Summary
Dans le manuscrit, nous décrivons l’utilisation d’un essai de journaliste de fluorescence à base de levure pour identifier les composants cellulaires impliqués dans le trafic et de tuer les processus de la cytotoxique une sous-unité de la ricine de toxine végétale (RTA).
Abstract
Bactérienne et centrale A / toxines B exploitent les voies naturelles de trafic dans les cellules eucaryotes pour atteindre leurs cibles intracellulaires dans le cytosol et finalement tuer. Tel A / toxines B sont généralement consistant d’un enzymatiquement actif Asubunit (p. ex., la toxine A (RTA) de la ricine) et une ou plusieurs cellule lie Bsubunit(s), qui est responsables de toxine contraignantes spécifiques des récepteurs de surface de cellules. Nos connaissances actuelles de la façon dont A / B toxines sont capables d’enivrantes efficacement aidés les cellules scientifiques pour comprendre les mécanismes cellulaires fondamentaux, comme l’endocytose et intracellulaire des protéines dans les cellules eucaryotes supérieures de tri. D’un point de vue médical, il est également important d’identifier les voies du trafic toxine majeure à trouver des solutions de traitement approprié pour les patients ou à finissent par développer des applications thérapeutiques pour le traitement du cancer à base de toxines.
Depuis les analyses du génome de A / la toxine B traite des cellules de mammifères est complexe, fastidieux et coûteux, plusieurs études sur A / transport de toxine B ont été réalisées dans l’organisme modèle de levure Saccharomyces cerevisiae. Bien qu’il soit moins complexes, fondamentaux des processus cellulaires chez les levures et les cellules eucaryotes supérieures sont semblables et très souvent les résultats obtenus chez les levures peuvent être transférées à la situation chez les mammifères.
Nous décrivons ici un essai de journaliste rapide et facile à utiliser pour analyser le trafic intracellulaire de RTA dans la levure. Un avantage essentiel de la nouvelle méthode de dosage est l’occasion d’étudier non seulement la RTA rétro-translocation du réticulum endoplasmique (ER) dans le cytosol, mais plutôt l’endocytose et toxine rétrograde de transport de la membrane plasmique dans le re. Le test utilise un plasmide de journaliste qui permet une mesure indirecte de la toxicité de la RTA à travers l’émission de fluorescence de la protéine fluorescente verte (GFP) après in vivo de la traduction. Comme RTA empêche efficacement l’initiation de la biosynthèse des protéines par dépurination ARNr 28 s, ce test permet l’identification des protéines de cellules hôtes impliqués dans le transport intracellulaire de RTA par le biais de la détection de changements dans l’émission de fluorescence.
Introduction
Patients souffrant d’infections par des bactéries productrices de toxine représentent un fardeau médical et financier grave pour chaque système de soins de santé social, en particulier les traitements thérapeutiques efficaces étant encore largement défaut. À élaborer de nouvelles stratégies thérapeutiques, les mécanismes de l’intoxication complexe de médicalement pertinente A / toxines B tels que la toxine cholérique, Shiga toxine ou ricine doivent être entièrement comprises au niveau moléculaire issu des nouveaux dosages puissants qui doivent être mises en œuvre.
Ces dernières années, plusieurs études ont tenté d’analyser A / transport de toxine B chez les levures et les cellules de mammifères en utilisant des méthodes fastidieuses et coûteuses telles que les toxines radioactives étiquetage1,2 mais aussi de dépistage basé sur siRNA 3les approches. Dans certains cas, traite de la toxine a été visualisée in vivo par microscopie de fluorescence après couplage chimique ou génétique des sous-unités de la toxine individuelle avec des fluorophores, points quantiques ou protéines fluorescentes4,5. Malheureusement, ces modifications entraînent souvent inactives et/ou altération des propriétés naturelles des toxines. Une autre façon élégante de répondre indirectement à une grande variété de questions scientifiques est l’utilisation de systèmes de journaliste issu des enzymes comme lacZ, luciférase, ou protéines fluorescentes (p. ex. GFP ou Acropora sp. (protéine fluorescente rouge dsRed)).
Dans ce manuscrit, un protocole simple est décrite qui identifie les composants cellulaires requis pour le transport intracellulaire des RTA extracellulaire appliquée chez S. cerevisiae. Ainsi, un plasmide de fluorescence-journaliste contenant un signal de N-borne ER-import suivi de GFP agit comme un capteur de biosynthèse de protéine, qui mesure indirectement l’inhibition de la protéine induite par la RTA traduction par GFP émission de fluorescence après in vivo traduction6. En cas que l’endocytose RTA et/ou trafic intracellulaire est négativement (ou positivement) affectés dans un mutant de délétion de levure particulière par rapport au type sauvage, cela peut être détectée par une augmentation (ou diminution) dans GFP fluorescence d’émission6.
Jusqu’ici, toutes les méthodes d’analyse transport RTA dans les cellules de levure sont limitaient au processus de rétro-translocation ER-à-cytosol de RTA. Dans un tel système artificiel, RTA contenant un signal d’importation ER s’exprime d’un promoteur inductible, ce qui entraîne un phénotype suicidaire1,7. Bien que la cellule liant la sous-unité B de la ricine est également absent dans le dispositif expérimental décrit dans ce manuscrit et, ainsi, ne pas entièrement représente la situation naturelle de ricine holotoxine intoxication8, transport de la toxine du plasma membrane à travers l’appareil de Golgi à la salle d’urgence peut être imité étroitement avec ce nouveau dosage. Fait intéressant, les résultats préliminaires obtenus dans l’étude pilote indiquent que les voies de trafic utilisés par RTA révèlent des ressemblances frappantes avec la route de l’intoxication de ricine holotoxine.
En résumé, la méthode décrite peut être utilisée pour déterminer le rôle spécifique des protéines cellulaires sélectionnés dans l’endocytose de la RTA et traite des levures. En outre, ce dispositif expérimental pourrait être facilement adapté aux autres ribosomes inactivation des toxines produites et sécrétées par les différentes levures et espèces bactériennes telles que zymocin ou la toxine de Shiga.
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Protocol
Remarque : Une vue d’ensemble du flux de travail expérimental général est représenté dans la Figure 1.
ATTENTION : RTA est hautement toxique pour les humains. L’autorisation de laboratoire de sécurité S2 (niveau de biosécurité 2 équivalent) est nécessaire. Veuillez porter des gants pendant l’expérience entière.
1. hétérologue Expression de son étiquette RTA chez Escherichia coli
- Transformer des cellules d’e. coli avec l’expression plasmide pET24-RTA(sa) 6 ou sur le pET24a de vecteur vide(+) à l’aide d’électroporation standard protocoles9,10. Les cellules contenant le plasmide vide servent de témoin négatif.
- Après sélection des clones positifs sur plaques de LB (100 µg/mL) contenant de kanamycine, ensemencer les cellules contenant le plasmide d’expression RTA ou le vecteur vide dans un milieukan mL 5 LB (milieu LB avec 100 µg/mL de kanamycine) et incuber à 37 ° C et 220 tr/mn pendant 24 h.
- Supplément 1 LB Lkan moyen avec pré-culture 5 mL et incuber les cellules à 37 ° C et 220 tr/mn jusqu'à ce que les cellules ont atteint une OD600 de 0,8 à 1,0 (environ 3-4 h). Par la suite, réduire la température de culture à 28 ° C et préparer un 1 M de la solution mère de l’isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) dans H2O.
- Induisent l’expression RTA de la e. coli en ajoutant IPTG à une concentration finale de 1 mM.
- Après 3,5 h à 28 ° C et 220 tr/mn, récolte des cellules par centrifugation à 10 000 x g et 4 ° C pendant 10 min, laver le culot deux fois avec 5 mL de tampon de liaison (500 mM NaCl, imidazole de 10 mM et 20 mM KH2PO4 pH = 7,4) à 10 000 x g et 4 ° C pendant 10 min et remettre pellet dans 5 mL de tampon de liaison.
Remarque : Le protocole peut être suspendue à ce stade et cellules peuvent être stockées à 80 ° C pendant plusieurs jours.
2. purification du RTA son marqués par chromatographie d’affinité
- Laisser agir de cellules sur la glace en utilisant le protocole suivant : 15 s pulse (20 microns), pause de s 30. Répétez cette opération cinq fois.
- Centrifuger la cellule lysat à 21 000 x g et 4 ° C pendant 15 minutes et filtrer le surnageant à l’aide d’un système de filtre de seringue stérile (taille des pores 0,2 µm).
NOTE : Granules cellulaires d’échantillons avec succès aux ultrasons montrent des bordures transparentes. - Utiliser un système de purification automatique équipé d’un 5 mL Ni2 +-base colonne d’affinité pour purifier la fraction RTA His-tag de la stérile filtré par e. coli surnageant. En général, utiliser une vitesse d’élution de 1 mL/min et laisser refroidir le système entier de purification afin d’empêcher la liaison de la toxine non efficace et perte d’activité de la toxine.
NOTE : Les paramètres pour la purification efficace de RTA sont répertoriés dans le tableau 1. Voir aussi Becker et al. Pour plus amples information sur9.- En bref, équilibrer la colonne d’affinité avec 20 mL de tampon de liaison pour retirer le tampon de stockage. Appliquer le surnageant stérile filtrée dans la colonne d’affinité à l’aide d’une seringue.
- Laver la colonne avec 25-35 mL de tampon de liaison pour éliminer les protéines non liées de la colonne. Exécutez les étapes de lavage jusqu'à l’absorbance UV à 280 nm est proche de la valeur initiale des UV.
- Éluer la fraction liée de RTA dans 20 à 35 mL de tampon d’élution (imidazole de 500 mM, 500 mM NaCl, 20 mM KH2PO4, pH = 7,2) et conserver l’échantillon sur la glace (Figure 2 a et 2 b de la Figure).
Remarque : L’élution de la fraction de la RTA est marquée par une augmentation de l’absorption UV. Veuillez noter pour collecter exclusivement cette fraction pour éviter la contamination avec des protéines non spécifiques liés. - Utilisez 20 µL d’échantillons éluées pour effectuer11 bleu de Coomassie ou Western blot analyse12,13 (facultatif). Utilisez les primaires contre son anticorps (1:1, 000) et secondaire anti-mouse-IgG-HRP (01:10, 000) pour détecter la RTA et de vérifier la pureté de l’échantillon (Figure 3).
- Desalt éluée fraction de RTA sur une colonne de dessalement de 5 mL et équilibrer échantillon à 0,8 M sorbitol.
- Remplacer la colonne d’affinité du système de purification par la colonne de dessalement et d’abord équilibrer la colonne avec 20 mL de 0,8 M sorbitol.
- S’applique à la fraction éluée de RTA pour la colonne en utilisant une seringue. Laver la colonne avec 100 mL de 0,8 M sorbitol et Éluer la morue dessalée fraction de RTA dans un tube de 15 mL dès l’absorption UV commence à augmenter (Figure 2).
- Fraction de magasin la LLUH éluée à 4 ° C.
Remarque : Arrêter directement d’échantillonnage de la RTA fraction lorsque la conductance augmente pour éviter toute contamination du sel. Paramètres pour la procédure de dessalement sont répertoriés dans le tableau 1.
- Éluées fraction de RTA à 10 000 x g et 4 ° C pendant 30 à 180 minutes en utilisant une colonne de spin de coupure 10 kDa pour un volume final de 1 à 2 mL de concentré et conserver l’échantillon à 4 ° C pendant 3 à 4 semaines.
ATTENTION : Ne pas congeler l’échantillon depuis gel conduit à une perte complète de l’activité de la RTA. - Déterminer la concentration de protéines à l’aide d’un kit de dosage de protéines classiques. La concentration de protéines doit être de l’ordre de 1 à 1,5 mg/mL.
Remarque : Le RTA a tendance à précipiter si la concentration en protéines est trop élevée (> 5 mg/mL).
3. Transformation et l’élimination de la paroi cellulaire de levure
- Transformer les mutants de délétion de levure sauvage ou sélectionné avec la GFP journaliste plasmide pRS315-K28SPGFP -6 à l’aide de lithium standard acétate transformation méthodes14. Incuber les cellules sur la leucine abandon (d/o) plaques de glucose (2 % de glucose, 1,5 % d’agar, sulfate d’ammonium 0,5 %, 0,17 % d’azote de levure Base (YNB) et 0,087 % d/o mix sans leucine) à 30 ° C pendant 2-3 jours pour la sélection positive clone.
- Sélectionner les 3 levure différents clones de chaque plaque et ensemencer les clones dans 100 mL de leucine d/o raffinose moyenne (2 % raffinose, sulfate d’ammonium 0,5 %, 0,17 % YNB et 0,087 % d/o mélanger sans leucine) à 220 tr/mn et 30 ° C à OD600 = 1,0 à 2,0 (2-4 x 107 cellules/mL).
NOTE : La croissance des cellules des différentes souches de levures suppression est différente. Moniteur OD600 via un spectrophotomètre. - Pour calculer les valeurs de600 OD, diluer les échantillons à OD600 = 0,1-0,3 (1:5 à 01:10 dilutions) et mesurer OD600 dans un spectrophotomètre. Comme référence, utilisez H2O additionné de la quantité correspondante de milieu de leucine d/o raffionose.
- Après finition étape 3.5, mélanger 4 µL de la culture de spheroplasted 50 mL avec 496 µL de tampon de sphéroplastes (environ 2 × 106 sphéroplastes) et centrifuger pendant 10 min à 400 g.
- Culot de remettre dans 10 mL H2O distillée, échantillon de vortex pour 30 s et plaque à 10 µL de l’échantillon sur des plaques de glucose d/o leucine (2 % de glucose, 1,5 % d’agar, sulfate d’ammonium 0,5 %, 0,17 % YNB et 0,087 % d/o mix sans leucine).
- Incuber les cellules pendant 3 jours à 30 ° C. Compter le nombre total de colonies de cellules cultivées sur la plaque. Pour l’évaluation des données, utilisez uniquement des échantillons avec une efficacité supérieure à 98 % (total nombre de colonies de cellules < 40 colonies/plaque).
4. GFP Reporter Assay mesure en plaques 96 puits
- Graine sur les sphéroplastes de cellules de levure obtenues à l’étape 3,7 en plaques 96 puits (200 µL/puits).
- Ajouter 70 µL leucine stabilisée d/o raffinose milieu contenant du contrôle négatif (éluat d’a Ni2 +-affinité purifié lysat cellulaire induite par l’IPTG e. coli cellules exprimant le vecteur vide) ou purifiée RTA dans une concentration finale de RTA de 5 µM ( correspond à 160 g/L RTA) dans chaque puits.
- Immédiatement ajouter 30 µL stabilisé galactose solution (galactose de 30 %, 0,8 M sorbitol) pour induire l’expression de la GFP et ensuite lancer la mesure.
Remarque : Effectuer au moins 3 répétitions techniques par expérience et biologiques 3 répétitions par souche de levure. - Après avoir terminé la préparation de l’échantillon (mesures 4.1-4.3), mettre la plaque de 96 puits en un lecteur de fluorescence et démarrer la mesure. Utilisez le filtre de nm de 475/509 requis pour la détection par fluorescence GFP. Effectuer des mesures à 30 ° C, 120 t/mn et avec un secousse diamètre de 1 mm sur une fenêtre de temps de 20 h (10 min d’intervalle de mesure).
Remarque : Le jeu de filtres GFP est normalement disponible dans tous les systèmes de lecteur. Température, la fenêtre de temps, mesure des intervalles et la concentration de RTA peut être ajustée pour les besoins propres. Résultats représentatifs sont indiquées à la Figure 4. - En option : Utiliser des contrôles internes supplémentaires dans la mesure pour le contrôle qualité. Préparer un contrôle négatif en ajoutant 30 µL leucine stabilisée d/o raffinose de milieu au lieu de 30 % de galactose (aucune induction GFP). En outre, ajouter 70 µL de solution de G418 sorbitol stabilisé de 0,8 M (300 µg/mL). L’inhibiteur de la protéine traduction G418 sert de témoin positif pour l’inhibition de la protéine car il empêche l’expression de la GFP dans la levure.
- Calculer la fluorescence GFP relative en pourcentage pour le point de temps 20 h selon l’équation suivante (voir Figure 4 a) :
NC où est le contrôle négatif
- Vous pouvez également déterminer la fluorescence GFP relative pour chaque point de mesure (voir aussi dans ce cas 10 min, l’étape 4.4) en utilisant l’équation ci-dessus. Comme le montre la Figure 4 b, créer un graphique en tamponnant les intensités de fluorescence GFP (axe y) au fil du temps (axe des x).
NC où est le contrôle négatif
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Representative Results
Le déroulement général du protocole décrit dans ce manuscrit est illustré à la Figure 1, environ résumant les étapes simples pour succès RTA purification et l’expérience de dosage de journaliste GFP ultérieure. On trouvera une description plus détaillée de chaque étape individuelle dans le protocole. La figure 2 illustre le résultat attendu d’une purification de RTA réussie par chromatographie d’affinité (Figure 2 a) et de la lutte contre les vecteurs vides (Figure 2 b). La figure 2 montre un résultat représentatif d’une expérience de dessalement illustrant la séparation idéale de la crête de protéine (bleue) et le pic de la sel-élué (brun). Une purification efficace de la RTA est présentée sous forme d’un gel SDS teinté bleu de Coomassie dans la Figure 3. Enfin, la Figure 4 résume quelques résultats originaux obtenus par cette méthode de dosage journaliste GFP simple et robuste6. Figure 4 a montre que le dosage de journaliste GFP établi est capable de produire des résultats fiables et représente schématiquement le plasmide de journaliste de GFP utilisé dans cette étude. Dans le graphique, la fluorescence GFP relative des sphéroplastes de levure dans des conditions RTA-traitées et non traitées est comparée à l’autre. Comme prévu, les cellules non induite ainsi traités G418 ne présentent presque aucune fluorescence GFP. Dans les cellules non traitées et négatifs témoins traités (vecteur vide), expression de la GFP n’est pas affectée et n’ont pas observés de différences significatives entre les deux échantillons. En revanche, traitement RTA conduit à la réduction prévue de fluorescence GFP médiée par le ribosome inhibant l’activité. Dans la Figure 4 b, une courbe de temps d’inhibition de fluorescence induite par le RTA GFP est affichée. Ce genre de présentation de données contient des informations supplémentaires sur le calendrier de l’expression de la GFP (90 min après l’induction de galactose) et le point de départ de l’inhibition translationnelle par RTA (210 min après l’application dans les cellules de type sauvage). Le retard dans la diminution de la fluorescence induite par la RTA probablement reflète la cinétique d’absorption et le transport intracellulaire de RTA dans le cytosol. La figure 4 illustre la fluorescence GFP relative obtenue par des mutants de levures sélectionnées après un 20 h RTA-traitement et par rapport au RTA-traitement et par rapport aux cellules de type sauvage imprégnées sur la RTA. Les composants ERAD Hrd1p et Der1p ont été choisis comme positif adapté contrôle parce que les études antérieures ont déjà montré que les deux protéines sont impliquées dans la retrotranslocation de ER-de-cytosol de RTA dans levure1. Par conséquent, les deux mutants montrent l’augmentation prévue en fluorescence GFP par rapport aux cellules de type sauvage. En revanche, les valeurs relatives de fluorescence GFP dans Δyos9 et Δnup120 cellules ne sont pas significativement différentes. Il a déjà été décrit qu’un manque de la lectine de contrôle de la qualité de ER Yos9p ni un manque dans la protéine de pore nucléaire Nup20p affecte RTA toxicité et transport1. On trouvera une liste des paramètres de chromatographie et de dessalage du affinité spécifique dans le tableau 1.
Figure 1 : déroulement général de purification de la RTA et dosage de journaliste GFP. La purification de la RTA (à gauche) commence par la transformation d’e. coli avec l’expression ou le vecteur vide, suivie de la culture et l’expression de la RTA induite par l’IPTG. Après la lyse cellulaire et filtration stérilisante, le surnageant est purifié par chromatographie d’affinité Ni2 + et pureté de l’échantillon est vérifiée par une coloration bleu de Coomassie ou Western blot. Avant les fractions éluées de RTA sont prêtes à utiliser dans l’expérience de dosage du journaliste GFP, fractions doivent être dessalé et concentré, et la concentration de protéines doit être déterminée. L’expérience de dosage des journaliste GFP (à droite) commence par la transformation des mutants de délétion de levure sauvage et/ou sélectionnés par la construction d’expression de GFP. Après la culture, la paroi cellulaire est éliminée par un traitement enzymatique pour permettre l’absorption de RTA en vivo . Puis, la fluorescence GFP de sphéroplastes de cellules de levure est mesurée dans des conditions traitées à la toxine et non traitées au fil du temps dans un lecteur de fluorescence (475/509 nm). Enfin, fluorescence GFP relative est déterminée à l’aide de l’équation indiquée à l’étape 4.6 et s’affiche comme illustré à la Figure 4. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Chromatographie d’affinité représentatif et dessalage résultats de cellules d’Escherichia coli contenant pET-RTA(sa) 6 ou le contrôle de vecteur vide. (A) graphique de purification typique d’un échantillon de lysat cellulaire e. coli exprimant la RTA(sa) 6 du vecteur pET24-RTA(sa) 6. La courbe bleue représente l’absorption UV à 280 nm causée par les noyaux aromatiques des acides aminés Trp, Tyr et Cys et sert d’indicateur de la protéine. Pendant le chargement de la colonne, protéines non liées sont détectés dans le cheminement (0 à 10 mL). Après avoir retiré les protéines non liées par lavage avec le tampon de liaison, concentration du tampon d’élution est passée de 0 à 100 % (courbe rouge) et protéines liées sont élués immédiatement de la colonne. Le pic de la courbe bleue entre 25 et 30 mL représente la fraction du lié son étiquette RTA (boîte noire). (B) graphique de purification typique d’un e. coli lysats de cellules exprimant la lutte antivectorielle vide. Même protocole de purification comme dans (A). Comme indiqué dans la boîte noire, aucuns protéines ne sont éluées de la colonne dans le contrôle négatif. (C) Desalting diagramme d’un échantillon de(sa) 6 pET24-RTA d’e. coli après purification d’affinité. Le diagramme montre la séparation de la fraction protéique de RTA (pic de 280 absorption nm entre 20 à 30 mL) et la fraction de sel (augmentation du pic de conductance après 30 mL).S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : analyse Western représentant de différents échantillons avant et après la purification d’affinité. 20 µL cell lysate (pistes 2-4) ou purifié de l’échantillon (pistes 5 à 7) de différentes variantes de la RTA (seulement les RTA non modifiée a été utilisée dans cette étude) analysés par SDS-PAGE et coloration bleu de Coomassie. Lane 1, échelle de protéine ; allée 2, RTA non modifié ; piste 3, RTAHDEL; piste 4, RTAKDEL; voie 5, RTA non modifié ; voie 6, RTAHDEL; voie 7, RTAKDEL. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : résultats représentatifs obtient par l’analyse de journaliste pour mutants de délétion de levure sauvage et certains traités RTA. (A), GFP Relative fluorescence de type sauvage sphéroplastes de levure contenant le journaliste plasmide pRS315-K28SP- GFP (à droite) moins induit (3 % de galactose, GFPind.) et non induite (2 % raffinose, GFPrepr.) conditions après 20 h GFP induction. Fluorescence relative de GFP a été également analysée en présence de la RTA (5 µM), G418 (300 µg/mL) ou le contrôle négatif (NC). L’inhibiteur de la protéine traduction G418 sert de témoin positif et empêche l’expression de la GFP dans la levure. Valeurs moyennes et écart-type (SD) sont indiqués. (B), GFP Relative fluorescence de (A) affiché dans le cours du temps sur une période de 20 h. Ce schéma fournit des informations supplémentaires sur le calendrier d’inhibition expression et traduction de GFP par RTA ; le comportement de la courbe reflète indirectement la cinétique d’absorption de la RTA et transport intracellulaire dans le cytosol. (C) résultat représentatif de levures sélectionnées mutants défectueux dans les protéines cellulaires qui sont connus pour être impliqués (Hrd1p et Der1p) ou non impliqués (Yos9p et Nup120p) dans la RTA traite levure1,6. La ligne pointillée représente un seuil de signification qui repose sur l’émission de fluorescence obtenue par les souches de contrôle positif (pour plus d’explications voir référence6). Valeurs moyennes et écart-type (SD) sont indiqués. Modification de la figure de Becker et al. 6 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Paramètre de chromotography d’affinité | ||
| Mesure des paramètres | UV (280 nm), concentration du tampon d’élution, Conductance | |
| Paramètres | Variable/unité | Valeur |
| Vitesse d’écoulement | mL/min | 1 |
| Pression maximale de colonne | MPa | 0,35 |
| Longueur d’onde | nm | 280 nm |
| Tampon de liaison | Position de la pompe | A |
| Tampon d’élution | Position de la pompe | B |
| Tampon d’élution départ concentration | % | 0 |
| Compensation de volume de système | mL | 10 |
| Équilibration de la colonne | mL | 20 |
| Injection de l’échantillon sur superloop/seringue | mL | volume de lysat cellulaire |
| Étape de lavage | mL | 20-35 |
| Étape d’élution | mL | 20-35 |
| Tampon d’élution de concentration pendant l’élution | % | 100 |
| Recalibrage de colonne avec 20 % EtOH | mL | 50 |
| Paramètre de dessalage | ||
| Mesure des paramètres | UV (280 nm), la Conductance | |
| Paramètres | Variable/unité | Valeur |
| Vitesse d’écoulement | mL/min | 4 |
| Pression maximale de colonne | MPa | 0,35 |
| Longueur d’onde | nm | 280 nm |
| Tampon de liaison | Position de la pompe | A |
| Tampon d’élution | Position de la pompe | B |
| Tampon d’élution départ concentration | % | 0 |
| Compensation de volume de système | mL | 10 |
| Équilibration de la colonne | mL | 20 |
| Injection de l’échantillon sur superloop/seringue | mL | volume de lysat cellulaire |
| Dessalage injection tampon (0,8 M sorbitol) | mL | 100 |
| Recalibrage de colonne avec 20 % EtOH | mL | 50 |
Tableau 1 : paramètres utilisés pour la purification d’affinité basée sur les colonnes et dessalage. Liste de tous les paramètres de la colonne pertinente (p. ex., débit, concentration du tampon d’élution, équilibration et laver étape durée) et les paramètres mesurés (par exemple, la conductance ou absorption UV).
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Discussion
Lorsque vous effectuez le protocole ci-dessus, nous vous recommandons les suggestions suivantes pour parvenir à une issue positive de l’expérience.
Pour l’expression de la protéine hétérologue, il est important pour ne pas dépasser la concentration de l’IPTG de 1 mM. Concentrations de l’IPTG > 1 mM inhibent l’expression de RTA induite par le promoteur et le plomb pour abaisser les rendements de la toxine. En outre, les cellules ne soient pas cultivées à des températures supérieures à 28 ° C pour éviter la formation de corps d’inclusion, pliage inefficace et inactivation de la toxine. Expression de la RTA à température plus basse (par exemple, 20-28 ° C) est possible et conduit également à la production de toxine active biologique. Toutefois, la réduction de température supplémentaires n’améliore pas significativement l’activité de RTA/pliage et se traduit par un rendement total de toxine inférieur par rapport à 28 ° C (données non présentées).
Paramètres de la purification de la chromatographie d’affinité (tableau 1) sont optimisés pour l’utilisation d’un système de purification automatique équipé de 5 mL Ni2 + colonne d’affinité et doit être ajustée à d’autres systèmes de colonne artisanale ou commerciale si RTA pureté et le rendement sont moins qu’optimales. Dans le cas de pureté de RTA sous-optimal (indiquée par l’apparition de protéines additionnelles en SDS-gels colorés bleu de Coomassie), une augmentation de la concentration de l’imidazole de la mémoire tampon de liaison réduit normalement liaison non-spécifique des protéines chargées positivement à la colonne, augmentant ainsi la pureté de RTA globale. Dans le cas des rendements de RTA sous-optimal, introduction des étapes supplémentaires sonification (4-8 impulsions), plus longue incubation fois (5 h) ou volumes plus importants de la culture (> 1 L) peut aider à améliorer le rendement global de la toxine. Cependant, il y a aussi l’occasion pour purifier les RTA avec succès par l’intermédiaire de systèmes de colonne en fonction de spin (données non présentées) si un système automatisé n’est pas disponible dans le laboratoire.
Pendant l’étape de dessalement, il est important d’ignorer la procédure d’échantillonnage dès que la conductance commence à monter. La contamination avec du sel, en particulier de l’imidazole, influe sur la mesure de la concentration protéique, aboutissant à la détermination de concentration RTA inexacte qui affecte directement le contenu de RTA utilisé dans l’essai de journaliste GFP.
Il est essentiel de stocker RTA purifiée à 4 ° C et éviter le gel. Les échantillons congelés montrent une réduction de l’activité de RTA dans la cellule de base XTT tests de vitalité sur les cellules HeLa (données non présentées). Les échantillons purifiés peuvent être conservées pendant environ 3-4 semaines avant leur activité biologique diminue continuellement. De plus, des concentrations élevées de RTA (≥ 5 mg/mL) après concentration colonne spin sont essentielles car RTA montre une tendance à précipiter à 0,8 M sorbitol.
L’inconvénient de la méthode est le fait que la RTA n’est normalement pas repris par les cellules de levure intact. Pour obtenir des résultats fiables, la paroi cellulaire des levures doit être complètement enlevé par traitement enzymatique. Par conséquent, il est indispensable de vérifier l’efficacité de la formation de sphéroplastes de chaque souche de levure par les méthodes décrites dans les étapes 3,4-3,5. En cas de préparation de sphéroplastes sous-optimale, la période d’incubation et la concentration de l’enzyme lytique devraient être optimisés et surveillés par microscopie à contraste de phase. Overdigestion (formation de fantôme) peut être évitée en réduisant les temps de concentration et/ou d’incubation enzyme lytique considérant que la démarche inverse est nécessaire en cas de digestion insuffisante. Données provenant de souches avec élimination insuffisante des parois cellulaires devraient être exclues de l’évaluation des données.
Il convient également de mentionner que le montage expérimental n’imite pas complètement le processus d’intoxication naturelle de la ricine. La sous-unité de B de liaison cellulaire de ricine (RTB) est manquant qui est normalement responsable de la liaison de la toxine efficace aux résidus de galactose à la surface cellulaire des cellules de mammifères,15. Théoriquement, cette limitation peut être surmontée en exécutant l’expérience avec la ricine purifiée holotoxine contenant ses sous-unités A et B. Néanmoins, les cellules de levure ne possèdent pas de résidus de galactose sur leur surface de la cellule qui pourrait servir de médiateur liaison de RTB8; ce fait explique aussi pourquoi les levures intactes ne sont pas sensibles contre la ricine. Il est donc difficile de savoir si la RTB agirait comme élément de liaison de cellule dans le modèle de la levure. Fait intéressant, anciens études a déjà démontré que la RTA est en mesure d’atteindre le cytosol des cellules des mammifères sans sa cellule contraignant de sous-unité B16. Pour comprendre ce phénomène, nous avons décidé d’utiliser seulement RTA dans le montage expérimental pour identifier des composants cellulaires chez les levures qui facilitent le trafic de la membrane plasmique dans le cytosol de la toxine. Étonnamment, les composants impliqués dans la RTA traite des levures montrent des similitudes frappantes pour les composants requis pour le transport de holotoxine de ricine efficace dans les cellules de mammifères,6. Selon ces résultats, on peut spéculer que RTB joue un rôle mineur dans le transport intracellulaire de ricine que précédemment supposé et qu’il est seulement important pour le contact initial à la surface des cellules de mammifères.
En revanche, les systèmes axés sur les siARN dans les cellules de mammifères reflètent la situation de la toxine naturelle parfaitement, mais sont long et coûteux3. En outre, l’utilisation de mutants de délétion de levure porte l’avantage important que les mutants montrent un knock-out complète de la protéine d’intérêt, alors que les systèmes axés sur les siARN se traduisent généralement par une réduction de la teneur en protéines. Dans certains cas, des niveaux de protéines résiduelles peuvent suffire pour le transport de la toxine par lequel aucun phénotype altéré n’est observé et, ainsi, l’implication de la protéine spécifique n’est pas visible dans les systèmes siRNA.
Bien que les souches de suppression de levure seulement non essentiels ont été utilisées dans l’original étudier6, souches sensibles à la température ainsi qu’une diminution de l’abondance par l’ARNm perturbation (DAmP) collection souches17 (niveau d’expression réduite des indispensables protéines) sont également adaptés pour ce genre de méthode à l’avenir. En général, le rôle des protéines essentielles ne peut pas être étudié avec ce test en raison de leur manque de viabilité, représentent donc une limitation du système de dosage.
Toutefois, la nouvelle méthode de dosage de journaliste représente une stratégie élégante et alternative aux méthodes actuelles qui essaient d’analyser transport RTA chez l’organisme modèle S. cerevisiae. Les études existantes utilisé des systèmes d’expression RTA axée sur le plasmide intracellulaires et sont limités à l’analyse de la rétro-translocation de l’ER dans le cytosol1,7. Mise en œuvre réussie de la demande de RTA extracellulaire maintenant ouvre la possibilité d’étudier non seulement ER retrotranslocation, mais aussi d’analyser indirectement transport RTA de la PM si l’appareil de Golgi au re.Comme la fonction cellulaire et de la localisation de la plupart des levures, gènes est aujourd'hui découvert et disponibles dans les bases de données, les protéines des candidats identifiés peuvent être directement attribués aux compartiments spécifiques et/ou des voies de transport.
Dans l’ensemble, la méthode de dosage du journaliste introduit représente une approche simple et robuste pour identifier le candidat protéines impliquées dans le trafic intracellulaire des toxines ou des sous-unités de toxine (p. ex., RTA) qui bloquent les protéines translation in vivo. Des écarts relativement faibles (1 à 10 %) ainsi que la reproductibilité élevée des données dans l’étude originale confirme ces déclarations. Le format de la plaque à 96 puits, un dépistage rapide des divers mutants de levure est possible en une journée après la purification de la toxine.
À l’avenir, il y a la possibilité d’utiliser la méthode de criblage à haut débit des bibliothèques de suppression de levure. Dans la configuration actuelle, la concentration de RTA appliquée (5 µM) est capable de diminuer la fluorescence GFP relative à 50 %. Dans ces conditions, la méthode offre l’avantage pour repérer des mutants de délétion négatif (augmentation de la fluorescence GFP) et effets positifs (fluorescence réduite de GFP) sur le transport de la RTA. Pour les projections à haut débit, une plus forte différence entre les échantillons traités et non traités est parfois bénéfique. En utilisant des concentrations plus élevées de RTA et/ou en augmentant l’intervalle de mesure (p. ex., 48 h), un bloc encore plus prononcé de l’expression de la GFP doit être réalisable.
Il est à souligner que cette méthode ne se limite pas seulement à analyser le processus d’intoxication d’extracellulaire RTA appliquée chez les levures, mais il y a aussi la possibilité d’analyser l’importation ER de RTA en exprimant la RTA sur un plasmide chez cette souche de journaliste GFP (données non montré). En outre, l’examen préalable de même adaptable pour étudier les voies de transport intracellulaire des autre biosynthèse de protéine inhibant les protéines telles que zymocin18 à l’avenir. Par contraste avec le mode de mise à mort bien caractérisé de zymocin, relativement peu est connu sur les voies de trafic responsables de transport efficace de la toxine dans le cytosol19,20. Ainsi, zymocin représente un candidat optimal pour les études futures étant donné que zymocin est naturellement pris par les cellules de levure. Ainsi, la suppression de la paroi cellulaire peut être omise qui améliore les performances globales de l’essai de journaliste GFP (en ce qui concerne les temps et les coûts). Avec l’aide de ce test de journaliste puissant, il serait possible de disséquer les itinéraires de transport intracellulaire de zymocin chez la levure.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Parties de cette étude ont été gracieusement pris en charge par une bourse de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial and yeast strains | |||
| E. coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
References
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