de onda 500-600 nm, dependendo do tamanho de partícula37. Padrões de AuNPs e a PLA-AuNPs XRD são mostrados na Figura 2. Todos os picos do cristalite foram observados em 2 a θ de 31,7 38,2, 44,4, 64,7 e 77,7 °. Foram atribuídas para o (100) (111) (200) (220), e (311) planos cristalográficos de ouro cubic-FCC (cúbico cara-centrado) (metal) nanoestruturas (JCPDS arquivo n º-00-004-0783). As intensidades de pico do cristalite PLA-AuNPs também aumentaram como um pico de difração mais amplo centralizado 31,7 °, implicando que os AuNPs foram incorporados em PLA e sugerindo a formação de polifásico nanoestruturas ouro38. Além disso, todos os picos de difração AuNP mostrados o PLA-AuNPs indicaram que o AuNPs tinha uma estrutura estável. O tamanho médio de PLA-AuNPs foi calculado através da equação de Scherrer (L = kλ/βcosθ), determinando-se a largura da reflexão de Bragg a (100). Partir do FWHM e d-espaçamento (tabela 2), o tamanho do cristalite do PLA-AuNPs foi calculado como 27 nm.

As dimensões do PLA-AuNPs e sua morfologia mais foram investigadas usando TEM. Da curva de distribuição de partículas TEM e imagens de PLA-AuNPs, verificou-se que as nanopartículas de ouro eram quase esféricas na forma (Figura 3). O tamanho das nanopartículas foi no intervalo de cerca de 37 nm, ligeiramente maior do que o obtido pela fórmula do Scherrer, sugerindo uma natureza policristalino de nanopartículas como sintetizado39. Tamanho menor resultante XRD em contraste com a temperatura também tem sido observado em pesquisas anteriores, provavelmente porque a estrutura da partícula é policristalino na natureza devido à quantidade significativa de cristalitos que são menores (sub partículas)40 . A Figura 4 mostra a imagem FESEM de PLA-AuNPs-preparado como SPCE. É evidente a partir do FESEM imagens e espectros EDX que a SPCE/PLA-AuNPs teve o maior percentual de peso de ouro, maior densidade e maior superfície de cobertura de nanopartículas. Ele pode também ser notado, particularmente, que Figura 4(a) mostra a imagem FESEM de um nu SPCE. A imagem FESEM na Figura 4(b) mostra bem-distribuída PLA-AuNPs. Para afirmar a composição química do sintetizado PLA-AuNPs ', EDX foi contratado para investigar a composição química do produzidos como PLA-AuNPs, conforme Figura 4(um)e 4(b). O espectro EDX confirmou que o PLA-AuNPs como produzidos eram compostas por ouro (Au) somente e não exibido nenhum outro elemento, exceto o pico correspondente ao carbono (C) e oxigênio (O). A presença do Pico C deveu-se o eletrodo de carbono para que a amostra era elenco de gota.

O espectro EDX também mostrou a presença de O indicando que o oxigênio foi adsorvido no eletrodo de carbono porque o filme foi exposto ao ar. Isto confirma que o oxigênio é adsorvido em nanotubos de carbono se eles são expostos ao ar por um longo tempo,41. Embora existam várias moléculas de gás no ar, oxigênio foi acreditado para ser o principal adsorbate sobre o carbono expostas ao ar nanotubos42, possivelmente devido a sua adsorção mais rápida em comparação com outras moléculas de43. Isto foi baseado em achar que o oxigênio foi o principal adsorbate sobre o eletrodo de carbono durante a exposição de ar durante a noite na preparação da amostra e reforçado a pureza química do PLA-AuNPs. A relação do pico anódica e catódica (eupa/ipc) foi quase 1, que deu o potencial de pico constante como o scan taxa aumentou44. Além disso, os potenciais de pico anódica e catódica foram consistentes na varredura diferentes taxas45 , sugerindo que a reação eletroquímica foi reversível baseada na separação de pico (Figura 5). A área de superfície ativa do eletrodo modificado foi calculada usando a equação Randles-Sevick (eupc = (2,69 × 105) n3/2 AD1/2 Cv1/2. A pista do enredo depc versus v1/2 na Figura 5(a) e (b), a área de superfície dos eléctrodos foi calculada como 0,26 cm2 e 0,41 cm2 para o bare SPCE e PLA-AuNPs, respectivamente. Este resultado confirmou que a melhoria proporcionada pelo PLA-AuNPs na área de superfície ativa foi relativamente mais elevado comparada com SPCE desencapado. O resultado derivado foi comparável de ouro incorporado no polímero nanopartículas (matriz β-CD-EDAS(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylene-diamine encapsulados nanopartículas de ouro), que revelou que uma alta área de superfície ativa intensificado o processo de transferência de elétrons e, portanto, resultou em melhor sensibilidade46.

A reação eletroquímica do SPCE modificada estava em um processo de difusão controlada, mostrado por diminuição K3[Fe(CN)6]3 -/4 - pico de corrente, que por sua vez baseou-se na corrente da raiz quadrada taxa de varredura (v 1/2). Para obter uma melhor visão das propriedades eletrodo modificado, realizou-se um estudo de espectroscopia (EIS) Impedância electroquímica para correlacionar com o desempenho do eletrodo modificado apresentado em termos de medições de CV. A seção de semicírculo vista em altas frequências, correlacionadas com o processo de limitar a transferência de elétrons no sie. A resistência de transferência de carga (Rct) foi medida diretamente como o diâmetro do semicírculo. Este resultado registrou-se com o valor de Rct da SPCE desencapado, que era Ω de 1932 e onde a modificação da SPCE/PLA-AuNPs diminuiu para Ω 1444 (Figura 6). A diminuição do valor dect R SPCE/PLA-AuNPs pode ter resultado de uma diminuição no local constante dieléctrica e/ou um aumento na espessura da elétrica dupla camada47, sugerindo que K3[Fe(CN)6]3 - /4 - função por adsorção na interface metal/solução. Estas saídas cumpridos aqueles derivados de medições de CV (Figura 7). As correntes de pico aumentaram progressivamente com a modificação dos SPCEs usando PLA-AuNPs, que mostrou que uma maior sensibilidade foi o inverso do inferior Rct48. Assim, o aumento do valor de CV de eletrodos modificados e a diminuição nos valores de Rct podem ter sido devido a substituição gradual de moléculas de água (o volume das moléculas de água é 27.19 Å3) pela adsorção do K3 [Fe(CN)6] -3/4 - na superfície metálica, diminuindo a extensão da dissolução reação49.

A tabela 3 indica o desvio-padrão relativo (RSD) da repetibilidade e reprodutibilidade do eletrodo modificado. Gravação de CV rotina de K3[Fe(CN)6]3 -/4 - foi feita por seis jogos consecutivos investigar a repetibilidade dos eletrodos modificados. O RSD da SPCE/PLA-AuNPs foi derivado como 4,26%. O eletrodo com PLA-AuNPs modificação deu melhor RSD após várias medições. Além disso, usando o mesmo procedimento, seis eletrodos modificados foram independentemente fabricados, que deu valores RSD de 4,05% para SPCE/PLA-AuNPs, indicando melhor reprodutibilidade da fabricação de eletrodos para PLA-AuNPs. O substrato modificado dependendo do PLA-AuNPs foi mantido a 37 ° C por uma duração prolongada. Também foi utilizado para o registro de 20 ciclos e uma diminuição de 18% na qualidade do sinal. Para atingir o máximo da saída do biosensor, período de imobilização, temperatura, junto com concentração ssDNA e critérios para a hibridação foram examinados. Estas condições necessárias para ser otimizado, como eles influenciam a corrente de pico de DPV. Para otimizar a concentração ssDNA, SPCE/PLA-AuNPs foi pipetado com concentração diferente (0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 e 1.4 µM) de ssDNA para 60 min para que a concentração óptima de ssDNA foi determinada. Com base na Figura 8, a corrente de pico DPV aumentou como altas concentrações de DNA foram usadas. O estudo também constatou que a concentração otimizada do DNA foi 1,2 µM ssDNA.

Para otimizar o período de imobilização envolvendo o DNA único-encalhado no SPCE/PLA-AuNPs, 25 µ l de ssDNA (1,2 µM) foram testados em momentos diferentes (30, 60, 90, 120, 150, 180 e 210 min). Na Figura 9, os resultados mostram um aumento no período de imobilização, resultando no aumento contínuo do pico do DPV atual. Assim, o tempo de imobilização ideal do ssDNA foi selecionado como 180 min. Para otimizar a temperatura de imobilização, a SPCE/PLA-AuNPs foi pipetado com ssDNA (1,2 µM) em diferentes temperaturas (75, 65, 55, 45, 35 e 25 ° C) por 180 min. Nós achamos que, quando a temperatura de imobilização foi aumentada para 55 ° C, a corrente de pico DPV inicialmente escalado seguido por uma depreciação subsequente (Figura 10); assim, 55 ° C foi selecionado como a temperatura de imobilização otimizado para ser usado em experimentos subsequentes. Separação do ssDNA é imóvel de superfícies de invalidez o eletrodo e a hibridação foi causada por temperaturas aumentada. Há outros relatos semelhantes resultados50. Divisão mais rápido e degeneração do DNA das superfícies de nanopartículas de ouro ocorreram maiores temperaturas51. Pesquisa realizada recentemente relatado que a ligação entre ouro e tiol oxida-se degrada rapidamente e simplesmente em uma situação que é o ambiente, por exemplo quando exposto à água, ar e luz52,53,54. O efeito do tempo de hibridação também foi investigado neste estudo.

A SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA fabricada foi a gota-elenco com uma solução de ADN alvo (0,2 µM) em hibridação de diferente épocas (5, 10, 15, 20, 25 e 30 min). A resposta do DPV levantou-se, obviamente, com um aumento de 5 min no tempo de incubação (de 5 a 10 min) (Figura 11). Uma vez que este valor foi obtido, um padrão de 10 a 30 min para baixo foi observado para que o tempo desejado para a hibridação foi escolhido como 10 min. A eficiência da hibridação aumentou com o aumento da temperatura de 25 ° C a 35 ° C (Figura 12). A alta corrente foi vista a diminuir lentamente a uma temperatura superior a 35 ° C. A razão para isto foi atribuída a desnaturação de estrutura sanduíche reduzindo o sinal de detecção. Daí, a temperatura ideal de hibridização selecionada foi a 35 ° C. O processo que usamos na detecção de que v. parahaemolyticus composto AuNPs para aumentar a área da superfície ativa do trabalho eletrodo, PLA para mediar a modificação da superfície e complexo, o redox MB, que reduziu a LB. O resultado deste processo de oxidação foi uma melhor afinidade entre ssDNA e MB55. O DPV atual foi diminuído devido o menor número de moléculas de MB anexados durante a hibridização do ssDNA com sua sequência complementar.

Realizamos ainda mais investigações sobre o desempenho do biosensor desenvolvido. Os resultados DPV na Figura 13 mostram que era capaz de distinguir seletivamente sonda DNA, DNA complementar, um-base DNA incompatível, três bases incompatível DNA e DNA não-complementar, na presença de MB como o rótulo de deteção56, 57. a corrente de pico mais baixo (0,73 µA) foi exibido por DNA complementar, que aumentou lentamente por um-base DNA incompatível (0.94 µA), três-bases incompatíveis DNA (1.05 µA), DNA não-complementar (3.25 µA) e sonda DNA (4,79 µA). O DNA alvo atual era a menor de todas as correntes de sequências do oligonucleotide, permitindo que nossos biosensor discriminar entre as sequências do oligonucleotide sensìvel e especificamente. MB fortemente vinculados com ssDNA do imobilizado sonda DNA produzindo uma grande corrente de pico DPV. SPCE/PLA-AuNPs/não-DNA complementar diminuído o DNA imobilizado sonda atual quase metade como apenas uma pequena quantidade de MB montado na superfície da SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA. Isto é provável que seja devido às interações entre MB e guanina inacessíveis bases. Os modos de interação de DNA e MB são fortemente dependentes de tais condições experimentais como pH, temperatura, concentração de DNA, força iônica e tipo de tampão58,59. MB link comumente para dsDNA de groove e modos de intercalative, resultando em acúmulo de MB na superfície de dsDNA60. A exposição da nossa captura sonda DNA DNA incompatível um-base e três bases DNA incompatível consistentemente reduzida correntes de pico DPV e o DNA alvo complementares continuou esta tendência. A tabela 4 mostra a porcentagem da taxa de seletividade para MB pico atual. Nossa conclusão geral que era hibridação do biosensor construído de DNA altamente seletiva através do DNA imobilizado sonda na superfície do SPCE/PLA-AuNPs.

A sensibilidade do biosensor DNA desenvolvido mais foi investigada com diferentes concentrações do oligonucleotide alvo complementares. Figura 14 mostra o esgotamento gradual da corrente de pico DPV da MB sobre o SPCE/PLA-AuNPs como a concentração de DNA complementar aumentada. A Figura 15 apresenta um coeficiente de regressão linear de 0,96 que foi gerado entre o log da corrente de pico MB reduzida e o log de várias concentração de ADN (12:02 a 0,02 mM) do alvo. Um gráfico das mudanças de corrente de pico (ΔP) foi plotado usando a fórmula de 3σ/m (σ é o desvio padrão de solução em branco e m, sendo a inclinação da curva linear)61,,62,63. Limite de detecção do biosensor fabricado de DNA foi calculado ser 16:43 que na verdade foi maior do que o nosso menor medido a amostra. Este resultado foi de acordo com o fato de que ΔP para 12:02 e 14:00 (2,65 × 10-6 A e 2,81 × 10-6 A) com um desvio padrão de 1,19 × 10-7 A e 1,06 × 10-7 A, respectivamente, sobreposto.

Para calcular o LOQ para o biosensor DNA fabricado, usamos a fórmula de 10σ/m em que (σ é o desvio-padrão solução em branco e m é o declive da curva linear) e encontrou o resultado de ser um ganho de 14:08. Repetidas de desnaturação do DNA complementar foi realizada para avaliar o biosensor de DNA em termos de sua capacidade de regeneração. Fizemos isso incubando eletrodo de DNA modificado complementares 0,2 µM em água quente a 86 ° C durante 8 min para desnaturar o DNA de cadeia dupla, seguido por rápido resfriamento em um banho de gelo para manter o desnaturado single-stranded DNA64.

A atividade de hibridização foi mantida em 91% de sua resposta inicial após 8 esforços de regeneração (n = 5, RSD = 4,05%). O biosensor DNA baseado no método de SAM para a imobilização de sonda de DNA para SPCE/PLA-AuNPs foi altamente estável, alcançar uma boa resposta na detecção de DNA complementar após processos de desnaturação repetidas. A estabilidade do nosso biosensor DNA quanto calor foi mais explorada. Para fazer isso, guardávamos o eléctrodo de PLA-AuNPs/SPCE/ssDNA em temperaturas de 4 ° C, 25 ° C e 45 ° C em uma bolsa de alumínio selado contendo sílica gel. No final de 6 meses, nós avaliar o DNA complementar e estima-se o percentual de recuperação da produção do sinal. A Figura 16 mostra que a sonda SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA foi altamente estável com mais de 80% de seu sinal inicial ainda recuperável após armazenamento de 6 meses. A forte reação entre PLA-AuNPs e ssDNA foi encontrada para ter estabilidade a longo prazo, a uma temperatura inferior a 45 ° C.

Nove espécies diferentes de bactérias (b. cereus, L. monocytogenes, C. jejuni, Escherichia coli O157: H7, V. alginolyticus, S. typhimurium, enterite S., K. pneumonia e V. parahaemolyticus) foram projectados por detecção de PCR. Os produtos de amplificação de PCR para detecção de espécie-específicos de V. parahaemolyticus da cultura de bactérias são mostrados na Figura 17. O gene toxR de V. parahaemolyticus foi utilizado como primeira demão do PCR para identificação de V. parahaemolyticus devido a sua presença em isolados patogénicos. A partir da análise PCR, V. parahaemolyticus mostrou resultados positivos devido à especificidade da primeira demão do PCR do gene toxR para o V. parahaemolyticus. Nenhum produto PCR de outras estirpes bacterianas foram detectado. O DPV pico de corrente obtido após uma avaliação de reatividade cruzada mostrou claramente a deteção de V. parahaemolyticus em comparação com outras espécies de bactérias, como ilustrado na Figura 18. O sinal DPV aumentado conforme o número de pares de bases diminuiu, devido à maior quantidade de moléculas MB ligado para as sondas. V. parahaemolyticus puderam claramente ser discriminados dos outros patógenos de origem alimentar que imitam o ambiente da amostra do alimento.

Berbigões foram selecionados como amostras reais para a validação de biosensor de DNA neste estudo uma vez que são ingredientes populares em vários tipos de comida local. É sabido que o berbigão cru muitas vezes carrega patogénico V. parahaemolyticus e podem transmitir estas bactérias aos seres humanos, especialmente se eles são inadequadamente refrigerados durante o armazenamento após a colheita de65. O grupo tratado de amostras de berbigão foi armazenado a-20 ° C por 24 h e exposto à luz UV, a 20 ° C, por 4h antes da extração de DNA durante a nossa etapa de pré-tratamento. Figura 19 mostra que a análise PCR encontrados V. parahaemolyticus em ambas as amostras (cravadas) tratadas e não tratadas. Isso é mostrado na estrada 7, 8, 9, 10, 11 e 12, correlacionando com a colônia contar na discussão anterior. Não V. parahaemolyticus aparece nas amostras tratadas e não tratadas (bilirrrubina), como mostrado na pista 1, 2, 3, 4, 5 e 6 nos resultados da PCR, embora a contagem de colônia indicam sua presença nas amostras. Uma possível razão para isso é a presença de contaminantes metabolitos como proteína, o DNA extraído66.

Figura 20 resume os resultados de deteção usando o biosensor desenvolvido de DNA, que com sucesso, determinada a presença de V. parahaemolyticus no grupo tratado que consiste de amostras cravadas e bilirrrubina. Estes resultados correlacionam-se positivamente com os resultados PCR anteriormente discutidos. Cada amostra de PCR que mostraram resultados positivos foi descoberta usando a técnica de PLA-estabilizado biosensor eletroquímico, que é baseado em AuNP, e a área do pico DPV claramente correspondia com as bandas de intensidade resultantes do PCR (Figura 19 e Figura 20). Estes resultados indicam que o sensor eletroquímico baseados em nanopartículas sugerido neste estudo detectou V. parahaemolyticus com sucesso em amostras reais, provando assim que é superior a PCR com nenhum efeito sobre a autenticidade dos resultados.

Figure 1
Figura 1 : Absorvância do PLA-AuNPs Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Espectro de difração de raios x de PLA-AuNPs. Adaptado com permissão da ref. [30]. Direitos autorais (2016) Sociedade Brasileira de Química. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Distribuição de diâmetro TEM frequência e imagens de PLA-AuNPs de medição uma escala de 50 nm. Reproduzido com permissão da ref. [30]. Direitos autorais (2016) Sociedade Brasileira de Química. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : EDX espectros e FESEM imagens do (a) bare SPCE e (b) SPCE/PLA-AuNPs. Reproduzido com permissão da ref. [30]. Direitos autorais (2016) Sociedade Brasileira de Química. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : O enredo da oxidação corrente de pico contra a raiz de quadrada de taxa de varredura e voltammograms cíclico: (a) bare SPCE e (b) SPCE/PLA-AuNPs, em 1,0 mmol L-1 K3[Fe(CN)6] (pH 7). As taxas de verificação foram 300, 250, 200, 150, 100 e 50 mV s−1. Adaptado com permissão da ref. [30]. Direitos autorais (2016) Sociedade Brasileira de Química. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6 : Espectros de impedância dos eletrodos modificados em 1,0 mmol L-1 K 3 [Fe(CN)6] (pH 7). Amplitude: 5 mV e gama de frequências: 0,1-105 Hz. adaptado com permissão da ref. [22]. Copyright Elsevier (2016). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7 : Corrente de pico anódico de modificado eletrodos em 1,0 mmol L-1 K 3 [Fe(CN)6] (pH 7) a uma taxa de varredura de 0.1 s V -1 usando a medição de voltametria cíclica Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8 : Efeito da concentração para a imobilização ssDNA no SPCE/PLA-AuNPs em 0,1 mol L-1 PBS (pH 7), com taxas de varredura de 0.1 V s -1 após incubação 30 min em 20 µM MB usando a medição de voltametria de pulso diferencial Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9 : Efeito do tempo de imobilização do ssDNA no SPCE/PLA-AuNPs em 0,1 mol L -1 PBS (pH 7) a uma taxa de varredura de 0.1 V s -1 após incubação 30 min em 20 µM MB usando a medição de voltametria de pulso diferencial Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 10
Figura 10 : Efeito da temperatura de imobilização ssDNA no SPCE/PLA-AuNPs a uma taxa de varredura de 0.1 s V -1 em 0,1 mol L -1 PBS (pH 7) após um período de incubação de 30 min em 20 µM de MB usando a medição de voltametria de pulso diferencial Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 11
Figura 11 : Efeito do tempo de hibridação no SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA em 0,1 mol L -1 PBS (pH 7) a uma taxa de varredura de 0.1 V s -1 após incubação 30 min em 20 µM MB usando a medição de voltametria de pulso diferencial Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 12
Figura 12 : Efeito da temperatura de hibridação no SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA em 0,1 mol L -1 PBS (pH 7) a uma taxa de varredura de 0.1 V s -1 após incubação 30 min em 20 µM MB usando a medição de voltametria de pulso diferencial. Reproduzido com permissão da ref. [22]. Copyright Elsevier (2016). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 13
Figura 13 : Histograma do pico de redução da MB atual usando diferentes tipos de DNA em 0,1 mol L –1 PBS (pH 7) a uma taxa de varredura de 0.1 V s -1 após incubação 30 min em 20 µM MB. O baixo-relevo ilustra voltammograms de pulso diferencial nas mesmas condições. Reproduzido com permissão da ref. [22]. Copyright Elsevier (2016). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 14
Figura 14 : Histograma do pico de redução da MB atual usando a concentração de DNA diferente em 0,1 mol L –1 PBS (pH 7) a uma taxa de varredura de 0.1 V s -1 após incubação 30 min em 20 µM MB usando a medição de voltametria de pulso diferencial. Reproduzido com permissão da ref. [22]. Copyright Elsevier (2016). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 15
Figura 15 : Um enredo linear da redução de pico atual da MB contra o log da concentração de DNA diferente em 0,1 mol L -1 PBS (pH 7) a uma taxa de varredura de 0.1 V s -1 após incubação 30 min em 20 µM MB usando a medição de voltametria de pulso diferencial. Reproduzido com permissão da ref. [22]. Copyright Elsevier (2016). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 16
Figura 16 : Efeito de temperaturas diferentes de hibridação no SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA em 6 meses de intervalo de armazenamento (n = 3). As medições foram feitas em 0,1 mol L-1 PBS (pH 7) a uma taxa de varredura de 0.1 V s-1 após incubação 30 min em 20 µM MB usando a medição de voltametria de pulso diferencial. Reproduzido com permissão da ref. [22]. Copyright Elsevier (2016). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 17
Figura 17 : Gel de Agarose amplificação por electroforese-PCR usando produtos de sequenciamento de genes 16S rRNA de bactérias selecionadas de cultura de bactérias. M: Lane 1KB escada de DNA, Lane C−: controle (água destilada esterilizada), Lane c + negativo: controle positivo (DNA extraído Escherichia coli é usado como modelo), Lane CE: Escherichia coli O157: H7, Lane CJ: c. jejuni , Lane BC: B. cereus, Lane KP: pneumonia K., Lane ST: S. typhimurium, Lane LM: L. monocytogenes, Lane SE: enterite S., VP de Lane: V. parahaemolyticus e Lane VV: V. alginolyticus clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 18
Figura 18 : Histograma do pico de redução da MB atual para estudo de reactividade cruzada do biosensor de DNA contra vários patógenos de origem alimentar em 0,1 mol L -1 PBS (pH 7) a uma taxa de varredura de 0.1 V s -1 após incubação 30 min em 20 µM MB usando a medição de voltametria de pulso diferencial. Reproduzido com permissão da ref. [23]. Direitos autorais (2017) Springer. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 19
Figura 19 : Produtos de amplificação de eletroforese-PCR de gel de Agarose de V. parahaemolyticus de amostras de berbigão fresco. M: Lane 2ul de escada de DNA 100 bp, pista 1-3: não tratada bilirrrubina amostras, Lane 4-6: tratados bilirrrubina amostras, Lane 7-9: não tratada amostras cravadas, Lane, 10-12: tratados amostras cravadas, Lane c +: controle positivo (V. parahaemolyticus ATCC 17802), Lane C-: controle (água destilada esterilizada) negativo. Reproduzido com permissão da ref. [23]. Direitos autorais (2017) Springer. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 20
Figura 20 : Histograma do pico de redução da MB atual para a deteção de V. parahaemolyticus em amostras de berbigão fresco usando o biosensor de DNA em 0,1 mol L-1 de PBS (pH 7) a uma taxa de varredura de 0.1 V s-1 após incubação 30 min em 20 µM MB usando a medição de voltametria de pulso diferencial. Reproduzido com permissão da ref. [23]. Direitos autorais (2017) Springer. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Composição do eletrodo Tempo de incubação (h) Temperatura (° C) Mídia de crescimento
Campylobacter jejuni 48 42 BA / BB
Listeria monocytogenes 48 30 TSA / TSB
Salmonella typhimurium 24 37 TSA / TSB
Salmonella enteritidis 24 37 TSA / TSB
Pneumonia de Klebsiella 24 37 EMBA / TSB
Escherichia coli O157: H7 24 37 MA / TSB
Bacilo círio 24 37 MYPA / TSB
Vibrio alginolyticus 24 37 TSA + 3% NaCl/TSB+3% NaCl
Vibrio parahaemolyticus 24 37 CA/TSA+3% NaCl/TSB+3% NaCl

Tabela 1: Cultura condições de bactérias selecionadas.

Amostra Pos. [° 2.] FWHM [° 2.] d-espaçamento [Å] Tamanho do cristalite (nm)
PLA-AuNPs 31.682 0.3149 2.8243 27

Tabela 2: O tamanho dos cristalitos PLA-AuNP. Adaptado com permissão da ref. [30]. Direitos autorais (2016) Sociedade Brasileira de Química.

Eletrodos modificados % RSD (n = 6) Redução do sinal (%) (n = 20)
Repetibilidade Reprodutibilidade
SPCE/PLA-AuNPs 4.26 4.05 18

Tabela 3: Propriedades de eletrodos modificados sobre alteração AuNPs e PLA-AuNPs em K 3 [Fe(CN)6] com 1,0 mmol L -1 concentração em uma taxa de varredura de 0.1 V s -1 . Adaptado com permissão da ref. [30]. Direitos autorais (2016) Sociedade Brasileira de Química.

Composição do eletrodo Eupa (µA) Epa Taxa de seletividade (%)
(n = 3) (V)
SPCE/PLA-AuNP/sonda DNA 4,79 ± 0,10 -0.46 -
SPCE/PLA-AuNP/não-DNA complementar 3,25 ± 0,12 -0.44 67.85
SPCE/PLA-AuNP/3-bases de DNA incompatível 1.05 ± 0,11 -0.45 21.92
SPCE/PLA-AuNP/1-base de DNA incompatível 0,94 ± 0,12 -0.46 19.62
DNA SPCE/PLA-AuNP/complementar 0,73 ± 0,10 -0.45 15,24

Tabela 4: seletividade DPV de MB pico de corrente em 0,1 mol L -1 PBS (pH 7) a uma taxa de varredura de 0.1 V s -1 após a incubação 30 min em 20 µM MB

Composição dos eletrodos Método de deteção Escala linear (M) Limite de deteção (M) Referências
AuNPs 3D DPV 1,5 × 10-6 - 7.0 × 10-9 2,0 × 10-10 69
(+) AuNPs DPV 1,0 × 10-9 - 1,5 × 10-12 2.6 × 10-12 70
AuNPs/GR DPV 1.3 × 10-9 - 2,5 × 10-11 8,3 × 10-12 71
AuNPs-ADH-GSs DPV 5,0 × 10-8 - 3.0 × 10-13  3.0 × 10-13 72
AuNPs-MPTS DPV 5,0 × 10-9 - 1,0 × 10-11  5,0 × 10-11 73
AuNPs – GO DPV 1,0 × 10-9 - 1,0 × 10-14 3,5 × 10-15 74
Porque / AuNPs DPV 1,0 × 10-9 - 1,0 × 10-12 7.0 × 10-13 75
PLA-AuNPs DPV 2,0 × 10-8 - 2,0 × 10-13 5.3 × 10-12 Este trabalho

Tabela 5: Comparação de alguns a nanosensors de DNA eletroquímica recentemente desenvolvido. Reproduzido com permissão da ref. [22]. Copyright Elsevier (2016).

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Discussion

Os passos críticos em um quadro para o desenvolvimento bem sucedido deste tipo de biosensor eletroquímico são a seleção de elementos de reconhecimento biológico adequado para o transdutor (ácido nucleico ou DNA aqui); abordagem de química para a construção de camada de sensoriamento do transdutor; material de transdução; otimização de imobilização de DNA e hibridação; e validação do biosensor desenvolvido usando amostras reais.

Núcleo para o desenvolvimento bem sucedido de um biosensor eletroquímico sensível e seletivo do DNA, é a otimização da condição imobilização e hibridação. Neste trabalho, usamos MB como o complexo de redox. Existem vários princípios de interações MB-DNA: (i) pela interação eletrostática da carga catiônica MB com a carga aniônica espinha dorsal de fosfato do ssDNA e dsDNA; (ii) pela intercalação MB através de inserção bem sucedida de MB entre alternando pares de bases G-C em dsDNA; (iii) por ligação covalente à extremidade do ssDNA alvo, que produz uma densidade baixa rótulo (um ou dois MB moléculas por uma cadeia de DNA); e (iv) por interações MB com uma base em ssDNA desvinculado da guanina. Nós aplicamos o quarto princípio, que identifica com precisão V. parahaemolyticus da Cruz reatividade de bactérias e de berbigão fresco. Após oxidação de particular interesse, houve uma forte afinidade entre MB e ssDNA. Hibridação do ssDNA com sua sequência complementar substitui as moléculas MB ligadas e assim reduz o sinal.

A série de resultados experimentais apresentados acima enfoca o desenvolvimento de um método rápido de detectar V. parahaemolyticus com alta seletividade e sensibilidade usando os princípios de hibridização de DNA. O primeiro passo é a síntese e caracterização de polilático estabilizada ácido ouro nanopartículas (PLA-AuNPs) para a modificação do eletrodo (figuras 1-6 e tabela 2). A qualidade das nanopartículas de ouro foi avaliada usando espectroscopia ultravioleta-visível (UV-Vis), difração de raios x (XRD), microscopia eletrônica de varredura de emissão de campo (FESEM), microscopia eletrônica de transmissão (TEM), voltametria cíclica (CV) e Análise de impedância. A segunda parte do desenvolvimento envolveu uma caracterização eletroquímica do eletrodo modificado (figuras 7-12 e tabela 3-4) que determinou o reforço bem sucedido do eletrodo modificado em relação o eletrodo nu em termos de detectar o evento de hibridização.

A terceira etapa do DNA baseado biosensor desenvolvimento baseou-se na otimização das condições experimentais do evento hibridação e a aplicação do biosensor desenvolvido para a detecção do patógeno real (figuras 13-20). O evento de hibridização que determinou o sucesso da detecção do patógeno foi avaliado utilizando voltametria de pulso diferencial (DPV). A existência positiva do patógeno alvo foi indicada através da redução da corrente. A sensibilidade do biosensor desenvolvido foi avaliada através da construção de um plano de calibração e o cálculo de LOD (Figura 15). O biosensor fabricado foi capaz de distinguir especificamente V. parahaemolyticus de outros patógenos com base em diferentes níveis de redução atual (figuras 17 e 18). A avaliação da viabilidade do biosensor desenvolvido para detecção de V. parahaemolyticus em amostra de alimentos real é apresentada nas figuras 19 e 20 , e a existência positiva do patógeno alvo é indicada pela redução da corrente . O desenvolvimento bem sucedido de biossensores baseados em DNA é altamente dependente da seleção de sondas de DNA, realce do eletrodo modificado, bem como a otimização das condições experimentais. A sonda de DNA aqui foi adaptada da obra anterior de Nakano67. Aprimoramento dos eletrodos modificados foi realizado com nanopartículas de ouro estabilizadas com ácido polilático para permitir a padronização do nanosize. A função de nanopartículas de ouro como electro material catalítico68 e agir para aumentar a taxa de transferência do elétron e também fornecer uma superfície na qual a sonda de DNA de âncora. Os parâmetros experimentais foram otimizados em termos de tempo de incubação e temperatura que é crucial para o DNA para formar a frente e verso. A temperatura de hibridização afeta a separação entre a adsorção não específica e este aumenta a seletividade do sensor. Tempo de incubação da hibridação aumenta as chances da formação frente e verso. O procedimento de imobilização deve ser otimizado a fim de certificar que a sonda de DNA serão na orientação adequada para a formação de frente e verso para o formulário.

Tabela 5 compara uma amostra de recentemente desenvolvido eletroquímica DNA biosensores69,70,,71,72,73,74,75 ,. Biosensing baseado em DNA é um método promissor para substituir técnicas moleculares com base, embora existam algumas limitações que devem ser abordadas antes que o método pode ser portátil o suficiente para o uso no local. A principal limitação é a extração de DNA de processamento de amostra como a pureza e a quantidade de DNA extraído no site não é provável que seja tão bom como que extraído pelo método padrão em laboratório. Se, no entanto, uma alternativa promissora a electroforese do gel e PCR pode ser substituído com sistema de pré-tratamento da amostra como microfluidic.

Biossensores baseados no DNA são potencialmente útil para muitas aplicações, incluindo o diagnóstico médico, monitoramento ambiental e acompanhamento de comida. Esta técnica permitirá monitoramento on-line de processos de controle de qualidade, bem como point-of-care monitoração de pacientes. A portabilidade do sistema sensor todo permitirá a descentralização dos processos de diagnósticos onde o consumidor pode usar o sistema de detecção no conforto de sua casa.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores gostaria de agradecer o apoio da Universiti Putra Malaysia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Merck 100056
Chloroform Merck 102445
Diaminoethane tetraacetic acid Promega E5134
Dibasic sodium phosphate  Sigma-Aldrich S9763
Disodium hydrogen phosphate Sigma-Aldrich 255793
Ethanol  Sigma-Aldrich 16368
Gold (III) chloride trihydrate Sigma-Aldrich 520918
Hydrochloric acid Merck 100317
Methylene blue Sigma-Aldrich M44907
Monobasic sodium phosphate, monohydrate Sigma-Aldrich S3522
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P5119
Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D NatureWorks 4042D
Potassium chloride R&M Chemicals 59435
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich P9791
Potassium hexacyanoferrate III R&M Chemicals 208019
Sodium acetate anhydrous salt Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
Trisodium citrate Sigma-Aldrich S1804
Tris(hydroxymethyl) aminomethane Fisher Scientific T395-100
Tris-Base Fisher Scientific BP152-500
2X PCR Master Mix with Dual-Dye Norgen Biotek 28240
Agarose gel Merck 101236
Bolton Agar Merck 100079
Bolton Broth Merck 100079
CHROMagar Vibrio CHROMagar VB910
dNTPs Promega U1511
Nuclease-free water Thermo Scientific R0581
Eosin methylene blue agar  Merck 101347
GelRed Biotium 41001
Glycerol Merck 104092
Go Taq Buffer Promega M7911
Loading dye 100 bp DNA ladder Promega G2101
Loading dye 1kb DNA ladder Promega G5711
Magnesium chloride Promega 91176
Mannitol egg yolk polymyxin agar Merck 105267
McConkey Agar Merck 105465
Nutrient Broth Merck 105443
Taq polymerase Merck 71003
Trypticase Soy Broth Merck 105459
Trypticase Soy Agar Merck 105458

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References

  1. Gould, L. H., Rosenblum, I., Nicholas, D., Phan, Q., Jones, T. F. Contributing factors in restaurant-associated foodborne disease outbreaks, FoodNet sites, 2006 and 2007. Journal of Food Protection. 76, 1824-1828 (2013).
  2. Arvanitoyannis, I. S., Kotsanopoulos, K. V., Papadopoulou, A. Rapid detection of chemical hazards (toxins, dioxins, and PCBs) in seafood. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 54, 1473-1528 (2014).
  3. Robertson, L. J., Sprong, H., Ortega, Y. R., van der Giessen, J. W. B., Fayer, R. Impacts of globalisation on foodborne parasites. Trends in Parasitology. 30, 37-52 (2014).
  4. Sandilands, E. A., Bateman, D. N. The epidemiology of poisoning. Medicine. 44, 76-79 (2016).
  5. Boschi-Pinto, C., Velebit, L., Shibuya, K. Estimating child mortality due to diarrhoea in developing countries. Bulletin of the World Health Organization. 86, 710-717 (2008).
  6. Farthing, M. J. G. Diarrhoea: A Significant Worldwide Problem. International Journal of Antimicrobial Agents. 14, 65-69 (2000).
  7. World Health Organization. WHO estimates of the global burden of foodborne diseases: foodborne disease burden epidemiology reference group 2007-2015. , 1-255 (2015).
  8. Yeung, M., Boor, K. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathogens and Disease. 1, 74-88 (2004).
  9. Sakazaki, R. Foodborne Diseases. Cliver, D. O., Riemann, H. P. , Academic Press. 127-136 (2002).
  10. Grochowsky, J., Odom, S. R., Akuthota, P., Stead, W. Primary Septicemia and Abdominal Compartment Syndrome From Vibrio parahaemolyticus Infection in a 40-Year-Old Patient With No Known Immunocompromise. Infectious Disease in Clinical Practice. 22, (2013).
  11. Raghunath, P. Roles of thermostable direct hemolysin (TDH) and TDH-related hemolysin (TRH) in Vibrio parahaemolyticus. Frontiers in Microbiology. 5, 805 (2014).
  12. Kalburge, S. S., Whitaker, W. B., Boyd, E. F. High-Salt Preadaptation of Vibrio parahaemolyticus Enhances Survival in Response to Lethal Environmental Stresses. Journal of Food Protection. 77, 246-253 (2014).
  13. Esteves, K., Hervio-Heath, D., Mosser, T., Rodier, C., Tournoud, M. G., Jumas-Bilak, E., Colwell, R. R., Monfort, P. Rapid proliferation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, and Vibrio cholerae during freshwater flash floods in French Mediterranean Coastal lagoons. Applied and Environmental Microbiology. 81, 7600-7609 (2015).
  14. Khandeparker, L., Anil, A. C., Naik, S. D., Gaonkar, C. C. Daily variations in pathogenic bacterial populations in a monsoon influenced tropical environment. Marine Pollution Bulletin. 96, 337-343 (2015).
  15. Caburlotto, G., Suffredini, E., Toson, M., Fasolato, L., Antonetti, P., Zambon, M., Manfrin, A. Occurrence and molecular characterization of Vibrio parahaemolyticus in crustaceans commercialised in Venice area, Italy. International Journal of Food Microbiology. 220, 39-49 (2016).
  16. Wong, H. C., Chen, M. C., Liu, S. H., Liu, D. P. Incidence of highly genetically diversified Vibrio parahaemolyticus in seafood imported from Asian countries. International Journal of Food Microbiology. 52, 181-188 (1999).
  17. Rosec, J. P., Causse, V., Cruz, B., Rauzier, J., Carnat, L. The international standard ISO/TS 21872-1 to study the occurence of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae in seafood: ITS improvement by use of a chromogenic medium and PCR. International Journal of Food Microbiology. 157, 189-194 (2012).
  18. Maniyankode, R. A., Kingston, J. J., Murali, H. S., Batra, H. V. Specific identification of vibrio parahaemolyticus employing monoclonal antibody based immunoassay. International Journal of Pharmacy and Biological Sciences. 4 (2), B156-B164 (2013).
  19. Suffredini, E., Lopez-Joven, C., Maddalena, L., Croci, L., Roque, A. Pulsed-field gel electrophoresis and PCR characterization of environmental Vibrio parahaemolyticus strains of different origins. Applied and Environmental Microbiology. 77, 6301-6304 (2011).
  20. Bhattacharyya, N., Hou, A. A pentaplex PCR assay for detection and characterization of Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolyticus isolates. Letters in Applied Microbiology. 57, 233-240 (2013).
  21. da Silva, E. T. S. G., et al. Electrochemical Biosensors in Point-of-Care Devices: Recent Advances and Future Trends. ChemElectroChem. 4 (4), 778-794 (2017).
  22. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. Sensitive detection of multiple pathogens using a single DNA probe. Biosensors and Bioelectronics. 86, 398-405 (2016).
  23. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. A simple, portable, electrochemical biosensor to screen shellfish for Vibrio parahaemolyticus. AMB Express. 7 (1), 41 (2017).
  24. Zhang, J., Li, Z., Zhang, H., Wang, J., Liu, Y., Chen, G. Rapid detection of several foodborne pathogens by F0F1-ATPase molecular motor biosensor. Journal of Microbiological Methods. 93, 37-41 (2013).
  25. Barsan, M. M., Ghica, E. M., Brett, C. M. A. Portable biosensing of food toxicants and environmental pollutants. Nikolelis, D. P., Varzakas , T., Erdem, A., Nikoleli, G. P. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Boca Raton. 33-69 (2014).
  26. Kwun, J., Yun, S., Park, L., Lee, J. H. Development of 1,1'-oxalyldiimidazole chemiluminescent biosensor using the combination of graphene oxide and hairpin aptamer and its application. Talanta. 119, 262-267 (2014).
  27. Thavanathan, J., Huang, N. M., Thong, K. L. Colorimetric biosensing of targeted gene sequence using dual nanoparticle platforms. International Journal of Nanomedicine. 10, 2711-2722 (2015).
  28. Hushiarian, R., Yusof, N. A., Abdullah, A. H., Ahmad, S. A. A., Dutse, S. W. Facilitating the indirect detection of genomic DNA in an electrochemical DNA biosensor using magnetic nanoparticles and DNA ligase. Analytical Chemistry Research. 6, 17-25 (2015).
  29. Dutse, S. W., Yusof, N. A., Ahmad, H., Hussein, M. Z., Zainal, Z., Hushiarian, R., Hajian, R. An Electrochemical Biosensor for the Determination of Ganoderma boninense Pathogen Based on a Novel Modified Gold Nanocomposite Film Electrode. Analytical Letters. 47 (5), 819-832 (2014).
  30. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hajian, R. Characterization of Polylactide-Stabilized Gold Nanoparticles and Its Application in the Fabrication of Electrochemical DNA Biosensors. Journal of the Brazilian Chemical Society. 27 (9), 1679-1686 (2016).
  31. Vongkamjan, K., Wang, S., Moreno Switt, A. I. Rapid detection of foodborne bacterial pathogens in seafood. Handbook of Seafood: Quality and Safety Maintenance and Applications. , 247-257 (2016).
  32. Wang, F., Jiang, L., Yang, Q., Han, F., Chen, S., Pu, S., Vance, A., Ge, B. Prevalence and antimicrobial susceptibility of major foodborne pathogens in imported seafood. Journal of Food Protection. 74 (9), 1451-1461 (2011).
  33. Szermer-Olearnik, B., Sochocka, M., Zwolinska, K., Ciekot, J., Czarny, A., Szydzik, J., Kowalski, K., Boratynski, J. Comparison of microbiological and physicochemical methods for enumeration of microorganisms. Postepy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej. 68, 1392-1396 (2014).
  34. Ivanov, I. G., Bachvarov, D. R. Determination of plasmid copy number by the "boiling" method. Analytical Biochemistry. 165 (1), 137-141 (1987).
  35. Gopireddy, V. R. Biochemical tests for the identification of bacteria. International Journal of Pharmacy and Technology. 3 (4), 1536-1555 (2011).
  36. Böhme, K., Fernández-No, I. C., Pazos, M., Gallardo, J. M., Barros-Velázquez, J., Cañas, B., Calo-Mata, P. Identification and classification of seafood-borne pathogenic and spoilage bacteria: 16S rRNA sequencing versus MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 34 (6), 877-887 (2013).
  37. Seoudi, R., Fouda, A. A., Elmenshawy, D. A. Synthesis, characterization and vibrational spectroscopic studies of different particle size of gold nanoparticle capped with polyvinylpyrrolidone. Physica B: Condensed Matter. 405, 906-911 (2010).
  38. Mishra, A., Harper, S., Yun, S. I. Interaction of biosynthesized gold nanoparticles with genomic DNA isolated from E. coli and S. aureus. Nanotechnology (IEEE-NANO). , 1745-1750 (2011).
  39. Sugimoto, T. Formation of modoispersed nano- and micro-particles controlled in size, shape, and internal structure. Chemical Engineering and Technology. 26, 313-321 (2003).
  40. Rath, C., Sahu, K. K., Kulkarni, S. D., Anand, S., Date, S. K., Das, R. P., Mishra, N. C. Microstructure-dependent coercivity in monodispersed hematite particles. Applied Physics Letters. 75, 4171-4173 (1999).
  41. Abbas, M., Wu, Z. Y., Zhong, J., Ibrahim, K., Fiori, A., Orlanducci, S., Sessa, V., Terranova, M. L., Davoli, I. X-ray absorption and photoelectron spectroscopy studies on graphite and single-walled carbon nanotubes: Oxygen effect. Applied Physics Letters. 87 (5), 051923 (2005).
  42. Lim, S. C., Choi, Y. C., Jeong, H. J., Shin, Y. M., An, K. H., Bae, D. J., Lee, Y. H., Lee, N. S., Kim, J. M. Effect of gas exposure on field emission properties of carbon nanotubes arrays. Advanced Materials. 13, 1563-1567 (2001).
  43. Kim, B. H., Kim, B. R., Seo, Y. G. A study on adsorption equilibrium for oxygen and nitrogen into carbon nanotubes. Adsorption. 11, 207-212 (2005).
  44. Bard, A. J., Faulkner, L. R. Electrochemical methods: Fundamentals and applications. , John Wiley & Sons Inc. (2000).
  45. Tan, Q., Wang, L., Ma, L., Yu, H., Ding, J., Liu, Q., Xiao, A., Ren, G. Study on anion electrochemical recognition based on a novel ferrocenyl compound with multiple binding sites. Journal of Physical Chemistry B. 112, 11171-11176 (2008).
  46. Manivannan, S., Ramaraj, R. Polymer-embedded gold and gold/silver nanoparticle-modified electrodes and their applications in catalysis and sensors. Pure and Applied Chemistry. 83, 2041-2053 (2011).
  47. Benali, O., Larabi, L., Traisnel, M., Gengembre, L., Hareka, Y. Electrochemical, theoretical and XPS studies of 2-mercapto-1-methylimidazole adsorption on carbon steel in 1 M HClO4. Applied Surface Science. 253, 6130-6139 (2007).
  48. Shi, Y., Wen, L., Li, F., Cheng, H. M. Nanosized Li4Ti5O12/graphene hybrid materials with low polarization for high rate lithium ion batteries. Journal of Power Sources. 196, 8610-8617 (2011).
  49. Bentiss, F., Traisnel, M., Lagrenee, M. The substituted 1,3,4-oxadiazoles: a new class of corrosion inhibitors of mild steel in acidic media. Corrosion Science. 42, 127-146 (2000).
  50. Wang, M., Gong, W., Meng, Q., Zhang, Y. Electrochemical DNA impedance biosensor for the detection of DNA hybridization with polymeric film, single walled carbon nanotubes modified glassy carbon electrode. Russian Journal of Electrochemistry. 47, 1368-1373 (2011).
  51. Herdt, A. R., Drawz, S. M., Kang, Y., Taton, T. A. DNA dissociation and degradation at gold nanoparticle surfaces. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 51 (2), 130-139 (2006).
  52. Bhatt, N., Huang, P. J. J., Dave, N., Liu, J. Dissociation and degradation of thiol-modified DNA on gold nanoparticles in aqueous and organic solvents. Langmuir. 27, 6132-6137 (2011).
  53. Liu, X., Jang, C. H., Zheng, F., Jürgensen, A., Denlinger, J. D., Dickson, K. A., Raines, R. T., Abbott, N. L., Himpsel, F. J. Characterization of protein immobilisation at silver surfaces by near edge X-ray absorption fine structure spectroscopy. Langmuir. 22, 7719-7725 (2006).
  54. Willey, T. M., Andrew, L., Vance, T., Buuren, V., Bostedt, C., Terminello, L. J., Fadley, C. S. Rapid degradation of alkanethiol-based self-assembled monolayers on gold in ambient laboratory conditions. Surface Science. 576 (1), 188-196 (2005).
  55. Farjami, E., Clima, L., Gothelf, K., Ferapontova, E. E. DNA interactions with a Methylene Blue redox indicator depend on the DNA length and are sequence specific. Analyst. 135, 1443-1448 (2010).
  56. Lin, X., Ni, Y., Kokot, S. An electrochemical DNA-sensor developed with the use of methylene blue as a redox indicator for the detection of DNA damage induced by endocrine-disrupting compounds. Analytica Chimica Acta. 867, 29-37 (2015).
  57. Zhang, F. T., Nie, J., Zhang, D. W., Chen, J. T., Zhou, Y. L., Zhang, X. X. Methylene Blue as a G-Quadruplex Binding Probe for Label-Free Homogeneous Electrochemical Biosensing. Analytical Chemistry. 86, 9489-9495 (2014).
  58. Ning, L., Li, X., Yang, D., Miao, P., Ye, Z., Li, G. Measurement of Intracellular pH Changes Based on DNA-Templated Capsid Protein Nanotubes. Analytical Chemistry. 86, 8042-8047 (2014).
  59. Sani, N. D. M., Heng, L. Y., Surif, S., Lazim, A. M., et al. AIP Conference Proceedings. Murad, A., et al. 1571, 636-640 (2013).
  60. Xu, P., Wang, J., Xu, Y., Chu, H., Shen, H., Zhang, D., Zhao, M., Liu, J., Li, G. Binding modes and interaction mechanism between different base pairs and methylene blue trihydrate: a quantum mechanics study. Advances in Experimental Medicine and Biology. 827, 187-203 (2015).
  61. Guo, Y., Chen, J., Chen, G. A label-free electrochemical biosensor for detection of HIV related gene based on interaction between DNA and protein. Sensors & Actuators, B: Chemical. 184, 113-117 (2013).
  62. Huang, K. J., Liu, Y. J., Wang, H. B., Wang, Y. Y., Liu, Y. M. Sub-femtomolar DNA detection based on layered molybdenum disulfide/multi-walled carbon nanotube composites, au nanoparticle and enzyme multiple signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 55, 195-202 (2014).
  63. Kong, R. M., Song, Z. L., Meng, H. M., Zhang, X. B., Shen, G. L., Yu, R. Q. A label-free electrochemical biosensor for highly sensitive and selective detection of DNA via a dual-amplified strategy. Biosensors and Bioelectronics. 54, 442-447 (2014).
  64. Rashid, J. I. A., Yusof, N. A., Abdullah, J., Hashim, U., Hajian, R. Novel Disposable Biosensor Based on SiNWs/AuNPs Modified-Screen Printed Electrode for Dengue Virus DNA Oligomer Detection. IEEE Sensors Journal. 15, 4420-4421 (2015).
  65. Yingkajorn, M., Sermwitayawong, N., Palittapongarnpimp, P., Nishibuchi, M., Robins, W. P., Mekalanos, J. J., Vuddhakul, V. Vibrio parahaemolyticus and its specific bacteriophages as an indicator in cockles (Anadara granosa) for the risk of V. parahaemolyticus infection in Southern Thailand. Microbial Ecology. 67, 849-856 (2014).
  66. Ahmad Ganaie, H., Ali, M. N. Short term protocol for the isolation and purification of DNA for molecular analysis. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research. 24, 266-270 (2014).
  67. Nakano, K., Kimura, T., Kitamura, Y., Ihara, T., Ishimatsu, R., Imato, T. Potentiometric DNA sensing platform using redox-active DNA probe pair for sandwich-type dual hybridization at indicator electrode surface. Journal of Electroanalytical Chemistry. 720-721, 71-75 (2014).
  68. Yang, J., Jim Yang, L., Heng-Phon, T., Gan-Moog, C. Inhibition of DNA hybridization by small metal nanoparticles. Biophysical Chemistry. 120, 87-95 (2006).
  69. Niu, L. M., Liu, F., Wang, W., Lian, K. Q., Ma, L., Shi, H. M., Kang, W. J. Electrochemical Behavior of Paraquat on a Highly Ordered Biosensor Based on an Unmodified DNA-3D Gold Nanoparticle Composite and Its Application. Electrochimica Acta. 153, 190-199 (2015).
  70. Li, Z., Miao, X., Xing, K., Zhu, A., Ling, L. Enhanced electrochemical recognition of double-stranded DNA by using hybridization chain reaction and positively charged gold nanoparticles. Biosensors and Bioelectronics. 74, 687-690 (2015).
  71. Niu, S., Sun, J., Nan, C., Lin, J. Sensitive DNA biosensor improved by 1,10-phenanthroline cobalt complex as indicator based on the electrode modified by gold nanoparticles and graphene. Sensors and Actuators B: Chemical. 176, 58-63 (2013).
  72. Yi, H., Xu, W., Yuan, Y., Bai, L., Wu, Y., Chai, Y., Yuan, R. A pseudo triple-enzyme cascade amplified aptasensor for thrombin detection based on hemin/G-quadruplex as signal label. Biosensors and Bioelectronics. 54, 415-420 (2014).
  73. Das, R., Sharma, M. K., Rao, V. K., Bhattacharya, B. K., Garg, I., Venkatesh, V., Upadhyay, S. An electrochemical genosensor for Salmonella typhi on gold nanoparticles-mercaptosilane modified screen printed electrode. Journal of Biotechnology. 188, 9-16 (2014).
  74. Han, X., Fang, X., Shi, A., Wang, J., Zhang, Y. An electrochemical DNA biosensor based on gold nanorods decorated graphene oxide sheets for sensing platform. Analytical Biochemistry. 443 (2), 117-123 (2013).
  75. Huang, K. J., Liu, Y. J., Zhang, J. Z., Cao, J. T., Liu, Y. M. Aptamer/Au nanoparticles/cobalt sulfide nanosheets biosensor for 17β-estradiol detection using a guanine-rich complementary DNA sequence for signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 67, 184-191 (2015).

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