Summary
原稿で人身売買に関与する植物毒素リシン (RTA) のサブユニットは細胞傷害性のプロセスを殺す細胞のコンポーネントを識別するために酵母を用いた蛍光レポーターの試金の使用について述べる。
Abstract
細菌や植物 A/B 毒素は、真核細胞の細胞質内の細胞内ターゲットに到達し、最終的に殺す自然の人身売買経路を悪用します。このような A ・ B 毒素が酵素によって実行中の構成一般的に Asubunit (例えば、リシン毒素 (RTA))、1 つまたは複数のセルに特定のバインド毒素は細胞表面の受容器のために責任がある Bsubunit(s) をバインドします。方法の私達の現在の知識 A/B 毒素はエンドサイトーシスと細胞内タンパク質高等真核細胞での並べ替えのような基本的な細胞メカニズムを理解する助け細胞科学者を効率的に夢中にさせることができます。医療の観点から、患者に適切な治療ソリューションを見つける、最終的にがん治療のための治療毒素ベース アプリケーションの開発の主要な毒素の人身売買ルートを特定することが重要です同様に。
A のゲノム解析から B 毒素哺乳類細胞における人身売買は、時間がかかり、複雑で高価な A に関するいくつかの研究/酵母モデル生物酵母で B 毒素輸送が行われています。酵母と高等真核生物の細胞のより複雑な根本的な細胞プロセスであるにもかかわらず類似していると酵母で得られた非常に頻繁が哺乳類の状況に転送できます。
ここでは、酵母の RTA の細胞内輸送を分析するための高速かつ使いやすいレポーターアッセイをについて説明します。新しいアッセイの重要な利点は、細胞質に小胞体 (ER) から RTA レトロ-転だけを調査する機会が、むしろエンドサイトーシスと逆行性毒素細胞膜が輸送小胞体に。アッセイ生体内で翻訳後、RTA 毒性緑色蛍光タンパク質 (GFP) の蛍光性の放出を介しての間接測定ができる記者プラスミドを使用しています。RTA は、28 s rRNA depurination によって蛋白質の生合成の開始を効率的にできないため、この試金は、蛍光性の放出で、ホスト細胞タンパク質の同定を変化検出による細胞内の RTA 輸送に関わるでできます。
Introduction
細菌の生産する毒素によって感染症を患っている患者は、効率的な治療がまだ大きく不足しているので特に各社会医療システム、医療、金融負担が大きいを表しています。医学的に関連する A の複雑な中毒メカニズム、新たな治療戦略を開発する/コレラ毒素、志賀毒素、リシンなど B 毒素が完全に実装すべき新規の強力な試金に基づく分子レベルで理解する必要があります。
近年、いくつかの研究は A の分析を試みました酵母の放射性毒素など時間がかかり、コストがかかる方法を使用して哺乳類セル B 毒素輸送標識 siRNA ベースのスクリーニングと同様、1,2 /3をに近づきます。場合によっては、毒素が人身売買されている可視化体内蛍光顕微鏡による fluorophores が付いて、量子ドットや蛍光タンパク質4,5サブユニットを個々 の毒素の化学および/または遺伝的結合の後。残念ながら、そのような変更はしばしば毒素の不活性および/または変更の自然な特性に します。さまざまな科学的な質問の答えを直接別のエレガントな方法はlacZのルシフェラーゼなど蛍光タンパク質酵素レポーター系の使用 (例えばGFP やDiscosoma sp. 赤色けい光たんぱく質 (下流))。
本稿では、単純なプロトコルは、出芽酵母の細胞外応用 RTA の細胞内輸送に必要な細胞のコンポーネントを特定する説明します。それにより、GFP が続く ER インポート N ターミナル信号を含んでいる蛍光レポーター プラスミッドは GFP 蛍光性の放出後体内で RTA を介したタンパク質翻訳阻害を直接に測定するタンパク質生合成センサーとして機能します。翻訳6。RTA エンドサイトーシスおよび/または細胞内輸送が否定的 (または積極的に) 影響する野生型と比較して特定の酵母削除変異株の場合は GFP 蛍光発光6に増加 (または減少) を検出できます。
これまでのところ、酵母細胞における RTA 輸送の分析のすべてのメソッドは、RTA の小胞体-細胞質レトロ移行プロセスに制限されていました。このような人工的なシステム、ER インポート信号を含む RTA は自殺の表現型の1、7の結果誘導型プロモーターから表されます。リシンの B サブユニットの結合セル本稿に記載されている実験のセットアップで行方不明は同様にであり、したがって、完全に表さないリシン holotoxin 中毒8の自然状況、毒素トランスポート プラズマから膜小胞体、ゴルジ装置では、この新規アッセイで密接にまねることができます。興味深いことに、パイロット研究で得られた予備的な結果は、RTA 人身取引の経路がリシン holotoxin の中毒ルートに顕著な類似性を明らかにすることを示します。
要約すると、RTA エンドサイトーシスで選択した細胞蛋白質と酵母の人身売買の特定の役割を決定するこの方法を使用できます。さらに、この実験のセットアップは簡単に他のリボソームが出され、様々 な酵母や細菌種は、zymocin や志賀毒素などから分泌毒素を不活性化に適応する可能性があります。
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Protocol
注: 一般的な実験的ワークフローの概要については、図 1に描かれています。
注意: RTA は人間にとって猛毒です。安全性研究室許可 S2 (バイオ セーフティ レベル 2 に相当) が必要です。全体の実験の間に手袋を着用してください。
1. 異種発現大腸菌の彼の付けられた RTA
- エシェリヒア属大腸菌細胞発現プラスミド pET24-RTA(彼) の 6または標準エレクトロポレーション プロトコル9,10を使用して、空のベクター pET24a(+)に変換します。空のプラスミドを含むセルは、ネガティブ コントロールとして機能します。
- カナマイシンを含む (100 μ g/mL) LB プレート上の肯定的なクローンの選択後、RTA 発現プラスミドまたは 5 mL の LB 培地菅(カナマイシンの 100 μ g/ml の LB 培地) で空のベクターを含む細胞を接種し、37 ° C で 24 時間 220 rpm 間加温します。
- 5 mL の前培養で 1 L LB菅媒体を補完し、細胞が 0.8 〜 1.0 (約 3-4 h) の外径600に達するまで、37 ° C および 220 rpm でセルを孵化させなさい。その後、培養温度を 28 ° C に減らすし、H2o. イソプロピル-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 原液の 1 M を準備
- 最終濃度 1 mM の IPTG を追加することによって尿細管性アシドーシス発現大腸菌を誘発します。
- 3.5 h 28 ° C で、220 rpm 10,000 × g、10 分、4 ° C で遠心分離によって細胞を収穫後 2 回の 5 mL の結合バッファー (500 mM の NaCl、10 mM のイミダゾールと 20 mM KH2PO4餌を洗浄します。、pH 7.4 を =) 10,000 x g と 4 ° C、10 分、5 mL の結合バッファーでペレットを再懸濁します。
注: プロトコルは一時停止することができますこの段階で、数日間 80 ° C でセルを格納できます。
2. アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーによって彼の付けられた RTA の浄化
- 次のプロトコルを使って氷の上細胞を超音波照射: 15 s パルス (20 ミクロン)、30 秒一時停止。5 回、この手順を繰り返します。
- 細胞ライセート 21,000 x g と 4 ° C、15 分でを遠心し、上清滅菌注射器フィルター システム (0.2 μ m 孔サイズ) を使用してフィルターを適用します。
注: 正常に熱量のサンプルの細胞ペレットは、透明の枠線を表示します。 - 5 mL Ni2 +を搭載した自動浄化システムを使用して-、無菌ろ過エシェリヒア属大腸菌の培養上清から、RTA の彼の付けられた分数を浄化するアフィニ ティー ・ カラムを用いた。一般に、1 mL/分の溶出速度を使用し、非効率的な毒素結合と毒素活性の損失を防ぐために全体の浄化システムをクールします。
メモ: 効率的な RTA 浄化のパラメーターは表 1に表示されます。ベッカーらも参照してください。さらに情報9。- 簡単に言えば、平衡 20 ml の結合バッファー記憶域バッファーを削除するのアフィニ ティー ・ カラム。注射器を用いたアフィニ ティー ・ カラムに上清を滅菌フィルターを適用します。
- 25-35 mL の結合バッファー列からバインドされていないタンパク質を削除すると列を洗います。紫外線吸光度 280 まで洗濯の手順 nm に近い紫外線の初期値。
- 20-35 mL の溶出バッファーでバインドされた RTA 分数を溶出 (500 mM のイミダゾール、500 mM 20 mM KH2PO4pH, 塩化ナトリウム = 7.2) し (図 2 aおよび図 2 b) 氷のサンプルを保ちます。
注: RTA 画分の溶出は、UV 吸収の増加によって示されます。専ら非特異的結合タンパク質の混入を防ぐためにこの割合を収集するために注意してください。 - 西部のしみの分析12,13 (オプション) またはブルー染色11を実行する溶出サンプルの 20 μ L を使用します。尿細管性アシドーシスを検出および確認サンプル純度 (図 3) にプライマリ反彼の抗体 (1:1, 000) および二次対策-mouse-IgG-HRP (1:10, 000) を使用します。
- 5 mL 脱塩カラムの溶出の RTA 分数を脱塩し、0.8 M ソルビトールのサンプルを平衡します。
- 脱塩カラムで精製システムの親和性列に置き換えるし、最初 0.8 M ソルビトール 20 mL でコラムを平衡させ。
- RTA の溶出画分を注射器を介して列に適用されます。0.8 M ソルビトールの 100 mL で列を洗浄し、紫外線吸収が (図 2) を増大し始めるとすぐに 15 mL チューブに脱塩の RTA の画分を溶出します。
- 4 ° C で溶出 RTA 分数を格納します。
注: は、コンダクタンスが塩の汚染を避けるために増加したとき直接 RTA 分数サンプリングを停止します。脱塩のプロシージャのパラメーターは表 1 のとおりです。
- 10,000 x g で 4 ° C 30-180 分 1-2 mL の最終巻に 10 kDa カットオフ スピン列を使用して溶出の RTA 分数を集中し、3-4 週間の 4 ° C でサンプルを格納します。
注意: は、RTA の活動の完全な損失につながるを凍結からサンプルを凍結しないでください。 - 従来タンパク質定量キットを用いたタンパク質濃度を決定します。蛋白濃度は 1 〜 1.5 mg/mL の範囲でする必要があります。
注: RTA 傾向にあるタンパク質濃度が高すぎる場合の沈殿 (> 5 mg/mL)。
3. 酵母の変換および細胞壁の除去
- GFP レポーター プラスミド pRS315 K28SP- GFP と6標準的なリチウム アセテート変換方法14を使用して野生型または選択した酵母欠失変異株を変換します。ロイシン ドロップ アウト (d/o) 上のセルを孵化させなさい肯定的なクローンの選択の 2 〜 3 日の 30 ° C でのグルコース プレート (グルコース 2% 1.5% 寒天 0.5% 硫酸アンモニウム、0.17% 酵母窒素ベース (YNB)、ロイシンなし 0.087 %d/o のミックス)。
- 各板から 3 の異なる酵母クローンをピックアップし、220 rpm と OD600 ~ 30 ° C でロイシン d/o ラフィノース培地 (2% ラフィノース、0.5% 硫酸アンモニウム、0.17%、YNB、0.087 %d/o ロイシンなしミックス) 100 mL でクローンを接種する = 1.0 2.0 (10 x 2 47セル/mL)。
注: 別の酵母遺伝子破壊株の細胞の成長が違います。分光光度計による外径600を監視します。 - 外径600サンプルを希釈する外径 φ600の値を計算するには、= 0.1 0.3 (1:5、1:10 に希釈) 外径600分光光度計で測定。参考として、H2O ロイシン d/o raffionose 中の対応する量の補完を使用します。
- 仕上げステップ 3.5、496 μ spheroplasting バッファー (約 2 × 106スフェロプ ラスト) で 50 mL の spheroplasted 文化の 4 μ L を混合し、400 × g で 10 分間遠心した後。
- 10 mL H2O にペレットを再懸濁します蒸留、30 s、およびロイシン d/o ブドウ糖プレート (2% グルコース 1.5% 寒天 0.5% 硫酸アンモニウム、0.17%、YNB、ロイシンなし 0.087 %d/o のミックス) のサンプルの 10 μ L をプレートの渦サンプル。
- 30 ° C で 3 日間インキュベート細胞皿の上の成長細胞群れ体の合計数をカウントします。データ評価のため効率が 98% 以上でサンプルのみの使用 (細胞コロニー総数 < 40 植民地/プレート)。
4. GFP レポーター アッセイ測定 96 ウェルのプレート
- 96 ウェルのプレート (200 μ L/ウェル) にステップ 3.7 で得られた酵母細胞スフェロプ ラストをシードします。
- 70 μ 安定ロイシン d/o ラフィノース培陰性対照を追加 (Ni2 +の溶出液-親和性浄化された細胞ライセート空のベクトルを表現する IPTG によるエシェリヒア属大腸菌のセルから) または最終的な RTA 濃度 5 μ M (の RTA を精製160 グラム/L の RTA に対応する) 各井戸。
- すぐに、GFP 発現を誘導し、その後、測定を開始 30 μ L 安定ガラクトース ソリューション (30% ガラクトース、0.8 M ソルビトール) を追加します。
注: 実験につき少なくとも 3 の技術的なレプリケートを実行し、3 生物が酵母ごとにレプリケートします。 - 仕上げのサンプル準備 (手順 4.1 4.3) 後、蛍光リーダーの 96 ウェル プレートを置くし、測定を開始します。475/509 nm のフィルターが GFP 蛍光検出に必要なセットを使用します。振動直径 20 h (10 分間隔の測定) の時間帯にわたって 1 mm と 120 rpm、30 ° C での測定を実行します。
注: GFP フィルター セットは通常リーダーのすべてのシステムで利用可能です。温度、時間、間隔、および RTA の濃度の測定は、独自のニーズに調整できます。代表的な結果は、図 4のとおりです。 - オプション: 品質管理測定の内部コントロールを追加を使用します。ネガティブ コントロールを準備するには、30% ガラクトース (GFP 誘導なし) の代わりに 30 μ L 安定ロイシン d/o ラフィノース媒体を追加します。また、0.8 M ソルビトール安定 G418 溶液 (300 μ g/mL) 70 μ L を追加します。酵母における GFP の発現を防ぐために、タンパク質翻訳阻害剤 G418 はタンパク質を阻害する肯定的な制御として機能します。
- 次の式によると 20 h の時間ポイントのパーセントで GFP 蛍光を計算 (図 4 aを参照してください):
、NC はネガティブ コントロール
- また、各測定ポイントの相対的な GFP 蛍光を確認 (このケースの 10 分でまた見なさいステップ 4.4) 上記の同等化を使用して。図 4 bに示すように、GFP の蛍光強度 (y 軸) を時間 (x 軸) をかけてしみが付くことによってグラフを作成します。
、NC はネガティブ コントロール
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Representative Results
本稿で説明したプロトコルの一般的なワークフローについては、図 1、ほぼ成功した RTA 浄化と後続の GFP レポーター アッセイ実験のため単一の手順を要約します。プロトコルの個々 の手順の詳細な説明を見つけることが。図 2は、アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー (図 2 a)、空のベクター コントロール (図 2 b) によって成功した RTA 浄化の期待される結果を示します。図 2は、タンパク質のピーク (青) と (ブラウン) 塩溶出ピークの理想的な分離を示す脱塩実験の代表的な結果を示しています。効果的な RTA 浄化は、図 3に Coomassie ステンド SDS のゲルの形で提示されます。最後に、図 4は、このシンプルで堅牢な GFP 基づかせていたレポーターの試金方法6によって得られたいくつかの元の結果をまとめたものです。図 4 aは、確立された GFP レポーターの試金は信頼性の高い結果を生成することができます、概略この研究で使用される GFP レポーター プラスミドを示して ことを示しています。グラフでは、RTA 処理し、非投与条件下で酵母スフェロプ ラストの相対的な GFP 蛍光は互いと比較されます。予想通り、G418 処理し同様、非誘導セルでほとんどない GFP 蛍光を表示します。非扱われ、否定的な制御処理 (空のベクター) セルの GFP 発現は影響されず、両方のサンプル間に有意差は認められなかった。対照的に、尿細管性アシドーシス治療はそのリボソーム阻害活性を介した予想される GFP 蛍光低減につながります。図 4 b、RTA 誘起 GFP 蛍光抑制の時間カーブが表示されます。このようなデータの表示には、GFP 発現 (ガラクトース誘導後 90 分) と RTA (野生型細胞におけるアプリケーション後 210 分) による翻訳阻害の出発点のタイミングに関する追加情報が含まれています。RTA を介した蛍光減少ほとんど遅延では、摂取動態と細胞質に RTA の細胞内輸送を反映しています。図 4は、20 h RTA 処理後に選択した酵母から得られると尿細管性アシドーシス治療に比較し、RTA 処理野生型細胞と比較して相対的な GFP 蛍光を示しています。ERAD コンポーネント Hrd1p および Der1p は、適切な陽性コントロールの以前の研究はすでに両蛋白質が酵母1で RTA の小胞体-細胞質 retrotranslocation の関与していることを実証するために選ばれました。したがって、両方の変異株は野生型細胞と比較して GFP 蛍光で増加が予想を表示します。対照的に、 Δyos9 のΔnup120 セル相対 GFP 蛍光値は大きく違いではありません。それは既に小胞体品質管理レクチン Yos9p の欠如も核膜孔タンパク質 Nup20p の欠如 RTA 毒性およびトランスポート1に影響を与えることが記載されています。特定のアフィニティ ・ クロマトグラフィーそして desalting パラメーターのリストは、表 1で見つけることが。
図 1: RTA 浄化および GFP 基づかせていたレポーターの試金の一般的なワークフローです。RTA の浄化 (左) はエシェリヒア属大腸菌の変換式または続く栽培および RTA の IPTG 誘導式空のベクターに始まります。セル換散、生殖不能のろ過後上澄みが Ni2 +親和性クロマトグラフィーによる浄化し、クマシー染色またはウェスタンブロッティング経由でサンプル純度を確認します。RTA の溶出画分は、GFP レポーター アッセイ実験で使用する準備ができて、前に脱塩し、濃縮する必要があります分数とタンパク質濃度を測定する必要があります。GFP レポーター アッセイ実験 (右) を削除 GFP 発現コンストラクトで野生型および/または選択した酵母の変換を開始します。栽培後、細胞壁が RTA生体内で吸収できるように酵素処理によって削除されます。酵母細胞スフェロプ ラストの GFP 蛍光は蛍光リーダーに時間をかけて毒素投与および非投与の条件の下で測定、(475/509 nm)。最後に、GFP 蛍光はステップ 4.6 に示す式を使用して決定され、図 4に示すように表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 代表的なアフィニ ティー ・ クロマトグラフィーとペット RTA(彼) 6または空のベクター コントロールを含む大腸菌細胞の結果を脱塩します。(A) 代表的な浄化グラフ大腸菌細胞ライセート サンプル ベクトル pET24 RTA(彼) の 6から RTA(彼) の 6を表現します。青の曲線を表す 280 UV 吸収 nm アミノ酸システイン、Tyr、Trp の芳香環によって引き起こされ、蛋白質の表示器として役立ちます。列の読み込み中に流れを (0-10 mL) で自由な蛋白質が検出されます。結合バッファーで洗浄することにより自由な蛋白質を除去した後溶出バッファー濃度が 0 から 100% (赤いカーブ) に増加し、列からバインドされた蛋白質に溶出されますすぐに。25 と 30 mL の青の曲線のピークは、バインドされた彼の付けられた RTA (ブラック ボックス) の割合を表します。(B)、エシェリヒア属大腸菌の lysate 空ベクトル制御を表現するセルからの典型的な浄化グラフ。(A) のように同じの浄化のプロトコル。ブラック ボックスのように、マイナス コントロールの列からタンパク質は溶出しません。(C) 親和性の浄化後の大腸菌pET24 RTA(彼) の 6サンプルの脱塩に使用図。図は RTA のタンパク質画分 (20-30 mL と 280 nm の吸収のピーク) の分離と塩の割合 (30 mL の後にピーク伝導率の増加)。この図の拡大版を表示するのには、ここをクリックしてください。
図 3: 親和性の浄化の前後に別のサンプルの代表ウエスタン解析します。20 μ L 細胞ライセート (レーン 2 4) または精製サンプル (レーン 5-7) (未変更 RTA だけは本研究で使用された) 別の RTA 亜種の SDS ページとクマシー ブルー染色で分析します。レーン 1、蛋白質の梯子;レーン 2、未変更の RTA;レーン 3、RTAHDEL;レーン 4、RTAKDEL;レーン 5、未変更の RTA;車線 6、RTAHDEL;車線 7、RTAKDEL。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 代表的な結果の RTA 処理野生型および選択した削除酵母レポーターアッセイによって得られます。野生型の (A) 相対的な GFP 蛍光レポーター プラスミド pRS315-K28SPを含む酵母スフェロプ ラスト - GFP (右) 下 (3% ガラクトース、GFPind) を誘導と非誘導 (2% ラフィノース、GFPrepr。) 20 h GFP 後条件。誘導。GFP 蛍光を RTA の存在下でも行った (5 μ M)、G418 (300 μ g/mL) または否定的な制御 (NC)。タンパク質翻訳阻害剤 G418 ポジティブ コントロールとして機能し、酵母における GFP の発現を防ぐことができます。平均値と標準偏差 (SD) を示します。コース時間 20 h 以上として表示されます (A) の (B) 相対 GFP 蛍光。この図は、RTA; による GFP 発現と翻訳阻害のタイミングに関する追加情報を提供します曲線の挙動は、RTA 吸収と細胞質への細胞内輸送の動力学を直接に反映されます。(C) またはない (Hrd1p と Der1p) が関与する知られている細胞の蛋白質の突然変異体欠陥である選択した酵母の代表的な結果では、(Yos9p と Nup120p) が RTA 酵母1,6に人身売買に関与します。点線が肯定的な制御系統によって得られる蛍光性の放出に基づいている意義のしきい値 (詳細な説明参照6を参照してください)。平均値と標準偏差 (SD) を示します。ベッカーらからの図が変更されました。6 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| アフィニティ chromotography パラメーター | ||
| 測定パラメーター | UV (280 nm)、溶出バッファー濃度、電気伝導 | |
| 設定 | 変数/単位 | 値 |
| 流量 | mL/分 | 1 |
| 列の最大圧力 | MPa | 0.35 |
| 波長 | nm | 280 nm |
| 結合バッファー | ポンプの位置 | A |
| 溶出バッファー | ポンプの位置 | B |
| 開始濃度溶出バッファー | % | 0 |
| システム ボリュームの補償 | mL | 10 |
| カラムの平衡化 | mL | 20 |
| Superloop/シリンジ サンプル注入 | mL | 細胞ライセート ボリューム |
| 洗浄手順 | mL | 20-35 |
| 溶出のステップ | mL | 20-35 |
| 中に溶出濃度溶出バッファー | % | 100 |
| 残量 20% の列の江藤 | mL | 50 |
| 脱塩パラメーター | ||
| 測定パラメーター | UV (280 nm)、コンダクタンス | |
| 設定 | 変数/単位 | 値 |
| 流量 | mL/分 | 4 |
| 列の最大圧力 | MPa | 0.35 |
| 波長 | nm | 280 nm |
| 結合バッファー | ポンプの位置 | A |
| 溶出バッファー | ポンプの位置 | B |
| 開始濃度溶出バッファー | % | 0 |
| システム ボリュームの補償 | mL | 10 |
| カラムの平衡化 | mL | 20 |
| Superloop/シリンジ サンプル注入 | mL | 細胞ライセート ボリューム |
| 脱塩バッファー注入 (0.8 M ソルビトール) | mL | 100 |
| 残量 20% の列の江藤 | mL | 50 |
表 1: パラメーター列ベースの親和性の浄化そして desalting のため使用します。すべての関連する列の設定 (例えば流量、溶出バッファー濃度、平衡および洗浄ステップ継続時間) と測定パラメーター (例えばコンダクタンス、UV 吸収) の一覧。
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Discussion
上記プロトコルを実行すると、実験の成功を達成するために次の提案をお勧めします。
異種蛋白質の表現、1 mM の IPTG 濃度を超えないようにすることが重要です。IPTG 濃度 > プロモーターによって誘導される RTA 式および毒素の収率を下げる鉛 1 mM を阻害します。さらに、封入体形成、非効率的な折りたたみ、毒素の不活性化を防ぐために 28 ° C 以上の高温で細胞を栽培する必要がありますはないです。RTA 式低温 (例えば, 20-28 ° C) が可能であり、また生物のアクティブな毒素の生産に 。ただし、追加の温度低減は RTA 活動/折りたたみを大幅改善し、28 ° C (データは示されていない) と比較して低い総毒収率の結果します。
アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー (表 1) の浄化パラメーターが自動浄化システムの使用 5 mL Ni2 +アフィニ ティー ・ カラムを装備し、場合調整その他自家製または商業列システムする必要がある最適化 RTA純度・収量が最適です。サブ最適な RTA 純度 (Coomassie ステンド SDS ゲル中のタンパク質の出現によって示される) の場合結合バッファーのイミダゾールの集中の増加は通常に正荷電の蛋白質の非特異的結合を減少、列、全体的な RTA の純度が高まります。サブ最適な RTA 利回り、追加音声化手順 (4-8 パルス)、(5 h) 時間長い潜伏または大量の文化の導入の場合 (> 1 L) 全体的な毒素収量を改善するために助けることができます。しかし、正常にスピン列ベース システム (データは示されていない) を介して尿細管性アシドーシスを浄化する機会はまた自動化されたシステムをラボで使用できない場合です。
脱塩ステップ コンダクタンスが上昇し始めるとすぐにサンプリング手順をスキップすることが重要です。特にイミダゾール塩混入 GFP レポーターの試金で使用される RTA コンテンツに直接影響を与える不正確な RTA 濃度測定の結果、タンパク質濃度測定に影響を与えます。
4 ° C で精製された RTA を保存し、凍結を避けるために不可欠です。凍結試料 RTA の活性が低下に表示 XTT 細胞活力アッセイ HeLa 細胞 (データは示されていない)。浄化されたサンプルは、生物活動は継続的に減少する前に約 3-4 週間保存できます。また、RTA は 0.8 M ソルビトールに沈澱する傾向を示していますので、回転カラム濃度後高 RTA 濃度 (≥5 mg/mL) は重要です。
メソッドの欠点は、RTA は通常はそのまま酵母細胞によってとられるという事実です。信頼性の高い結果を達成するため、酵母細胞壁を酵素処理で完全に削除する必要があります。したがって、3.4 3.5 の手順で説明されている方法で各酵母のスフェロプ ラスト形成効率をチェックする不可欠です。サブ最適なスフェロプ ラスト準備の場合培養時間と溶菌酵素濃度必要があります最適化して位相差顕微鏡を介して監視します。Overdigestion (ゴースト編成) は、不十分な消化の場合逆のアプローチが必要なに対し、細胞壁溶解酵素濃度やインキュベーション時間を減らすことによって防ぐことができます。不十分な細胞壁除去系統からのデータは、データ評価から除外すべき。
実験のセットアップでは、完全にリシンの自然中毒プロセスを模倣しないが、また述べられるべきであります。リシン (RTB) のセル結合 B サブユニットは、通常15哺乳類細胞の細胞表面でガラクトース残基に効率的な毒素結合に責任があるがありません。理論的には、その A と B サブユニットを含む精製リシン holotoxin に実験を実行することによってこの制限を克服できます。それにもかかわらず、酵母は RTB8の結合を仲介することができる、セル表面のガラクトース残基を持っていません。この事実はまた、なぜそのままの酵母がリシンに対して敏感ではないについて説明します。したがって、RTB 酵母モデルでセル結合コンポーネントとして機能するだろう場合は明らかです。興味深いことに、元の研究は既に RTA が16B サブユニットの結合セルせず哺乳類細胞の細胞質に到達することを示した。この現象を理解するには、毒素の細胞膜から細胞質への人身売買を促進する酵母細胞のコンポーネントを識別する実験のセットアップでのみ RTA を使用にしました。驚いたことに、RTA 酵母で人身売買に関与するコンポーネントは、哺乳類細胞6における効率的なリシン holotoxin 輸送に必要なコンポーネントを印象的な類似点を示します。これらの結果に基づいて、それが推測できる RTB が以前に考えよりもマイナーな役割を果たしている細胞内リシン トランスポートとは哺乳類の細胞表面への初期接触においてのみ重要。
対照的に、哺乳類細胞で siRNA ベースのシステム完全に自然な毒素の状況が時間がかかり、高価な3。さらに、酵母欠失変異株の使用を負う重要な利点を siRNA ベースのシステムは、一般に蛋白質のレベルの削減につながるに対し、変異体は、興味の蛋白質の完全なノックアウトを表示します。いくつかのケースで残留タンパク質レベルとして十分である毒素輸送という表現型変化が観測されないと、したがって、特定の蛋白質の関与は siRNA ベースのシステムに表示されません。
削除のみの非本質的な酵母が元で使用されていたが mRNA 摂動 (湿気) コレクション系統17 (エッセンシャルの発現低下のレベルによって6温度感受性系統、減らされた豊かさを研究します。タンパク質) は、将来的にこの種類のメソッドに適しています同様に。一般に、重要な蛋白質の役割をすることはできませんこのアッセイで生存率の不足のため, したがって、アッセイ システムの制限を表します。
ただし、新しいレポーターの試金はモデル生物の出芽酵母における RTA 輸送を分析しようとする既存のメソッドにエレガントで代替戦略を表します。既存の研究は細胞内のプラスミド駆動型 RTA 式システムを使用、細胞質1,7に小胞体からレトロな転座の分析に制限されています。細胞外の RTA 今アプリケーションの実装を成功させるだけでなく小胞体 retrotranslocation を勉強するだけでなく、直接分析する PM から RTA トランスポートも小胞体、ゴルジ体の可能性を開きます。遺伝子細胞機能および酵母の大半の局在として最近の発見とデータベースで使用できる、識別された候補蛋白質特定のコンパートメントに直接割り当てることができます・経路を輸送します。
全体的にみて、導入したレポーターの試金方法は毒素やタンパク質翻訳体内のブロック (例えばRTA) 毒素のサブユニットの細胞内輸送に関与する候補蛋白質を識別する簡単かつ堅牢な方法を表します。元の研究ではデータの高再現性と同様に、比較的低い標準偏差 (1 ~ 10%) は、これらのステートメントを確認します。96 ウェル プレート形式により様々 な酵母変異株の高速スクリーニングは毒素浄化後の日以内可能です。
将来は、酵母削除ライブラリの高スループット スクリーニング方法を使用する可能性があります。応用 RTA 濃度 (5 μ M) は、現在の設定では、50% 相対 GFP 蛍光を減らすことができます。これらの条件の下では、メソッドは負 (増加 GFP 蛍光) と RTA 交通に及ぼす影響 (減らされた GFP 蛍光) 肯定的な欠失変異を識別するために利点を提供します。高スループット スクリーニング処理と無処理のサンプルのより強力な差は有益なの.RTA の高濃度を使用しておよび/または測定間隔 (例えば、48 h) を大きく、GFP 発現のさらにもっと顕著なブロックは達成する必要があります。
このメソッドは、酵母細胞の応用 RTA の中毒のプロセスを分析するしか制限されないが、またこの GFP レポーター株のプラスミドを介して尿細管性アシドーシスを表現することによって尿細管性アシドーシスの ER インポートを分析する機会があると強調するだ (データないです。図)。さらに、スクリーニングのアプローチは、将来的に zymocin18などタンパク質を阻害する他の蛋白質の生合成の細胞内輸送経路を研究する同様に適合できます。Zymocin のよく特徴付けられて殺害モードと対照をなして比較的ほとんど知られている人身売買経路の細胞質19,20に毒素の効率的な輸送のための責任について。これにより、zymocin は zymocin は酵母細胞によってとられることは当然のことながら、将来の研究のための最適な候補を表します。したがって、(時間とコスト) の面で GFP レポーターの試金の全体的なパフォーマンスを向上させる細胞壁の除去を省略できます。この強力なレポーターの試金の助けを借りて、それは酵母における zymocin の細胞内輸送ルートを解剖する可能になります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
本研究の一部は親切 (SFB 1027, A6) ドイツ研究基金からの助成金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial and yeast strains | |||
| E. coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
References
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