Summary
在手稿中, 我们描述了使用模型荧光记者分析, 以确定涉及的细胞成分的贩运和杀伤过程中的毒素 a 亚基的植物毒蓖麻。
Abstract
细菌和植物 A/B 毒素利用真核细胞的自然贩运途径达到其在胞的细胞内目标, 并最终杀死。这种/B 类毒素一般由酶活性 Asubunit (如、蓖麻毒素 A ()) 和一个或多个细胞结合 Bsubunit (s) 组成, 后者负责对特定细胞表面受体的毒素结合。我们目前对甲乙毒素如何能有效地令人陶醉的细胞的知识帮助科学家了解基本的细胞机制, 如吞和细胞内蛋白在更高的真核细胞中排序。从医学的角度来看, 同样重要的是要找出主要的毒素贩运路线, 为病人找到适当的治疗方案, 或最终发展治疗毒素的癌症治疗应用。
由于对哺乳动物细胞的 a/b 毒素贩运的全基因组分析是复杂、耗时和昂贵的, 因此在酵母模型生物体酿酒酵母中进行了关于 a/b 毒素转运的几项研究。尽管不那么复杂, 酵母和高真核细胞中的基本细胞过程是相似的, 而且在酵母中获得的结果往往可以转移到哺乳动物的情况。
在这里, 我们描述一个快速和易于使用的记者化验分析的细胞内贩运的酵母。这种新的检测方法的一个重要优点是, 不仅有机会从内质网 (er) 中研究胞, 而且从细胞膜到 ER 的吞和逆行毒素的转运。该分析利用了一个记者质粒, 允许间接测量在体内的绿色荧光蛋白 (GFP) 的荧光发射后,在活体翻译。由于贸易协定有效地防止了蛋白质生物合成的 28S rRNA depurination, 这一分析可以通过检测荧光发射的变化来识别细胞内的细胞间贸易中所涉及的宿主细胞膜蛋白。
Introduction
由毒素产生菌感染的病人是每个社会保健系统的严重的医疗和经济负担, 特别是因为有效的治疗治疗仍然很大程度上缺失。为了发展新的治疗策略, 在医学上相关的 a/b 毒素, 如霍乱毒素, 志贺毒素, 或蓖麻毒的复杂中毒机制, 需要在分子水平上充分了解, 基于新的强有力的化验, 必须实施。
近年来, 一些研究试图通过使用耗时和成本密集型的方法, 如放射性毒素标记1,2以及 siRNA-based 筛选来分析酵母和哺乳动物细胞中的 a/b 毒素转运接近3。在某些情况下, 毒素贩运已被可视化的在体内荧光显微镜后, 与荧光, 量子点, 或荧光蛋白的单个毒素亚基的化学和/或遗传耦合4,5。不幸的是, 这种修改往往导致不活泼和/或改变的自然性质的毒素。另一种可以间接回答各种科学问题的优雅方法是使用基于酶的记者系统, 如lacZ、荧光或荧光蛋白 (如GFP 或Discosoma sp. 红色荧光蛋白 (dsRed))。
在这篇手稿中, 一个简单的协议被描述为 extracellularly 在S. 酿酒酵母中的细胞内传输所需的细胞成分进行识别。因此, 荧光-报告质粒含有一个 N 终端 ER 输入信号, 其次是 gfp 作为蛋白质生物合成传感器, 这间接地测量了在体内的 gfp 荧光发射后的蛋白质的翻译抑制. 翻译6。如果与野生型相比, 在特定的酵母缺失突变体中, 吞和/或胞内贩运是消极的 (或积极的), 这可以通过 GFP 荧光发射的增加 (或减少) 检测6。
目前, 所有分析酵母细胞中的区域内转运的方法都被限制在 ER-to-cytosol 的转运过程中。在这样的人工系统中, 含有 ER 输入信号的含氟贸易协定是由一个可诱导的启动子表达的, 导致自杀型表现为1,7。虽然在本手稿中所描述的实验装置中, 蓖麻蛋白的细胞结合 B 亚基同样缺失, 因此, 不完全代表蓖麻毒素 holotoxin 中毒的自然情况8, 从等离子体中运毒膜通过高尔基体对 ER 的仪器可以与这种新的检测严密模仿。有趣的是, 在试点研究中取得的初步结果表明, 贸易协定所使用的贩运途径显示出与蓖麻毒 holotoxin 的中毒路线有惊人的相似之处。
总之, 所描述的方法可以用来确定特定的作用, 选择细胞蛋白在吞和贩运酵母。此外, 这种实验装置可以很容易地适应其他的核糖体灭活毒素产生和分泌的各种酵母和细菌物种, 如 zymocin 或志贺毒素。
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Protocol
注意: 一般实验工作流的概述如图 1所示。
警告: 对人类来说, 贸易协定是剧毒的。安全实验室许可 S2 (生物安全等级2当量) 是必要的。在整个实验中请戴上手套。
1. 在大肠杆菌中他标记的异种的异源表达
- 用表达质粒 pET24-RTA(其) 6或空向量 pET24a(+)使用标准的电穿孔协议9,10转换大肠杆菌单元格。含有空质粒的细胞充当阴性对照。
- 在含有卡那霉素的阳性克隆 (100 µg/毫升) lb 板后, 在5毫升kan培养基 (lb 培养基与100µg/毫升卡那霉素) 中接种含有区域内表达质粒或空向量的细胞, 并在37° c 和 220 rpm 下孵育 24 h。
- 补充 1 L LB坎培养基与5毫升培养和孵育细胞在37° c 和 220 rpm 直到细胞达到了 OD600 0.8-1.0 (大约 3-4 h)。此后, 将培养温度降低到28° c, 并在 H2O 中准备1米的 isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 库存解决方案。
- 通过在1毫米的最终浓度中加入 IPTG, 诱导大肠杆菌的表达。
- 在 3.5 h 在28° c 和220转每分钟, 收获细胞由离心在 1万 x g 和4° c 为 10 min, 洗涤药丸二次以5毫升的捆绑缓冲 (500 毫米氯化钠, 10 毫米咪唑, 并且20毫米在2PO4, pH = 7.4) 在 1万 x g 和4° c 为 10 min, 和重颗粒在5毫升结合缓冲器。
注意: 协议在这个阶段可以暂停, 并且细胞可以被存放在80° c 几天。
2. 通过亲和层析纯化其标记的贸易量
- 几种细胞在冰使用以下协议: 十五年代脉冲 (20 微米), 三十年代暂停。重复此步骤五次。
- 离心分离器在 2.1万 x 和4° c 为15分钟和过滤上清液使用无菌注射器过滤系统 (0.2 µm 孔大小)。
注: 成功声样品的细胞颗粒显示透明边框。 - 使用配备了5毫升 Ni2 +的亲和柱的自动净化系统, 从未消毒的过滤后的大肠杆菌上清纯化其标记的含量。一般而言, 使用1毫升/分钟的洗脱速度, 冷却整个净化系统, 以防止效率毒素的结合和毒素活性的丧失。
注意: 在表 1中列出了有效的贸易协定净化参数。参见贝克尔et al。有关详细信息,9。- 简单地, 用 20 mL 的绑定缓冲区平衡关联列来删除存储缓冲区。用注射器将无菌过滤的上清液涂抹在亲和柱上。
- 用25-35 毫升的结合缓冲器清洗柱, 从柱上移除未绑定的蛋白质。执行洗涤步骤, 直到 280 nm 的紫外线吸收接近初始 uv 值。
- 洗在20-35 毫升的洗脱缓冲液 (500 毫米咪唑, 500 毫米氯化钠, 20 毫米,2PO4, pH = 7.2), 并保持样品在冰上 (图 2A和图 2B)。
注: 在紫外线吸收的情况下, 该组分的洗脱率明显增加。请注意, 专门收集这个分数, 以防止污染与非特异性结合蛋白。 - 使用20µL 洗样品执行马斯亮蓝色染色11或西方印迹分析12,13 (可选)。使用初级抗他的抗体 (1:1, 000) 和第二 anti-mouse-IgG-HRP (1:10,000) 来检测和验证样品纯度 (图 3)。
- 淡化洗在5毫升脱盐柱和平衡样品中的0.8 米山梨醇中的含量。
- 用脱盐柱取代纯化系统的亲和柱, 先平衡20毫升0.8 米山梨醇的柱。
- 通过注射器将洗的比例分数应用到柱子上。当紫外线吸收开始增加 (图 2C) 时, 用100毫升0.8 米山梨醇和洗的盐水在15毫升管中清洗该柱。
- 在4° c 下贮存洗的含量。
注: 当电导增加时, 直接停止含盐量的分数取样, 以避免盐分污染。脱盐过程的参数列于表1。
- 将洗 1万 x g 和4° c 的30-180 分钟集中度用 10 kDa 截止自旋柱到1-2 毫升的最终体积, 并在4° c 下储存样品3-4 周。
警告: 不要冻结样品, 因为冷冻会导致整个贸易协定活动的完全丧失。 - 使用常规蛋白质测定试剂盒确定蛋白质浓度。蛋白质浓度应在 1-1. 5 毫克/毫升的范围内。
注: 如果蛋白质浓度太高 (#62; 5 毫克/毫升), 就会沉淀。
3. 酵母转化和细胞壁去除
- 利用 gfp 报告质粒 pRS315-K28SP-gfp6使用标准醋酸锂转化方法14转换野生型或选定的酵母缺失突变体。在0.087% ° c 下孵育亮氨酸辍学 (d-/o) 葡萄糖板 (2% 葡萄糖, 1.5% 琼脂, 0.5% 硫酸铵, 0.17% 酵母氮基 (YNB) 和30的无亮氨酸混合) 的细胞, 用于阳性克隆选择的2-3 天。
- 从每个板块挑选3不同的酵母克隆, 在100毫升的亮氨酸糖培养基中接种克隆 (2% 糖, 0.5% 硫酸铵, 0.17% YNB 和0.087% 的无亮氨酸的混合, 在 220 rpm 和30° c 到 OD600 = 1.0-2.0 (2-4 x 107细胞/毫升)。
注意: 不同酵母缺失菌株的细胞生长是不同的。通过分光光度计监视 OD600 。 - 要计算 od600值, 请将样本稀释到 od600 = 0.1-0.3 (1:5 到1:10 稀释), 并在分光光度计中测量外径600 。作为参考, 使用 H2o 辅以相应数量的亮氨酸 raffionose 培养基。
- 完成步骤3.5 后, 混合4µL 的 spheroplasted 50 mL 文化与496µL spheroplasting 缓冲区 (约 2 x 106原生质) 和离心机为10分钟 400 x g。
- 重颗粒在10毫升 H2O 蒸馏, 漩涡样品三十年代, 和板材出10µL 的样品上亮氨酸 d-/O 葡萄糖板 (2% 葡萄糖, 1.5% 琼脂, 0.5% 硫酸铵, 0.17% YNB, 和0.087% 的 d/o 混合没有亮氨酸)。
- 孵育细胞3天在30° c。计算板上生长细胞菌落总数。对于数据评估, 只使用效率高于98% 的样本 (总细胞菌落数和 #60; 40 殖民地/板块)。
4. GFP 报告仪测定96井板
- 将步骤3.7 中获得的酵母细胞原生质成 96-井板 (200 µL/井)。
- 添加70µL 稳定的亮氨酸 d/o 糖培养基含有负控制 (洗的镍2 +亲和纯化细胞裂解 IPTG 诱导的大肠杆菌细胞表达空矢量) 或纯化的区域贸易协定在最后的贸易量集中5µM ( 对应于每井160克/升)。
- 立即添加30µL 稳定的半乳糖溶液 (30% 半乳糖, 0.8 米山梨醇), 以诱导 GFP 的表达, 并随后开始测量。
注: 每次试验至少进行3技术复制, 每株酵母菌3次生物复制。 - 完成样品制备后 (步骤 4.1-4.3), 把 96-井板在一个荧光阅读器, 并开始测量。使用 GFP 荧光检测所需的 475/509 nm 过滤器集。执行测量在30° c, 120 转每分钟, 并且以震动直径1毫米在时间窗口 20 h (测量的区间 10 min)。
注意: GFP 过滤器集通常在所有读卡器系统中都可用。温度、时间窗、测量间隔和浓度可根据自身需要进行调整。有代表性的结果如图 4所示。 - 可选: 在质量控制的测量中使用额外的内部控制。通过添加30µL 稳定亮氨酸 d/o 糖培养基而不是30% 半乳糖 (无 GFP 诱导) 来准备负控制。此外, 添加70µL 0.8 米山梨醇稳定 G418 溶液 (300 µg/毫升)。蛋白质翻译抑制剂 G418 作为积极控制蛋白质抑制, 因为它防止 GFP 在酵母表达。
- 根据以下公式计算 20 h 时间点的相对 GFP 荧光百分比 (请参见图 4A):
其中 NC 为负控件
- 另外, 确定相对 GFP 荧光为每个测量点 (在这种情况下 10 min, 也参见步骤 4.4) 使用上述等式。如图 4B所示, 通过在时间 (x 轴) 上印迹 GFP 荧光强度 (y-axis) 来创建图形。
其中 NC 为负控件
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Representative Results
本手稿中所描述的协议的一般工作流程在图 1中作了说明, 大致总结了成功的贸易协定纯化和随后的 GFP 报告实验的单一步骤。可以在协议中找到每个单独步骤的更详细的描述。图 2说明了通过亲和层析 (图 2A) 和空矢量控件 (图 2B) 成功进行的贸易协定净化的预期结果。图 2C显示了脱盐实验的典型结果, 说明了蛋白质峰值 (蓝色) 和盐-洗峰 (褐色) 的理想分离。在图 3中, 以马斯亮染色的 SDS 凝胶为形式, 提出了一种有效的贸易协定纯化方法。最后,图 4总结了由这个简单而健壮的 GFP-based 报告方法6获得的一些原始结果。图 4A说明了已建立的 gfp 报告分析方法能够产生可靠的结果, 并在本研究中用图解法描述 gfp 报告质粒。在图中, 比较了酵母原生质在处理条件下的相对 GFP 荧光。正如所料, non-induced 和 G418-treated 细胞几乎不显示 GFP 荧光。在处理和阴性对照治疗 (空向量) 细胞中, GFP 表达不受影响, 两种样品间的显著差异均未观察到。相比之下, 贸易协定的治疗导致预期 GFP 荧光还原介导的核糖体抑制活性。在图 4B中, 显示了一个由贸易协定诱导的 GFP 荧光抑制的时间曲线。这种数据介绍包含了有关 GFP 表达的时间 (90 分钟后的半乳糖诱导) 的额外信息, 以及由区域贸易协定 (在野生型细胞中应用后210分钟) 转化抑制的起始点。在胞中, 对其进行的荧光衰减的延迟很可能反映了其吸收动力学和细胞内转运。图 4C说明了经过20小时的治疗后, 从选定的酵母突变体获得的相对 GFP 荧光, 并将其与区域处理方法进行比较, 并与经处理的野生型细胞进行比较。ERAD 组分 Hrd1p 和 Der1p 被选择了作为适当的正面控制, 因为早先研究已经证明了这两种蛋白质都参与了酵母的 ER-to-cytosol retrotranslocation 的1。因此, 两个突变体都显示了与野生型细胞相比, GFP 荧光的预期增加。相比之下, Δyos9 和Δnup120 单元格中的相对 GFP 荧光值没有显著差异。它已经被描述, 既不缺乏 ER 质量控制凝集素 Yos9p 也不缺乏在核孔蛋白 Nup20p 影响的地区贸易的毒性和运输1。在表 1中可以找到特定亲和色谱和脱盐参数的列表。
图 1: 贸易协定纯化和 GFP-based 报告员分析的一般工作流程本研究从大肠杆菌的转化开始, 用表达或空向量, 其次是培养和 IPTG 诱导的表达。在细胞裂解和无菌过滤后, 通过 Ni2 +亲和层析法纯化上清液, 通过马斯亮染色或印迹来验证样品纯度。在洗的活性组分在 GFP 报告实验中准备使用之前, 分数需要盐水和浓缩, 必须确定蛋白质浓度。gfp 报告实验 (右) 开始与野生型和/或选择的酵母删除突变体与 gfp 表达结构的转变。在培养后, 细胞壁被酶处理去除, 允许在体内的内吸收。然后, 在荧光阅读器 (475/509 nm) 下, 在毒素处理和处理条件下测定酵母细胞原生质的 GFP 荧光。最后, 使用步骤4.6 中所示的公式确定相对 GFP 荧光, 如图 4所示。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 具有代表性的亲和层析和脱盐结果的大肠杆菌细胞包含 pET-区域化的(他) 6或空的矢量控件.(A)大肠杆菌细胞裂解样品的典型纯化图表示贸易协定(他) 6从矢量 pET24-RTA(他) 6。蓝色曲线代表的紫外线吸收在 280 nm 引起的芳香环的氨基酸激进党, Tyr, 和胱氨酸和作为蛋白质指标。在列加载期间, 未绑定的蛋白质在流动通过 (0-10 毫升) 被发现。通过结合缓冲液洗涤去除未粘合的蛋白质后, 洗脱缓冲液浓度从0增加到 100% (红色曲线), 结合蛋白从柱上立即洗。在25和30毫升之间的蓝色曲线的峰值代表了他标记的贸易协定 (黑盒) 的分数。(B) 从表达空矢量控制的单元中提取的大肠杆菌的典型纯化图. 与 (A) 中相同的纯化协议。如黑盒中所示, 阴性对照柱中没有蛋白质洗。(C) 一个大肠杆菌的脱盐图 pET24-RTA(他) 6亲和纯化后的样品。该图显示了在20-30 毫升 (280 nm) 和盐馏分 (30 毫升后增加电导峰) 之间的蛋白质组分的分离 (峰值)。请点击这里查看更大版本的这个数字。
图 3: 代表西方对不同样品亲和纯化前后的分析.采用 SDS-页和马斯亮蓝染色法分析了20µL 细胞裂解 (2-4 车道) 或不同的异种贸易协定变种 (仅在本研究中使用的未修改的贸易协定) 的纯化样品 (车道 5-7)。1车道, 蛋白质阶梯;2车道, 未修改的贸易协定;车道 3, 贸易协定HDEL;车道 4, 贸易协定KDEL;5车道, 未修改的贸易协定;车道 6, 贸易协定HDEL;车道 7, 贸易协定KDEL。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 由报告员对野生型和精选的酵母缺失突变体进行检测的代表性结果.(A) 野生型酵母原生质的相对 gfp 荧光, 含有报告质粒 pRS315-K28SP-gfp (右) (3% 半乳糖, GFPind) 和 non-induced (2% 糖, GFPrepr). 20 h gfp 后的条件感应.还分析了相关的 GFP 荧光的存在 (5 µM), G418 (300 µg/毫升) 或负控制 (NC)。蛋白翻译抑制剂 G418 作为阳性对照, 防止 GFP 在酵母中的表达。平均值和标准偏差 (SD) 被表明。(B) 相对 GFP 荧光从 (A) 显示为时间过程超过20小时。该图提供了有关 GFP 表达的时间和由贸易协定进行翻译抑制的补充信息;曲线的行为间接反映了胞的吸收和细胞内转运的动力学。(C) 具有代表性的结果选择酵母突变体的细胞蛋白, 已知是涉及 (Hrd1p 和 Der1p) 或不涉及 (Yos9p 和 Nup120p) 在酵母的贸易, 在贸易中的贸易,1,6。虚线代表了一个意义的阈值, 这是基于由正控制菌株获得的荧光发射 (进一步解释参见参考6)。平均值和标准偏差 (SD) 被表明。该图已从贝克尔et al.中修改6 请单击此处查看此图的较大版本.
| 亲和相参数 | ||
| 测量参数 | 紫外线 (280 nm), 洗脱缓冲液浓度, 电导 | |
| 设置 | 变量/单元 | 值 |
| 流量 | 毫升/分钟 | 1 |
| 最大柱压 | mpa | 0.35 |
| 波长 | nm | 280毫微米 |
| 绑定缓冲区 | 泵位置 | 一个 |
| 洗脱缓冲器 | 泵位置 | b |
| 起始浓度洗脱缓冲 | % | 0 |
| 系统容量补偿 | 毫升 | 10 |
| 列平衡 | 毫升 | 20 |
| 注射 superloop/注射器样品 | 毫升 | 细胞裂解体积 |
| 洗涤步骤 | 毫升 | 20-35 |
| 洗脱步骤 | 毫升 | 20-35 |
| 洗脱过程中的浓缩洗脱缓冲 | % | 100 |
| 20% 乙醇柱的再校准 | 毫升 | 50 |
| 脱盐参数 | ||
| 测量参数 | 紫外线 (280 nm), 电导率 | |
| 设置 | 变量/单元 | 值 |
| 流量 | 毫升/分钟 | 4 |
| 最大柱压 | mpa | 0.35 |
| 波长 | nm | 280毫微米 |
| 绑定缓冲区 | 泵位置 | 一个 |
| 洗脱缓冲器 | 泵位置 | b |
| 起始浓度洗脱缓冲 | % | 0 |
| 系统容量补偿 | 毫升 | 10 |
| 列平衡 | 毫升 | 20 |
| 注射 superloop/注射器样品 | 毫升 | 细胞裂解体积 |
| 脱盐缓冲注射 (0.8 米山梨醇) | 毫升 | 100 |
| 20% 乙醇柱的再校准 | 毫升 | 50 |
表 1: 用于列亲和纯化和脱盐的参数.列出所有相关的列设置 (例如、流速、洗脱缓冲液浓度、平衡和洗涤步骤持续时间) 和测量参数 (如、电导或紫外线吸收)。
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Discussion
在执行上述协议时, 我们建议以下建议, 以取得成功的实验结果。
对于异源蛋白的表达, 重要的是不超过 IPTG 浓度的1毫米。IPTG 的浓度和 #62; 1 mM 抑制启动子诱导的贸易量表达, 导致毒素产量降低。此外, 细胞不应在高于28° c 的温度下培养, 以防止包涵体形成、低效折叠和毒素失活。在较低的温度 (例如, 20-28 ° c) 是可能的, 也导致生物活性毒素的生产。然而, 额外的温度降低并没有显著改善贸易组织的活动/折叠, 结果在总毒素产量比28° c (数据没有显示)。
亲和层析 (表 1) 的纯化参数被优化为使用装有5毫升 Ni2 +亲和柱的自动净化系统, 并应调整为其他自制或商业柱系统纯度和产量是次优。在不理想的马斯亮的情况下 (由额外的蛋白质的外观表明, 在多染的 SDS 凝胶), 增加的咪唑浓度的结合缓冲通常减少不结合的积极带电的蛋白质柱, 从而增加了总的贸易的纯度。在不理想的区域贸易量的情况下, 引入额外的可步骤 (4-8 脉冲), 更长的潜伏期 (5 小时) 或更大的培养体积 (和 #62; 1 L) 可以帮助提高总的毒素产量。但是, 如果实验室中没有自动化系统, 则还有机会通过基于自旋列的系统 (未显示数据) 成功地净化贸易协定。
在脱盐过程中, 一旦电导开始上升, 就必须跳过取样过程。含盐的污染, 特别是咪唑, 影响蛋白质浓度的测定, 导致不准确的浓度测定, 直接影响到在 GFP 报告中使用的含量。
必须在4° c 贮存纯化的贸易协定, 避免结冰。冰冻样本显示, 在 HeLa 细胞的 XTT-based 细胞活力测定中, 区域贸易组织的活性降低 (数据未显示)。纯化样品在其生物活性不断降低之前可保存3-4 周左右。此外, 在自旋柱浓度后, 高浓度 (5 毫克/毫升) 是至关重要的, 因为在0.8 米山梨醇中有沉淀的倾向。
这种方法的缺点是, 通常没有完整的酵母细胞占去了区域贸易协定。为了获得可靠的结果, 酵母细胞壁需要完全去除酶处理。因此, 用步骤 3.4-3.5 中描述的方法检查每株酵母菌的 spheroplast 形成效率是非常必要的。在 spheroplast 制备的情况下, 应通过相衬显微镜对培养时间和裂解酶浓度进行优化和监测。Overdigestion (幽灵形成) 可以通过减少溶解酶浓度和/或潜伏期来预防, 而在消化不足的情况下则需要相反的方法。从数据评估中排除细胞壁不充分的菌株的数据。
还应该提到的是, 实验装置并不完全模仿蓖麻毒素的自然中毒过程。细胞结合 B 亚基蓖麻毒素 (出价) 是缺少的, 通常负责有效的毒素结合到半乳糖残留在细胞表面的哺乳动物细胞15。从理论上讲, 这一限制可以通过对含有 a 和 B 亚基的纯化蓖麻蛋白 holotoxin 进行实验来克服。然而, 酵母细胞在他们的细胞表面不拥有半乳糖残滓可能斡旋捆绑出价8;这一事实也解释了为什么完整的酵母细胞对蓖麻毒素不敏感。因此, 不清楚出价是否在酵母模型中充当细胞结合组分。有趣的是, 以前的研究已经证明, 在没有细胞结合 B 亚基16的情况下, 区域贸易组织能够达到哺乳动物细胞的胞。为了理解这一现象, 我们决定只使用实验装置中的胞来识别酵母中的细胞成分, 从而促进从细胞膜向毒素的贩运。令人惊讶的是, 涉及在酵母区域贩运的成分显示出惊人的相似之处所需的成分有效的蓖麻毒 holotoxin 运输在哺乳动物细胞6。根据这些结果, 可以推测, 出价在细胞内蓖麻毒素的转运中起着次要的作用, 而这对于最初接触哺乳动物细胞表面很重要。
相比之下, 哺乳动物细胞中的 siRNA-based 系统完全反映了自然毒素的情况, 但耗时且昂贵的3。此外, 酵母缺失突变体的使用具有重要的优势, 突变体显示了一个完全剔除的蛋白质的兴趣, 而 siRNA-based 系统一般导致蛋白质水平的降低。在某些情况下, 残留的蛋白质水平可以是足够的毒素运输, 没有改变表型的观察, 因此, 具体的蛋白质的参与是不可见的 siRNA-based 系统。
虽然仅不必要的酵母删除菌株在最初的研究中使用了6, 温度敏感菌株以及减少丰度由 mRNA 摄动 (潮湿) 汇集菌株17 (减少的表达水平的必要蛋白质) 同样适合这类方法在将来。一般情况下, 由于缺乏生存能力, 基本蛋白的作用不能用这种方法进行研究, 因此, 它代表了检测系统的局限性。
然而, 新的记者分析代表了一个优雅的和替代的策略, 试图在模型生物体S. 酿酒酵母中对贸易协定的运输进行剖析。现有的研究采用细胞内质粒驱动的胞表达系统, 并仅限于分析从 ER 到回归易位的1,7。成功的实施细胞外 retrotranslocation 的应用, 现在打开的可能性, 不仅研究 er, 但也间接分析的贸易协定的运输从 PM, 虽然高尔基对 er。由于目前大多数酵母基因的细胞功能和定位都在数据库中被发现和使用, 因此确定的候选蛋白可以直接分配给特定的隔间和/或传输通路。
总的来说, 介绍的报告方法是一种简单和稳健的方法, 以确定参与细胞内贩运毒素或毒素亚基 (如, 贸易协定) 的候选蛋白, 阻断蛋白质翻译在体内。相对地低标准偏差 (1-10%) 并且高数据再现性在原始的研究证实了这些声明。由于96井板格式, 快速筛选各种酵母突变体是可能的一天后, 毒素纯化。
在未来, 有可能使用的方法高通量筛选酵母删除库。在目前的设置, 应用的贸易量浓度 (5 µM) 能够减少相对 GFP 荧光到50%。在这些条件下, 该方法提供了一个优势, 以确定删除突变体的负 (增加 gfp 荧光) 和积极 (减少 gfp 荧光) 的影响, 贸易协定的运输。对于高通量的筛查, 处理和处理样品之间的更强的区别有时是有益的。通过使用较高的浓度和/或增加测量间隔 (例如, 48 h), 更明显的 GFP 表达块应该是可以实现的。
强调这种方法不仅限于分析酵母胞外应用的中毒过程, 还有机会通过在该 GFP 报告株中通过质粒表达贸易量, 分析其 ER 进口 (数据不显示)。此外, 筛选方法同样可以适应研究其他蛋白质生物合成抑制蛋白的细胞内转运通路, 如 zymocin18 。与 zymocin 的典型的杀害方式对比, 相对地很少是已知的关于负责有效毒素运输的贩运途径到胞19,20。因此, zymocin 代表了未来研究的最佳候选者, 因为 zymocin 自然会被酵母细胞所占。因此, 可以省略细胞壁的去除, 从而提高 GFP 报告器检测的整体性能 (关于时间和成本)。在这一强大的记者分析的帮助下, 解剖 zymocin 在酵母中的细胞内转运路线是可行的。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究的部分得到了德意志 Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6) 的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial and yeast strains | |||
| E. coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
References
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