Summary
Nel manoscritto, descriviamo l'uso di un'analisi del reporter di fluorescenza basati su lievito per identificare componenti cellulari coinvolti nel traffico e uccidere i processi dei citotossici una subunità della ricina di tossina della pianta (RTA).
Abstract
Batterica e centrale un / tossine B sfruttano le naturali vie di traffico nelle cellule eucariotiche per raggiungere i loro target intracellulare nel citosol e infine uccidere. Un / tossine B consistono generalmente di un enzimaticamente attivo Asubunit (ad es., tossina ricina un (RTA)) e uno o più celle, associazione Bsubunit(s), che sono responsabili di tossina vincolante a specifici recettori di superficie di cella. La nostra attuale conoscenza di come A / B tossine sono in grado di efficientemente inebrianti cellule ha aiutate gli scienziati per comprendere i meccanismi cellulari fondamentali, come endocitosi e proteina intracellulare in cellule eucariotiche superiori. Da un punto di vista medico, allo stesso modo è importante identificare le rotte del narcotraffico tossina principali per trovare soluzioni adeguate di trattamento per i pazienti o per eventualmente sviluppare applicazioni basate su tossina terapeutiche per la terapia del cancro.
Dall'analisi del genoma della A / tossina B traffico in cellule di mammifero è complesso, lungo e costoso, parecchi studi sulla A / trasporto di tossina B sono stati effettuati nell'organismo modello lievito Saccharomyces cerevisiae. Pur essendo meno complessi, fondamentali processi cellulari in lievito e cellule eucariotiche superiori sono simile e molto spesso i risultati ottenuti in lievito possono essere trasferiti alla situazione dei mammiferi.
Qui, descriviamo un'analisi del reporter di veloce e facile da usare per analizzare il traffico intracellulare di RTA in lievito. Un vantaggio essenziale del nuovo test è la possibilità di indagare non solo RTA retrò-traslocazione dal reticolo endoplasmatico (ER) nel citosol, ma piuttosto di endocitosi e retrograda tossina trasporto dalla membrana plasmatica in ER. Il test si avvale di un plasmide del reporter che permette la misura indiretta della tossicità di RTA attraverso l'emissione di fluorescenza della proteina fluorescente verde (GFP) dopo la traduzione in vivo . Poiché RTA previene efficacemente l'inizio della biosintesi della proteina da depurinazione rRNA 28S, questo test consente l'identificazione delle proteine della cellula ospite coinvolti nel trasporto intracellulare di RTA attraverso la rilevazione dei cambiamenti nell'emissione di fluorescenza.
Introduction
Pazienti affetti da infezioni da batteri che producono la tossina rappresentano un grave onere medico e finanziario per ogni sistema di assistenza sanitaria sociale, in particolare quanto efficaci trattamenti terapeutici sono ancora in gran parte mancante. Per sviluppare nuove strategie terapeutiche, i meccanismi complessi intossicazione della medicamente relativi A / tossine B come la tossina del colera, produttore della tossina Shiga o ricina ha bisogno di essere compresa a livello molecolare, basato sul romanzo saggi potente che devono essere implementati.
Negli ultimi anni, diversi studi ha tentato di analizzare A / trasporto di tossina B in lievito e cellule di mammifero usando metodi che richiede tempo e costosa come tossina radioattivo etichettatura1,2 , nonché a screening basato su siRNA si avvicina a3. In alcuni casi, traffico di tossina è stata visualizzata in vivo mediante microscopia a fluorescenza dopo accoppiamento chimico e/o genetico delle subunità di tossina individuali con fluorofori, punti quantici o proteine fluorescenti4,5. Purtroppo, tali modifiche spesso portano a inattivo e/o alterata proprietà naturali delle tossine. Un altro modo elegante per rispondere indirettamente a una vasta gamma di domande scientifiche è l'uso di sistemi reporter basato sugli enzimi come lacZ, luciferasi, o proteine fluorescenti (ad es. GFP o Discosoma sp. (proteina fluorescente rosso dsRed)).
In questo manoscritto, un semplice protocollo è descritto che identifica i componenti cellulari necessari per il trasporto intracellulare di RTA extracellularly applicata in S. cerevisiae. In tal modo, un plasmide di fluorescenza-reporter contenente un segnale N-terminale ER-importazione seguito da GFP agisce come un sensore di biosintesi della proteina, che misura indirettamente l'inibizione di traduzione di RTA-mediato della proteina GFP emissione di fluorescenza dopo in vivo traduzione6. Nel caso che endocitosi RTA e/o traffico intracellulare è influenzata negativamente (o positivamente) in un mutante di delezione di lievito particolare rispetto al wild type, questo può essere rilevato attraverso un aumento (o diminuzione) GFP fluorescenza emissione6.
Finora, tutti i metodi di analisi trasporto RTA in cellule di lievito sono stati limitati al processo retrò-traslocazione ER-a-citosol di RTA. In un sistema così artificiale, RTA contenente un segnale di importazione di ER è espresso da un promotore inducibile, risultante in un fenotipo suicida1,7. Anche se la cella associazione subunità B della ricina similarmente è manca nel setup sperimentale descritto in questo manoscritto e, quindi, non rappresenti perfettamente la situazione naturale di ricina holotoxin intossicazione8, tossina trasporti dal plasma membrana attraverso l'apparato del Golgi al pronto soccorso può essere imitata molto attentamente con questa analisi Novella. Interessante, i risultati preliminari ottenuti nello studio pilota indicano che le vie di traffico utilizzate da RTA rivelano sorprendenti analogie con l'itinerario di intossicazione di ricina holotoxin.
In sintesi, il metodo descritto può essere utilizzato per determinare il ruolo specifico di proteine cellulari selezionati nell'endocitosi RTA e traffico in lievito. Inoltre, questa messa a punto sperimentale potrebbe essere facilmente adattato a altri ribosoma inattivanti tossine prodotto e secreto da diverse specie batteriche come zymocin o tossina Shiga e lievito.
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Protocol
Nota: Una panoramica del flusso di lavoro sperimentale generale è raffigurata nella Figura 1.
Attenzione: RTA è altamente tossico per gli esseri umani. È necessaria l'autorizzazione del laboratorio di sicurezza S2 (livello di biosicurezza 2 equivalente). Si prega di indossare guanti durante l'intero esperimento.
1. eterologhi di sua etichetta RTA in Escherichia coli
- Trasformare le cellule di Escherichia coli con l'espressione del plasmide pET24-RTA(sua) 6 o il vettore vuoto pET24a(+) utilizzando protocolli standard elettroporazione9,10. Celle contenenti il plasmide vuoto servono come controllo negativo.
- Dopo la selezione dei cloni positivi sulle piastre di LB (100 µ g/mL) contenenti kanamicina, inoculare le cellule contenenti il plasmide di espressione di RTA o il vettore vuoto nel mezzo di 5ml LBkan (LB medium con 100 µ g/mL di kanamicina) e incubare a 37 ° C e 220 giri/min per 24 h.
- Supplemento 1 L LBkan medio con la pre-cultura 5ml e incubare le cellule a 37 ° C e 220 giri/min fino a quando le cellule hanno raggiunto un OD600 di 0.8-1.0 (circa 3-4 h). Da allora in poi, ridurre la temperatura di cultura a 28 ° C e preparare un 1m della soluzione di riserva (IPTG) isopropilico-β-D-1-thiogalactopyranoside in H2O.
- Inducono l'espressione di RTA di e. coli con l'aggiunta di IPTG ad una concentrazione finale di 1 mM.
- Dopo 3,5 h a 28 ° C e 220 giri/min, raccolto cellule mediante centrifugazione a 10.000 x g e 4 ° C per 10 minuti, lavare la pallina due volte con 5 mL di tampone di associazione (500 mM NaCl, imidazolo di 10 mM e 20 mM KH2PO4 pH = 7,4) a 10.000 x g e a 4 ° C per 10 min e risospendere il pellet in 5 mL di tampone di associazione.
Nota: Il protocollo può essere sospesa in questa fase e le cellule possono essere memorizzate a 80 ° C per diversi giorni.
2. la purificazione della sua etichetta RTA tramite cromatografia di affinità
- Sottoporre ad ultrasuoni cellule sul ghiaccio con il seguente protocollo: 15 s pulse (20 micron), 30 s pausa. Ripetere questo passaggio cinque volte.
- Centrifugare a 21.000 x g e a 4 ° C per 15 min lysate delle cellule e filtrare il surnatante utilizzando un sistema di filtri siringa sterile (dimensione dei pori di 0,2 µm).
Nota: Il pellet cellulare dei campioni lisati con successo mediante mostrano bordi trasparenti. - Utilizzare un sistema di purificazione automatizzata con 5ml Ni2 +-base colonna di affinità per purificare la frazione di His-Tag RTA dalla sterile filtrata e. coli surnatante. In generale, utilizzare una velocità di eluizione di 1 mL/min e raffreddare il sistema di purificazione di tutto per prevenire la perdita di attività di tossina e associazione tossina non efficiente.
Nota: I parametri per purificazione efficiente RTA sono elencati nella tabella 1. Vedi anche Becker et al. Per ulteriori informazioni9.- Brevemente, equilibrare la colonna di affinità con 20 mL di buffer obbligatorio rimuovere il buffer di memoria. Applicare il surnatante filtrato sterile sulla colonna di affinità usando una siringa.
- Lavare la colonna con 25-35 mL di buffer di associazione per rimuovere le proteine non associate dalla colonna. Eseguire la fase di lavaggio fino a capacità di assorbimento UV a 280 nm è vicino al valore iniziale di UV.
- Eluire la frazione legata RTA in 20-35 mL di tampone di eluizione (imidazolo di 500 mM, 500 mM NaCl, 20 mM KH2PO4, pH = 7.2) e tenere il campione sul ghiaccio (Figura 2A e 2B di figura).
Nota: Eluizione della frazione RTA è contrassegnata da un aumento nell'assorbimento di UV. Si prega di notare per raccogliere esclusivamente questa frazione per evitare la contaminazione con proteine rilegate non specifici. - Utilizzare 20 µ l di campioni eluiti per eseguire Blue di Coomassie macchiatura11 o Western blot analisi12,13 (facoltativo). Utilizzare primario anti-sua anticorpi (1:1, 000) e secondario anti-mouse-IgG-HRP (01:10, 000) per rilevare RTA e verificare la purezza del campione (Figura 3).
- Desalificare eluiti frazione RTA su una colonna di dissalazione 5ml ed equilibrare il campione in sorbitolo di 0,8 M.
- Sostituire la colonna di affinità del sistema di purificazione dalla colonna dissalazione ed equilibrare in primo luogo la colonna con 20 mL di sorbitolo di 0,8 M.
- Applicare la frazione di RTA eluita alla colonna tramite una siringa. Lavare la colonna con 100 mL di sorbitolo 0,8 M ed eluire la frazione di RTA dissalata in una provetta da 15 mL, non appena l'assorbimento di UV inizia ad aumentare (Figura 2).
- Memorizzare la frazione eluita RTA a 4 ° C.
Nota: Interrompere direttamente campionamento frazione RTA quando aumenta la conduttanza per evitare contaminazione salina. Parametri per la procedura di dissalazione sono elencati nella tabella 1.
- Eluite frazione RTA a 10.000 x g e a 4 ° C per 30-180 min utilizzando una colonna di spin 10 kDa cut-off ad un volume finale di 1-2 mL di concentrato e conservare il campione a 4 ° C per 3-4 settimane.
Attenzione: Non congelare il campione dal congelamento conduce ad una perdita completa di attività di RTA. - Calcolare la concentrazione di proteina mediante un kit di determinazione della proteina convenzionali. Concentrazione nella proteina dovrebbe essere nel range di 1-1.5 mg/mL.
Nota: RTA tende a precipitare se la concentrazione nella proteina è troppo alta (> 5 mg/mL).
3. trasformazione e rimozione della parete cellulare del lievito
- Trasformare mutanti di delezione di lievito wild-type o selezionato con la GFP reporter plasmide pRS315-K28SP- GFP6 utilizzando standard litio acetato trasformazione metodi14. Incubare le cellule su leucina abbandono (d/o) piastre di glucosio (glucosio 2%, 1,5% agar, 0,5% di solfato di ammonio, 0,17% lievito azoto Base (YNB) e 0,087% d/o mix senza leucina) a 30 ° C per 2-3 giorni per selezione clonale positivo.
- Scegli 3 cloni di lievito diverso da ogni piatto e inoculare i cloni in 100 mL di leucina d/o raffinosio medio (2% raffinosio, 0,5% di solfato di ammonio, 0,17% YNB e mescolare senza leucina 0,087% dallavalle) a 220 giri/min e 30 ° C a OD600 = 1.0-2.0 (2-4 x 107 cellule/mL).
Nota: La crescita delle cellule i diverso l'eliminazione di ceppi di lievito è diverso. Monitor OD600 tramite uno spettrofotometro. - Per calcolare i valori di OD600 , diluire i campioni a OD600 = 0.1-0.3 (1:5 a 01:10 diluizioni) e misurare OD600 con uno spettrofotometro. Come riferimento, utilizzare H2O completato con la corrispondente quantità di leucina d/o raffionose mezzo di.
- Dopo finitura passo 3.5, mescolare 4 µ l della cultura spheroplasted 50ml con 496 µ l di tampone di spheroplasting (circa 2 × 106 Sferoplasti) e centrifugare per 10 min a 400 x g.
- Risospendere il pellet in 10 mL di H2O distillata, campione di vortice per 30 s e piastra fuori 10 µ l del campione su piastre di glucosio di d/o di leucina (2% di glucosio, agar 1,5%, 0,5% di solfato di ammonio, 0,17% YNB e 0,087% d/o mix senza leucina).
- Incubare le cellule per 3 giorni a 30 ° C. Contare il numero totale delle colonie delle cellule coltivate sulla piastra. Per la valutazione dei dati, utilizzare solo i campioni con efficienza supera al 98% (totale numero di Colonia di cellule < 40 colonie/piastra).
4. GFP Reporter Assay misura in piastre da 96 pozzetti
- Seme fuori gli sferoplasti di cellule di lievito ottenute al passaggio 3,7 in piastre da 96 pozzetti (200 µ l/pozzetto).
- Aggiungere 70 µ l leucina stabilizzato d/o raffinosio terreno contenente il controllo negativo (eluato di una Ni2 +-affinità purificato lysate delle cellule dalle cellule di IPTG-indotta e. coli che esprimono il vettore vuoto) o purificata RTA a una concentrazione finale di RTA di 5 µM ( corrispondenti a 160 g/L RTA) in ciascun pozzetto.
- Immediatamente aggiungere 30 µ l stabilizzato galattosio soluzione (30% galattosio, sorbitolo 0,8 M) per indurre l'espressione di GFP e successivamente avviare la misurazione.
Nota: Eseguire la tecniche almeno 3 ripetizioni per esperimento e 3 biologici replica al ceppo di lievito. - Dopo aver completato la preparazione del campione (punti 4.1-4.3), mettere la piastra a 96 pozzetti in un lettore di fluorescenza e avvia la misurazione. Utilizzare il 475/509 nm set di filtri necessari per la rilevazione della fluorescenza di GFP. Eseguire misurazioni a 30 ° C, 120 giri/min e con un diametro d'agitazione di 1 mm sopra una finestra di tempo di 20 h (gli intervalli di 10 min di misurazione).
Nota: Il set di filtri GFP è normalmente disponibile in tutti i sistemi di lettore. Temperatura, intervallo di tempo, misurare intervalli e RTA concentrazione può essere regolata per le proprie esigenze. Risultati rappresentativi sono mostrati in Figura 4. - Facoltativo: Utilizzare ulteriori controlli interni nella misura per il controllo qualità. Preparare un controllo negativo aggiungendo 30 µ l leucina stabilizzato d/o raffinosio medium invece 30% galattosio (nessuna induzione di GFP). Inoltre, aggiungere 70 µ l di soluzione di 0,8 M sorbitolo stabilizzato G418 (300 µ g/mL). L'inibitore di traduzione proteica G418 serve come controllo positivo per l'inibizione della proteina impedisce espressione di GFP in lievito.
- Calcolare in per cento per il punto di tempo di 20 h secondo la seguente equazione relativa fluorescenza GFP (Vedi Figura 4A):
dove NC è il controllo negativo
- In alternativa, determinare la fluorescenza di GFP relativa per ciascun punto di misura (in questo caso 10 min, vedi anche punto 4.4) utilizzando l'equazione di cui sopra. Come mostrato in Figura 4B, è possibile creare un grafico di macchiare le intensità di fluorescenza di GFP (asse y) nel corso del tempo (asse x).
dove NC è il controllo negativo
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Representative Results
Il flusso di lavoro generale del protocollo descritto in questo manoscritto è illustrata nella Figura 1, approssimativamente che riassume i singoli passaggi per successo RTA purificazione e il successivo esperimento di analisi del reporter GFP. Una descrizione più dettagliata di ogni singolo passaggio può essere trovata nel protocollo. La figura 2 illustra il risultato previsto di una purificazione di RTA successo da cromatografia di affinità (Figura 2A) e controllo di vettore vuoto (Figura 2B). Figura 2 Mostra un risultato rappresentativo di un esperimento di dissalazione che illustrano la separazione ideale tra il picco di proteina (blu) e il picco sale-eluiti (marrone). Un'efficace purificazione di RTA è presentata nella forma di un macchiato di Coomassie SDS-gel nella Figura 3. Infine, Figura 4 riassume alcuni originali risultati ottenuti da questa semplice e robusto reporter GFP-based test metodo6. Figura 4A illustra che l'analisi del reporter GFP stabilito è in grado di produrre risultati affidabili e raffigura schematicamente il plasmide del reporter GFP utilizzato in questo studio. Nel grafico, la fluorescenza di GFP relativa di Sferoplasti lievito in condizioni RTA-trattati e non trattati viene confrontata con l'altro. Come previsto, le cellule indotto non così come G418-trattati non mostrano quasi alcuna fluorescenza di GFP. In cellule non trattate e negativo controllo-trattati (vettore vuoto), espressione della GFP non è interessato e non sono state osservate differenze significative tra entrambi i campioni. Al contrario, RTA trattamento determina la riduzione prevista di fluorescenza di GFP mediata dalla sua ribosoma attività d'inibizione. In Figura 4B, viene visualizzata una curva del tempo di inibizione di fluorescenza indotta da RTA GFP. Questo tipo di presentazione dei dati contiene informazioni aggiuntive sui tempi di espressione di GFP (90 min dopo induzione di galattosio) e il punto di partenza dell'inibizione traslazionale di RTA (210 min dopo l'applicazione in cellule wild-type). Il ritardo nella diminuzione di RTA-mediata fluorescenza molto probabilmente riflette la cinetica di assorbimento e il trasporto intracellulare di RTA al cytosol. Figura 4 illustra la fluorescenza di GFP relativa ottenuta da mutanti di lievito selezionato dopo un 20 h RTA-trattamento e rispetto al RTA-trattamento e rispetto ai trattati RTA cellule wild-type. I componenti ERAD Hrd1p e Der1p sono stati scelti come controlli positivi adatto perché studi precedenti già dimostrato che entrambe le proteine sono coinvolte nel retrotranslocation ER-a-citosol di RTA in lievito1. Di conseguenza, entrambi mutanti mostrano l'aumento previsto in fluorescenza di GFP rispetto alle cellule wild-type. Al contrario, valori di fluorescenza GFP relativi in Δyos9 e Δnup120 celle non siano significativamente diversi. È già stato descritto che la mancanza del lectin del controllo di qualità di ER Yos9p né una mancanza nella proteina del poro nucleare Nup20p interessare RTA tossicità e trasporto1. Un elenco dei parametri di cromatografia e dissalazione di affinità specifica può essere trovato nella tabella 1.
Figura 1: flusso di lavoro generale di RTA purificazione e analisi basate su GFP reporter. La purificazione di RTA (a sinistra) inizia con la trasformazione di e. coli con l'espressione o il vettore vuoto seguita da coltivazione ed espressione di RTA IPTG-indotta. Dopo la lisi cellulare e filtrazione sterile, il surnatante viene purificato tramite cromatografia di affinità di Ni2 + e purezza del campione viene verificata tramite colorazione di Coomassie o Western blot. Prima le frazioni eluite RTA sono pronte per l'uso nell'esperimento di analisi del reporter GFP, frazioni devono essere dissalato e concentrato, e deve essere determinata la concentrazione proteica. L'esperimento di dosaggio reporter GFP (a destra) inizia con la trasformazione di mutanti di delezione di lievito selvaggio-tipo e/o selezionato con il costrutto di espressione di GFP. Dopo la coltivazione, la parete cellulare viene rimosso mediante trattamento enzimatico per consentire RTA in vivo l'assorbimento. Quindi, fluorescenza GFP di Sferoplasti delle cellule di lievito è misurata in condizioni di tossina-trattati e non trattati nel corso del tempo in un lettore di fluorescenza (475/509 nm). Infine, relativa fluorescenza GFP è determinata utilizzando la formula indicata al punto 4.6 e viene visualizzato come illustrato nella Figura 4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Cromatografia di affinità rappresentativo e risultati delle cellule di e. coli contenenti animali-RTA(sua) 6 o il controllo di vettore vuoto di desalificazione. (A) il grafico tipico di purificazione di un campione lisato cellulare di Escherichia coli esprimendo RTA(sua) 6 dal vettore pET24-RTA(sua) 6. Curva blu rappresenta l'assorbimento UV a 280 nm causato da anelli aromatici degli aminoacidi Trp, Tyr e Cys e serve come indicatore di proteina. Durante il caricamento di colonna, proteine non associati vengono rilevati in flusso continuo (0-10 mL). Dopo la rimozione di proteine non associati mediante lavaggio con buffer di associazione, concentrazione di tampone di eluizione è aumentato da 0 a 100% (curva rossa) e proteine rilegate immediatamente sono eluiti dalla colonna. Il picco della curva blu tra 25 e 30 mL rappresenta la frazione di RTA di His-tag associato (scatola nera). (B) il grafico tipico di purificazione di un e. coli lisato dalle cellule che esprimono controllo vettore vuoto. Stesso protocollo di purificazione come in (A). Come mostrato nella finestra di nero, proteine non sono eluiti dalla colonna nel controllo negativo. (C) desalazione diagramma di un campione di(sua) 6 pET24-RTA di e. coli dopo purificazione di affinità. Il diagramma mostra la separazione della frazione proteica RTA (picco di assorbimento di 280 nm tra 20-30 mL) e la frazione di sale (aumentando il picco di conduttanza dopo 30 mL).Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: analisi di Western rappresentante di diversi campioni prima e dopo la purificazione di affinità. 20 µ l cella lysate (corsie 2-4) o campione purificato (corsie 5-7) di diverse varianti di RTA (solo non modificato RTA è stato utilizzato in questo studio) analizzati da SDS-PAGE e colorazione blu di Coomassie. Lane 1, scala di proteine; corsia 2, RTA non modificato; Vicolo 3, RTAHDEL; Vicolo 4, RTAKDEL; corsia 5, RTA non modificato; corsia 6, RTAHDEL; corsia 7, RTAKDEL. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: risultati rappresentativi ottengono dall'analisi del reporter per mutanti di delezione di lievito selezionato e del selvaggio-tipo RTA-trattati. (A) GFP relativa fluorescenza di selvaggio-tipo Sferoplasti lievito contenente il reporter plasmide pRS315-K28SP- GFP (a destra) sotto indotta (3% galattosio, GFPind.) e non-indotta (2% raffinosio, GFPrepr.) condizioni dopo 20 h GFP induzione. Relativa fluorescenza GFP è stato analizzato anche in presenza di RTA (5 µM), G418 (300 µ g/mL) o il controllo negativo (NC). L'inibitore di traduzione proteica G418 serve come controllo positivo e impedisce l'espressione della GFP in lievito. Sono indicati i valori medi e deviazioni standard (DS). (B) GFP relativa fluorescenza da (A) visualizzato come corso di tempo oltre 20 h. Questo schema fornisce informazioni aggiuntive sui tempi di inibizione di espressione e traduzione di GFP di RTA; il comportamento di curva riflette indirettamente la cinetica di assorbimento di RTA e trasporto intracellulare nel citosol. (C) risultato rappresentativo di lievito selezionato mutanti difettoso in proteine cellulari che sono noti per essere coinvolti (Hrd1p e Der1p), o non partecipa RTA tratta di lievito1,6(Yos9p e Nup120p). La linea tratteggiata rappresenta una soglia di significatività che si basa sull'emissione di fluorescenza ottenuto con i ceppi di controllo positivo (per ulteriori spiegazioni vedere riferimento6). Sono indicati i valori medi e deviazioni standard (DS). La figura è stata modificata da Becker et al. 6 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Parametro di chromotography di affinità | ||
| Parametri di misura | UV (280 nm), concentrazione di tampone di eluizione, conduttanza | |
| Impostazioni | Variabile/unità | Valore |
| Tasso di flusso | mL/min | 1 |
| Pressione massima delle colonne | MPa | 0.35 |
| Lunghezza d'onda | Nm | 280 nm |
| Buffer di associazione | Posizione della pompa | A |
| Tampone di eluizione | Posizione della pompa | B |
| Tampone di eluizione di concentrazione iniziale | % | 0 |
| Compensazione del volume di sistema | mL | 10 |
| Equilibratura della colonna | mL | 20 |
| Iniezione del campione sopra superloop/siringa | mL | volume di lisato cellulare |
| Fase di lavaggio | mL | 20-35 |
| Passo di eluizione | mL | 20-35 |
| Tampone di eluizione di concentrazione durante l'eluizione | % | 100 |
| Ricalibrazione della colonna con 20% EtOH | mL | 50 |
| Parametro di desalificazione | ||
| Parametri di misura | UV (280 nm), conduttanza | |
| Impostazioni | Variabile/unità | Valore |
| Tasso di flusso | mL/min | 4 |
| Pressione massima delle colonne | MPa | 0.35 |
| Lunghezza d'onda | Nm | 280 nm |
| Buffer di associazione | Posizione della pompa | A |
| Tampone di eluizione | Posizione della pompa | B |
| Tampone di eluizione di concentrazione iniziale | % | 0 |
| Compensazione del volume di sistema | mL | 10 |
| Equilibratura della colonna | mL | 20 |
| Iniezione del campione sopra superloop/siringa | mL | volume di lisato cellulare |
| Iniezione di dissalazione buffer (sorbitolo 0,8 M) | mL | 100 |
| Ricalibrazione della colonna con 20% EtOH | mL | 50 |
Tabella 1: parametri utilizzati per la purificazione di affinità basata su colonne e dissalazione. Elenco di tutte le impostazioni di colonna pertinenti (ad es., portata, concentrazione di tampone di eluizione, equilibratura e durata del passaggio di lavaggio) e parametri misurati (ad es., la conduttanza o assorbimento UV).
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Discussion
Quando si esegue il protocollo di cui sopra, si consiglia i seguenti suggerimenti per ottenere un risultato di successo dell'esperimento.
Per l'espressione della proteina eterologa, è importante non superare la concentrazione di IPTG di 1 mM. Concentrazioni di IPTG > 1 mM inibire indotta da promotore espressione di RTA e piombo per abbassare i rendimenti di tossina. Inoltre, le cellule non vanno coltivate a temperature superiori a 28 ° C per impedire la formazione del corpo di inclusione, pieghevole inefficiente e inattivazione di tossina. Espressione di RTA a temperatura più bassa (ad esempio, 20-28 ° C) è possibile e porta anche alla produzione di tossina attiva biologica. Tuttavia, la riduzione di temperatura aggiuntive non migliora significativamente RTA attività/pieghevole e si traduce in una resa totale tossina inferiore rispetto ai 28 ° C (dati non mostrati).
Parametri di purificazione di cromatografia di affinità (tabella 1) sono ottimizzati per l'uso di un sistema di purificazione automatizzata dotato di 5ml Ni2 + affinità colonna e deve essere regolato ad altri sistemi fatti in casa o commerciale colonna se RTA purezza e rendimento sono sub-ottimali. In caso di sub-ottima purezza RTA (indicato dalla comparsa di altre proteine in gel di SDS macchiato di Coomassie), un aumento della concentrazione di imidazolo di buffer di associazione normalmente riduce il legame aspecifici di proteine positivamente caricate per il colonna, aumentando così la purezza complessiva di RTA. In caso di sub-ottimale RTA rendimenti, introduzione di sonificazione ulteriori passi (4-8 impulsi), incubazione più volte (5 h) o più grandi volumi di coltura (> 1 L) può contribuire a migliorare il rendimento complessivo di tossina. Tuttavia, c'è anche la possibilità di purificare con successo RTA tramite sistemi di spin colonna basata (dati non mostrati) se un sistema automatizzato non è disponibile in laboratorio.
Durante la fase di dissalazione, è importante saltare la procedura di campionamento, non appena la conduttanza comincia a salire. Contaminazione con il sale, soprattutto imidazolo, influenza la misura della concentrazione di proteine, con conseguente determinazione di concentrazione di RTA imprecisa che colpisce direttamente il contenuto di RTA utilizzato nell'analisi della reporter GFP.
È essenziale per conservare purificata RTA a 4 ° C ed evitare il congelamento. I campioni congelati mostrano una ridotta attività della RTA nella cella basata su XTT saggi di vitalità su cellule HeLa (dati non mostrati). Campioni purificati possono mantenersi per circa 3-4 settimane prima di loro attività biologica è continuamente diminuita. Inoltre, alte concentrazioni di RTA (≥ 5 mg/mL) dopo concentrazione colonna spin sono fondamentali perché RTA Mostra una tendenza a precipitare in sorbitolo di 0,8 M.
Uno svantaggio del metodo è il fatto che RTA normalmente non è preso dalle cellule di lievito intatto. Per ottenere risultati affidabili, la parete delle cellule di lievito deve essere completamente rimosso dal trattamento enzimatico. Pertanto, è essenziale verificare l'efficienza di formazione dello spheroplast di ogni ceppo di lievito con i metodi descritti nei passaggi 3.4-3.5. In caso di preparazione dello spheroplast sub-ottimale, il tempo di incubazione e la concentrazione degli enzimi litici dovrebbe essere ottimizzati e monitorati tramite microscopia di contrasto di fase. Overdigestion (formazione di fantasma) può essere prevenuta riducendo i tempi di concentrazione e/o incubazione degli enzimi litici considerando che l'approccio opposto è necessaria in caso di digestione insufficiente. Dati da ceppi con parete cellulare insufficiente rimozione dovrebbero essere escluso dalla valutazione dati.
Va anche ricordato che la messa a punto sperimentale non imitare completamente il processo di intossicazione naturale della ricina. La subunità B associazione di cella di ricina (RTB) manca che è normalmente responsabile per l'associazione di tossina efficiente ai residui di galattosio alla superficie delle cellule di cellule di mammifero15. Teoricamente, questa limitazione può essere superata eseguendo l'esperimento con holotoxin di ricina purificata contenente la subunità A e B. Tuttavia, le cellule di lievito non possiedono residui di galattosio sulla loro superficie cellulare che potrebbe mediare associazione di RTB8; Questo fatto spiega anche perché le cellule di lievito intatti non sono sensibili contro ricina. Così, non è chiaro se RTB avrebbe agito come componente di associazione delle cellule nel modello di lievito. È interessante notare che, ex studi già dimostrato che RTA è in grado di raggiungere nel citosol delle cellule di mammiferi senza relativa cellula associazione subunità B16. Per capire questo fenomeno, abbiamo deciso di utilizzare solo RTA nel setup sperimentale per identificare componenti cellulari nel lievito che facilitano la tossina tratta dalla membrana del plasma nel cytosol. Sorprendentemente, i componenti coinvolti nel traffico di lievito RTA mostrano somiglianze ai componenti necessari per il trasporto di holotoxin di ricina efficiente in cellule di mammifero6. Basato su questi risultati, può essere speculato che RTB svolge un ruolo minore nel trasporto intracellulare ricina quanto supposto in precedenza e che è importante solo per il contatto iniziale alla superficie delle cellule dei mammiferi.
Al contrario, sistemi basati su siRNA in cellule di mammifero perfettamente riflettono la situazione di tossina naturale, ma sono lunghe e costose3. Inoltre, l'uso di mutanti di delezione di lievito porta il vantaggio importante che i mutanti mostrano un knock-out completo della proteina di interesse, mentre sistemi basati su siRNA in genere portano ad una riduzione del livello della proteina. In alcuni casi, livelli di proteine residue possono essere sufficienti per il trasporto di tossina per cui nessun fenotipo alterato è osservato e, quindi, il coinvolgimento della proteina specifica non è visibile nei sistemi basati su siRNA.
Anche se sono stati utilizzati ceppi di lievito da solo non essenziali eliminazione nell'originale Studio6, ceppi sensibili alla temperatura, nonché abbondanza in diminuzione da mRNA perturbazione (umido) Collezione ceppi17 (ridotta espressione livello essenziale proteine) sono similarmente adatti per questo tipo di metodo in futuro. In generale, il ruolo delle proteine essenziali non può essere studiati con questo dosaggio a causa della loro mancanza di vitalità, rappresentano quindi una limitazione del sistema di dosaggio.
Tuttavia, la nuova analisi del reporter rappresenta una strategia elegante ed alternativa ai metodi esistenti che tenta di analizzare trasporto RTA nell'organismo modello S. cerevisiae. Gli studi esistenti utilizzavano sistemi di espressione intracellulari del plasmide-driven RTA e sono limitati all'analisi di retrò-spostamento dall'ER nel cytosol1,7. Efficace attuazione dell'applicazione extracellulare RTA ora si apre la possibilità di studiare non solo ER retrotranslocation ma anche indirettamente analizzare trasporto RTA dal PM però il Golgi al pronto soccorso.Come la funzione cellulare e la localizzazione della maggior parte di lievito geni al giorno d'oggi viene scoperto e disponibili nelle banche dati, le proteine identificate candidato possono essere assegnate direttamente ai compartimenti specifici e/o le vie di trasporto.
Nel complesso, il metodo di analisi introdotto reporter rappresenta un approccio semplice e robusto per identificare candidati proteine coinvolte nel traffico intracellulare di tossine o subunità tossina (ad es., RTA) che bloccano la traduzione della proteina in vivo. Deviazioni standard relativamente basse (1-10%), così come la riproducibilità dei dati elevata nello studio originale confermano queste affermazioni. A causa del formato di piastra a 96 pozzetti, uno screening veloce di diversi mutanti di lievito è possibile entro un giorno dopo la purificazione di tossina.
In futuro, c'è la possibilità di utilizzare il metodo per high throughput screening di librerie di eliminazione del lievito. Nella configurazione attuale, la concentrazione di RTA applicata (5 µM) è in grado di ridurre la fluorescenza di GFP relativa al 50%. In queste condizioni, il metodo offre il vantaggio di identificare mutanti di delezione con (aumento della fluorescenza GFP) effetti negativi e positivi (fluorescenza GFP ridotta) sul trasporto di RTA. Per le proiezioni a resa elevata, la differenza più forte tra i campioni trattati e non trattati a volte è utile. Utilizzando le più alte concentrazioni di RTA e/o aumentare l'intervallo di misura (ad es., 48h), un blocco ancora più pronunciato di espressione di GFP dovrebbe essere realizzabile.
Deve essere sottolineato che questo metodo non è limitato solo per analizzare il processo di intossicazione di RTA extracellulare applicata in lievito, ma c'è anche la possibilità di analizzare l'importazione di ER di RTA esprimendo RTA via un plasmide in questo ceppo di reporter GFP (dati non mostrato). Inoltre, l'approccio di screening può essere adattato similarmente per studiare le vie di trasporto intracellulare di altri biosintesi della proteina inibendo proteine quali zymocin18 in futuro. Contrariamente alla modalità di uccisione ben caratterizzati di zymocin, relativamente piccolo è conosciuto circa le vie di traffico responsabile dei trasporti efficiente tossina nel cytosol19,20. Quindi, zymocin rappresenta un candidato Ottimo per gli studi futuri come zymocin naturalmente è preso dalle cellule di lievito. Così, la rimozione della parete delle cellule può essere omesso che migliora le prestazioni complessive del dosaggio reporter GFP (rispetto al tempo e costi). Con l'aiuto di questa analisi del reporter potente, sarebbe fattibile per sezionare le vie di trasporto intracellulare di zymocin in lievito.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Parti di questo studio sono state gentilmente sostenuta da una sovvenzione del Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial and yeast strains | |||
| E. coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
References
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